CN111763662A - 酮还原酶及其在替格瑞洛中间体合成中的应用 - Google Patents
酮还原酶及其在替格瑞洛中间体合成中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种酮还原酶、其编码基因、其核酸的重组表达载体、重组表达转化体及其制备方法，以及该酮还原酶在替格瑞洛中间体合成中的应用。本发明的酮还原酶为2‑氯‑1‑(3,4‑二氟苯基)乙酮转化合成(S)‑2‑氯‑1‑(3,4‑二氟苯基)乙醇的生物催化合成提供了可供选择的新酶源，其催化能力高效，在不添加昂贵的辅酶的情况下，含本发明的酮还原酶的全细胞可催化高浓度底物完全转化，能够进一步降低生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及一种酮还原酶及其替格瑞洛中间体合成中的应用。
背景技术
替格瑞洛(Ticagrelor)是一类新型环戊基三唑嘧啶类抗血小板聚集药物，2010年在欧洲上市，2012年11月在我国上市，同年我国PCI指南也将其列为抗血小板治疗药物之一，目前已成为国外许多ACS治疗指南推荐的抗血小板治疗用药。
酮还原酶(EC1.1.1.X，X＝1，2)也被称为羰基还原酶(Carbonyl reductase，CR)或醇脱氢酶(Alcohol dehydrogenase，ADH)，它们可逆地催化酮或者醛还原为醇，并需要辅助因子的参与。微生物细胞或者微生物来源的羰基还原酶可以高效地催化前手性酮的还原，是制备手性醇分子的重要方法之一。天然酶在工业应用中普遍存在无法适应工业生产条件和对非天然底物的催化能力低等问题。
CN105671099A、CN106047828A、CN109423484A、CN106906249A、CN106701840A、CN107686447A、CN109295020A和CN109112166A等专利文献中给出了采用生物酶催化法制备替格瑞诺手性中间体(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇的方法。
CN105671099A中的实施例表明其反应体系催化能力最高仅能达到100g/L，底物浓度的提升至150g/L，底物转化率由99.6％降低至89％。CN106047828A中，突变体L205A转化底物的浓度可以提升至200g/L，但需要的反应时间达到20h，其应用价值仍有待提高。
CN109423484A中公开的酮还原酶能够转化底物浓度高达350g/L的底物，但需要加入价格昂贵的NADP辅酶才能完全转化反应，也限制了其工业应用范围。
CN106906249A和CN106701840A中，转化底物浓度分别为133g/L和38g/L，与后续工业化应用均有一定的距离。
CN107686447A、CN109295020A和CN109112166A均使用葡萄糖脱氢酶实现了辅酶再生，但是底物葡萄糖在葡萄糖脱氢酶作用下反应生成葡糖酸，给后续纯化带来了很大的挑战。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，针对现有2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮的酶催化反应存在的问题，本发明对一种新来源的酮还原酶序列，经定点突变技术进行分子改造，从而获得活性提高的酮还原酶KRED突变体，提高酶的底物催化能力。
本发明的酮还原酶的氨基酸序列，其来源于Leifsonia poae的酮还原酶KRED，该酶基因大小为759bp，编码251个氨基酸，NCBI登录号为BAP47552。
本发明提供了一种酮还原酶，其为由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的第146号位氨基酸、第154号位氨基酸、第194号位氨基酸和第206号位氨基酸中的一个或多个进行突变后所形成的新氨基酸序列构成的酮还原酶；
其中，突变子为：
(1)L146A(亮氨酸突变为丙氨酸)、L146I(亮氨酸突变为异亮氨酸)或L146V(亮氨酸突变为缬氨酸)；
(2)S154Y(丝氨酸突变为酪氨酸)、S154T(丝氨酸突变为苏氨酸)、S154F(丝氨酸突变为苯丙氨酸)或S154W(丝氨酸突变为色氨酸)；
(3)L194I(亮氨酸突变为异亮氨酸)；和/或，
(4)F206A(苯丙氨酸突变为丙氨酸)、F206G(苯丙氨酸突变为甘氨酸)、F206L(苯丙氨酸突变为亮氨酸)或F206V(苯丙氨酸突变为缬氨酸)。
优选的组合突变为：S154Y/L146A、S154Y/L146I、S154Y/F206A、S154Y/F206L、S154Y/L194I、S154Y/L194I/L146A、S154Y/L194I/L146I、S154Y/L194I/F206A、S154Y/L194I/F206L或S154Y/L194I/L146A/F206A。
按本领域常识，酮还原酶一般可由基因工程菌发酵等方法获得，不限制其来源；所述基因工程菌可选自枯草芽孢杆菌、酵母菌或大肠杆菌，优选大肠杆菌。因而，本发明还提供了一种酮还原酶，其氨基酸序列中的第146号位、第154号位、第194号位和第206号位处的氨基酸为下述(1)～(4)中的一种或多种，其余的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；
(1)第146号位的氨基酸为丙氨酸、异亮氨酸或缬氨酸；
(2)第154号位的氨基酸为酪氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸或色氨酸；
(3)第194号位的氨基酸为异亮氨酸；
(4)第206号位的氨基酸为丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸或缬氨酸。
在本发明一些优选的具体实施方式中，所述酮还原酶的氨基酸序列为SEQ IDNo.4、SEQ ID No.6、SEQ ID No.8、SEQ ID No.10、SEQ ID No.12、SEQ ID No.14、SEQ IDNo.16、SEQ ID No.18、SEQ ID No.20、SEQ ID No.22、SEQ ID No.24、SEQ ID No.26、SEQ IDNo.28、SEQ ID No.30、SEQ ID No.32、SEQ ID No.34、SEQ ID No.36、SEQ ID No.38或SEQID No.40。
本发明还提供了一种所述酮还原酶的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列以SEQ ID No.1所示的序列为出发序列，根据所述酮还原酶的氨基酸与SEQ ID No.2的差异，对密码子进行突变后得到：
L146A：DNA序列中146号位氨基酸的密码子由CTG突变为GCT；
L146I：DNA序列中146号位氨基酸的密码子由CTG突变为ATT；
L146V：DNA序列中146号位氨基酸的密码子由CTG突变为GTT；
S154Y：DNA序列中154号位氨基酸的密码子由AGC突变为TAC；
S154T：DNA序列中154号位氨基酸的密码子由AGC突变为ACT；
S154F：DNA序列中154号位氨基酸的密码子由AGC突变为TTC；
S154W：DNA序列中154号位氨基酸的密码子由AGC突变为TGG；
L194I：DNA序列中194号位氨基酸的密码子CTG突变为ATT；
F206A：DNA序列中206号位氨基酸的密码子由TTT突变为GCT；
F206G：DNA序列中206号位氨基酸的密码子由TTT突变为GGT；
F206L：DNA序列中206号位氨基酸的密码子由TTT突变为CTT；
F206V：DNA序列中206号位氨基酸的密码子由TTT突变为GTT。
在本发明一些优选的具体实施方式中，所述酮还原酶的编码基因的多核苷酸序列为SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9、SEQ ID No.11、SEQ ID No.13、SEQ ID No.15、SEQ ID No.17、SEQ ID No.19、SEQ ID No.21、SEQ ID No.23、SEQ IDNo.25、SEQ ID No.27、SEQ ID No.29、SEQ ID No.31、SEQ ID No.33、SEQ ID No.35、SEQ IDNo.37或SEQ ID No.39。
本发明还提供了一种分离的核酸，所述核酸是编码所述酮还原酶的核酸。
其中，所述核酸的制备方法可为本领域常规的制备方法，所述制备方法较佳地包括：通过基因克隆技术获得编码所述酮还原酶的核酸分子，或者通过人工全序列合成的方法得到编码所述酮还原酶的核酸分子。
本发明还提供了一种包含上述核酸的重组表达载体。
其中，所述重组表达载体可通过本领域常规方法获得，一般是将所述核酸连接于各种表达载体上构建而成。所述载体较佳地为质粒pKK223-3。
本发明还提供了一种包含上述重组表达载体的重组表达转化体。
其中，所述重组表达转化体的制备方法一般是蒋所述重组表达载体转化至宿主微生物中制得。所述宿主微生物较佳地为大肠杆菌(E.coli)，更佳地为大肠杆菌BL21(DE3)或大肠杆菌DH5α。将所述重组表达载体(如质粒)转化至E.coli BL21(DE3)中，即可得到本发明优选的基因工程菌株。转化方法可选择本领域常规方法，如电转法、热激法等。
本发明还提供了一种所述酮还原酶的制备方法，其包括如下步骤：培养上述的重组表达转化体，从培养物中获得所述酮还原酶。
其中，所述制备方法较佳地为：将所述重组表达转化体接种至含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养12-20h(例如16h)，再以体积浓度1％-5％(例如4％)接种到新鲜的含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养至菌体浓度OD600为1.0-2.0，向培养基中加入浓度为1-10g/L(例如5g/L)的乳糖，37℃培养6-8h后，离心，收集菌体细胞。
本发明还提供了所述酮还原酶在2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮酶催化反应合成(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇中的应用。
其中，酶催化反应的底物浓度较佳地为50-600g/L，更佳地为500-600g/L。
本发明中，所述催化反应较佳地按下述方式进行：将2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮、含有所述酮还原酶的细胞、缓冲液和异丙醇混合，反应，即可。
其中，所述细胞的浓度较佳地为10-100g/L，更佳地为25-50g/L。
其中，所述缓冲液可为本领域常规使用的缓冲液，如磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(PBS缓冲液)、磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，较佳地为PBS缓冲液。所述缓冲液的浓度较佳地为0.05M-0.2M；所述缓冲液的pH值较佳地为6.0-8.0。
其中，反应体系中的异丙醇的体积百分比较佳地为10％-40％。
其中，所述反应的温度较佳地为20-40℃；所述反应的pH值较佳地为6.0-8.0；所述反应的时间较佳地为2-24h。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
由于氨基酸序列的特殊性，任何含有本发明所示氨基酸序列的肽蛋白的片段或其突变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该肽蛋白的片段或肽蛋白突变体与前述氨基酸序列的同源性在90％、95％、99％或99.5％以上，均属于本发明保护范围之列。具体地，所述改变包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；其中，对于突变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，突变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。
由于核苷酸序列的特殊性，任何含有本发明所示多核苷酸的突变体，只要其与前述多核苷酸的同源性在90％、95％、99％或99.5％以上，均属于本发明保护范围之列。具体地，所述多核苷酸的突变体是指具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列。该多核苷酸的变体可以是生的变位变异体或非生的变异体，包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。按本领域常识，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个多核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的肽蛋白的功能。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
本发明的酮还原酶为2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮转化合成(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇的生物催化合成提供了可供选择的新酶源，其催化能力高效，在不添加昂贵的辅酶的情况下含本发明的酮还原酶的全细胞可催化500g/L底物完全转化，ee值大于99％，与现有技术相比可以进一步降低生产成本。
附图说明
图1为实施例4中的蛋白胶电泳图谱。
图2为实施例6和对比实施例1的反应进程曲线。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1：酮还原酶突变体文库的构建及筛选
通过序列空间结构分析，判断序列中第146号位氨基酸，第154号位氨基酸，第194号位氨基酸和第206号位氨基酸为催化反应能力的关键位点，对此位点进行的氨基酸饱和突变，获得这四个位点最适用氨基酸或者其组合。采用定点突变PCR策略对如序列表SEQ IDNo.2所示的酮还原酶BL21-pKK223-KRED核苷酸序列进行突变改造。
表1：酮还原酶定点饱和突变引物设计
酮还原酶突变体文库的制备通过定点饱和突变来实现，引物设计如表1，
第一轮，以SEQ ID No.2载体pKK223-KRED为模板，分别以表1中L146F/L146R，S154F/S154R，L194F/L194R，F206F/F206R为引物，经饱和突变PCR，将酮还原酶氨基酸序列的第146号位亮氨酸，154号位的丝氨酸，194号位的亮氨酸，206号位的苯丙氨酸突变为其余19种氨基酸，并转化，涂平板，通过催化筛选得到酶活提高的突变体，L146A、L146I、L146V、S154Y、S154T、S154F、S154W、L194I、F206A、F206G、F206L及F206V。通过比较第一轮饱和突变文库中突变序列，突变子S154Y的活力最高，即酮还原酶突变体KRED-S154Y。
第二轮以突变体序列KRED-S154Y为模板，L146F/L146R，L194F/L194R，F206F/F206R为引物，经饱和突变PCR，将酮还原酶氨基酸序列的第146号位亮氨酸，194号位的亮氨酸，206号位的苯丙氨酸突变为其余19种氨基酸，并转化，涂平板，通过催化筛选得到组合突变子S154Y/L146A、S154Y/L146I、S154Y/F206A及S154Y/L194I。通过比较第二轮饱和突变文库中突变序列，突变子S154Y/L194I的活力较高，即酮还原酶突变体KRED-S154Y/L194I。
第三轮以突变体序列KRED-S154Y/L194I为模板，L146F/L146R，F206F/F206R为引物，经饱和突变PCR，将酮还原酶氨基酸序列的第146号位亮氨酸，206号位的苯丙氨酸突变为其余19种氨基酸，并转化，涂平板，通过催化筛选得到组合突变子S154Y/L194I/L146A、S154Y/L194I/F206A。通过比较第三轮饱和突变文库中突变序列，突变子S154Y/L194I/L146A的活力较高，即酮还原酶突变体KRED-S154Y/L194I/L146A。
第四轮以突变体序列KRED-S154Y/L194I/L146A为模板，F206F/F206R为引物，经饱和突变PCR，将酮还原酶氨基酸序列的206号位的苯丙氨酸突变为其余19种氨基酸，并转化，涂平板，通过催化筛选得到组合突变子S154Y/L194I/L146A/F206A，即酮还原酶突变体KRED-S154Y/L194I/L146A/F206A。
突变PCR体系(25μL)为：5倍FastPfu缓冲液10μL，2.5mM dNTPs 4μL，突变上下引物各1μL，模板1μL，FastPfu DNA聚合酶0.5μL，补ddH2O至50μL。PCR条件为：95℃预变性3min；经18个循环：95℃，45s；55℃,45s；72℃，2min 18个循环；最后72℃终延伸7分钟。PCR结果分别进行DNA琼脂糖凝胶电泳阳性验证，将PCR产物进行Dpn I酶消化模板，37℃，1小时，65℃，1分钟灭活，将PCR产物热击转化大肠杆菌E.coli BL21感受态细胞，置于37℃、160转/分钟，培养1小时，涂布于含50μg/mL氨苄青霉素抗性的LB平板上，37℃倒置培养过夜，对获得的突变体进行优势突变体的筛选，筛选条件如下：10mL反应体系按照菌体10g/L的量加入pH 7.0的PBS缓冲液(100mM)重悬细胞，加入终浓度100g/L的2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮，10％异丙醇，水浴摇床30℃、150rpm反应，10min取样取样检测(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇浓度，筛选获得优势菌株。将获得的优势菌株送苏州金维智生物技术有限公司测序，并保存。
实施例2：重组酮还原酶摇瓶表达
BL21-pKK223-KRED菌株及实施例1构建获得的酮还原酶突变体文库接种至含氨苄青霉素的LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，pH＝7.0)中，于37℃，200rpm的摇床中振荡培养12小时，获得活化的菌体培养液。
分别接种2mL上述获得的菌体培养液于50mL含氨苄青霉素的LB培养基中，置于同样条件下振荡培养，定时测量菌液在600nm下的吸光值以监测菌体生长密度，当菌液OD600值为1.0-2.0时，加入诱导剂乳糖至菌体终浓度为5g/L，将培养液置于37℃、180rpm的摇床诱导表达6-8h，获得发酵液。此后通过将发酵液经8000rpm离心10min，收集获得菌体，备用。
实施例3：突变文库筛选
将实施例2制备的菌体按照菌体10g/L的量加入pH 7.0的PBS缓冲液(100mM)重悬细胞，加入终浓度100g/L的2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮，10％异丙醇，水浴摇床30℃、150rpm反应10min，取反应液100μL，900μL无水甲醇沉淀蛋白，即反应液稀释10倍，12000转/分钟离心3分钟，取上清，过0.22μM微滤膜，作为液相样品检测(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇浓度及产物ee值，以产物(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇浓度及产物ee值为指标，筛选获得KRED突变体优势菌株编号及其催化性能如表2所示。
液相产物浓度检测条件：色谱柱C18柱(4.6×250mm，Acchrom，China)，流动相乙腈:0.1％磷酸盐缓冲液，体积比为80:20，流速1.5mL/min，检测波长210nm，进样量1μL，柱温35℃。2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮，2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇保留时间分别为：11.5min，10min。
液相产物手性ee值检测条件：Chiralpakia(4.6×250mm，DAICEL，上海)，流动相为正己烷(0.1％三氟乙酸)：异丙醇，体积比为95:5，流速1mL/min，检测波长260nm，产物(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇保留时间为10.2min，产物对映体保留时间为11.4min。
表2：pKK223-KRED及突变体文库优势菌株催化性能对比
如上表2所述，来源于Leifsonia poae的酮还原酶氨基酸序列中第146号位氨基酸，第154号位氨基酸，第194号位氨基酸和第206号位氨基酸为催化反应的关键位点，经过对这四个位点氨基酸的饱和突变，经过四轮突变筛选获得SEQ40突变体S154Y/L194I/L146A/F206A菌株的活力最高，相较于原始序列菌株活力提高近4倍。
实施例4：重组大肠杆菌基因工程菌株的发酵罐发酵
发酵培养基配方：酵母粉15g/L，氯化钠5g/L，硫酸铵4g/L，磷酸氢二钾4g/L，甘油10g/L，硫酸氯化镁0.5g/L，硫酸锰0.1g/L，硫酸亚铁0.15g/L。
补料培养基配方：葡萄糖600g/L，酵母粉：200g/L。
控制发酵液pH 7.0，搅拌转速300-800rpm，发酵过程中关联搅拌控制溶氧25％左右，空气流量1:1vvm，葡萄糖残余量1％以下。分别接种OD600＝3-4的上述实施例2获得的各工程菌株的菌体培养液，接种量为发酵液体积的5％。发酵前期即菌体生长阶段，控制发酵液pH＝7.0左右，罐温35-37℃，发酵液OD600＝25时加入诱导剂乳糖，采用流加方式至终浓度为10g/L，诱导重组酮还原酶的表达，采用氨水控制发酵液pH＝7.0-7.2左右，罐温为35-37℃左右，此后继续发酵17-18h。当发酵过程中溶氧、pH出现上升时，说明基础培养基已消耗完，通过流加葡萄糖600g/L和酵母粉200g/L溶液维持培养物的生长。此后通过将发酵液经8000rpm离心10min，收集获得菌体(菌体编号对应于氨基酸序列号)，备用。
取部分不同诱导时间的湿菌体进行SDS-PAGE蛋白电泳检验表达水平，SDS-PAGE电泳结果如图1所示，由图1可知，目标蛋白大小与预期一致。
实施例5
反应体系总体积100ml，在250ml的反应瓶中，加入1-10g(湿重)实施例4发酵获得的基因工程菌菌体和pH 6.0-8.0的PBS缓冲液(0.05M-0.2M)搅拌均匀，依次加入2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮10-60g，异丙醇10-40ml，水浴20-40℃条件下反应2-12h。取反应液100μL，加入900μL无水甲醇沉淀蛋白，即反应液稀释10倍，12000转/分钟离心3分钟，取上清，过0.22μM微滤膜，作为液相样品检测(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇浓度并计算底物转化率，反应2h及12h的底物转化率结果见表3。
结果表明：使用10-50g/L的基因工程菌湿菌体在适当条件下反应12h，均可催化100-500g/L浓度范围底物几乎完全转化为产物；底物浓度达到600g/L时，反应体系中底物浓度过高，对酶催化反应产生了一定程度上的抑制，延长反应时间至24h可以完全转化。
表3：实施例5中各样品反应条件及底物转化率
对比实施例1：催化500g/L的2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮底物
称取50g实施例4发酵获得的基因工程菌SEQ2，加入700mL磷酸缓冲液pH 8.0的PBS(100mM)搅匀，依次加入2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮500g，异丙醇300mL，水浴30℃条件下反应，反应1-12h，取反应液100μL，加入900μL无水甲醇沉淀蛋白，即反应液稀释10倍，12000转/分钟离心3分钟，取上清，过0.22μM微滤膜，作为液相样品检测(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇浓度及产物ee值。以实施例3所示液相检测方法检测反应过程中(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇的生成，反应进程曲线如图2所示。
实施例6：催化500g/L的2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮底物
称取50g实施例4发酵获得的基因工程菌SEQ40，加入700mL磷酸缓冲液pH8.0的PBS(100mM)搅匀，依次加入2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮500g，异丙醇300mL，水浴30℃条件下反应，反应1-12h，取反应液100μL，加入900μL无水甲醇沉淀蛋白，即反应液稀释10倍，12000转/分钟离心3分钟，取上清，过0.22μM微滤膜，作为液相样品检测(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇浓度及产物ee值。以实施例3所示液相检测方法检测反应过程中(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇的生成，反应进程曲线如图2所示。检测产物ee值＞99.9％。
通过对比实施例1与实施例6了可以看出，经突变筛选出来的菌株SEQ40酮还原酶突变体S154Y/L194I/L146A/F206A，比SEQ2酮还原酶原始序列催化反应能力大大提高，并且突变体仍保持优异的底物选择性。
Claims (10)
1.一种酮还原酶，其特征在于，其氨基酸序列中的第146号位、第154号位、第194号位和第206号位处的氨基酸为下述(1)～(4)中的一种或多种，其余的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；
(1)第146号位的氨基酸为丙氨酸、异亮氨酸或缬氨酸；
(2)第154号位的氨基酸为酪氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸或色氨酸；
(3)第194号位的氨基酸为异亮氨酸；
(4)第206号位的氨基酸为丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸或缬氨酸。
2.如权利要求1所述的酮还原酶，其特征在于，所述酮还原酶的氨基酸序列为SEQ IDNo.4、SEQ ID No.6、SEQ ID No.8、SEQ ID No.10、SEQ ID No.12、SEQ ID No.14、SEQ IDNo.16、SEQ ID No.18、SEQ ID No.20、SEQ ID No.22、SEQ ID No.24、SEQ ID No.26、SEQ IDNo.28、SEQ ID No.30、SEQ ID No.32、SEQ ID No.34、SEQ ID No.36、SEQ ID No.38或SEQID No.40。
3.一种如权利要求1或2所述的酮还原酶的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列以SEQ ID No.1所示的序列为出发序列，根据所述酮还原酶的氨基酸与SEQ IDNo.2的差异，对密码子进行突变后得到：
L146A：DNA序列中146号位氨基酸的密码子由CTG突变为GCT；
L146I：DNA序列中146号位氨基酸的密码子由CTG突变为ATT；
L146V：DNA序列中146号位氨基酸的密码子由CTG突变为GTT；
S154Y：DNA序列中154号位氨基酸的密码子由AGC突变为TAC；
S154T：DNA序列中154号位氨基酸的密码子由AGC突变为ACT；
S154F：DNA序列中154号位氨基酸的密码子由AGC突变为TTC；
S154W：DNA序列中154号位氨基酸的密码子由AGC突变为TGG；
L194I：DNA序列中194号位氨基酸的密码子CTG突变为ATT；
F206A：DNA序列中206号位氨基酸的密码子由TTT突变为GCT；
F206G：DNA序列中206号位氨基酸的密码子由TTT突变为GGT；
F206L：DNA序列中206号位氨基酸的密码子由TTT突变为CTT；
F206V：DNA序列中206号位氨基酸的密码子由TTT突变为GTT。
4.如权利要求3所述的酮还原酶的编码基因，其特征在于，其多核苷酸序列为SEQ IDNo.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9、SEQ ID No.11、SEQ ID No.13、SEQ IDNo.15、SEQ ID No.17、SEQ ID No.19、SEQ ID No.21、SEQ ID No.23、SEQ ID No.25、SEQ IDNo.27、SEQ ID No.29、SEQ ID No.31、SEQ ID No.33、SEQ ID No.35、SEQ ID No.37或SEQID No.39。
5.一种分离的核酸，其特征在于，所述核酸是编码如权利要求1或2所述的酮还原酶的核酸。
6.一种包含如权利要求5所述的核酸的重组表达载体。
7.一种包含如权利要求6所述的重组表达载体的重组表达转化体。
8.一种如权利要求1或2所述酮还原酶的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：培养上述的重组表达转化体，从培养物中获得所述酮还原酶；
所述制备方法较佳地为：将所述重组表达转化体接种至含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养12-20h，再以体积浓度1％-5％接种到新鲜的含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养至菌体浓度OD600为1.0-2.0，向培养基中加入浓度为1-10g/L的乳糖，37℃培养6-8h后，离心，收集菌体细胞。
9.如权利要求1或2所述的酮还原酶在2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮酶催化反应合成(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述酶催化反应的底物浓度为50-600g/L，较佳地为500-600g/L；
和/或，所述催化反应按下述方式进行：将2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮、含有所述酮还原酶的细胞、缓冲液和异丙醇混合，反应，即可。
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