CN108118035A

CN108118035A - 一种环己酮单加氧酶及其应用

Info

Publication number: CN108118035A
Application number: CN201611077847.5A
Authority: CN
Inventors: 金志平; 金圣芳; 郑飞; 张敏洁; 黄悦
Original assignee: SHANGHAI JINGXIN BIOLOGICAL MEDICAL CO Ltd; Zhejiang Jingxin Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: SHANGHAI JINGXIN BIOLOGICAL MEDICAL CO Ltd; Zhejiang Jingxin Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2016-11-30
Filing date: 2016-11-30
Publication date: 2018-06-05
Anticipated expiration: 2036-11-30
Also published as: CN108118035B

Abstract

本发明公开了一种环己酮单加氧酶及其应用，特别是公开了一种通过定点突变获得的环己酮单加氧酶及其应用，与SEQ ID NO:1相比，所述环己酮单加氧酶的氨基酸序列在以下至少一个位点发生基因突变：第386位丝氨酸Ser突变成天冬酰胺Asn，第435位丝氨酸Ser突变成苏氨酸Thr。实验表明，本发明的环己酮单加氧酶能够将高浓度的奥美拉唑硫醚底物催化转化为埃索美拉唑。

Description

一种环己酮单加氧酶及其应用

技术领域

本发明属酶工程技术领域，涉及一种通过基因定点突变获得的环己酮单加氧酶及其应用，特别涉及所述环己酮单加氧酶在将高浓度的奥美拉唑硫醚底物催化转化为埃索美拉唑中的应用。

背景技术

埃索美拉唑和奥美拉唑都是用于治疗胃溃疡的质子泵抑制剂(Proton pumpinhibitors，PPIs)，其中埃索美拉唑是S构型的奥美拉唑，其化学名称为5-甲氧基-2-((S)-((4-甲氧基-3,5-二甲基-2-吡啶基)甲基)亚硫酰基)-1H-苯并咪唑，CAS登录号为119141-88-7，化学结构如下式I所示。奥美拉唑的化学名称为5-甲氧基-2-(((4-甲氧基-3,5-二甲基-2-吡啶基)甲基)亚硫酰基)-1H-苯并咪唑，CAS登录号为73590-58-6，其化学结构如下式II所示。

与奥美拉唑相比，埃索美拉唑具有肝脏首过效应低、血药浓度高、血浆半衰期长、生物利用度高、药物间相互作用小、药效强而持久等优势，尤其适合用于特殊人群，如老年人、肾功能不全和轻中度肝功能不全患者。此外，埃索美拉唑还适用于已经治愈的食管炎患者防止复发的长期维持治疗，与适当的抗菌疗法联合用药可根除幽门螺杆菌，并且能愈合与幽门螺杆菌感染相关的十二指肠溃疡，防止与幽门螺杆菌相关的消化性溃疡复发。埃索美拉唑以其卓著的品质名列2004年全球畅销药物第5位，销售额高达43亿美元。

目前，已报道的埃索美拉唑的化学合成方法主要有拆分法和氧化法。专利CN103288801A公开了一种高纯度埃索美拉唑钠的制备方法，其通过向奥美拉唑钠溶液中加入三乙胺和L-(+)-扁桃的酸溶液实现拆分目的，然而该方法收率比较低，生产成本比较大，不适合工业化生产。专利CN 102807560B公开了一种不对称氧化合成埃索美拉唑的方法，以手性配体(S,S)-6,6’-二羟基-2,2’-联苯二甲酸二乙酯与四异丙氧基钼形成的络合物为催化剂，以异丙基过氧化氢为氧化剂，对奥美拉唑硫醚物进行不对称催化氧化得到埃索美拉唑。但是由于该方法采用的催化剂比较复杂，市场很难获得，氧化剂异丙基过氧化氢比较昂贵，因此不适合规模化生产应用。

埃索美拉唑的生物酶合成法具有反应收率高，产物手性选择性好，且无需重金属手性配体的优势。US 5840552A通过筛选获得一系列可用于生物氧化反应的菌株，制备埃索美拉唑，其催化手性选择性较好，产物ee值大于99％，但是缺点是产物浓度较低，为ppm级别。CN 102884178A公开了一种非天然存在的单加氧酶，用于催化合成拉唑类化合物，然而其一批反应可催化的底物浓度比较低(33g/L)，不利于工业化大规模应用。

发明内容

为了克服现有的生物酶合成法中反应底物奥美拉唑硫醚浓度过低的缺陷，本发明利用酶基因工程技术来对现有技术的环己酮单加氧酶进行改造和筛选，构建高酶活性的环己酮单加氧酶，从而可将高浓度的奥美拉唑硫醚底物催化转化为埃索美拉唑。

因此，本发明的第一个目的是提供一种可将高浓度的奥美拉唑硫醚底物催化转化为埃索美拉唑的环己酮单加氧酶。与SEQ ID NO:1相比，所述环己酮单加氧酶的氨基酸序列在以下至少一个位点发生基因突变：第386位丝氨酸(Ser，S)突变成天冬酰胺(Asn，N)，第435位丝氨酸(Ser，S)突变成苏氨酸(Thr，T)。其中SEQ ID NO:1是现有的NCBI登录号为578026767的环己酮单加氧酶的氨基酸序列。

在本发明的一个实施方案中，与SEQ ID NO:1相比，所述环己酮单加氧酶的氨基酸序列在以下至少一个位点发生基因突变：第111位苏氨酸(T)突变成丝氨酸(S)，第386位丝氨酸(S)突变成天冬酰胺(N)。

在本发明的一个实施方案中，与SEQ ID NO:1相比，所述环己酮单加氧酶的氨基酸序列在以下至少一个位点发生基因突变：第288位异亮氨酸(Ile，I)突变成亮氨酸(Leu，L)，第435位丝氨酸(S)突变成苏氨酸(T)。

在本发明的一个实施方案中，与SEQ ID NO:1相比，所述环己酮单加氧酶的氨基酸序列在以下至少一个位点发生基因突变：第435位丝氨酸(S)突变成苏氨酸(T)，第516位缬氨酸(Val，V)突变成亮氨酸(L)。

在本发明的一个实施方案中，与SEQ ID NO:1相比，所述环己酮单加氧酶的氨基酸序列在以下至少一个位点发生基因突变：第386位丝氨酸(S)突变成天冬酰胺(N)，第435位丝氨酸(S)突变成苏氨酸(T)，第526位缬氨酸(Val，V)突变成亮氨酸(Leu，L)，。

在本发明的一个实施方案中，与SEQ ID NO:1相比，所述环己酮单加氧酶的氨基酸序列在以下至少一个位点发生基因突变：第111位苏氨酸(T)突变成丝氨酸(S)，第288位异亮氨酸(I)突变成亮氨酸(L)，第386位丝氨酸(S)突变成天冬酰胺(N)，第435位丝氨酸(S)突变成苏氨酸(T)，第516位缬氨酸(V)突变成亮氨酸(L)，第526位缬氨酸(V)突变成亮氨酸(L)，第537位苏氨酸(T)突变成丝氨酸(S)，第540位谷氨酰胺(Q)突变成天冬酰胺(N)。

在本发明的一个实施方案中，所述环己酮单加氧酶的氨基酸序列选自：SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17；编码所述氨基酸的核苷酸序列相应分别选自：SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18。

在本发明的一个实施方案中，提供编码上述环己酮单加氧酶突变体的基因。优选地，编码所述环己酮单加氧酶的基因的核苷酸序列选自：编码SEQ ID NO:3的SEQ ID NO:4；编码SEQ ID NO:5的SEQ ID NO:6；编码SEQ ID NO:7的SEQ ID NO:8；编码SEQ ID NO:9的SEQ ID NO:10；编码SEQ ID NO:11的SEQ ID NO:12；编码SEQ ID NO:13的SEQ ID NO:14；编码SEQ ID NO:15的SEQ ID NO:16；编码SEQ ID NO:17的SEQ ID NO:18。

本发明通过采用QuickChange Site-directed Mutagenesis(Stratagene)方法(Agilent Technologies)，对现有的NCBI登录号为578026767的环己酮单加氧酶基因片段进行蛋白质工程改造。

在本发明的一个实施方案中，设计如下引物(划线处对应相应的突变位点)，对现有的NCBI登录号为578026767的环己酮单加氧酶基因进行蛋白质工程改造，具体是，对该环己酮单加氧酶基因的氨基酸序列SEQ ID NO:1的第386位进行定点突变改造：

F4：GATGCGGGCGATGGCAACTACAAGCGCATCG

R4：CGATGCGCTTGTAGTTGCCATCGCCCGCATC。

获得本发明的环己酮单加氧酶基因，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，对应的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

在本发明的一个实施方案中，设计如下引物(划线处对应相应的突变位点)，对现有的NCBI登录号为578026767的环己酮单加氧酶基因进行蛋白质工程改造，具体是，对该环己酮单加氧酶基因的氨基酸序列SEQ ID NO:1的第435位进行定点突变改造：

F5：GGTCCACTGGCCAATACTCCTCCTATCATCG

R5：CGATGATAGGAGGAGTATTGGCCAGTGGACC

获得本发明的环己酮单加氧酶基因，氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，对应的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。

在本发明的一个实施方案中，设计如下引物(划线处对应相应的突变位点)，对上述环己酮单加氧酶基因进行蛋白质工程改造，具体是对该环己酮单加氧酶基因的氨基酸序列SEQ ID NO:3的第435位进行定点突变改造：

F5：GGTCCACTGGCCAATACTCCTCCTATCATCG

R5：CGATGATAGGAGGAGTATTGGCCAGTGGACC

获得本发明的环己酮单加氧酶基因，其氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，对应的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。

在本发明的一个实施方案中，设计如下引物(划线处对应相应的突变位点)，对上述环己酮单加氧酶基因进行蛋白质工程改造，具体是对该环己酮单加氧酶基因的氨基酸序列SEQ ID NO:3的第111位的氨基酸进行定点突变改造：

F2：GTTTAATACCGCCGTGAGCAGTGCTCATTATAACG

R2：CGTTATAATGAGCACTGCTCACGGCGGTATTAAAC

获得本发明的环己酮单加氧酶基因，其氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，对应的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。

在本发明的一个实施方案中，对上述环己酮单加氧酶基因进行蛋白质工程改造，具体是对该环己酮单加氧酶基因的氨基酸序列SEQ ID NO:5的第288位进行定点突变改造：

F3：CCTTTGGGGACATACTTACCAATATGGAAG

R3：CTTCCATATTGGTAAGTATGTCCCCAAAGG

获得本发明的环己酮单加氧酶基因，其氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，对应的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。

在本发明的一个实施方案中，设计如下引物(划线处对应相应的突变位点)，对上述环己酮单加氧酶基因进行蛋白质工程改造，具体是对该环己酮单加氧酶基因的氨基酸序列SEQ ID NO:5的第516位进行定点突变改造：

F6：GAAAGAATATCGTAGCCTTTTAGCTAATTGC

R6：GCAATTAGCTAAAAGGCTACGATATTCTTTC

获得本发明的环己酮单加氧酶基因，其氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示，对应的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示。

在本发明的一个实施方案中，设计如下引物(划线处对应相应的突变位点)，对上述环己酮单加氧酶基因进行蛋白质工程改造，具体是对该环己酮单加氧酶基因的氨基酸序列SEQ ID NO:7的第526位进行定点突变改造：

F7：CAAAAATCATGCGTATTTGGGCTTTGATATTCAG

R7：CTGAATATCAAAGCCCAAATACGCATGATTTTTG

获得本发明的环己酮单加氧酶基因，其氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示，对应的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示。

在本发明的一个实施方案中，设计如下引物(划线处对应相应的突变位点)，对上述环己酮单加氧酶基因进行蛋白质工程改造，具体是对该环己酮单加氧酶基因的氨基酸序列SEQ ID NO:7的第111、288、516、526、537和540位的进行定点突变改造：

其中对于第111位氨基酸突变的设计引物如下(划线处对应相应的突变位点)：

F2：GTTTAATACCGCCGTGAGCAGTGCTCATTATAACG

R2：CGTTATAATGAGCACTGCTCACGGCGGTATTAAAC

对于第288位氨基酸突变设计的引物如下(划线处对应相应的突变位点)：

F3：CCTTTGGGGACATACTTACCAATATGGAAG

R3：CTTCCATATTGGTAAGTATGTCCCCAAAGG

对于第516位氨基酸突变设计的引物如下(划线处对应相应的突变位点)：

F6：GAAAGAATATCGTAGCCTTTTAGCTAATTGC

R6：GCAATTAGCTAAAAGGCTACGATATTCTTTC

对于第526位氨基酸突变设计的引物如下(划线处对应相应的突变位点)：

F7：CAAAAATCATGCGTATTTGGGCTTTGATATTCAG

R7：CTGAATATCAAAGCCCAAATACGCATGATTTTTG

对于第537位、540位氨基酸突变设计的引物如下(划线处对应相应的突变位点)：

F8：GTTACAGCGCTCAGATTCCAAACAGGACGCTAATGCGTAAGGATCC

R8：GGATCCTTACGCATTAGCGTCCTGTTTGGAATCTGAGCGCTGTAAC

获得本发明的环己酮单加氧酶基因，其氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示，对应的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示。

本发明的第二个目的是提供携带所述环己酮单加氧酶基因的表达载体和基因工程菌株，特别是携带所述环己酮单加氧酶基因的重组大肠杆菌基因工程菌株。

在本发明的一个实施方案中，采用以下方法构建携带所述环己酮单加氧酶的表达载体和基因工程菌株：首先以本发明的环己酮单加氧酶基因为模板，通过PCR扩增扩展(基因两端加Nde I和BamH I内切酶片段)，并利用Nde I和BamH I内切酶位点将扩增的基因插入至pET28a质粒中，连接后获得携带所述环己酮单加氧酶的表达载体，然后将该表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中，即构建获得携带所述环己酮单加氧酶的重组大肠杆菌基因工程菌株。

其中PCR扩增扩展设计的引物如下：

正向引物F1：GGAATTCCATATGAGTACCAAGATGGATTTTGATGC

反向引物R1：CGCGGATCCTTACGCATTAGCCTGCTGTTTGG。

PCR程序如下：

95℃预变性3min；

95℃，45s；55℃，45s；72℃，2min；25个循环；

72℃，7min。

所述重组大肠杆菌基因工程菌株的培养可采用本领域技术人员熟知的常规方法培养，比如摇瓶培养和发酵罐培养。

所述摇瓶培养主要包括如下步骤：

(1)将所述重组大肠杆菌基因工程菌株接种至含卡那霉素的LB培养基中，于37℃的摇床中振荡培养，获得活化的菌体培养液；

(2)将上述获得的菌体培养液接种于含卡那霉素的LB培养基中，置于同样条件下振荡培养，定时测量菌液在600nm下的吸光值，以便监测菌体生长密度，当菌液OD₆₀₀值为2.0-5.0时，加入诱导剂IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)至终浓度为0.01-1.00mmol/L，然后将该培养液置于32℃的摇床中诱导表达，获得发酵液。将发酵液离心，收集获得菌体，备用。

其中，所述LB培养基的配方是：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，pH＝7.0。

优选将所述重组大肠杆菌接种至含卡那霉素的LB培养基中，于37℃，100-500rpm的摇床中振荡培养至少20小时，获得活化的菌体培养液。

更优选将所述重组大肠杆菌接种至含卡那霉素的LB培养基中，于37℃，200-300rpm的摇床中振荡培养至少16小时，获得活化的菌体培养液。

优选当菌液OD₆₀₀值为2.0-4.0时，加入诱导剂IPTG至终浓度为0.05-0.1mmol/L，然后将该培养液置于32℃、100-500rpm的摇床诱导表达至少20h，获得发酵液。

优选当菌液OD₆₀₀值为2.0-3.0时，加入诱导剂IPTG至菌体终浓度为0.05-0.06mmol/L，然后将该培养液置于32℃、200-300rpm的摇床诱导表达至少16h，获得发酵液。

所述发酵罐培养主要包括如下步骤：

在特定的发酵培养基配方条件下，控制发酵液pH＝7.0-7.2左右，搅拌，发酵过程中控制溶氧20％以上，空气流量1:1vvm(通气比)，葡萄糖残余量5％以下。接入种子液，发酵前期即菌体生长阶段，控制发酵液pH＝7.0左右，罐温35-37℃，当发酵液OD₆₀₀达到20-30时加入IPTG至菌体终浓度为0.1-1.00mmol/L，诱导环己酮单加氧酶的表达，控制发酵液pH＝7.0-7.2左右，罐温为32℃左右，此后继续发酵至少16小时。发酵过程中当葡萄糖浓度低于15g/L时，通过流加葡萄糖100-500g/L溶液来维持培养物的生长。将发酵液经5000-10000rpm离心5-30min，收集获得菌体，备用。

其中所述发酵培养基配方是：酵母粉15g/L，氯化钠5g/L，硫酸铵4g/L，磷酸氢二钾4g/L，甘油10g/L，硫酸氯化镁0.1g/L，硫酸锰0.5g/L，pH＝7.0。

优选地，控制发酵液pH＝7.0，搅拌转速500-1000rpm，优选800-1000rpm，发酵过程中控制溶氧30％以上，空气流量1:1vvm(通气比)，葡萄糖残余量1％以下。

优选地，接入种子液的OD₆₀₀＝1.0-2.0，更优选1.5-2.0，接入量为发酵液体积的1％-10％，优选5％-10％。

优选地，当发酵液OD₆₀₀达到25-30时加入IPTG至菌体终浓度为0.5-1.00mmol/L，诱导环己酮单加氧酶的表达。

优选地，当发酵液OD₆₀₀达到25时加入IPTG至菌体终浓度为0.5mmol/L，诱导环己酮单加氧酶的表达。

更优选地，发酵过程中当葡萄糖浓度低于10g/L时，通过流加葡萄糖300-500g/L溶液维持培养物的生长。将发酵液经8000-10000rpm离心10-30min，收集获得菌体。

所述药瓶培养和发酵罐培养获得的发酵液的酶活，可采用以下方法检测：

取经摇瓶培养或经发酵罐发酵获得的发酵液，离心收集菌体，倒出上清液；向该菌体中加入磷酸钾缓冲液(50mmol，pH＝8.0)、氧化型辅酶II、拉唑硫醚、异丙醇、酮还原酶粉(华东理工大学鲁华生物技术研究所赠送，酶活力为1300U)，漩涡混匀；置于37℃的摇床中振荡反应，HPLC检测埃索美拉唑的产物生成量，并计算酶活。其中每单位酶活(U)定义为每小时催化生成1μmol的埃索美拉唑所需的酶量。

优选地，取经摇瓶培养或经发酵罐发酵获得的发酵液离心收集菌体，倒出上清液；向该菌体加入1-5ml磷酸钾缓冲液(50mmol，pH＝8.0)、0.2g/L氧化型辅酶II、10mmol/L拉唑硫醚、10％(v/v)异丙醇、0.05g的酮还原酶粉，漩涡混匀；置于37℃，200-300rpm的摇床中，振荡反应1-3h，HPLC检测埃索美拉唑的产物生成量，并计算酶活。

其中HPLC检测条件是：Shimadzu液相色谱，Phenomenex色谱柱，流动相为10mM磷酸盐(pH＝7.6)：乙腈(60:40)，流速1mL/min，柱温35℃，紫外检测波长300nm，检测时长15min；保留时间：产物(3.8min)，底物(8.2min)。

本发明第三个目的是提供所述环己酮单加氧酶突变体(基因)或携带所述环己酮单加氧酶突变体(基因)的表达载体和/或基因工程菌株在生产埃索美拉唑中的用途。

当将本发明的环己酮单加氧酶用于生产埃索美拉唑时，不仅可以直接以酶的形式比如游离酶或固定化酶的形式用于酶催化反应，而且还可以以表达该酶的微生物的形式将奥美拉唑硫醚底物催化转化为埃索美拉唑。

其中，微生物形式可以是携带所述环己酮单加氧酶的表达载体、基因工程菌株等。

本发明的环己酮单加氧酶突变体(基因)或携带所述环己酮单加氧酶突变体(基因)的表达载体和/或基因工程菌株特别可将高浓度的奥美拉唑硫醚底物催化转化为埃索美拉唑，其中奥美拉唑硫醚底物的浓度可高达165g/L。

在本发明的一个生产埃索美拉唑的实施方案中，将所述环己酮单加氧酶突变体(基因)、携带所述环己酮单加氧酶基因的表达载体和/或基因工程菌株(菌体)加入磷酸缓冲液(pH＝9.0)中，超声破碎，离心，收集上清液；然后向该上清液中依次加入异丙醇脱氢酶、奥美拉唑硫醚、异丙醇、氧化性辅酶II，在有氧气的环境下进行反应，当液相中奥美拉唑硫醚含量小于1wt％后，加入乙酸乙酯终止反应，静置分层，乙酸乙酯用饱和氯化钠水溶液清洗，干燥后旋干，获得目标产物埃索美拉唑。

本发明通过对现有的环己酮单加氧酶基因片段进行定点基因突变，获得具有特定氨基酸/核苷酸序列的环己酮单加氧酶突变体(基因)，该环己酮单加氧酶突变体(基因)、携带该环己酮单加氧酶突变体(基因)的表达载体和/或基因工程菌株均可将高浓度的奥美拉唑硫醚底物催化转化成埃索美拉唑。本发明方法实现了价格低廉且收率高的生产亚砜类化合物(例如埃索美拉唑)的可能，大大降低了生产成本，具有优越的工业化应用价值。

具体实施方式

本文涉及到多种物质的添加量、含量、浓度，以及百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。

在本文中，术语“环己酮单加氧酶突变体”、“突变体环己酮单加氧酶”、“突变的环己酮单加氧酶”、“环己酮单加氧酶突变体(基因)”表示相同的意义，都是指通过对现有的环己酮单加氧酶的氨基酸序列SEQ ID NO:1进行定点突变获得的环己酮单加氧酶，尤其是指酶活活性增强的环己酮单加氧酶突变体。

在本发明中，有时为了描述简便，会将某种蛋白质名称与其编码基因(DNA)名称混用，本领域技术人员应能理解它们在不同描述场合表示不同的物质。例如，对于某一种环己酮单加氧酶突变体，用于描述其催化底物反应时，指的是蛋白质；在作为一种基因描述时，指的是编码该环己酮单加氧酶突变体的基因，以此类推。

相对于现有的环己酮单加氧酶的氨基酸序列SEQ ID NO:1，本发明环己酮单加氧酶突变体均是在某些位点发生了若干个，例如1个、或2个、最高8个氨基酸的突变，并且这些位点具有高度的重合性。由于环己酮单加氧酶仅包含543个氨基酸，可突变替换的氨基酸数量极少，因此这些突变体与环己酮单加氧酶SEQ ID NO:1保持了98.5％以上的同源性。

表达本发明的环己酮单加氧酶的微生物可以是任何转化体宿主，例如包括但不限于细菌和真菌。优选细菌，尤其是大肠杆菌。

当作为生物催化剂用于生产埃索美拉唑时，本发明的环己酮单加氧酶可以是酶的形式、菌体形式或其他形式。所述酶的形式包括游离酶、固定化酶，包括纯化酶、粗酶、发酵液、载体固定的酶等；所述菌体形式包括存活菌体和死亡菌体。

本发明的环己酮单加氧酶的分离纯化、包括固定化酶制备技术也是本领域技术人员所熟知的。

实施例

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非限定本发明的保护范围。下述实施例中所述的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。所述试剂或者耗材，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。

对比例1：环己酮单加氧酶的合成并构建菌株1#

通过NCBI查询环己酮单加氧酶基因(NCBI登录号为578026767)，合成该基因，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，对应的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。然后以该基因片段为模板，通过PCR扩增扩展(基因两端加Nde I和BamH I内切酶片段)，并利用Nde I和BamH I内切酶位点将该基因插入至pET28a质粒中，连接获得携带该环己酮加氧酶的表达载体，最后将该表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中，构建获得携带该环己酮单加氧酶基因的重组大肠杆菌基因工程菌株，记为菌株1#。

其中PCR扩增扩展设计的引物序列如下：

正向引物F1：GGAATTCCATATGAGTACCAAGATGGATTTTGATGC

反向引物R1：CGCGGATCCTTACGCATTAGCCTGCTGTTTGG

PCR扩增扩增程序如下：

95℃预变性3min；

95℃，45s；55℃，45s；72℃，2min；25个循环；

72℃，7min。

实施例1：环己酮单加氧酶基因的定点突变并构建菌株2#

采用QuickChange Site-directed Mutagenesis(Stratagene)方法(AgilentTechnologies)，对上述对比例1的环己酮单加氧酶基因进行蛋白质工程改造，具体是对该环己酮单加氧酶氨基酸序列SEQ ID NO:1的第386位的丝氨酸(S)进行定点基因突变改造，设计如下引物(划线处对应相应的突变位点)：

F4：GATGCGGGCGATGGCAACTACAAGCGCATCG

R4：CGATGCGCTTGTAGTTGCCATCGCCCGCATC

PCR程序设定：

95℃预变性3min；

95℃，45s；55℃，45s；72℃，2min 18个循环；

72℃，7min。

然后以该基因为模板，通过PCR扩增扩展(基因两端加Nde I和BamH I内切酶片段)，并利用Nde I和BamH I内切酶位点将该基因插入至pET28a质粒中，连接获得携带该环己酮加氧酶的表达载体，最后将该表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中，构建获得携带该环己酮单加氧酶基因的重组大肠杆菌基因工程菌株，记为菌株2#。

其中PCR扩增扩展设计的引物如下：

正向引物F1：GGAATTCCATATGAGTACCAAGATGGATTTTGATGC

反向引物R1：CGCGGATCCTTACGCATTAGCCTGCTGTTTGG

PCR程序如下：

95℃预变性3min；

95℃，45s；55℃，45s；72℃，2min；25个循环；

72℃，7min。

实施例2：环己酮单加氧酶基因的定点突变并构建菌株3#

采用QuickChange Site-directed Mutagenesis(Stratagene)方法(AgilentTechnologies)，对上述对比例1的环己酮单加氧酶基因进行蛋白质工程改造，具体是对该环己酮单加氧酶氨基酸序列SEQ ID NO:1的第435位的丝氨酸(S)进行定点突变改造，设计如下引物(划线处对应相应的突变位点)：

F5：GGTCCACTGGCCAATACTCCTCCTATCATCG

R5：CGATGATAGGAGGAGTATTGGCCAGTGGACC

PCR程序设定：

95℃预变性3min；

95℃，45s；55℃，45s；72℃，2min 18个循环；

72℃，7min。

获得本发明的环己酮单加氧酶突变基因，氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，对应的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。

然后以该基因为模板，按照实施例1的方法进行PCR扩增扩展(基因两端加Nde I和BamH I内切酶片段)，并利用Nde I和BamH I内切酶位点将该基因插入至pET28a质粒中，连接获得携带该环己酮加氧酶的表达载体，最后将该表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中，构建获得携带该环己酮单加氧酶基因的重组大肠杆菌基因工程菌株，记为菌株3#。

实施例3：环己酮单加氧酶基因的定点突变并构建菌株4#

采用QuickChange Site-directed Mutagenesis(Stratagene)方法(AgilentTechnologies)，对上述实施例1突变获得的环己酮单加氧酶基因进行蛋白质工程改造，具体是对该环己酮单加氧酶氨基酸序列SEQ ID NO:3的第435位的丝氨酸(S)进行定点突变改造，设计如下引物(划线处对应相应的突变位点)：

F5：GGTCCACTGGCCAATACTCCTCCTATCATCG

R5：CGATGATAGGAGGAGTATTGGCCAGTGGACC

PCR程序设定：

95℃预变性3min；

95℃，45s；55℃，45s；72℃，2min 18个循环；

72℃，7min。

获得本发明的环己酮单加氧酶突变基因，其氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，对应的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。

然后以该基因为模板，按照实施例1的方法进行PCR扩增扩展(基因两端加Nde I和BamH I内切酶片段)，并利用Nde I和BamH I内切酶位点将该基因插入至pET28a质粒中，连接获得携带该环己酮加氧酶的表达载体，最后将该表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中，构建获得携带该环己酮单加氧酶基因的重组大肠杆菌基因工程菌株，记为菌株4#。

实施例4：环己酮单加氧酶基因的定点突变并构建菌株5#

采用QuickChange Site-directed Mutagenesis(Stratagene)方法(AgilentTechnologies)，对上述实施例1突变获得的环己酮单加氧酶基因进行蛋白质工程改造，具体是对该环己酮单加氧酶氨基酸序列SEQ ID NO:3的第111位的苏氨酸(T)进行定点突变改造，设计如下引物(划线处对应相应的突变位点)：

F2：GTTTAATACCGCCGTGAGCAGTGCTCATTATAACG

R2：CGTTATAATGAGCACTGCTCACGGCGGTATTAAAC

PCR程序设定：

95℃预变性3min；

95℃，45s；55℃，45s；72℃，2min 18个循环；

72℃，7min。

获得本发明的环己酮单加氧酶突变基因，其氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，对应的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。

然后以该基因为模板，按照实施例1的方法进行PCR扩增扩展(基因两端加Nde I和BamH I内切酶片段)，并利用Nde I和BamH I内切酶位点将该基因插入至pET28a质粒中，连接获得携带该环己酮加氧酶的表达载体，最后将该表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中，构建获得携带该环己酮单加氧酶基因的重组大肠杆菌基因工程菌株，记为菌株5#。

实施例5：环己酮单加氧酶基因的定点突变并构建菌株6#

采用QuickChange Site-directed Mutagenesis(Stratagene)方法(AgilentTechnologies)，对上述实施例2突变获得的环己酮单加氧酶基因进行蛋白质工程改造，具体是对该环己酮单加氧酶氨基酸序列SEQ ID NO:5的第288位的异亮氨酸(I)进行定点突变改造，设计如下引物(划线处对应相应的突变位点)：

F3：CCTTTGGGGACATACTTACCAATATGGAAG

R3：CTTCCATATTGGTAAGTATGTCCCCAAAGG

PCR程序设定：

95℃预变性3min；

95℃，45s；55℃，45s；72℃，2min 18个循环；

72℃，7min。

获得本发明的环己酮单加氧酶突变基因，其氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，对应的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。

然后以该基因为模板，按照实施例1的方法进行PCR扩增扩展(基因两端加Nde I和BamH I内切酶片段)，并利用Nde I和BamH I内切酶位点将该基因插入至pET28a质粒中，连接获得携带该环己酮加氧酶的表达载体，最后将该表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中，构建获得携带该环己酮单加氧酶基因的重组大肠杆菌基因工程菌株，记为菌株6#。

实施例6：环己酮单加氧酶基因的定点突变并构建菌株7#

采用QuickChange Site-directed Mutagenesis(Stratagene)方法(AgilentTechnologies)，对上述实施例2突变获得的环己酮单加氧酶基因进行蛋白质工程改造，具体是对该环己酮单加氧酶氨基酸序列SEQ ID NO:5的第516位的缬氨酸(V)进行定点突变改造，设计如下引物(划线处对应相应的突变位点)：

F6：GAAAGAATATCGTAGCCTTTTAGCTAATTGC

R6：GCAATTAGCTAAAAGGCTACGATATTCTTTC

PCR程序设定：

95℃预变性3min；

95℃，45s；55℃，45s；72℃，2min 18个循环；

72℃，7min。

获得本发明的环己酮单加氧酶突变基因，其氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示，对应的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示。

然后以该基因为模板，按照实施例1的方法进行PCR扩增扩展(基因两端加Nde I和BamH I内切酶片段)，并利用Nde I和BamH I内切酶位点将该基因插入至pET28a质粒中，连接获得携带该环己酮加氧酶的表达载体，最后将该表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中，构建获得携带该环己酮单加氧酶基因的重组大肠杆菌基因工程菌株，记为菌株7#。

实施例7：环己酮单加氧酶基因的定点突变并构建菌株8#

采用QuickChange Site-directed Mutagenesis(Stratagene)方法(AgilentTechnologies)，对上述实施例3突变获得的环己酮单加氧酶基因进行蛋白质工程改造，具体是对该环己酮单加氧酶氨基酸序列SEQ ID NO:7的第526位的缬氨酸(V)进行定点突变改造，设计如下引物(划线处对应相应的突变位点)：

F7：CAAAAATCATGCGTATTTGGGCTTTGATATTCAG

R7：CTGAATATCAAAGCCCAAATACGCATGATTTTTG

PCR程序设定：

95℃预变性3min；

95℃，45s；55℃，45s；72℃，2min 18个循环；

72℃，7min。

获得本发明的环己酮单加氧酶突变基因，其氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示，对应的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示。

然后以该基因为模板，按照实施例1的方法进行PCR扩增扩展(基因两端加Nde I和BamH I内切酶片段)，并利用Nde I和BamH I内切酶位点将该基因插入至pET28a质粒中，连接获得携带该环己酮加氧酶的表达载体，最后将该表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中，构建获得携带该环己酮单加氧酶基因的重组大肠杆菌基因工程菌株，记为菌株8#。

实施例8：环己酮单加氧酶基因的定点突变并构建菌株9#

采用QuickChange Site-directed Mutagenesis(Stratagene)方法(AgilentTechnologies)，对上述实施例3突变获得的环己酮单加氧酶基因进行蛋白质工程改造，具体是对该环己酮单加氧酶氨基酸序列SEQ ID NO:7的第111、288、516、526、537和540位的氨基酸进行定点突变改造：

其中对于第111位苏氨酸(T)突变，设计如下引物(划线处对应相应的突变位点)：

F2：GTTTAATACCGCCGTGAGCAGTGCTCATTATAACG

R2：CGTTATAATGAGCACTGCTCACGGCGGTATTAAAC

对于第288位异亮氨酸(I)突变，设计如下引物(划线处对应相应的突变位点)：

F3：CCTTTGGGGACATACTTACCAATATGGAAG

R3：CTTCCATATTGGTAAGTATGTCCCCAAAGG

对于第516位缬氨酸(V)突变，设计如下引物(划线处对应相应的突变位点)：

F6：GAAAGAATATCGTAGCCTTTTAGCTAATTGC

R6：GCAATTAGCTAAAAGGCTACGATATTCTTTC

对于第526位缬氨酸(V)突变，设计如下引物(划线处对应相应的突变位点)：

F7：CAAAAATCATGCGTATTTGGGCTTTGATATTCAG

R7：CTGAATATCAAAGCCCAAATACGCATGATTTTTG

对于第537位苏氨酸(T)、540位谷氨酰胺(Q)突变，设计如下引物(划线处对应相应的突变位点)：

F8：GTTACAGCGCTCAGATTCCAAACAGGACGCTAATGCGTAAGGATCC

R8：GGATCCTTACGCATTAGCGTCCTGTTTGGAATCTGAGCGCTGTAAC

PCR程序设定：

95℃预变性3min；

95℃，45s；55℃，45s；72℃，2min 18个循环；

72℃，7min。

获得本发明的环己酮单加氧酶突变基因，其氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示，对应的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示。

然后以该基因为模板，按照实施例1的方法进行PCR扩增扩展(基因两端加Nde I和BamH I内切酶片段)，并利用Nde I和BamH I内切酶位点将该基因插入至pET28a质粒中，连接获得携带该环己酮加氧酶的表达载体，最后将该表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中，构建获得携带该环己酮单加氧酶基因的重组大肠杆菌基因工程菌株，记为菌株9#。

实施例9：重组大肠杆菌基因工程菌株的揺瓶培养

将对比例1和实施例1～8构建获得的重组大肠杆菌基因工程菌株1#至9#分别接种至含卡那霉素的LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，pH＝7.0)中，于37℃，200rpm的摇床中振荡培养至少16小时，获得活化的菌体培养液。

分别接种2ml上述获得的菌体培养液于50ml含卡那霉素的LB培养基中，置于同样条件下振荡培养，定时测量菌液在600nm下的吸光值以监测菌体生长密度，当菌液OD₆₀₀值为2.0-3.0时，加入诱导剂IPTG至菌体终浓度为0.05mmol/L，将培养液置于32℃、200rpm的摇床诱导表达16h，获得发酵液，8000rpm离心10min，收集获得的菌体，备用。

实施例10：重组大肠杆菌基因工程菌株的发酵罐发酵

发酵培养基配方：酵母粉15g/L，氯化钠5g/L，硫酸铵4g/L，磷酸氢二钾4g/L，甘油10g/L，硫酸氯化镁0.1g/L，硫酸锰0.5g/L，pH＝7.0。

控制发酵液pH 7.0，搅拌转速800rpm，发酵过程中控制溶氧30％以上，空气流量1:1vvm，葡萄糖残余量1％以下。分别接种OD₆₀₀＝1.5的上述实施例9获得的各工程菌株的菌体培养液，接种量为发酵液体积的5％。发酵前期即菌体生长阶段，控制发酵液pH＝7.0左右，罐温35-37℃，发酵液OD₆₀₀＝25时加入诱导剂IPTG至终浓度为0.5mmol/L，诱导环己酮单加氧酶的表达，控制发酵液pH＝7.0-7.2左右，罐温为32℃左右，此后继续发酵16小时。当发酵过程中葡萄糖浓度低于10g/L时，通过流加葡萄糖300g/L溶液维持培养物的生长。此后通过将发酵液8000rpm离心10min，收集获得菌体，备用。

实施例11：酶活测定

分别取2ml实施例9和10获得的发酵液，离心收集菌体，倒出上清液；在菌体中加入1ml磷酸钾缓冲液(50mmol，pH＝8.0)、0.2g/L氧化性辅酶II、10mmol/L奥美拉唑硫醚、10％(v/v)异丙醇、0.05g的酮还原酶粉(华东理工大学鲁华生物技术研究所赠送，酶活力为1300U)，漩涡混匀；置于37℃、200rpm的摇床中，振荡反应1h，HPLC检测埃索美拉唑的产物生成量，计算酶活。其中每单位酶活(U)定义为每小时催化生成1μmol的埃索美拉唑所需的酶量。酶活检测结果参看下表1。

HPLC检测条件：Shimadzu液相色谱，Phenomenex色谱柱，流动相为10mM磷酸盐(pH7.6):乙腈(60:40)，流速1mL/min，柱温35℃，紫外检测波长300nm，检测时长15min。

保留时间：产物(3.8min)，底物(8.2min)。

表1酶活检测结果

从表1可以看出，与对比例1的菌株1#相比较，携带本发明的环己酮单加氧酶基因的各重组大肠杆菌菌株2#～9#的酶活活性都得到大幅提高，特别是菌株5#、2#、4#和7#提高非常显著，说明本发明的基因定点突变非常有效。

实施例12：催化转化30g/L奥美拉唑硫醚底物

称取10g菌株1#的菌粉(菌体干燥物)，加入80mL磷酸缓冲液(pH＝9.0，50mM)，超声破碎(冰浴，功率600w，工作5s，间歇5s，破碎时间10min，重复3次)，8000rpm离心10min，收集上清液待用。

在上述收集的上清液中，依次加入异丙醇脱氢酶1g、奥美拉唑硫醚3g、异丙醇20mL、氧化性辅酶II 0.006mg，在氧气环境下保温30℃反应，反应48h，液相检测奥美拉唑硫醚含量小于1wt％后，加入200mL乙酸乙酯终止反应。静置分层，分去水层，乙酸乙酯用饱和氯化钠水溶液洗2遍，干燥后旋干，获得2.73g产物，收率91％。HPLC分析显示该产物为埃索美拉唑，纯度≥99.9％，ee值99.2％。[M+H]⁺：346.0。

实施例13：催化转化165g/L奥美拉唑硫醚底物

称取10g菌株2#的菌粉，加入100mL磷酸缓冲液(pH＝8.0，50mM)，超声破碎(冰浴，功率600w，工作5s，间歇5s，破碎时间10min，重复3次)，8000rpm离心10min，收集上清液待用。

在上述收集的上清液中，依次加入异丙醇脱氢酶1g、奥美拉唑硫醚20g、异丙醇20mL、氧化性辅酶II 0.01mg，在氧气环境下保温32℃反应，反应24h，液相检测奥美拉唑硫醚含量小于1wt％后，加入200mL乙酸乙酯终止反应。静置分层，分去水层，乙酸乙酯用饱和氯化钠水溶液洗2遍，干燥后旋干，获得19.5g产物，收率97.5％。HPLC分析显示该产物为埃索美拉唑，纯度≥99.9％，ee值99.5％。[M+H]⁺：346.0。

实施例14：催化转化60g/L奥美拉唑硫醚底物

称取10g菌株3#的菌粉，加入70mL磷酸缓冲液(pH＝8.5，50mM)，超声破碎(冰浴，功率600w，工作5s，间歇5s，破碎时间10min，重复3次)，8000rpm离心10min，收集上清液待用。

在上述收集的上清液中，依次加入异丙醇脱氢酶2g、奥美拉唑硫醚6g、异丙醇30mL、氧化型辅酶II 0.002mg，在氧气环境下保温35℃反应，反应24h，液相检测奥美拉唑硫醚含量小于1wt％后，加入200mL乙酸乙酯终止反应。静置分层，分去水层，乙酸乙酯用饱和氯化钠水溶液洗2遍，干燥后旋干，获得5.12g产物，收率85.4％。HPLC分析显示该产物为埃索美拉唑，纯度≥99.9％，ee值99.3％。[M+H]⁺：346.0。

实施例15：催化转化100g/L奥美拉唑硫醚底物

称取10g菌株4#的菌粉，加入80mL磷酸缓冲液(pH＝8.5，50mM)，超声破碎(冰浴，功率600w，工作5s，间歇5s，破碎时间10min，重复3次)，8000rpm离心10min，收集上清液待用。

在上述收集的上清液中，依次加入异丙醇脱氢酶2g、奥美拉唑硫醚10g、异丙醇20mL、氧化型辅酶II 0.02mg，在氧气环境下保温25℃反应，反应48h，液相检测奥美拉唑硫醚含量小于1wt％后，加入200mL乙酸乙酯终止反应。静置分层，分去水层，乙酸乙酯用饱和氯化钠水溶液洗2遍，干燥后旋干，获得9.6g产物，收率96％。HPLC分析显示该产物为埃索美拉唑，纯度≥99.9％，ee值99.5％。[M+H]⁺：346.0。

实施例16：转化165g/L奥美拉唑硫醚底物

称取10g菌株5#的菌粉，加入80mL磷酸缓冲液(pH＝9.0，100mM)，超声破碎(冰浴，功率600w，工作5s，间歇5s，破碎时间10min，重复3次)，8000rpm离心10min，收集上清液待用。

在上述收集的上清液中，依次加入异丙醇脱氢酶1g、奥美拉唑硫醚20g、异丙醇40mL、氧化性辅酶II 0.2mg，在氧气环境下保温30℃反应，反应48h，液相检测奥美拉唑硫醚含量小于1wt％后，加入200mL乙酸乙酯终止反应。静置分层，分去水层，乙酸乙酯用饱和氯化钠水溶液洗2遍，干燥后旋干，获得18.6g产物，收率93％。HPLC分析显示该产物为埃索美拉唑，纯度≥99.9％，ee值99.6％。[M+H]⁺：346.0。

实施例17：催化转化100g/L奥美拉唑硫醚底物

称取10g菌株6#的菌粉，加入80mL磷酸缓冲液(pH＝8.5，50mM)，超声破碎(冰浴，功率600w，工作5s，间歇5s，破碎时间10min，重复3次)，8000rpm离心10min，收集上清液待用。

在上述收集的上清液中，依次加入异丙醇脱氢酶2g、奥美拉唑硫醚10g、异丙醇20mL、氧化型辅酶II 0.02mg，在氧气环境下保温25℃反应，反应56h，液相检测奥美拉唑硫醚含量小于1wt％后，加入200mL乙酸乙酯终止反应。静置分层，分去水层，乙酸乙酯用饱和氯化钠水溶液洗2遍，干燥后旋干，获得8.9g产物，收率89％。HPLC分析显示该产物为埃索美拉唑，纯度≥99.9％，ee值99.2％。[M+H]⁺：346.0。

实施例18：催化转化30g/L奥美拉唑硫醚底物

称取10g菌株7#的菌粉，加入70mL磷酸缓冲液(pH＝8.5，100mM)，超声破碎(冰浴，功率600w，工作5s，间歇5s，破碎时间10min，重复3次)，8000rpm离心10min，收集上清液待用。

在上述收集的上清液中，依次加入异丙醇脱氢酶0.5g、奥美拉唑硫醚3g、异丙醇30mL、氧化型辅酶II 0.01mg，在氧气环境下保温35℃反应，反应12h，液相检测奥美拉唑硫醚含量小于1wt％后，加入200mL乙酸乙酯终止反应。静置分层，分去水层，乙酸乙酯用饱和氯化钠水溶液洗2遍，干燥后旋干，获得2.91g产物，收率97％。HPLC分析显示该产物为埃索美拉唑，纯度≥99.9％，ee值99.2％。[M+H]⁺：346.0。

实施例19：催化转化30g/L奥美拉唑硫醚底物

称取10g菌株8#的菌粉，加入70mL磷酸缓冲液(pH＝8.5，100mM)，超声破碎(冰浴，功率600w，工作5s，间歇5s，破碎时间10min，重复3次)，8000rpm离心10min，收集上清液待用。

在上述收集的上清液中，依次加入异丙醇脱氢酶1g、奥美拉唑硫醚3g、异丙醇30mL、氧化型辅酶II 0.01mg，在氧气环境下保温15℃反应，反应42h，液相检测奥美拉唑硫醚含量小于1wt％后，加入200mL乙酸乙酯终止反应。静置分层，分去水层，乙酸乙酯用饱和氯化钠水溶液洗2遍，干燥后旋干，获得2.88g产物，收率96％。HPLC分析显示该产物为埃索美拉唑，纯度≥99.9％，ee值99.3％。[M+H]⁺：346.0。

实施例20：催化转化30g/L奥美拉唑硫醚底物

称取10g菌株9#的菌粉，加入70mL磷酸缓冲液(pH＝8.5，100mM)，超声破碎(冰浴，功率600w，工作5s，间歇5s，破碎时间10min，重复3次)，8000rpm离心10min，收集上清液待用。

在上述收集的上清液中，依次加入异丙醇脱氢酶1g、奥美拉唑硫醚1g、异丙醇30mL、氧化型辅酶II 0.001mg，在氧气环境下保温15℃反应，反应48h，液相检测奥美拉唑硫醚含量小于1wt％后，加入200mL乙酸乙酯终止反应。静置分层，分去水层，乙酸乙酯用饱和氯化钠水溶液洗2遍，干燥后旋干，获得0.92g产物，收率92％。HPLC分析显示该产物为埃索美拉唑，纯度≥99.9％，ee值99.5％。[M+H]⁺：346.0。

综上所述，相比氨基酸序列为SEQ ID NO:1的环己酮单加氧酶，本发明的环己酮单加氧酶突变体的酶活活性得到大幅提高，并且降低了酶的底物(奥美拉唑硫醚)抑制性，提高了奥美拉唑硫醚的转化率和反应收率，以及目标产品的纯度，具有广阔的工业应用前景。

序列表

<110> 浙江京新药业股份有限公司

上海京新生物医药有限公司

<120> 一种环己酮单加氧酶及其应用

<130> SHPI1600872

<160> 18

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 543

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Ser Thr Lys Met Asp Phe Asp Ala Ile Val Ile Gly Ala Gly Phe

1 5 10 15

Gly Gly Leu Tyr Ala Val Lys Lys Leu Arg Asp Glu Leu Glu Leu Lys

20 25 30

Val Lys Ala Phe Asp Lys Ala Thr Asp Val Gly Gly Thr Trp Tyr Trp

35 40 45

Asn Arg Tyr Pro Gly Ala Leu Thr Asp Thr Glu Thr His Leu Tyr Cys

50 55 60

Tyr Ser Trp Asp Lys Glu Met Leu Gln Ser Leu Glu Ile Lys Lys Lys

65 70 75 80

Tyr Val Gln Gly Pro Asp Val Arg Lys Tyr Leu Gln Gln Val Ala Glu

85 90 95

Lys His Asp Leu Lys Lys Ser Tyr Gln Phe Asn Thr Ala Val Thr Ser

100 105 110

Ala His Tyr Asn Glu Ala Asp Ala Leu Trp Glu Val Thr Thr Glu Tyr

115 120 125

Gly Asp Lys Tyr Thr Ala Arg Phe Leu Ile Thr Ala Val Gly Leu Leu

130 135 140

Ser Ala Pro Asn Trp Pro Asn Ile Lys Gly Ile Asn Gln Phe Lys Gly

145 150 155 160

Glu Leu His His Thr Ser Arg Trp Pro Asp Asp Val Ser Ile Glu Gly

165 170 175

Lys Arg Val Gly Val Ile Gly Thr Gly Ser Thr Gly Val Gln Val Ile

180 185 190

Thr Ala Val Ala Pro Leu Ala Lys His Leu Thr Val Phe Gln Arg Ser

195 200 205

Pro Gln Tyr Ser Val Pro Ile Gly Asn Asp Pro Leu Ser Glu Glu Asp

210 215 220

Val Lys Lys Ile Lys Asp Asn Tyr Asp Lys Ile Trp Asp Gly Val Lys

225 230 235 240

Asn Ser Ala Leu Ala Tyr Gly Val Asn Glu Ser Thr Val Pro Ala Met

245 250 255

Ser Val Ser Ala Glu Glu Arg Lys Ala Val Phe Glu Lys Ala Trp Gln

260 265 270

Thr Gly Gly Gly Met Arg Phe Met Phe Glu Thr Phe Gly Asp Ile Ile

275 280 285

Thr Asn Met Glu Ala Asn Ile Glu Ala Gln Asn Phe Ile Lys Gly Lys

290 295 300

Ile Ala Arg Ile Val Lys Asp Pro Ala Ile Ala Gln Lys Leu Met Pro

305 310 315 320

Gln Asp Leu Tyr Ala Cys Arg Pro Leu Cys Asp Ser Gly Tyr Tyr Asn

325 330 335

Thr Phe Asn Arg Glu Asn Val Arg Leu Glu Asp Val Lys Ala Asn Pro

340 345 350

Ile Val Glu Ile Thr Glu Asn Gly Val Lys Leu Glu Asn Gly Asp Phe

355 360 365

Val Glu Leu Asp Met Leu Ile Cys Ala Thr Gly Phe Asp Ala Gly Asp

370 375 380

Gly Ser Tyr Lys Arg Ile Asp Ile Gln Gly Lys Asn Gly Leu Ala Ile

385 390 395 400

Lys Asp Tyr Trp Lys Glu Gly Pro Ser Ser Tyr Met Gly Val Ala Val

405 410 415

Asn Asn Tyr Pro Asn Met Phe Met Val Phe Gly Pro Asn Gly Pro Leu

420 425 430

Ala Asn Ser Pro Pro Ile Ile Glu Ser Gln Val Glu Trp Ile Ser Val

435 440 445

Phe Ile Gln Tyr Thr Val Glu Asn Asn Val Glu Ser Ile Glu Ala Asp

450 455 460

Lys Glu Ala Glu Glu Gln Trp Thr Gln Thr Cys Ala Asn Ile Ala Glu

465 470 475 480

Lys Thr Leu Phe Pro Lys Ala Lys Cys Arg Ile Phe Gly Ala Asn Ile

485 490 495

Pro Gly Lys Lys Asn Thr Val Tyr Leu Tyr Leu Gly Gly Leu Lys Glu

500 505 510

Tyr Arg Ser Val Leu Ala Asn Cys Lys Asn His Ala Tyr Val Gly Phe

515 520 525

Asp Ile Gln Leu Gln Arg Ser Asp Thr Lys Gln Gln Ala Asn Ala

530 535 540

<210> 2

<211> 1632

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgagtacca agatggattt tgatgcaatt gtgatcggtg ccggctttgg cggcctgtat 60

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260 265 270

Thr Gly Gly Gly Met Arg Phe Met Phe Glu Thr Phe Gly Asp Ile Leu

275 280 285

Thr Asn Met Glu Ala Asn Ile Glu Ala Gln Asn Phe Ile Lys Gly Lys

290 295 300

Ile Ala Arg Ile Val Lys Asp Pro Ala Ile Ala Gln Lys Leu Met Pro

305 310 315 320

Gln Asp Leu Tyr Ala Cys Arg Pro Leu Cys Asp Ser Gly Tyr Tyr Asn

325 330 335

Thr Phe Asn Arg Glu Asn Val Arg Leu Glu Asp Val Lys Ala Asn Pro

340 345 350

Ile Val Glu Ile Thr Glu Asn Gly Val Lys Leu Glu Asn Gly Asp Phe

355 360 365

Val Glu Leu Asp Met Leu Ile Cys Ala Thr Gly Phe Asp Ala Gly Asp

370 375 380

Gly Asn Tyr Lys Arg Ile Asp Ile Gln Gly Lys Asn Gly Leu Ala Ile

385 390 395 400

Lys Asp Tyr Trp Lys Glu Gly Pro Ser Ser Tyr Met Gly Val Ala Val

405 410 415

Asn Asn Tyr Pro Asn Met Phe Met Val Phe Gly Pro Asn Gly Pro Leu

420 425 430

Ala Asn Thr Pro Pro Ile Ile Glu Ser Gln Val Glu Trp Ile Ser Val

435 440 445

Phe Ile Gln Tyr Thr Val Glu Asn Asn Val Glu Ser Ile Glu Ala Asp

450 455 460

Lys Glu Ala Glu Glu Gln Trp Thr Gln Thr Cys Ala Asn Ile Ala Glu

465 470 475 480

Lys Thr Leu Phe Pro Lys Ala Lys Cys Arg Ile Phe Gly Ala Asn Ile

485 490 495

Pro Gly Lys Lys Asn Thr Val Tyr Leu Tyr Leu Gly Gly Leu Lys Glu

500 505 510

Tyr Arg Ser Leu Leu Ala Asn Cys Lys Asn His Ala Tyr Leu Gly Phe

515 520 525

Asp Ile Gln Leu Gln Arg Ser Asp Ser Lys Gln Asn Ala Asn Ala

530 535 540

<210> 18

<211> 1632

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

atgagtacca agatggattt tgatgcaatt gtgatcggtg ccggctttgg cggcctgtat 60

gccgttaaaa aactgcgcga tgaactggaa ctgaaagtta aagcctttga taaagcaacg 120

gatgtgggcg ggacctggta ttggaatcgc tatccgggcg cactgacgga tacggaaacc 180

catctgtatt gctattcttg ggataaagaa atgctacaga gtttagaaat caaaaagaaa 240

tatgtgcagg gcccagatgt tcgcaaatac ttacagcagg ttgcagaaaa acatgatctg 300

aaaaaatctt atcagtttaa taccgccgtg agcagtgctc attataacga ggcggatgcc 360

ctgtgggaag tgacaaccga atatggcgat aaatataccg cacgctttct gattaccgcc 420

gtgggtctgc tgtctgcacc taattggcct aatatcaaag gcatcaatca gtttaaaggt 480

gaactgcatc atacgtcacg ctggccggat gatgtgagca tcgaaggcaa gagagtgggt 540

gtgatcggta cgggtagtac gggcgttcag gttattacag cagttgctcc attagccaaa 600

catctgaccg tgtttcagcg tagtccacag tatagtgttc cgatcggcaa tgatccactg 660

agcgaagaag atgttaagaa gattaaagat aattatgata aaatctggga tggtgtgaaa 720

aatagcgcct tagcctatgg tgtgaatgag tctacagttc cagccatgag cgtgagtgca 780

gaagaacgta aagccgtgtt tgaaaaggca tggcagacgg gtggcgggat gcgctttatg 840

tttgaaacct ttggggacat acttaccaat atggaagcta atatcgaagc acagaatttt 900

atcaaaggca aaattgcccg catcgttaaa gatcctgcca ttgcacagaa actgatgcct 960

caggatctgt atgcttgtcg cccgctgtgc gattcaggct attataatac ctttaatcgc 1020

gaaaatgttc gtctggaaga tgttaaagct aatccgatcg tggaaatcac cgaaaatggc 1080

gttaaactgg aaaatggcga ttttgtggaa ttagatatgc tgatttgcgc gaccggcttt 1140

gatgcgggcg atggcaacta caagcgcatc gacatacagg ggaaaaatgg cttagccatc 1200

aaagattatt ggaaagaagg tcctagtagc tatatgggcg ttgcggttaa caactatccg 1260

aatatgttta tggtttttgg tccgaatggt ccactggcca atactcctcc tatcatcgaa 1320

tctcaggttg agtggatttc agtgtttatc cagtataccg ttgaaaacaa tgttgaatct 1380

atcgaagccg ataaagaagc ggaagaacag tggacccaga cctgcgccaa tattgccgaa 1440

aaaaccctgt ttcctaaagc caaatgtcgc atctttggtg ccaatattcc gggcaagaaa 1500

aacacggtgt atctgtacct cggcggtctg aaagaatatc gtagcctttt agctaattgc 1560

aaaaatcatg cgtatttggg ctttgatatt cagttacagc gctcagattc caaacagaac 1620

gctaatgcgt aa 1632

Claims

1.一种将奥美拉唑硫醚催化转化成埃索美拉唑的环己酮单加氧酶，其特征在于，与SEQID NO:1相比，所述环己酮单加氧酶的氨基酸序列在以下至少一个位点发生基因突变：第386位丝氨酸Ser突变成天冬酰胺Asn，第435位丝氨酸Ser突变成苏氨酸Thr。

2.根据权利要求1所述的环己酮单加氧酶，其特征在于，所述氨基酸序列选自：SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17。

3.根据权利要求2所述的环己酮单加氧酶，其特征在于，编码所述氨基酸序列的环己酮单加氧酶基因的核苷酸序列分别相应选自：SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18。

4.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体携带权利要求1～3任一项所述的环己酮单加氧酶的表达基因。

5.一种基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株携带权利要求1～3任一项所述的环己酮单加氧酶的表达基因。

6.根据权利要求5所述的基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株为重组大肠杆菌基因工程菌株。

7.根据权利要求6所述的基因工程菌株，其特征在于，所述重组大肠杆菌基因工程菌株采用以下方法构建：以权利要求1～3任一项所述的环己酮单加氧酶基因片段为模板，通过在该基因片段两端加Nde I和BamH I内切酶片段进行PCR扩增扩展，并利用Nde I和BamH I内切酶位点将该基因片段插入至pET28a质粒中，连接获得携带所述环己酮单加氧酶基因的表达载体，然后将该表达载体转入大肠杆菌BL21中，即构建获得携带所述环己酮单加氧酶基因的重组大肠杆菌基因工程菌株。

8.根据权利要求7所述的基因工程菌株，其特征在于，所述PCR扩增扩展的引物如下：

正向引物F1：GGAATTCCATATGAGTACCAAGATGGATTTTGATGC；

反向引物R1：CGCGGATCCTTACGCATTAGCCTGCTGTTTGG。

9.一种将奥美拉唑硫醚催化转化成埃索美拉唑的方法，其特征在于，向反应体系中加入权利要求1～3任一项所述的环己酮单加氧酶，或者携带权利要求1～3任一项所述的环己酮单加氧酶的基因工程菌株，然后将奥美拉唑硫醚底物催化转化成埃索美拉唑。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述奥美拉唑硫醚底物的浓度高达165g/L。