CN113583985A

CN113583985A - 一种可以在毕赤酵母高效分泌的单加氧酶突变体及应用

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Publication number: CN113583985A
Application number: CN202110879522.3A
Authority: CN
Inventors: 郁惠蕾; 李亚静; 郑宇璁; 许建和; 潘江; 秦鹏
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2021-08-02
Filing date: 2021-08-02
Publication date: 2021-11-02
Anticipated expiration: 2041-08-02
Also published as: CN113583985B

Abstract

本发明涉及一种可以在毕赤酵母高效分泌的单加氧酶突变体及应用，该单加氧酶突变体是将如SEQ ID No.1所示氨基酸序列自N端第1位至X位氨基酸残基替换为SEQ ID No.2所示氨基酸序列第1位至X位氨基酸残基所形成的蛋白质，其中X为125‑135的整数；并在所形成如SEQ ID No.3的氨基酸序列的基础上，对一个或多个氨基酸残基发生突变得到多个性能更佳的单加氧酶突变体。本发明的单加氧酶突变体能在毕赤酵母中高效分泌表达，可直接使用发酵上清液作为酶促反应的催化剂，与大肠杆菌胞内重组表达的单加氧酶相比，本发明的单加氧酶获取简单，蛋白纯度高，避免了常规制备胞内酶的细胞破碎过程，并简化了下游分离提取过程，具有良好的工业应用前景。

Description

一种可以在毕赤酵母高效分泌的单加氧酶突变体及应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种单加氧酶突变体及其基因，含有该基因的重组表达质粒和重组表达转化体，所述单加氧酶突变体的制备，以及所述单加氧酶突变体在(S)-奥美拉唑合成中的应用。

背景技术

手性亚砜如(S)-5-甲氧基-2-[[(4-甲氧基-3,5-二甲基-2-吡啶基)甲基]亚磺酰基]-1H-苯并咪唑((S)-奥美拉唑，也称埃索美拉唑)是治疗胃食管反流性疾病的质子泵抑制剂。临床研究表明，只有(S)-构型的亚砜具备治疗效力，因而这类拉唑类药物的光学纯度对药物的药效有极其重要的影响。潜手性硫醚的不对称氧化是合成该类手性亚砜的重要制备方法。目前工业上制备亚砜常采用金属不对称氧化法(WO9118895；JP9971370)，但是也存在较多问题。例如，催化过程中用到大量的金属催化剂，过氧酸和有机溶剂对操作人员和环境影响较大；后处理工艺中用到萃取、干燥、过滤、浓缩等操作，操作较为繁琐；后处理过程中产生较多的三废；且化学催化剂常催化亚砜过度氧化为砜，而副产物砜的分离和去除是非常困难的。

生物催化硫醚的不对称氧化具备反应条件温和、化学及立体选择性高，仅产生副产物水等优点，近些年来成为新兴的手性亚砜绿色合成途径。在现有的生物催化不对称氧化硫醚产生亚砜的工具酶中，Baeyer-Villger单加氧酶(BVMO)是催化亚砜合成研究较多的一类酶，拥有高度的选择性和广泛的底物谱，在合成高附加值化学品、手性砌块以及大宗化学品等方面具有潜在的应用价值(ACS Catal.2019,9,11207-11241)。尽管天然BVMO对部分小位阻硫醚具备一定的活力和较优的立体选择性，但对于潜手性大位阻拉唑硫醚如奥美拉唑硫醚则没有活力或仅产生无效构型的产物(Appl.Microbiol.Biotechnol.2021,105,3169–3180)。

本申请发明人通过基因挖掘的方法获得了来源于醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)的环己酮单加氧酶(AcCHMO)，随后采用基于结构的理性设计和定向进化改造等多种策略，获得突变体AcCHMO_V6，实现了该酶底物偏好性由环己酮向奥美拉唑硫醚的偏转(ACS Sustainable Chem.Eng.2019,7,7218-7226；Biotechnol.Bioeng.2020,118,1–8；Mol.Catal.2021,509,111625)，并实现了反应的中试过程放大(Org.Process Res.Dev.2020,24,1124-1130)。

尽管生物催化奥美拉唑硫醚不对称氧化已经取得了一定的进展，但目前已有的BVMO整细胞催化奥美拉唑硫醚氧化活力相对较低，在催化过程中通常需要将大肠杆菌胞内表达的单加氧酶纯化制备为纯酶以求提高添加量，操作繁琐；或需要将细胞破碎制备为粗酶液，由于粗酶液含有较多胞内杂质如核酸等，反应后处理萃取过程存在严重的乳化。另一方面，由于大肠杆菌本身为条件致病菌，其细胞膜含有内毒素，限制了其在目标反应产物为食药相关分子生产中的应用。作为发展成熟的食药安全宿主，毕赤酵母(Pichia pastoris)具有生长周期短，易于大规模高密度发酵、对蛋白具备简单的翻译后修饰和成熟的跨膜分泌系统等优势。目前，尚无任何利用毕赤酵母分泌表达BVMO的报道。

发明内容

针对目前已知的具备大位阻拉唑硫醚氧化活力的单加氧酶只能在大肠杆菌胞内表达的问题，本发明提供一种可以分泌表达单加氧酶的毕赤酵母重组菌株；并针对AcCHMO_V6在毕赤酵母分泌水平过低的问题，提供新型单加氧酶突变体及其编码基因序列，含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，可高效分泌表达该单加氧酶突变体的重组毕赤酵母转化体培养物的制备方法，以及该单加氧酶突变体或重组转化体培养物在催化大位阻芳香醛拉唑硫醚不对称氧化中的应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本申请发明人将AcCHMO_V6及文献报道的经典黄素单加氧酶(CHMO_Aciento,Eur JBiochem 1976,63,175-192)基因导入毕赤酵母后发现，AcCHMO_V6在毕赤酵母酵母的分泌上清中表达量极低，而CHMO_Aciento实现了较高的表达水平。遗憾的是CHMO_Aciento本身并无催化拉唑硫醚的活力。

其中，AcCHMO_V6的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，对应的碱基序列如SEQ ID No.4所示；

CHMO_Acineto的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，对应的碱基序列如SEQ ID No.5所示。

本发明采取的技术方案之一是：

本发明的提供一种单加氧酶嵌合突变体，即提供一种分离的蛋白质，是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)将如SEQ ID No.1所示氨基酸序列自N端第1位至X位氨基酸残基替换为SEQ IDNo.2所示氨基酸序列第1位至X位氨基酸残基所形成的蛋白质，其中X为125、126、127、128、129、130、131、132、133、134或135；

(b)将(a)中的一个或多个氨基酸残基替换为其他氨基酸残基所形成的新氨基酸序列对应的蛋白质。

在本发明的一个实施方式中，单加氧酶嵌合突变体为将如SEQ ID No.1所示氨基酸序列的前130位氨基酸序列更改为SEQ ID No.2所示氨基酸序列的前130位氨基酸所形成的新氨基酸序列对应的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，命名为AcCHMO_H6，对应的碱基序列如SEQ ID No.6所示。

在本发明的一个实施方式中，进一步，本发明提供多种较佳的单加氧酶突变体，其是由下述任一氨基酸序列组成的蛋白质：

(1)将如SEQ ID No.3所示氨基酸序列的第3位谷氨酰胺替换为苏氨酸；

(2)将如SEQ ID No.3所示氨基酸序列的第3位谷氨酰胺替换为苏氨酸，第111位谷氨酰胺替换为苏氨酸；

(3)将如SEQ ID No.3所示氨基酸序列的第3位谷氨酰胺替换为苏氨酸，第43位丙氨酸替换为甘氨酸，第111位谷氨酰胺替换为苏氨酸。

(4)将如SEQ ID No.3所示氨基酸序列的第3位谷氨酰胺替换为苏氨酸，第14位甘氨酸替换为丙氨酸，第71位亮氨酸替换为甲硫氨酸。

(5)将如SEQ ID No.3所示氨基酸序列的第3位谷氨酰胺替换为苏氨酸，第14位甘氨酸替换为丙氨酸，第43位丙氨酸替换为甘氨酸，第71位亮氨酸替换为甲硫氨酸。

(6)将如SEQ ID No.3所示氨基酸序列的第3位谷氨酰胺替换为苏氨酸，第14位甘氨酸替换为丙氨酸，第43位丙氨酸替换为甘氨酸，第71位亮氨酸替换为甲硫氨酸，第111位谷氨酰胺替换为苏氨酸。

(7)将如SEQ ID No.3所示氨基酸序列的第3位谷氨酰胺替换为苏氨酸，第14位甘氨酸替换为丙氨酸，第43位丙氨酸替换为甘氨酸，第71位亮氨酸替换为甲硫氨酸，第111位谷氨酰胺替换为苏氨酸，第120位丙氨酸变成苏氨酸。

(8)将如SEQ ID No.3所示氨基酸序列的第3位谷氨酰胺替换为苏氨酸，第14位甘氨酸替换为丙氨酸，第43位丙氨酸替换为甘氨酸，第55位亮氨酸替换酪氨酸，第71位亮氨酸替换为甲硫氨酸，第111位谷氨酰胺替换为苏氨酸，第120位丙氨酸替换成苏氨酸。

本发明所述蛋白质的制备方法为本领域常规制备方法。所述制备方法较佳的为：将编码所述突变体蛋白质的核酸分子克隆到重组载体，将所得重组载体转化到转化体中，得到重组表达转化体，通过培养所得的重组表达转化体，即可分离获得所述的蛋白质。所述制备方法也可以通过人工合成蛋白质的序列获得。

本发明的技术方案之二是：

本发明提供一种分离的核酸，所述核酸是编码上述蛋白质的核酸分子。

在本发明的一个实施方式中，所述核酸的制备方法为本领域常规制备方法，所述制备方法较佳的包括：通过基因克隆技术如融合PCR与易错PCR或者通过人工全序列合成的方法得到编码单加氧酶突变体基因的核酸分子。

如本领域技术人员所知：编码SEQ ID No.3的氨基酸序列的碱基序列可以通过适当引入替换、确实、改变、插入或增加来提供一个多聚核苷酸的同系物。本发明中多聚核苷酸的同系物可以通过对编码该蛋白序列基因的一个或者多个碱基在保持酶活性的范围内进行替换、缺失或增加来制备获得。

在本发明的一个实施方式中，所述核酸分子的制备方法为本领域常规的制备方法，所述制备方法较佳的为：以单加氧酶AcCHMO_V6和CHMO_Aciento的基因序列为模板，利用含有重叠区域的引物，通过PCR方法将如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的前125至135位氨基酸残基编码碱基替换为SEQ ID No.2所示氨基酸序列的对应氨基酸的编码碱基并扩增，即得到单加氧酶嵌合突变体蛋白的编码核酸分子。进而，采用易错PCR技术对如SEQ ID No.3所示氨基酸序列的前130位区域进行随机突变，进一步得到含有点突变的核酸分子，其中所述含有突变点的突变引物为本领域常用的引物，只要能通过一般基因工程手段技术将SEQ IDNo.3的氨基酸残基序列突变为本发明所需氨基酸残基即可。

在本发明的一个实施方式中，所述含有突变点的引物的制备方法为本领域常规制备方法，较佳的为人工合成。利用所得PCR引物进行PCR扩增程序，即可得到编码所述单加氧酶突变体的核酸分子。

在本发明的一个实施方式中，所述PCR扩增为本领域常规技术，其中所述PCR反应的体系(20μL)较佳的为：上述模板20～50ng，上游/下游突变引物各1μL(10μM)，10μLPrimeStar mix，灭菌双蒸水补足体系至20μL。

在本发明的一个实施方式中，所述PCR扩增的程序较佳的为：(1)94℃变性3min；(2)98℃变性10s；(3)53～55℃退火20s；(4)72℃延伸5min 30s；步骤(2)～(4)共延伸16个循环，最后72℃延伸10min，4℃保藏产物。

本发明采取的技术方案之三是：

本发明提供一种包含上述核酸的重组表达载体。

在本发明的一个实施方式中，所述重组表达载体可通过本领域常规方法获得，即将本发明所述的单加氧酶基因突变体的核酸分子连接于各种表达载体上构建而成。所述的表达载体为本领域常规的各种载体；较佳的，所述载体包括但不限于各种质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体，优选为质粒pPICZαA。

本发明采取的技术方案之四是：

本发明提供一种包含上述重组表达载体的重组表达转化体。

在本发明的一个实施方式中，所述表达转化体的制备方法为：将上述重组表达载体转化至宿主微生物细胞中制得。

在本发明的一个实施方式中，所述的宿主微生物为本领域常规的微生物宿主，只要能满足上述重组表达载体中的表达框能正常行使功能，且所携带的基因可被有效表达并分泌至胞外即可。进一步，所述微生物宿主为：毕赤酵母(Pichia pastoris)，优选为毕赤酵母X33或毕赤酵母GS115。将前述重组表达质粒转化至Pichia pastoris X33中，即可获得本发明优选的基因工程菌株。

在本发明的一个实施方式中，所述转化方法为本领域常规转化方法，优选为为电击转化或原生质体融合法。

本发明采取的技术方案之五是：

本发明提供一种重组单加氧酶的制备方法，其中包括如下步骤：培养上述的重组表达转化体，从培养物中获得重组单加氧酶。

在本发明的一个实施方式中，所述制备方法为：将上述重组毕赤酵母接种至含有氨苄青霉素(100μg/mL)的BMGY液体培养基(蛋白胨：20g/L，酵母提取物：10g/L，甘油：10g/L，无氨基酸酵母氮源：13.6g/L，生物素：0.4mg/L，终浓度为200mM的磷酸钾缓冲盐，pH 6.0)中，25～30℃，200rpm培养，培养液的吸光密度OD₆₀₀达到1.0～2.0(优选1.5)，离心收集菌体，重悬于BMMY液体培养基(蛋白胨：20g/L，酵母提取物：10g/L，甲醇：15mL/L，无氨基酸酵母氮源：13.6g/L，生物素：0.4mg/L，终浓度为200mM的磷酸钾缓冲盐，pH 6.0)进行计时诱导，于诱导24、48、72小时补加纯甲醇至终浓度0.5～2％(优选地为1.5％，v/v)，连续诱导80h即可得到高效表达的重组单加氧酶。

本发明采取的技术方案之六是：

本发明使用上述蛋白质或上述重组表达转化体的培养物或分泌上清作为催化剂，在催化大位阻潜手性拉唑硫醚合成光学纯亚砜中的应用。

在本发明的一个实施方式中，所述大位阻芳基取代醛的化学式如式1所示：

在本发明的一个实施方式中，所述应用方法包括以下步骤：使用所述单加氧酶突变体或所述重组表达转化体的培养物或分泌上清作为催化剂，催化所述拉唑类硫醚亚砜化反应，然后从反应液中提取、纯化获得高光学纯度的手性亚砜。

在本发明的一个实施方式中，较佳的，上述应用的一种操作方式为：

所述不对称氧化反应条件为：硫醚浓度为0.1～0.3g/L，反应温度为25～30℃，不对称还原反应中额外添加甲酸脱氢酶，甲酸钠，辅酶NADP⁺或NADPH；

所述甲酸脱氢酶的用量为37～110U/g潜手性拉唑硫醚化合物；

所述甲酸钠的用量为0.68～1.1g/g潜手性拉唑硫醚化合物；

所述辅酶NADPH或NADP⁺的用量为0.1～0.2mM。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

与现有技术相比，本发明的积极进步效果在于：

(1)与大肠杆菌胞内表达的AcCHMO相比，本发明公开的单加氧酶突变体可直接被毕赤酵母分泌至培养物中，其蛋白纯度高，可直接用于大位阻拉唑硫醚的氧化反应。

(2)与已知单加氧酶相比，本发明所述的单加氧酶突变体在兼顾大位阻硫醚单加氧酶不对称氧化活力的情况下，显著提高了在毕赤酵母的分泌表达量，使用重组毕赤酵母分泌上清催化奥美拉唑硫醚的不对称氧化反应，底物浓度为0.3g/L时，20h的转化率由母本的0.68％提升达到了89％。本发明的多个单加氧酶突变体均可被毕赤酵母分泌表达，含有单加氧酶突变体的上清可催化合成手性药物埃索美拉唑，具有很好的工业应用前景。

附图说明

图1为重组单加氧酶嵌合突变体及后续点突变体的构建示意图。

图2为毕赤酵母高产单加氧酶突变体高通量筛选示意图。

图3为单加氧酶突变体AcCHMO_H6-M8催化奥美拉唑硫醚氧化。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1

单加氧酶嵌合体的制备

首先基于AcCHMO_V6与CHMO_Acineto的氨基酸序列进行比对，根据N端序列一致性，将如SEQ ID No.1所示氨基酸序列的前X位氨基酸序列更改为SEQ ID No.2所示氨基酸序列的前X位氨基酸所形成的新氨基酸序列对应的蛋白质，X＝125、126、127、128、129、130、131、132、133、134或135；得到序列替换的嵌合体(AcCHMO_HN,N＝1～11)。

设计含有二者重叠区域的突变引物，将SEQ ID No.1自N端起的特定长度的氨基酸序列替换为SEQ ID No.3中相应的氨基酸序列。

其中，重组pPICZαA-AcCHMO _HX(X＝1～11)单加氧酶嵌合突变体构建如图1所示。

PCR反应体系I(20μL)：模板(pPICZαA-CHMO_Aciento)20～50ng，一对突变引物各1μL(10μM)，10μL PrimeStar mix，灭菌双蒸水补足体系至20μL。

PCR反应体系II(20μL)：模板(pPICZαA-AcCHMO_V6)20～50ng，一对突变引物各1μL(10μM)，10μL PrimeStar mix，灭菌双蒸水补足体系至20μL。

PCR反应程序：(1)94℃变性3min；(2)98℃变性10s；(3)53～55℃退火20s；(4)对于PCR反应体系I，72℃延伸3min 40s，对于PCR反应体系II，则在72℃延伸1min 30s；步骤(2)～(4)共延伸16个循环，最后72℃延伸10min，4℃保藏产物。

PCR产物经通过限制性内切酶Dpn I酶切后，通过琼脂糖凝胶核酸电泳分别切胶回收，采用ClonExpress一步法定向克隆试剂盒连接质粒，将反应产物转化至大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞，并均匀涂布于含有50μg/mL博来霉素的低盐LLB培养基(蛋白胨：10g/L，酵母提取物：5g/L，氯化钠：5g/L，琼脂粉：20g/L)琼脂平板。37℃培养20h后，挑选单克隆，即得到含有嵌合体表达质粒的E.coli DH5α菌株，送上海赛因生物科技有限公司进行测序分析。测序结果用ClustalX软件与AcCHMO_V6和CHMO_Acineto编码基因序列进行比对，确认嵌合突变完成后，用Qiagen小量质粒抽提试剂盒从含突变体质粒的E.coli DH5α菌株中提取质粒。所得质粒经限制性内切酶Sac I于37℃线性化后，经Qiagen PCR产物纯化试剂盒回收，电击转化毕赤酵母X33感受态细胞，并均匀涂布于含有50μg/mL博来霉素的YPD培养基琼脂平板(蛋白胨：20g/L，酵母提取物：10g/L，葡萄糖：20g/L，琼脂粉：20g/L)，28℃培养48h，挑取单克隆，即得到表达不同单加氧酶嵌合突变体的表达菌株。

实施例2

单加氧酶嵌合体点突变

采用易错PCR技术对如SEQ ID No.3所示氨基酸序列的单加氧酶突变体AcCHMO_H6的前130个氨基酸进行随机突变。

以实施例1中所得单加氧酶嵌合体的重组载体作为模板，设计引物对其前130个氨基酸进行易错PCR，所使用的引物如表1所示：

表1.制备单加氧酶嵌合体点突变体的引物

名称	序列(5’→3’)
		130-FP	GAGGCTGAAACTGCAGGAATTC
130-RP	TCAGGAAACGCGCGGTAAACTT
		pPICZαA-FP	AAGTTTACCGCGCGTTTCCTGA
pPICZαA-RP	GAATTCCTGCAGTTTCAGCCTC

其中，重组pPICZαA-AcCHMO_H6点突变体的构建如图1所示，突变体高通量筛选方法如图2所示。

以pPICZαA-AcCHMO_H6为模板，用rTaq DNA聚合酶进行易错PCR，构建随机突变库。PCR体系(50μL)：rTaq DNA聚合酶0.5μl，10×PCR buffer(Mg²⁺Plus)5.0μl，dNTP Mixture(各2.0mM)4.0μl，终浓度为150μmol/L的MnCl₂，pPICZαA-AcCHMO_H6质粒100ng，上下游引物130-FP/130-RP(10μM)各2μl，加灭菌蒸馏水补足至50μl。PCR反应程序：(1)95℃预变性5min；(2)94℃变性30s；(3)58℃退火30s；(4)72℃延伸40s；步骤(2)～(4)共进行30个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存产物。另取pPICZαA-CHMO_Acineto为模板，用高保真PrimeSTARPremix体系进行扩增质粒，PCR体系(30μL)：模板20～50ng，引物pPICZαA-FP/pPICZαA-RP各1.5μL(10μM)，15μL PrimeStar mix，灭菌双蒸水补足体系至30μL。PCR反应程序：(1)95℃预变性3min；(2)98℃变性10s；(3)55℃退火30s；(4)72℃延伸3min 40s；步骤(2)～(4)共进行30个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存产物。将前述PCR产物经限制性内切酶Dpn I酶切消化模板，利用ClonExpress一步法定向克隆试剂盒连接扩增质粒，反应产物转化大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞，并均匀涂布于含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂平板上，置于37℃培养箱中静置培养约12h，并均匀涂布于含有50μg/mL博来霉素的低盐LLB培养基(蛋白胨：10g/L，酵母提取物：5g/L，氯化钠：5g/L，琼脂粉：20g/L)琼脂平板。37℃培养20h后，用生理盐水收集平板上菌落，利用Qiagen小量质粒抽提试剂盒从收集的菌体中提取质粒。所得质粒经限制性内切酶Sac I于37℃线性化后，经Qiagen PCR产物纯化试剂盒回收，电击转化毕赤酵母X33感受态细胞并均匀涂布于含有300μg/mL博来霉素的YPD培养基琼脂平板(蛋白胨：20g/L，酵母提取物：10g/L，葡萄糖：20g/L，琼脂粉：20g/L)，28℃培养48h，分别挑取单菌落于含50μg/mL博来霉素的YPD培养基液体培养基(蛋白胨：20g/L，酵母提取物：10g/L，葡萄糖：20g/L)的384孔深孔板中，于30℃，300rpm培养24h，吸取1μL培养液整齐点种于悬浮了奥美拉唑硫醚的基础盐固体培养基(蛋白胨：20g/L，酵母提取物：10g/L，无氨基酸酵母氮源(YNB,BD Difco)：13.6g/L，生物素：0.4mg/L，终浓度为200mM的磷酸钾缓冲盐，pH 6.5，奥美拉唑硫醚：1mM，DMSO：2％)中，点毕，待菌液被培养基吸收后，将培养基的盖板上注入7mL纯甲醇，体系倒置培养48h。挑取具有显著透明圈的单菌落接种于含有4mL YPD培养基(蛋白胨：20g/L，酵母提取物：10g/L，葡萄糖：20g/L，琼脂粉：20g/L)的试管中，于30℃，300rpm培养24h。收集2mL菌液于2mL EP管，于8000×g室温离心1min，弃上清，加入100mg陶瓷珠(Φ1mm)和0.5mL TE缓冲液(tris-HCl,20mM,10mM EDTA,pH 8.0)，室温涡旋1min，冰上冷却1min，重复十次，于8000×g室温离心1min。所得上清即为含有酵母基因组的裂解液模板。利用PrimeStar Premix扩增突变片段进行测序，反应体系(30μL)：模板2μL，引物130-FP/130各1.5μL(10μM)，15μL PrimeStar mix，灭菌双蒸水补足体系至30μL。PCR反应程序：(1)95℃预变性3min；(2)98℃变性10s；(3)55℃退火30s；(4)72℃延伸3min 40s；步骤(2)～(4)共进行30个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存产物。将PCR产物经琼脂糖凝胶核酸电泳后切胶回收，送上海赛因生物科技有限公司进行测序分析。测序结果用ClustalX软件与CHMO_Acineto编码自N端起至第130氨基酸的基因序列进行比对，确认突变位点。对重组酵母阳性菌株进行摇瓶发酵复筛验证。

通过筛选，发现将单加氧酶嵌合突变体AcCHMO_H6的第3位谷氨酰胺替换为苏氨酸，第14位甘氨酸替换为丙氨酸，第43位丙氨酸替换为甘氨酸，第55位亮氨酸替换酪氨酸，为第71位亮氨酸替换为甲硫氨酸，第111位谷氨酰胺替换为苏氨酸，第120位丙氨酸变成苏氨酸的优选突变体，其毕赤酵母的分泌上清催化奥美拉唑硫醚氧化的活力显著提高。

实施例3

重组单加氧酶突变体的表达

将实施例2中所得突变体的表达菌株接种于含有100μg/mL博来霉素的YPD液体培养基(蛋白胨：20g/L，酵母提取物：10g/L，葡萄糖：20g/L)中，于30℃，250rpm震荡培养24h，按1％的接种量接种至100ml含有100μg/mL氨苄青霉素的BMGY液体培养基(蛋白胨：20g/L，酵母提取物：10g/L，甘油：10g/L，无氨基酸酵母氮源(YNB,BD Difco)：13.6g/L，生物素：0.4mg/L，终浓度为200mM的磷酸钾缓冲盐，pH 6.0)中，置于30℃，250rpm摇床中培养，当培养液的光浊度OD₆₀₀达到1.5时，停止培养，离心收集酵母细胞，小心倾倒出BMGY培养基上清，然后将收集的菌体用100ml的BMMY培养基(甲醇：10ml/L，蛋白胨：20g/L，酵母提取物：10g/L，生物素：0.4mg/L，无氨基酸酵母氮源13.6g/L，终浓度为100mM的磷酸钾缓冲盐，pH 6.0)重新悬浮，置于30℃，250rpm摇床中继续培养，每24h添加1.5ml的纯甲醇进行诱导，持续培养、诱导72h，培养过程中定期吸取培养液，离心后取上清，进行奥美拉唑硫醚的氧化活力测定，监控单加氧酶的表达。培养结束后，将培养液于4℃、8000×g离心后去除菌体，得酵母分泌上清。

实施例4

单加氧酶氧化奥美拉唑硫醚反应转化率的测定

在2mL圆底离心管内进行硫醚氧化反应，恒温振荡器控制温度在25℃，振荡频率为1000rpm。500μL反应体系中加入50μL酵母分泌上清，甲酸钠的终浓度为100mM，辅酶NADP⁺的浓度为0.1mM，BstFDH粗酶粉的添加量是12.5U/L，奥美拉唑硫醚0.2g/L，助溶剂甲醇的添加量为2％。反应12h和20h时取样，向体系中加等量体积乙酸乙酯萃取，经无水硫酸钠干燥后以装有大赛璐CHIRALPAK IA柱的高效液相色谱仪(岛津)进行分析。流动相为乙醇/正庚烷＝3/7，流速为1mL/min，柱温为40℃，在300nm处检测反应过程中的奥美拉唑硫醚、(S)-奥美拉唑、(R)-奥美拉唑的含量；其保留时间依次为6.2min、12min和16.9min。实施例1各嵌合体的催化反应结果见表2，实施例2在嵌合体AcCHMO_H6基础上的点突变体催化反应结果见表3。

表2.重组硫醚单加氧酶嵌合突变体催化氧化奥美拉唑硫醚反应的结果

突变体名称	替换氨基酸残基位置	12h转化率(％)	20h转化率(％)	Ee值(％)
					AcCHMO<sub>V6</sub>	-	0.42	0.68	>99
CHMO<sub>Acineto</sub>	-	0	0	-
					AcCHMO<sub>H1</sub>	1-125	0.68	0.92	>99
AcCHMO<sub>H2</sub>	1-126	1.3	1.8	>99
					AcCHMO<sub>H3</sub>	1-127	2.1	2.8	>99
AcCHMO<sub>H4</sub>	1-128	3.7	4.9	>99
					AcCHMO<sub>H5</sub>	1-129	4.5	4.7	>99
AcCHMO<sub>H6</sub>	1-130	5.9	6.5	>99
					AcCHMO<sub>H7</sub>	1-131	1.8	2.9	>99
AcCHMO<sub>H8</sub>	1-132	0.98	1.08	>99
					AcCHMO<sub>H9</sub>	1-133	0.87	0.92	>99
AcCHMO<sub>H10</sub>	1-134	0.58	0.86	>99
					AcCHMO<sub>H11</sub>	1-135	0.41	0.61	>99

AcCHMO_H1是指将如SEQ ID No.1所示氨基酸序列的前125位氨基酸序列更改为SEQID No.2所示氨基酸序列的前125位氨基酸所形成的新氨基酸序列对应的蛋白质；AcCHMO_H2是指将如SEQ ID No.1所示氨基酸序列的前126位氨基酸序列更改为SEQ ID No.2所示氨基酸序列的前126位氨基酸所形成的新氨基酸序列对应的蛋白质；AcCHMO_H3是指将如SEQ IDNo.1所示氨基酸序列的前127位氨基酸序列更改为SEQ ID No.2所示氨基酸序列的前127位氨基酸所形成的新氨基酸序列对应的蛋白质；AcCHMO_H4是指将如SEQ ID No.1所示氨基酸序列的前128位氨基酸序列更改为SEQ ID No.2所示氨基酸序列的前128位氨基酸所形成的新氨基酸序列对应的蛋白质；AcCHMO_H5是指将如SEQ ID No.1所示氨基酸序列的前129位氨基酸序列更改为SEQ ID No.2所示氨基酸序列的前129位氨基酸所形成的新氨基酸序列对应的蛋白质；AcCHMO_H6是指将如SEQ ID No.1所示氨基酸序列的前130位氨基酸序列更改为SEQID No.2所示氨基酸序列的前130位氨基酸所形成的新氨基酸序列对应的蛋白质；AcCHMO_H7是指将如SEQ ID No.1所示氨基酸序列的前131位氨基酸序列更改为SEQ ID No.2所示氨基酸序列的前131位氨基酸所形成的新氨基酸序列对应的蛋白质；AcCHMO_H8是指将如SEQ IDNo.1所示氨基酸序列的前132位氨基酸序列更改为SEQ ID No.2所示氨基酸序列的前132位氨基酸所形成的新氨基酸序列对应的蛋白质；AcCHMO_H9是指将如SEQ ID No.1所示氨基酸序列的前133位氨基酸序列更改为SEQ ID No.2所示氨基酸序列的前133位氨基酸所形成的新氨基酸序列对应的蛋白质；AcCHMO_H10是指将如SEQ ID No.1所示氨基酸序列的前134位氨基酸序列更改为SEQ ID No.2所示氨基酸序列的前134位氨基酸所形成的新氨基酸序列对应的蛋白质；AcCHMO_H11是指将如SEQ ID No.1所示氨基酸序列的前135位氨基酸序列更改为SEQ ID No.2所示氨基酸序列的前135位氨基酸所形成的新氨基酸序列对应的蛋白质。

表3嵌合点突变体毕赤酵母分泌上清催化氧化奥美拉唑硫醚反应的结果

实施例5

单加氧酶突变体酵母分泌上清浓缩液的制备

将实施例3中获得的酵母上清以0.22μm孔径的微滤膜微滤，于4℃以截留分子量为30kDa的超滤膜超滤浓缩，并以磷酸钾缓冲液(100mM,pH 8.0)反复置换，浓缩至10mg/mL蛋白浓度。

实施例6

单加氧酶突变体AcCHMO_H6-M8催化奥美拉唑硫醚氧化

1L反应器中反应液共0.6L，设置温度为25℃、搅拌转速为150rpm。反应体系中奥美拉唑硫醚底物浓度为0.3g/L，助溶剂甲醇的添加量为10％，甲酸钠的终浓度为10mM，辅酶NADP⁺的浓度为0.2mM；AcCHMO_H6-M8投入酶活为15U，甲酸脱氢酶的添加量为15U。通空气速率保持在0.5vvm。反应过程中间歇取样，待底物转化99％以上时，结束反应。反应结果如图3所示。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华东理工大学

<120> 一种可以在毕赤酵母高效分泌的单加氧酶突变体及应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 542

<212> PRT

<213> 醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)

<400> 1

Met Thr Gln Lys Met Asp Phe Asp Ala Ile Ile Ile Gly Ala Gly Phe

1 5 10 15

Gly Gly Leu Tyr Gly Leu Lys Lys Leu Arg Asp Asp Leu Asn Leu Lys

20 25 30

Val Arg Ala Phe Asp Arg Ala Thr Glu Val Gly Gly Thr Trp Phe Trp

35 40 45

Asn Gln Tyr Pro Gly Ala Tyr Ser Asp Ser Glu Thr His Leu Tyr Cys

50 55 60

Tyr Ser Trp Asp Lys Gly Leu Leu Gln Glu Met Glu Ile Lys Arg Lys

65 70 75 80

Tyr Ile Ser Gln Pro Asp Val Leu Ala Tyr Leu Lys Arg Val Ala Asp

85 90 95

Lys His Asp Leu Arg Lys Asp Ile Gln Phe Glu Thr Gly Ile Arg Ser

100 105 110

Ala Tyr Phe Asp Glu Glu Asn Ser Phe Trp Asn Val Thr Thr Glu Asn

115 120 125

Asp Glu Lys Phe Thr Ala Arg Phe Leu Ile Thr Ala Leu Gly Pro Leu

130 135 140

Ala Ala Pro Asn Leu Pro Lys Ile Lys Gly Ile Glu Thr Phe Lys Gly

145 150 155 160

Glu Leu His His Thr Ser Arg Trp Pro Lys Asp Val Thr Phe Ser Gly

165 170 175

Lys Arg Val Gly Val Ile Gly Thr Ser Ser Thr Gly Val Gln Val Ile

180 185 190

Thr Ala Ile Ala Ser Gln Val Lys His Leu Thr Val Phe Gln Arg Ser

195 200 205

Ala Gln Tyr Ser Val Pro Ile Gly Asn Val Val Met Ser Glu Thr Asp

210 215 220

Val Ala Lys Ile Lys Glu Asn Tyr Asp Gln Ile Trp Glu Asn Val Trp

225 230 235 240

Asn Ser Ala Leu Gly Tyr Gly Leu Asn Glu Ser Thr Leu Pro Thr Met

245 250 255

Ser Val Ser Ala Glu Glu Arg Asp Lys Ile Phe Glu Lys Ala Trp Gln

260 265 270

Glu Gly Gly Gly Leu Arg Phe Met Phe Glu Thr Phe Gly Asp Ile Ala

275 280 285

Val Asp Glu Thr Ala Asn Ile Glu Ala Gln Asn Phe Ile Lys Lys Lys

290 295 300

Ile Ser Glu Ile Val Lys Asp Pro Phe Val Ala Lys Lys Leu Thr Pro

305 310 315 320

Thr Asp Leu Tyr Ala Cys Arg Pro Leu Cys Asp Ser Gly Tyr Tyr Glu

325 330 335

Ile Phe Asn Arg Asp Asn Val Ser Leu Glu Asp Val Lys Ala Asn Pro

340 345 350

Ile Val Glu Ile Lys Glu Asp Cys Val Val Thr Ala Asp Gly Val Glu

355 360 365

His Lys Leu Asp Met Leu Ile Cys Ala Thr Gly Phe Asp Ala Val Asp

370 375 380

Gly Ser Tyr Lys Arg Ile Asp Ile Arg Gly Lys Asp Gly Ile Ser Ile

385 390 395 400

Lys Asp His Trp Lys Asp Gly Pro Asn Ser Tyr Leu Gly Met Met Val

405 410 415

Ser Asn Phe Pro Asn Met Phe Met Val Phe Gly Pro Asn Gly Pro Leu

420 425 430

Ala Asn Ser Pro Pro Ile Ile Glu Thr Gln Val Glu Trp Ile Ala Asp

435 440 445

Leu Ile Gly Tyr Ala Glu Asp His Gln Ile Asn Gln Ile Glu Ala Thr

450 455 460

Lys Asp Ala Val Asp Asn Trp Thr Asn Thr Cys Ser Asp Ile Ala Asn

465 470 475 480

Lys Thr Leu Phe Ala Lys Ala Lys Cys Arg Ile Phe Gly Ala Asn Val

485 490 495

Ser Gly Lys Lys Asn Thr Val Tyr Leu Tyr Met Gly Gly Leu Lys Glu

500 505 510

Tyr Arg Asn Gln Ile Ser Glu Val Ala Asn Asn Asn Tyr Lys Gly Cys

515 520 525

Leu Leu Lys Gln Ser Val Lys Lys Thr Asn Leu Ile Glu Ser

530 535 540

<210> 2

<211> 543

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ser Gln Lys Met Asp Phe Asp Ala Ile Val Ile Gly Gly Gly Phe

1 5 10 15

Gly Gly Leu Tyr Ala Val Lys Lys Leu Arg Asp Glu Leu Glu Leu Lys

20 25 30

Val Gln Ala Phe Asp Lys Ala Thr Asp Val Ala Gly Thr Trp Tyr Trp

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Asn Arg Tyr Pro Gly Ala Leu Thr Asp Thr Glu Thr His Leu Tyr Cys

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Tyr Val Gln Gly Pro Asp Val Arg Lys Tyr Leu Gln Gln Val Ala Glu

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100 105 110

Ala His Tyr Asn Glu Ala Asp Ala Leu Trp Glu Val Thr Thr Glu Tyr

115 120 125

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145 150 155 160

Glu Leu His His Thr Ser Arg Trp Pro Asp Asp Val Ser Phe Glu Gly

165 170 175

Lys Arg Val Gly Val Ile Gly Thr Gly Ser Thr Gly Val Gln Val Ile

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275 280 285

Thr Asn Met Glu Ala Asn Ile Glu Ala Gln Asn Phe Ile Lys Gly Lys

290 295 300

Ile Ala Glu Ile Val Lys Asp Pro Ala Ile Ala Gln Lys Leu Met Pro

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Gln Asp Leu Tyr Ala Lys Arg Pro Leu Cys Asp Ser Gly Tyr Tyr Asn

325 330 335

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340 345 350

Ile Val Glu Ile Thr Glu Asn Gly Val Lys Leu Glu Asn Gly Asp Phe

355 360 365

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Gly Asn Tyr Val Arg Met Asp Ile Gln Gly Lys Asn Gly Leu Ala Met

385 390 395 400

Lys Asp Tyr Trp Lys Glu Gly Pro Ser Ser Tyr Met Gly Val Thr Val

405 410 415

Asn Asn Tyr Pro Asn Met Phe Met Val Leu Gly Pro Asn Gly Pro Phe

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<210> 3

<211> 542

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Ser Gln Lys Met Asp Phe Asp Ala Ile Val Ile Gly Gly Gly Phe

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Val Gln Ala Phe Asp Lys Ala Thr Asp Val Ala Gly Thr Trp Tyr Trp

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275 280 285

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Leu Leu Lys Gln Ser Val Lys Lys Thr Asn Leu Ile Glu Ser

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<210> 4

<211> 1629

<212> DNA

<213> 醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)

<400> 4

atgacccaaa agatggactt tgacgccatt attattggtg ccggttttgg tggtttgtac 60

ggtttgaaga agttgagaga cgatttgaac ttgaaggtta gagcctttga tagagccact 120

gaagttggtg gtacttggtt ttggaatcaa taccctggtg cttatagtga tagtgaaact 180

catttgtact gttactcttg ggataagggt ttgttgcagg aaatggagat taaaagaaag 240

tatatctccc aacctgatgt tttggcttac ttgaagagag tcgccgataa gcatgacctt 300

agaaaggata ttcaatttga aactggtatc agatctgctt actttgatga agaaaactct 360

ttttggaacg ttactactga gaatgatgag aagtttactg ctagattttt gattactgcc 420

ttgggtcctt tggctgctcc taacttgcca aagattaagg gtattgaaac ttttaagggt 480

gagttgcatc acactagtag atggccaaag gatgttactt tttctggtaa gagagttggt 540

gttattggta cttcttctac tggtgttcaa gttatcactg caattgcttc tcaagttaag 600

catttgactg tttttcagag atccgcccaa tattctgttc ctattggtaa tgttgttatg 660

tccgaaaccg atgttgctaa gattaaggaa aactacgatc aaatttggga aaatgtctgg 720

aactccgctt tgggttacgg tttgaacgag tctactttgc caactatgtc tgtttccgct 780

gaagaaagag ataaaatttt tgaaaaggcc tggcaagaag gtggaggttt gagatttatg 840

ttcgaaactt ttggtgatat cgccgttgat gaaactgcta acattgaagc tcaaaacttt 900

attaagaaga agatctccga aatcgttaag gatccatttg ttgctaagaa gttgacccct 960

actgacttgt acgcttgtag accattgtgt gactctggat actatgaaat ctttaacaga 1020

gataacgtct ctcttgaaga cgttaaggct aacccaattg ttgaaattaa ggaagactgc 1080

gttgttactg ctgatggagt tgaacataag ttggatatgt tgatttgtgc tactggtttt 1140

gatgctgttg atggttctta taagagaatt gatatcagag gtaaggatgg aatttctatt 1200

aaggatcatt ggaaggatgg tccaaactct tacttgggta tgatggtttc taattttcca 1260

aatatgttca tggtcttcgg accaaacggt ccattggcta actctccacc aattattgaa 1320

actcaagttg aatggattgc tgatttgatt ggttatgctg aggatcatca aattaaccaa 1380

attgaggcta ctaaggatgc tgtcgataac tggactaaca cttgttccga cattgctaac 1440

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aatactgtct acttgtatat gggtggattg aaagaataca gaaaccaaat cagtgaggtc 1560

gcaaataaca actacaaagg atgtttgttg aagcaaagtg tcaagaagac aaacttgatc 1620

gaaagttaa 1629

<210> 5

<211> 1632

<212> DNA

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atgtcacaaa aaatggattt tgatgctatc gtgattggtg gtggttttgg cggactttat 60

gcagtcaaaa aattaagaga cgagctcgaa cttaaggttc aggcttttga taaagccacg 120

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cacctctact gctattcttg ggataaagaa ttactacaat cgctagaaat caagaaaaaa 240

tatgtgcaag gccctgatgt acgcaagtat ttacagcaag tggctgaaaa gcatgattta 300

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gaagaacgca aggcagtttt tgaaaaggca tggcaaacag gtggcggttt ccgtttcatg 840

tttgaaactt tcggtgatat tgccaccaat atggaagcca atatcgaagc gcaaaatttc 900

attaagggta aaattgctga aatcgtcaaa gatccagcca ttgcacagaa gcttatgcca 960

caggatttgt atgcaaaacg tccgttgtgt gacagtggtt actacaacac ctttaaccgt 1020

gacaatgtcc gtttagaaga tgtgaaagcc aatccgattg ttgaaattac cgaaaacggt 1080

gtgaaactcg aaaatggcga tttcgttgaa ttagacatgc tgatatgtgc cacaggtttt 1140

gatgccgtcg atggcaacta tgtgcgcatg gacattcaag gtaaaaacgg cttggccatg 1200

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aacatgttca tggtgcttgg accgaatggc ccgtttacca acctgccgcc atcaattgaa 1320

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attgaagcga caaaagaagc ggaagaacaa tggactcaaa cttgcgccaa tattgcggaa 1440

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gccaatgcct aa 1632

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atgtcacaaa aaatggattt tgatgctatc gtgattggtg gtggttttgg cggactttat 60

gcagtcaaaa aattaagaga cgagctcgaa cttaaggttc aggcttttga taaagccacg 120

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gagttgcatc acactagtag atggccaaag gatgttactt tttctggtaa gagagttggt 540

gttattggta cttcttctac tggtgttcaa gttatcactg caattgcttc tcaagttaag 600

catttgactg tttttcagag atccgcccaa tattctgttc ctattggtaa tgttgttatg 660

tccgaaaccg atgttgctaa gattaaggaa aactacgatc aaatttggga aaatgtctgg 720

aactccgctt tgggttacgg tttgaacgag tctactttgc caactatgtc tgtttccgct 780

gaagaaagag ataaaatttt tgaaaaggcc tggcaagaag gtggaggttt gagatttatg 840

ttcgaaactt ttggtgatat cgccgttgat gaaactgcta acattgaagc tcaaaacttt 900

attaagaaga agatctccga aatcgttaag gatccatttg ttgctaagaa gttgacccct 960

actgacttgt acgcttgtag accattgtgt gactctggat actatgaaat ctttaacaga 1020

gataacgtct ctcttgaaga cgttaaggct aacccaattg ttgaaattaa ggaagactgc 1080

gttgttactg ctgatggagt tgaacataag ttggatatgt tgatttgtgc tactggtttt 1140

gatgctgttg atggttctta taagagaatt gatatcagag gtaaggatgg aatttctatt 1200

aaggatcatt ggaaggatgg tccaaactct tacttgggta tgatggtttc taattttcca 1260

aatatgttca tggtcttcgg accaaacggt ccattggcta actctccacc aattattgaa 1320

actcaagttg aatggattgc tgatttgatt ggttatgctg aggatcatca aattaaccaa 1380

attgaggcta ctaaggatgc tgtcgataac tggactaaca cttgttccga cattgctaac 1440

aaaactttgt ttgctaaagc taagtgcaga atctttggtg ctaacgtctc tggaaagaag 1500

aatactgtct acttgtatat gggtggattg aaagaataca gaaaccaaat cagtgaggtc 1560

gcaaataaca actacaaagg atgtttgttg aagcaaagtg tcaagaagac aaacttgatc 1620

gaaagttaa 1629

Claims

1.一种单加氧酶突变体，其特征在于，是如下(a)或(b)的蛋白质：

2.根据权利要求1所述的一种单加氧酶突变体，其特征在于，所述单加氧酶突变体是将如SEQ ID No.3所示氨基酸序列的第3位、第14位、第43位、第55位、第71位、第111位、第120位的一个或多个氨基酸残基替换为其他氨基酸残基所形成的新氨基酸序列对应的蛋白质。

3.根据权利要求2所述的单加氧酶突变体，其特征在于，所述单加氧酶突变体是由下述任一氨基酸序列对应的蛋白质：

(3)将如SEQ ID No.3所示氨基酸序列的第3位谷氨酰胺替换为苏氨酸，第43位丙氨酸替换为甘氨酸，第111位谷氨酰胺替换为苏氨酸；

(4)将如SEQ ID No.3所示氨基酸序列的第3位谷氨酰胺替换为苏氨酸，第14位甘氨酸替换为丙氨酸，第71位亮氨酸替换为甲硫氨酸；

(5)将如SEQ ID No.3所示氨基酸序列的第3位谷氨酰胺替换为苏氨酸，第14位甘氨酸替换为丙氨酸，第43位丙氨酸替换为甘氨酸，第71位亮氨酸替换为甲硫氨酸；

(6)将如SEQ ID No.3所示氨基酸序列的第3位谷氨酰胺替换为苏氨酸，第14位甘氨酸替换为丙氨酸，第43位丙氨酸替换为甘氨酸，第71位亮氨酸替换为甲硫氨酸，第111位谷氨酰胺替换为苏氨酸；

(7)将如SEQ ID No.3所示氨基酸序列的第3位谷氨酰胺替换为苏氨酸，第14位甘氨酸替换为丙氨酸，第43位丙氨酸替换为甘氨酸，第71位亮氨酸替换为甲硫氨酸，第111位谷氨酰胺替换为苏氨酸，第120位丙氨酸变成苏氨酸；

4.一种分离的核酸，其特征在于，所述核酸是编码如权利要求1或2所述单加氧酶突变体的核酸。

5.一种重组表达载体，其特征在于，包含如权利要求4所述核酸。

6.一种重组表达转化体，其特征在于，包含如权利要求5所述重组表达载体。

7.一种催化剂在催化大位阻潜手性拉唑硫醚氧化反应制备光学纯亚砜中的应用，其特征在于，所述催化剂为权利要求1-3中任一项所述单加氧酶突变体、权利要求6所述重组表达转化体的培养物或重组表达转化体的分泌上清。

8.根据权利要求7所述的一种催化剂在催化大位阻潜手性拉唑硫醚氧化反应制备光学纯亚砜中的应用，其特征在于，所述大位阻潜手性拉唑硫醚的化学式如式1所示：

9.根据权利要求7所述的一种催化剂在催化大位阻潜手性拉唑硫醚氧化反应制备光学纯亚砜中的应用，其特征在于，所述催化剂催化大位阻潜手性拉唑硫醚氧化反应，反应过程中消耗还原型辅酶NADPH，生成氧化型辅酶NADP⁺。

10.根据权利要求9所述的一种催化剂在催化大位阻潜手性拉唑硫醚氧化反应制备光学纯亚砜中的应用，其特征在于，所述反应体系中含有辅酶NADP⁺或NADPH，额外添加甲酸脱氢酶，催化甲酸盐氧化，再生还原型辅酶NADPH。