CN111424006B - 一种重组细胞及其合成α,β-不饱和醛的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种重组细胞及其合成α,β‑不饱和醛的应用，所述重组细胞是将烯醇脱氢酶编码基因、NADPH氧化酶编码基因和血红蛋白编码基因共同导入宿主细胞构建而成。本发明融合共表达烯醇脱氢酶、NADPH氧化酶和血红蛋白的重组细胞一锅法级联催化200mM 2‑丁烯‑1‑醇的选择性氧化，反应6h后底物完全转化为产物2‑丁烯醛，显著地提高了基因工程菌的催化效率；所述方法具有高选择性，反应过程中没有检测到过度氧化产物饱和醛、烯酸和饱和酸，避免了副产物的生成；除了氧气，不需加入其它辅底物，也不需要加入过氧化氢酶；方法绿色高效，可适合大规模工业生产。

Description

一种重组细胞及其合成α,β-不饱和醛的应用
(一)技术领域
本发明涉及一种α,β-不饱和醛的合成，特别涉及一种共表达烯醇脱氢酶、NADPH氧化酶和血红蛋白的重组细胞及其在合成α,β-不饱和醛中的应用。
(二)背景技术
α,β-不饱和醛常用于香料工业中，也是有机合成中的重要中间体。例如，柠檬醛(3,7-二甲基-2,6-辛二烯-1-醛)可用于生产紫罗兰酮、维生素A和E以及类胡萝卜素等。α,β-不饱和醛可通过化学催化或生物催化将相应的α,β-不饱和醇选择性氧化而获得。化学催化通常存在过度氧化和选择性差等问题。此外，传统的化学氧化剂具有一定的危险和环境危害。相对应地，生物催化由于其高活力、高选择性和环境友好等特点而受到了越来越多的关注。
在生物催化中，用于α,β-不饱和醇选择性氧化的生物催化剂主要包括两类：(1)醇氧化酶和(2)醇脱氢酶。醇氧化酶需要氧气的参与，催化α,β-不饱和醇选择性氧化生成α,β-不饱和醛，同时还产生H2O2。H2O2会损害醇氧化酶，因而通常利用过氧化氢酶催化H2O2进一步分解成O2和H2O。2019年，de Almeida等人报道了利用源自杏鲍菇的重组芳醇氧化酶作为生物催化剂，酶法催化将高浓度的反式2-己烯-1-醇选择性氧化为反式2-己烯-1-醛(deAlmeida TP,van Schie MMCH,Ma A,Tieves F,Younes SHH,Fernández-Fueyo E,ArendsIWCE,Riul Jr A,Hollmann F.Efficient aerobic oxidation of trans-2-hexen-1-olusing the aryl alcohol oxidase from Pleurotus eryngii.Adv Synth Catal.2019；361:2668-2672)。该酶重组表达形成包涵体，因而需要酶的分离纯化和复性，这不利于该酶在工业催化上的应用。目前已经详细表征酶学性质的醇氧化酶数量十分有限，而已经详细表征的醇脱氢酶则数量众多，这为构建高效的生物催化工艺提供了更多的选择。醇脱氢酶催化氧化反应是可逆的，并且需要NAD(P)+作为辅酶，因而基于醇脱氢酶的选择性氧化工艺需要有效的NAD(P)+再生来改变反应平衡以及减低辅酶NAD(P)+的使用量。
NAD(P)+再生可通过偶联第二底物或者偶联第二个酶来驱动。底物偶联策略往往需要添加过量的第二底物。相比而言，偶联第二个酶启动辅酶再生更为高效，其中NAD(P)H氧化酶作为第二个酶与醇脱氢酶共表达实现级联催化反应，是已被证明行之有效的NAD(P)+再生方法。NAD(P)H氧化酶在分子氧参与下催化氧化NAD(P)H生成NAD(P)+，同时生成过氧化氢(1型NAD(P)H氧化酶)或水(2型NAD(P)H氧化酶)。在醇脱氢酶和NAD(P)H氧化酶共表达的基础上，结合融合表达的技术构建多功能融合酶，可以提高NADP+再生和级联反应的催化效率，从而构建更为高效的整细胞一锅法催化工艺。
我们前期筛选获得了一个具有选择性氧化α,β-不饱和醇的高活力菌株约克氏菌WZY002，并对其烯醇脱氢酶YsADH进行了分离纯化和酶学性质表征(应向贤、汪钊、王一芳等，一种烯醇脱氢酶、编码基因、载体、工程菌及其应用；专利号：ZL 201310578047.1)。基于与YsADH的相容性，我们进一步选择源自热球菌Thermococcus kodakaraensis的NADPH氧化酶TkNOX驱动NADP+再生，并选择具有携氧功能的源自透明颤菌Vitreoscilla stercoraria血红蛋白VsHGB强化NADP+再生。目前，尚未见共表达烯醇脱氢酶YsADH、NADPH氧化酶TkNOX和血红蛋白VsHGB的构建报道，也未见利用共表达烯醇脱氢酶YsADH、NADPH氧化酶TkNOX和血红蛋白VsHGB重组细胞选择性氧化α,β-不饱和醇生成α,β-不饱和醛的报道。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种共表达烯醇脱氢酶、NADPH氧化酶和血红蛋白的重组细胞，以及利用所构建的重组细胞催化α,β-不饱和醇氧化生成α,β-不饱和醛的新方法，该方法具有高效、化学选择性专一、绿色环保、条件温和等优点，避免了化学法中常见的过度氧化、化学选择性低、催化剂不够环保等问题。
本发明采用的技术方案是：
第一方面，本发明提供了一种共表达烯醇脱氢酶、NADPH氧化酶和血红蛋白的重组细胞，所述重组细胞是将烯醇脱氢酶(YsADH)编码基因、NADPH氧化酶(TkNOX)编码基因和血红蛋白(VsHGB)编码基因共同导入宿主细胞构建而成，所述宿主细胞为E.coli BL21(DE3)，所述烯醇脱氢酶、NADPH氧化酶和血红蛋白的共表达以融合的方式或是非融合的方式进行。
所述烯醇脱氢酶来源于约克氏菌(Yokenella sp.WZY002)，其氨基酸序列如SEQID No.1所示，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，包括SEQ ID No.2所示核苷酸序列的互补序列。
所述NADPH氧化酶来源于热球菌(Thermococcus kodakaraensis)，其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，包括SEQ ID No.4所示核苷酸序列的互补序列。
所述血红蛋白来源于透明颤菌(Vitreoscilla stercoraria)，其氨基酸序列如SEQ ID No.5所示，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，包括SEQ ID No.6所示核苷酸序列的互补序列。
本发明所述非融合方式共表达烯醇脱氢酶、NADPH氧化酶和血红蛋白的基因工程菌按如下方法构建：将编码所述烯醇脱氢酶的核苷酸片段插入pACYCDuet-1载体上的第一克隆位点Nco I和Hind III之间，将编码所述NADPH氧化酶的核苷酸片段插入pACYCDuet-1载体上的第二克隆位点Nde I和Xho I之间，得到第一重组载体pACYCDuet-1-YsADH-TkNOX。将编码所述血红蛋白的核苷酸插入第二载体pET28a上的EcoR I和Hind III之间，得到第二重组载体pET28a-VsHGB。将第一重组载体pACYCDuet-1-YsADH-TkNOX导入宿主细胞E.coliBL21(DE3)，得到重组细胞E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-YsADH-TkNOX。利用CaCl2法将重组细胞E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-YsADH-TkNOX制成感受态细胞，然后将第二重组载体pET28a-VsHGB导入该感受态中，得到共表达烯醇脱氢酶、NADPH氧化酶和血红蛋白的重组细胞E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-YsADH-TkNOX/pET28a-VsHGB。
本发明所述融合方式共表达烯醇脱氢酶、NADPH氧化酶和血红蛋白的基因工程菌按如下方法构建：根据融合蛋白技术原理，设计带有四种不同柔性连接肽(linker)的多对特异性引物，将烯醇脱氢酶、NADPH氧化酶和血红蛋白的核苷酸序列通过基因工程手段进行克隆，得到多组目的重组DNA片段。将得到的重组DNA片段通过“一步克隆”技术，将其插入到载体pACYCDuet-1上的限制性内切酶活性位点Nco I和Hind III之间。将得到的重组质粒导入宿主细胞E.coli BL21(DE3)中，得到重组细胞。
所述的四种柔性linker分别为：GSG，GGGGS，(GSG)2和(GGGGS)2。将烯醇脱氢酶和NADPH氧化酶融合表达，得到四种融合共表达烯醇脱氢酶和NADPH氧化酶的重组细胞：E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-YsADH–GGGGS-TkNOX，E.coli BL21(DE3)/pACYCDUet-1-YsADH-(GGGGS)2-TkNOX，E.coli BL21(DE3)/pACYCDUet-1-YsADH–GSG-TkNOX以及E.coliBL21(DE3)/pACYCDUet-1-YsADH-(GSG)2-TkNOX。基于催化表现，优选的linker为GSG。
进一步的，利用GSG作为linker，得到融合共表烯醇脱氢酶、NADPH氧化酶和血红蛋白的重组细胞E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-YsADH–GSG-TkNOX-GSG-VsHGB。
第二方面，本发明还提供一种重组细胞在催化α,β-不饱和醇氧化生成α,β-不饱和醛中的应用，所述的应用为：以含烯醇脱氢酶编码基因、NADPH氧化酶编码基因和血红蛋白编码基因的重组细胞经诱导培养获得的湿菌体的冻干菌粉为催化剂，以α,β-不饱和醇为底物，以FAD和/或NADP+为辅酶，以pH 6.0～8.5的缓冲液为反应介质构成转化体系，在40～65℃、400～900rpm条件下进行反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得α,β-不饱和醛。
进一步，所述的α,β-不饱和醇包括2-丁烯-1-醇、3-甲基-2-丁烯-1-醇、2-己烯-1-醇、香叶醇、橙花醇、肉桂醇、视黄醇或法尼醇，优选2-丁烯-1-醇或3-甲基-2-丁烯-1-醇。
进一步，所述反应的温度为45℃，反应转速为600rpm。
进一步，所述转化体系中，底物加入终浓度为50～300mM(优选100mM)，所述催化剂加入量以转化体系体积计为20～60g/L(优选60g/L)，所述FAD加入终浓度为0～1.0mM(0是指不添加，优选0.2-1.0mM)，更优选0.2mM，所述NADP+加入终浓度为0～1.0mM(0是指不添加，优选0.2-1.0mM)，更优选0.4mM，所述缓冲液为50mM Tris-HCl(pH 7.5～8.5)或50mMPIPES溶液(pH 6.0～7.0)，优选50mM Tris-HCl(pH 8.0)。
进一步，所述反应在纯氧条件下进行。
进一步，所述非融合共表达重组细胞按如下方法制备冻干菌粉：将重组细胞接种于含有终浓度100μg/mL卡那霉素和50μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，在37℃和200rpm培养过夜，取培养物以体积浓度2％的接种量转接于150mL含有100μg/mL卡那霉素和50μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，在37℃和200rpm培养至菌体浓度OD600至0.6～0.8(优选0.6)，向培养物中加入终浓度0.1～0.5mM(优选0.3mM)的IPTG，在16～37℃诱导培养6-14h(优选20℃培养12h)，然后离心洗涤收集湿菌体，-80℃条件下冻干24h，获得冻干菌粉。
进一步，所述融合表达重组细胞按如下方法制备冻干菌粉：将重组细胞接种于含有终浓度50μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，在37℃和200rpm培养过夜，取培养物以体积浓度2％的接种量转接于150mL含有终浓度50μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，在37℃和200rpm培养至菌体浓度OD600至0.6～0.8(优选0.6)，向培养物中加入终浓度0.1～0.5mM(优选0.3mM)的IPTG，在16～37℃诱导培养6-14h(优选20℃培养12h)，然后离心洗涤收集湿菌体，-80℃条件下冻干24h，获得冻干菌粉。
所述湿菌体按如下方法收集：诱导结束后，分别将诱导液8000rpm离心10min后，弃上清，沉淀用缓冲液50mM Tris-HCl(pH 8.0)洗涤，以8000rpm离心10min后，弃上清，重复2次，得洗涤后湿菌体。
进一步，所述反应液分离纯化方法为：反应液在12000rpm下离心2min，取上清，加入4倍反应液体积的乙酸乙酯，在200rpm和30℃条件下萃取1.5h，萃取结束后，在12000rpm下离心1min，取上层有机相；在有机相中加入无水硫酸钠去除水分，取100μL用于色谱分析，剩余有机相经减压蒸馏去除溶剂乙酸乙酯，得到产物α,β-不饱和醛。
本发明利用重组细胞诱导产生的烯醇脱氢酶在NADP+参与下催化α,β-不饱和醇脱氢生成α,β-不饱和醛和NADPH，生成的NADPH经NADPH氧化酶和氧气作用下氧化生成NADP+，从而实现NADP+循环，同时诱导产生的血红蛋白具有携氧功能，有助于提高反应催化效率，缩短反应时间。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明提供了融合方式或非融合方式共表达烯醇脱氢酶、NADPH氧化酶和血红蛋白的重组细胞，以及利用所述重组细胞一锅法级联催化α,β-不饱和醇氧化生成α,β-不饱和醛(图1)。所述方法高效，比如，200mM底物2-丁烯-1-醇在6h内完全转化为产物2-丁烯醛；所述方法具有高选择性，反应过程中没有检测到过度氧化产物饱和醛、烯酸和饱和酸，表明该方法高效专一地催化α,β-不饱和醇氧化生成α,β-不饱和醛，避免了副产物的生成。在相同条件下催化100mM 3-甲基-2-丁烯-1-醇2h时，融合共表达重组细胞的催化得率(100％)大大高于非融合共表达重组细胞的催化得率(53％)，表明融合共表达显著地提高了基因工程菌的催化效率。所述方法以氧气(O2)为辅底物，生成水(H2O)，无需加入其它辅底物，且因反应温度较高，避免了过氧化氢(H2O2)的生成，不需要加入过氧化氢酶；方法绿色高效，可适合大规模工业生产。
(四)附图说明
图1为重组细胞一锅法级联催化α,β-不饱和醇制备α,β-不饱和醛的示意图。
图2为非融合共表达烯醇脱氢酶、NADPH氧化酶和血红蛋白重组细胞所制得的粗酶液的SDS-PAGE检测图。其中泳道M对应的是Protein Marker；泳道1对应的是诱导表达血红蛋白的重组细胞所制的粗酶液，血红蛋白大小约14kDa；泳道2对应的是诱导表达烯醇脱氢酶的重组细胞所制的粗酶液，烯醇脱氢酶大小约37kDa；泳道3对应的是诱导共表达NADPH氧化酶和烯醇脱氢酶的重组细胞所制得的粗酶液，NADPH氧化酶和烯醇脱氢酶大小分别为约51.2kDa和约37kDa；泳道4对应的是诱导共表达的NADPH氧化酶、烯醇脱氢酶和血红蛋白的重组细胞所制得的粗酶液；泳道5对应的是对照组，该粗酶液由未经诱导的含有NADPH氧化酶、烯醇脱氢酶和血红蛋白编码基因的重组细胞制得。
图3为融合共表达烯醇脱氢酶、NADPH氧化酶和血红蛋白重组细胞所制得的粗酶液的SDS-PAGE检测图。其中泳道M对应的是Protein Marker；泳道1对应的是融合表达YsADH–GSG-TkNOX-GSG-VsHGB重组细胞所制得的粗酶液；泳道2对应的是融合表达YsADH–GSG-TkNOX重组细胞所制得的粗酶液；泳道3对应的是融合表达YsADH–GGGGS-TkNOX重组细胞所制得的粗酶液；泳道4对应的是融合表达YsADH–(GSG)2-TkNOX重组细胞所制得的粗酶液；泳道5对应的是融合表达YsADH-(GGGGS)2-TkNOX重组细胞所制得的粗酶液；泳道6对应的是非融合共表达NADPH氧化酶和烯醇脱氢酶的重组细胞所制得的粗酶液，NADPH氧化酶和烯醇脱氢酶大小分别为约51.2kDa和约37kDa；泳道7对应的是诱导表达烯醇脱氢酶的重组细胞所制的粗酶液，烯醇脱氢酶大小约37kDa；泳道8对应的是对照组，该粗酶液由未经诱导的含有NADPH氧化酶、烯醇脱氢酶和血红蛋白等编码基因的重组细胞制得。
图4为四种表达不同融合蛋白的重组细胞催化效果比较。
图5为温度对重组细胞选择性氧化3-甲基-2-丁烯-1-醇合成3-甲基-2-丁烯醛的影响。
图6为pH对重组细胞选择性氧化3-甲基-2-丁烯-1-醇合成3-甲基-2-丁烯醛的影响。
图7为不同辅酶的添加量对重组细胞选择性氧化3-甲基-2-丁烯-1-醇合成3-甲基-2-丁烯醛的影响。
图8为转速对重组细胞选择性氧化3-甲基-2-丁烯-1-醇合成3-甲基-2-丁烯醛的影响。
图9为对重组细胞选择性氧化不同浓度3-甲基-2-丁烯-1-醇合成3-甲基-2-丁烯醛的时间进程。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照分子生物领域常规实验方法进行，如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的实验方法，或者按照制造厂商所建议的实验方法。
实施例1 约克氏菌(Yokenella sp.WZY002)烯醇脱氢酶编码基因的获取
利用已公开的来源于约克氏菌(Yokenella sp.WZY002)的烯醇脱氢酶(YsADH)编码基因(GenBank登录号为KF887947)，经过密码子优化后，人工合成(苏州金唯智生物技术有限公司提供基因合成服务)该烯醇脱氢酶编码基因，氨基酸序列和核苷酸序列分别如SEQID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
实施例2 热球菌(Thermococcus kodakaraensis)NADPH氧化酶编码基因的获取
利用已公开的来源于热球菌(Thermococcus kodakaraensis)的NADPH氧化酶(TkNOX)编码基因(GenBank登录号为BAD85488)，经过密码子优化后，人工合成(杭州擎科生物技术有限公司提供基因合成服务)该NADPH氧化酶(TkNOX)编码基因，氨基酸序列和核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
实施例3 透明颤菌(Vitreoscilla stercoraria)血红蛋白编码基因的获取
利用已公开的来源于透明颤菌(Vitreoscilla stercoraria)的血红蛋白(VsHGB)编码基因(GenBank登录号为AAA27584)，经过密码子优化后，人工合成(杭州擎科生物技术有限公司提供基因合成服务)该肌红蛋白酶(VsHGB)编码基因，氨基酸序列和核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
实施例4 非融合共表达烯醇脱氢酶YsADH、NADPH氧化酶TkNOX和血红蛋白VsHGB的重组细胞构建
1、单独表达烯醇脱氢酶YsADH和单独表达血红蛋白VsHGB的重组细胞
将烯醇脱氢酶YsADH编码基因插入到质粒pACYCDUet-1上Nco I/Hind III位点酶切位点之间，获得重组质粒pACYCDUet-1-YsADH。将重组质粒pACYCDuet-1-YsADH转入E.coli BL21(DE3)，获得基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-YsADH。基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-YsADH在含有50μg/mL氯霉素的LB固体培养基上划线分离，挑取单菌落接种于50mLLB液体培养基中，并加入终浓度50μg/mL氯霉素，在37℃和200rpm恒温摇床培养12h。基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-YsADH提取质粒测序表明，烯醇脱氢酶YsADH编码基因插入无误。
将血红蛋白VsHGB编码基因插入到质粒pET28a上EcoRI和HindIII位点，得到重组质粒pET28a-VsHGB。将重组质粒pET28a-VsHGB导入感受态细胞E.coli BL21(DE3)中，获得基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-VsHGB。基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-VsHGB经提取质粒测序表明，血红蛋白VsHGB编码基因插入无误。
2、非融合共表达烯醇脱氢酶YsADH和NADPH氧化酶TkNOX的重组细胞
将烯醇脱氢酶YsADH编码基因和NADPH氧化酶TkNOX编码基因插入到质粒pACYCDUet-1上Nco I/Hind III位点和Nde I/Xho I两对酶切位点之间，获得重组质粒pACYCDUet-1-YsADH-TkNOX。将重组质粒pACYCDuet-1-YsADH-TkNOX转入E.coli BL21(DE3)，获得基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-YsADH-TkNOX。基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pACYCDuet-1-YsADH-TkNOX在含有50μg/mL氯霉素的LB固体培养基上划线分离，挑取单菌落接种于50mL LB液体培养基中，并加入终浓度50μg/mL氯霉素，在37℃和200rpm恒温摇床培养12h。基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-YsADH-TkNOX提取质粒测序表明，烯醇脱氢酶YsADH和NADPH氧化酶TkNOX的编码基因插入无误。
3、非融合共表达烯醇脱氢酶YsADH、NADPH氧化酶TkNOX和血红蛋白VsHGB的重组细胞
基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-YsADH-TkNOX在含50μg/mL氯霉素的LB固体培养基上划线分离，挑取单菌落接种于50mL LB液体培养基中，并加入终浓度50μg/mL氯霉素，在37℃和200rpm恒温摇床培养12h。取1mL种子液转接至50mL含有50μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，在37℃和200rpm下培养至OD600至0.4，冰上冷却半小时，取菌液离心并洗涤菌体，用氯化钙溶液处理制成E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-YsADH-TkNOX感受态细胞。将重组质粒pET28a-VsHGB导入感受态细胞E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-YsADH-TkNOX中，获得基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-VsHGB/pACYCDuet-1-YsADH-TkNOX。基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-VsHGB/pACYCDuet-1-YsADH-TkNOX经提取质粒测序表明，烯醇脱氢酶YsADH、NADPH氧化酶TkNOX和血红蛋白VsHGB的编码基因插入无误。
实施例5 单独表达烯醇脱氢酶或血红蛋白，非融合共表达烯醇脱氢酶和NADPH氧化酶，非融合共表达烯醇脱氢酶、NADPH氧化酶和血红蛋白的重组细胞的诱导表达与冻干菌粉制备
1、诱导表达
E.coli BL21(DE3)/pET28a-VsHGB接种于含有终浓度100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃和200rpm培养过夜，取培养物以体积浓度2％的接种量转接于150mL含有100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃和200rpm培养至菌体浓度OD600至0.6，向培养物中加入终浓度0.3mM的IPTG在20℃诱导培养12h，获得诱导液。如图2(泳道1)所示，血红蛋白在大肠杆菌中成功表达。
将E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-YsADH和E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-YsADH-TkNOX分别接种于含有终浓度50μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，在37℃和200rpm培养过夜，取培养物以体积浓度2％的接种量转接于150mL含有50μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，在37℃和200rpm培养至菌体浓度OD600至0.6，向培养物中加入终浓度0.3mM的IPTG在20℃诱导培养12h，获得诱导液。如图2(泳道2和泳道3)所示，烯醇脱氢酶以及烯醇脱氢酶和NADPH氧化酶均在大肠杆菌中成功表达。
E.coli BL21(DE3)/pET28a-VsHGB/pACYCDuet-1-YsADH-TkNOX接种于含有终浓度100μg/mL卡那霉素和50μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，在37℃和200rpm培养过夜，取培养物以体积浓度2％的接种量转接于150mL含有100μg/mL卡那霉素和50μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，在37℃和200rpm培养至菌体浓度OD600至0.6，向培养物中加入终浓度0.3mM的IPTG在20℃诱导培养12h，获得诱导液。如图2(泳道4)所示，烯醇脱氢酶、NADPH氧化酶和血红蛋白均在大肠杆菌中成功表达。经比酶活测定(同实施例6方法)，在非融合共表达烯醇脱氢酶、NADPH氧化酶和血红蛋白重组细胞所制得的粗酶液中，烯醇脱氢酶和NADPH氧化酶的比酶活分别是613U/g和1542U/g。
2、冻干粉制备
诱导结束后，分别将诱导液8000rpm离心10min后，弃上清，得湿菌体。随后用缓冲液50mM Tris-HCl(pH 8.0)洗涤，以8000rpm，离心10min后，弃上清，得洗涤后湿菌体，操作重复2次。将得到的湿菌体放于-20℃两天后，放于冻干机-80℃条件下冻干24h，整体除水率在90％左右，分别获得单独表达烯醇脱氢酶或血红蛋白重组细胞的冻干菌粉、非融合共表达烯醇脱氢酶和NADPH氧化酶重组细胞的冻干菌粉和非融合共表达烯醇脱氢酶、NADPH氧化酶和血红蛋白重组细胞的冻干菌粉。
实施例6 烯醇脱氢酶和NADPH氧化酶的比酶活测定
1、粗酶液的制备
称取实施例5得到的冻干菌粉0.5g，加入15mL的50mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)充分重悬菌体后，然后在冰浴(0℃)条件下对菌悬液进行超声破碎。在600W下超声破碎10min，工作2s，间歇6s，以相同条件重复破碎3次。破碎菌液在4℃和12000rpm下离心10min，所得到的上清液即为目的蛋白的粗酶液。将目的蛋白的粗酶液用截留分子量为10kDa的超滤管在4℃和5000rpm下离心30min进行浓缩。离心结束后，得到的溶液即为浓缩后的目的蛋白的粗酶液。
2、烯醇脱氢酶的比酶活测定
烯醇脱氢酶的酶活力采用分光光度计的单因素动力学方法测定在340nm处吸光值的变化来计算酶活。比酶活测定体系：20mM 2-丁烯-1-醇，1.0mM NADP+，100μL粗酶液，加50mM Tris-HCl(pH 8.0)补足1mL。酶活力单位(U)定义：在45℃下，每分钟还原1μmol NADP+所需的酶量。每次做三组平行实验，计算平均值和标准误差。烯醇脱氢酶(YsADH)的体积酶活力及比活力计算公式如公式1和公式2：
Figure BDA0002392333650000081
Figure BDA0002392333650000082
①ΔA为1min之内吸光值的变化；
②V1、V2分别为反应液的总体积和添加的酶液体积，mL；
③6220为NAD(P)H在340nm下的摩尔消光系数，
④L为光程距离，为1cm；t为反应时间，1min；
3、NADPH氧化酶的比酶活测定
NADPH氧化酶的酶活力采用分光光度计的单因素动力学方法测定340nm处吸光值的变化来计算酶活。酶活检测体系为：0.4mM NADPH，0.4mM FAD，100μL粗酶液，加50mMTris-HCl(pH 8.0)补足1mL。酶活力单位(U)定义：在45℃下，每分钟氧化1μmol NADPH所需的酶量。每次做三组平行实验，计算平均值和标准误差。NADPH氧化酶的体积酶活力及比活力计算公式如上公式1和公式2。
4、蛋白浓度测定
根据BCA法蛋白质浓度测定试剂盒绘制蛋白浓度标准曲线，测得的线性关系公式为Y＝0.0029X+0.1124，其中Y：是562nm处的吸光度值，X：为BSA溶液浓度(μg/mL)，标准偏差为R2＝0.9979。然后根据标准蛋白浓度曲线计算蛋白浓度，进而计算比酶活。每次做三组平行实验，计算平均值和标准误差。
实施例7 单独表达烯醇脱氢酶、非融合共表达烯醇脱氢酶和NADPH氧化酶以及非融合共表达烯醇脱氢酶、NADPH氧化酶和血红蛋白的重组细胞的催化效果比较
催化反应体系包括：100mM 3-甲基-2-丁烯-1-醇、0.2mM FAD、0.2mM NADP+、50mMTris-HCl(pH 8.0)，最后分别加入实施例5方法制备的单独表达烯醇脱氢酶、非融合共表达烯醇脱氢酶和NADPH氧化酶以及非融合共表达烯醇脱氢酶、NADPH氧化酶和血红蛋白的冻干菌粉0.3g，总体系为5mL。反应条件为45℃和600rpm。反应2h后，反应液在12000rpm下离心2min，取上清，加入4倍反应液体积的乙酸乙酯，在200rpm和30℃条件下萃取1.5h，萃取结束后，在12000rpm下离心1min，取上层有机相；在有机相中加入无水硫酸钠去除水分，然后取100μL用于色谱分析产物3-甲基-2-丁烯醛(实施例16方法检测)。每次做三次平行实验，计算平均值和标准误差。
如表1数据所示，反应2h后，以单独表达烯醇脱氢酶的重组细胞催化底物时，产物的得率仅为11.75％；以非融合共表达烯醇脱氢酶和NADPH氧化酶的重组细胞催化底物时，产物的得率为21.30％，说明双酶级联催化时，驱动辅酶循环，有助于提高催化效果。以非融合共表达烯醇脱氢酶、NADPH氧化酶和血红蛋白的重组细胞为催化剂时，产物的得率提高到35.48％，说明血红蛋白的加入进一步加速了辅酶循环的进行。当将反应器气相空间的空气置换为纯氧，产物的得率进一步提高到51.3％，表明充分的氧供给有利于提高催化效率。
表1单独表达烯醇脱氢酶、非融合共表达烯醇脱氢酶和NADPH氧化酶及非融合共表达烯醇脱氢酶、NADPH氧化酶和血红蛋白的重组细胞的催化效果比较
Figure BDA0002392333650000091
a在该反应中，反应器气相空间的空气置换为纯氧。
实施例8 融合共表达烯醇脱氢酶和NADPH氧化酶的重组细胞构建与催化效果比较
1、融合共表达烯醇脱氢酶和NADPH氧化酶的重组细胞构建
为了构建四种不同的YsADH-linker-TkNOX融合蛋白，去除了YsADH编码基因的终止密码子，选择了不同长度的接头(Gly–Ser–Gly)n(n＝1、2)，或(Gly–Gly–Gly–Gly–Ser)n(n＝1、2)，通过两轮PCR引入YsADH和TkNOX编码基因的开放阅读框之间。引物汇总表见表2。PCR的第一轮使用4对引物将linker(GSG)n(n≤2)或(GGGGS)n(n≤2)引入YsADH编码基因的3’端。同时，使用另外4对引物将互补linker(GSG)n(n≤2)或(GGGGS)n(n≤2)引入TkNOX编码基因的5’端。纯化每种PCR产物，并在第二轮PCR中用作模板。接着，使用带有linker的一对引物，通过重叠PCR技术，将上一轮的PCR产物(YsADH和TkNOX编码基因)连接起来。PCR程序包括：98℃(3min)，32个循环包括98℃(10s)，58℃(15s)，72℃(40s)，最后72℃保持5min。最后一步将凝胶纯化的PCR产物插入到pACYCDUet-1载体上的Nco I和Hind III之间。将融合质粒导入到宿主细胞E.coliBL21(DE3)中，得到4个表达不同融合蛋白的重组细胞，分别为：E.coli BL21(DE3)/pACYCDUet-1-YsADH–GGGGS-TkNOX；E.coli BL21(DE3)/pACYCDUet-1-YsADH-(GGGGS)2-TkNOX；E.coli BL21(DE3)/pACYCDUet-1-YsADH–GSG-TkNOX以及E.coliBL21(DE3)/pACYCDUet-1-YsADH-(GSG)2-TkNOX。经提取质粒测序表明，双酶融合基因插入无误。
2、融合共表达烯醇脱氢酶和NADPH氧化酶的重组细胞的诱导表达
4个表达不同融合蛋白的重组细胞分别接种于含有终浓度50μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，在37℃和200rpm培养过夜，取培养物以体积浓度2％的接种量转接于150mL含有50μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，在37℃和200rpm培养至菌体浓度OD600至0.6，向培养物中加入终浓度0.3mM的IPTG，在20℃诱导培养12h。诱导结束后，将诱导液8000rpm离心10min后，弃上清，得湿菌体。随后用缓冲液50mM Tris-HCl(pH 8.0)洗涤，以8000rpm离心10min后，弃上清，得洗涤后湿菌体，操作重复2次即可。此时，将得到的湿菌体放于-20℃两天后，放于冻干机-80℃条件下冻干24h。由所得冻干菌粉分别制得粗酶液(同实施例6方法制备)，经SDS-PAGE电泳检测，烯醇脱氢酶和NADPH氧化酶均在大肠杆菌中成功融合共表达(图3)。
3、融合共表达烯醇脱氢酶和NADPH氧化酶的重组细胞的催化效果比较
催化反应体系为5mL，包括：100mM 3-甲基-2-丁烯-1-醇，0.2mM FAD，0.2mM NADP+，50mM Tris-HCl(pH 8.0)，最后加入冻干菌粉0.3g。反应条件为45℃和600rpm，反应器气相空间的空气置换为纯氧。反应2h后，反应液在12000rpm下离心2min，取上清，加入4倍反应液体积的乙酸乙酯，在200rpm和30℃条件下萃取1.5h，萃取结束后，在12000rpm下离心1min，取上层有机相；在有机相中加入无水硫酸钠去除水分，然后取100μL用于色谱分析产物3-甲基-2-丁烯醛(实施例16方法检测)。每次做三次平行实验，计算平均值和标准误差。同样条件下，以非融合共表达烯醇脱氢酶、NADPH氧化酶和血红蛋白的重组细胞为对照。
如图4所示，以重组细胞E.coli BL21(DE3)/pACYCDUet-1-YsADH–GGGGS-TkNOX作为催化剂时，产物的得率为90.45％；以重组细胞E.coli BL21(DE3)/pACYCDUet-1-YsADH–GSG-TkNOX为催化剂时，产物得率为92.92％；以重组细胞E.coli BL21(DE3)/pACYCDUet-1-YsADH-(GGGGS)2-TkNOX为催化剂时，产物得率为71.73％；以重组细胞E.coli BL21(DE3)/pACYCDUet-1-YsADH-(GSG)2-TkNOX为催化剂时，产率为91.73％。与对照相比，所有融合共表达烯醇脱氢酶和NADPH氧化酶的重组细胞均优于非融合共表达烯醇脱氢酶和NADPH氧化酶的重组细胞，其中，又以柔性linker(GSG)构建的融合共表达烯醇脱氢酶和NADPH氧化酶的重组细胞催化效果最好。
表2用于融合共表达的引物汇总表
Figure BDA0002392333650000101
Figure BDA0002392333650000111
实施例9 融合共表达蛋白烯醇脱氢酶、NADPH氧化酶和血红蛋白的重组细胞构建、诱导表达与催化效果确证
1、融合共表达蛋白烯醇脱氢酶、NADPH氧化酶和血红蛋白的重组细胞构建
选择连接肽GSG作为最适连接肽，连接第三个蛋白VsHGB(表2)。为了构建YsADH-GSG-TkNOX-GSG-VsHGB融合基因，去除了TkNOX编码基因的终止密码子。通过两轮PCR将连接肽GSG引入了YsADH-GSG-TkNOX和VsHGB之间。最后将凝胶纯化的PCR产物插入到pACYCDUet-1载体上的Nco I和Hind III之间，获得融合质粒pACYCDUet-1-YsADH-GSG-TkNOX-GSG-VsHGB。将融合质粒导入到宿主细胞E.coli BL21(DE3)中，得到融合蛋白E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-YsADH-GSG-TkNOX-GSG-VsHGB。经提取质粒测序表明，三酶融合基因插入无误。
2、融合共表达蛋白烯醇脱氢酶、NADPH氧化酶和血红蛋白的重组细胞诱导表达
E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-YsADH-GSG-TkNOX-GSG-VsHGB接种于含有终浓度50μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，在37℃和200rpm培养过夜，取培养物以体积浓度2％的接种量转接于150mL含有50μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，在37℃和200rpm培养至菌体浓度OD600至0.6，向培养物中加入终浓度0.3mM的IPTG在20℃诱导培养12h。诱导结束后，将诱导液8000rpm离心10min后，弃上清，得湿菌体。随后用缓冲液50mM Tris-HCl(pH 8.0)洗涤，以8000rpm离心10min后，弃上清，得洗涤后湿菌体，操作重复2次即可。此时，将得到的湿菌体放于-20℃两天后，放于冻干机-80℃条件下冻干24h。由所得冻干菌粉制得粗酶液(同实施例6方法制备)，经SDS-PAGE电泳检测，多功能融合蛋白YsADH-GSG-TkNOX-GSG-VsHGB在大肠杆菌中成功表达(图3)。所得粗酶液经实施例6方法测定，蛋白质浓度为0.61mg/mL；烯醇脱氢酶比酶活为801.4U/g；NADPH氧化酶比酶活为983U/g。
3、融合共表达蛋白烯醇脱氢酶、NADPH氧化酶和血红蛋白的重组细胞催化效果
催化体系为5mL，包括：100mM 3-甲基-2-丁烯-1-醇、0.2mM FAD、0.2mM NADP+、50mM Tris-HCl(pH 8.0)，0.1g冻干菌粉。反应条件为45℃和600rpm，反应器气相空间的空气置换为纯氧。反应2h后，反应液在12000rpm下离心2min，取上清，加入4倍反应液体积的乙酸乙酯，在200rpm和30℃条件下萃取1.5h，萃取结束后，在12000rpm下离心1min，取上层有机相；在有机相中加入无水硫酸钠去除水分，然后取100μL用于色谱分析产物3-甲基-2-丁烯醛(实施例16方法检测)，剩余有机相经减压蒸馏去除溶剂乙酸乙酯，得到产物3-甲基-2-丁烯醛。每次做三次平行实验，计算平均值和标准误差。结果表明，反应的得率高达100％。后续的催化反应条件优化以重组细胞E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-YsADH-GSG-TkNOX-GSG-VsHGB冻干菌粉作为生物催化剂。
实施例10 催化体系的最适温度
探究催化体系的最适温度，反应体系包括：100mM 3-甲基-2-丁烯-1-醇、0.2mMFAD、0.2mM NADP+、50mM Tris-HCl(pH 8.0)及实施例9制备的冻干菌粉0.1g，总体系为5mL。反应条件选取40℃、45℃、50℃、55℃、60℃和65℃，搅拌转速为600rpm，反应器气相空间的空气置换为纯氧。催化反应2h后，反应液在12000rpm下离心2min，取上清，加入4倍反应液体积的乙酸乙酯，在200rpm和30℃条件下萃取1.5h，萃取结束后，在12000rpm下离心1min，取上层有机相；在有机相中加入无水硫酸钠去除水分，然后取100μL用于色谱分析产物3-甲基-2-丁烯醛(实施例16方法检测)。每次做三组平行实验，计算平均值和标准误差。
如图5所示，在40℃时催化，产物得率为51.21％；在45℃时催化，产物的得率提高至70.35％；在50℃催化时，产物的得率开始减少到56.24％；55℃时，产物的得率为50.34％；在60℃时，产物的得率降至21.92％；在65℃时，产物得率仅为6.29％。由此可知，催化反应的最适温度为45℃。
实施例11 催化体系的最适pH
根据实施例10，确定催化体系的最适温度为45℃。进一步探究催化体系的最适pH。反应体系：100mM 3-甲基-2-丁烯-1-醇、0.2mM FAD、0.2mM NADP+、50mM Tris-HCl(pH 7.5～8.5)缓冲液或50mM PIPES(6.0～7.0)缓冲液，实施例9方法制备的冻干菌粉0.1g，总体系为5mL。反应温度为45℃，反应pH范围包括6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和8.5，搅拌转速为600rpm，反应器气相空间的空气置换为纯氧。催化反应2h后，反应液在12000rpm下离心2min，取上清，加入4倍反应液体积的乙酸乙酯，在200rpm和30℃条件下萃取1.5h，萃取结束后，在12000rpm下离心1min，取上层有机相；在有机相中加入无水硫酸钠去除水分，然后取100μL用于色谱分析产物3-甲基-2-丁烯醛(实施例16方法检测)。每次做三组平行实验，计算平均值和标准误差。
如图6所示，当反应pH为6.0时，产物的得率为12.44％；当pH为6.5时，产物的得率为21.26％；当pH为7.0时，产物的得率提高至39.44％；随着pH的升高，产物的得率也随之升高。当pH为7.5时，产物得率为47.8％；当pH为8.0时，产物得率为55.91％；当pH为8.5时，产物得率为52.45％。由此可知，催化反应的最适pH为8.0。
实施例12 催化体系的最适辅酶添加量
1、探究辅酶FAD的最适添加量
根据实施例11，确定催化体系的最适pH为8.0。进一步探究催化体系的辅酶(FAD和NADP+)最适添加量。反应体系：100mM 3-甲基-2-丁烯-1-醇、0.2mM NADP+、50mM Tris-HCl(pH 8.0)，实施例9方法制备的冻干菌粉0.1g，其中辅酶FAD的浓度范围：0mM、0.2mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM和1.0mM，反应总体系为5mL。反应器气相空间的空气置换为纯氧。在45℃、搅拌转速为600rpm条件下催化反应2h后，反应液在12000rpm下离心2min，取上清，加入4倍反应液体积的乙酸乙酯，在200rpm和30℃条件下萃取1.5h，萃取结束后，在12000rpm下离心1min，取上层有机相；在有机相中加入无水硫酸钠去除水分，然后取100μL用于色谱分析产物3-甲基-2-丁烯醛(实施例16方法检测)。每次做三组平行实验，计算平均值和标准误差。
如图7所示，当不添加辅酶FAD时，产物的得率仅为8.1％；当FAD的浓度为0.2mM时，产物得率提高至65.66％；当FAD的浓度为0.4mM时，产物得率为34.54％；继续将FAD的浓度提高至0.6mM、0.8mM和1.0mM时，产物的得率分别降至29.71％、28.32％和28.30％。当辅酶FAD的添加量为0.2mM时，催化效果最好，因此FAD的最适添加量为0.2mM。
2、探究辅酶NADP+的最适添加量
根据步骤1，确定催化体系中辅酶FAD的最适添加量为0.2mM。进一步探究辅酶NADP+的最适添加量。反应体系：100mM 3-甲基-2-丁烯-1-醇、0.2mM FAD、50mM Tris-HCl(pH8.0)，实施例9方法制备的冻干菌粉0.1g，其中辅酶NADP+的浓度范围：0mM、0.2mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM和1.0mM，反应总体系为5mL。反应器气相空间的空气置换为纯氧。在45℃、搅拌转速为600rpm条件下催化反应2h后，反应液在12000rpm下离心2min，取上清，加入4倍反应液体积的乙酸乙酯，在200rpm和30℃条件下萃取1.5h，萃取结束后，在12000rpm下离心1min，取上层有机相；在有机相中加入无水硫酸钠去除水分，然后取100μL用于色谱分析产物3-甲基-2-丁烯醛(实施例16方法检测)。每次做三组平行实验，计算平均值和标准误差。
如图7所示，当不添加辅酶NADP+时，产物得率为20％；当NADP+的浓度为0.2mM时，产物得率为31.36％；继续将NADP+的浓度提高至0.4mM时，产物得率为37.39％，与不添加时(0mM)相比，提高了近1倍左右；随后将NADP+的浓度提高到0.6mM、0.8mM和1.0mM时，产物得率分别为37.71％、37.75％和37.05％，表明随着NADP+的浓度继续提高，产物得率提高的并不明显。因此，从催化效果和经济成本考虑，催化反应体系中辅酶NADP+的最适添加量为0.4mM。
实施例13 催化体系的最适搅拌速度
根据以上实例的探究条件，确定反应体系：100mM 3-甲基-2-丁烯-1-醇、0.4mMNADP+、0.2mM FAD、50mM Tris-HCl(pH 8.0)，实施例9方法制备的冻干菌粉0.1g，总体系为5mL。反应温度为45℃，转速范围为400rpm、500rpm、600rpm、700rpm、800rpm和900rpm，反应器气相空间的空气置换为纯氧。催化反应2h后，反应液在12000rpm下离心2min，取上清，加入4倍反应液体积的乙酸乙酯，在200rpm和30℃条件下萃取1.5h，萃取结束后，在12000rpm下离心1min，取上层有机相；在有机相中加入无水硫酸钠去除水分，然后取100μL用于色谱分析产物3-甲基-2-丁烯醛(实施例16方法检测)。每次做三组平行实验，计算平均值和标准误差。
如图8所示，当转速为400rpm时，产物得率为30.77％；当转速为500rpm时，产物得率提高至45.77％；当转速为600rpm时，产物得率达到最大值55.66％；随后转速为700rpm、800rpm和900rpm时，产物得率分别为39.75％、39.62％和35.85％。由数据可知，一定的搅拌速度可以加快反应速率，过高的搅拌速度会对细胞造成一定的剪切力的损害，从而影响催化效果。因此，此催化体系的最适搅拌速度为600rpm。
实施例14 重组细胞催化不同浓度3-甲基-2-丁烯-1-醇的选择性氧化。
反应体系中分别以50mM、100mM、150mM、200mM、250mM、300mM 3-甲基-2-丁烯-1-醇为底物，其余包括：0.4mM NADP+、0.2mM FAD、50mM Tris-HCl(pH 8.0)，实施例9方法制备的冻干菌粉0.3g，总体系为5mL。反应温度为45℃，搅拌转速为600rpm，反应器气相空间的空气置换为纯氧。由于底物浓度不同，其反应完全的时间也不同，因此采取定时取样进行气相检测。反应液在12000rpm下离心2min，取上清，加入4倍反应液体积的乙酸乙酯，在200rpm和30℃条件下萃取1.5h，萃取结束后，在12000rpm下离心1min，取上层有机相；在有机相中加入无水硫酸钠去除水分，然后取100μL用于色谱分析产物3-甲基-2-丁烯醛(实施例16方法检测)。每次做三组平行实验，计算平均值和标准误差。
如图9所示，50mM、100mM、150mM、200mM、250mM的3-甲基-2-丁烯-1-醇转化完全的时间分别为1.5h、2h、4h、6h、8h；300mM 3-甲基-2-丁烯-1-醇在反应12h后，产物得率为80.10％。由此可知，随着底物浓度的增加，产物完全转化所需要的时间也随之增加。
实施例15 重组细胞催化不同α,β-不饱和醇选择性氧化生成α,β-不饱和醛
不同的底物包括：2-丁烯-1-醇、3-甲基-2-丁烯-1-醇、2-己烯-1-醇、香叶醇、橙花醇、肉桂醇、视黄醇和法尼醇。反应体系：0.4mM NADP+、0.2mM FAD、50mM Tris-HCl(pH8.0)，实施例9方法制备的冻干菌粉0.3g，以及加入相对应浓度的底物至反应体系为5mL即可。反应温度为45℃，搅拌转速为600rpm，反应器气相空间的空气置换为纯氧。反应结束后，反应液在12000rpm下离心2min，取上清，加入4倍反应液体积的乙酸乙酯，在200rpm和30℃条件下萃取1.5h，萃取结束后，在12000rpm下离心1min，取上层有机相；在有机相中加入无水硫酸钠去除水分，然后取100μL用于色谱分析产物2-丁烯醛、3-甲基-2-丁烯醛、2-己烯醛、香叶醛、橙花醛、肉桂醛、视黄醛或法尼醛(同实施例16方法检测)，剩余有机相经减压蒸馏去除溶剂乙酸乙酯，得到产物α,β-不饱和醛。每次做三组平行实验，计算平均值和标准误差。
如表3数据所示，碳链较短的α,β-不饱和醇(如2-丁烯-1-醇和3-甲基-2-丁烯-1-醇)以200mM浓度反应时，在6h之内产物得率为100％。以300mM浓度反应时，在8h和12h时产物得率分别为96.7％和80.1％。接下来，随着碳链长度的增加，其能催化的底物浓度和反应时间也有了相应的变化。其中碳链较长的视黄醇和法尼醇，底物初始浓度为50mM时在反应10h后产物得率分别为88.24％和85.78％。
表3融合共表达蛋白烯醇脱氢酶、NADPH氧化酶和血红蛋白的重组细胞催化不同底物的结果比较
Figure BDA0002392333650000151
实施例16 利用气相/高效液相色谱法检测不同底物/产物对的色谱条件
利用气相色谱法检测底物/产物对：2-丁烯-1-醇/2-丁烯醛、3-甲基-2-丁烯-1-醇/3-甲基-2-丁烯醛、反-2-己烯-1-醇/反-2-己烯醛、橙花醇/橙花醛、香叶醇/香叶醛、肉桂醇/肉桂醛、法尼醇/法尼醛。其中2-丁烯-1-醇/2-丁烯醛、3-甲基-2-丁烯-1-醇/3-甲基-2-丁烯醛、反-2-己烯-1-醇/反-2-己烯醛、肉桂醇/肉桂醇等底物/产物对的检测方法如下：Agilent 6890N手性柱BGB-174(30m×250μm×0.25μm)；检测器FID，250℃；载气，N2；载气流量，2.27mL/min；分流比，1:19；进样量，1.0μL；进样口温度，250℃。升温程序：75℃保持3min，以10℃/min升温至120℃，保持3min，随后以30℃/min升温至180℃，保持3min。
橙花醇/橙花醛、香叶醇/香叶醛、法尼醇/法尼醛等底物/产物对的气相检测方法如下：Agilent6890N手性柱BGB-174(30m×250μm×0.25μm)；检测器FID，250℃；载气，N2；载气流量，2.27mL/min；分流比，1:19；进样量，1.0μL；进样口温度，250℃。升温程序：75℃保持3min，以4℃/min升温至120℃，保持3min，随后以30℃/min升温至180℃，保持3min。
视黄醇/视黄醛的高效液相检测方法如下：柱温40℃，紫外波长：340nm，流速：1mL/min，洗脱方式：等度洗脱，流动相：甲醇：乙腈＝95:5。柱子：C18。
不同底物和产物对的色谱保留时间汇总见表4。
表4不同底物/产物对的色谱保留时间
Figure BDA0002392333650000152
Figure BDA0002392333650000161
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 一种重组细胞及其合成α,β-不饱和醛的应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 345
<212> PRT
<213> 未知(Unknown)
<400> 1
Met Ser Ile Ile Lys Ser Tyr Ala Ala Lys Glu Ala Gly Ser Glu Leu
1 5 10 15
Glu Leu Tyr Glu Tyr Asp Ala Gly Glu Leu Arg Pro Glu Asp Val Glu
20 25 30
Val Gln Val Asp Tyr Cys Gly Ile Cys His Ser Asp Leu Ser Met Ile
35 40 45
Asp Asn Glu Trp Gly Phe Ser Gln Tyr Pro Leu Val Ala Gly His Glu
50 55 60
Val Ile Gly Arg Val Ala Ala Leu Gly Ser Ala Ala Gln Glu Lys Gly
65 70 75 80
Val Lys Val Gly Gln Arg Val Gly Val Gly Trp Thr Ala Arg Ser Cys
85 90 95
Gly His Cys Asp Ala Cys Ile Ser Gly Asn Gln Ile Asn Cys Leu Glu
100 105 110
Gly Ala Val Ala Thr Ile Leu Asn Arg Gly Gly Phe Ala Glu Lys Leu
115 120 125
Arg Ala Asp Trp Gln Trp Val Ile Pro Leu Pro Glu Ser Ile Asp Ile
130 135 140
Glu Ser Ala Gly Pro Leu Leu Cys Gly Gly Ile Thr Val Phe Lys Pro
145 150 155 160
Leu Leu Met His His Ile Thr Ala Thr Ser Arg Val Gly Val Ile Gly
165 170 175
Ile Gly Gly Leu Gly His Ile Ala Ile Lys Leu Leu His Ala Val Ser
180 185 190
His Gly Asx Cys Glu Val Thr Ala Phe Ser Ser Asn Pro Ser Lys Glu
195 200 205
Gln Glu Val Leu Ala Val Ser His Gly Asx Ala Asp Lys Val Val Asn
210 215 220
Ser Arg Asp Pro Asp Ala Leu Asn Ala Leu Ala Gly Gln Phe Asp Leu
225 230 235 240
Ile Ile Asn Thr Val Asn Val Asp Leu Asp Trp Gln Pro Tyr Phe Glu
245 250 255
Ala Leu Ala Tyr Gly Gly His Phe His Thr Val Gly Ala Val Met Lys
260 265 270
Pro Leu Pro Val Pro Ala Phe Thr Leu Ile Ala Gly Asp Arg Ser Ile
275 280 285
Ser Gly Ser Ala Thr Gly Thr Pro Tyr Glu Leu Arg Lys Leu Met Lys
290 295 300
Phe Ala Gly Arg Ser Lys Val Ser Pro Thr Thr Glu Leu Phe Pro Met
305 310 315 320
Ser Gln Ile Asn Glu Ala Ile Gln His Val Arg Asp Gly Lys Ala Arg
325 330 335
Tyr Arg Val Val Leu Gln Ala Asp Phe
340 345
<210> 2
<211> 1020
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 2
atgtctatta taaaaagcta tgccgcaaaa gaggcgggca gcgaactcga actttacgaa 60
tatgatgccg gtgaactcag gccggaagat gtcgaggtgc aggtcgacta ctgcggtatc 120
tgccattccg atctttccat gatcgacaac gaatggggat tctctcagta tccgctggtt 180
gccgggcatg aagtgattgg ccgcgtggcg gcgctcggca gtgcggcgca ggaaaaaggg 240
gtgaaagttg gtcagcgcgt gggcgtaggc tggacggcgc gcagctgtgg gcattgcgat 300
gcatgtatca gcggtaatca gattaactgc ctggaaggcg ccgtagccac cattctcaac 360
cgtggcggtt ttgccgagaa actgcgggca gactggcagt gggtgatccc gcttccggag 420
agcatcgata ttgagtcggc aggtcctctg ttatgcggcg gtattacggt ttttaaacct 480
ctgctgatgc accacatcac cgcgaccagt cgcgtggggg tgatcggcat cggcggtctt 540
gggcacattg ccattaaact gttgcacgca atgggctgtg aagtgaccgc attcagctcg 600
aatccgtcga aagaacagga agtgctggca atgggggcgg ataaagtcgt gaacagtcgc 660
gatccagacg cgttaaatgc gctggcaggc cagtttgatc tcattatcaa caccgttaat 720
gtcgacctcg actggcagcc ctactttgaa gcgctggcct atggcggcca tttccacacc 780
gtcggcgcag tgatgaagcc gctgccggtt ccggcgttta cattgattgc tggcgatcgc 840
agcatctccg gctcagcaac cggtacgccc tatgagctgc gcaaattgat gaagtttgcc 900
gggcgcagca aggtctcgcc gacgacagag ctgttcccaa tgtcgcaaat caacgaagcc 960
atccagcacg ttcgcgacgg caaagcgcgt taccgcgtgg tactgcaagc cgacttttga 1020
<210> 3
<211> 445
<212> PRT
<213> 未知(Unknown)
<400> 3
Met Glu Arg Lys Thr Val Val Val Ile Gly Gly Gly Ala Ala Gly Met
1 5 10 15
Ser Thr Ala Ser Arg Val Lys Arg Leu Lys Pro Glu Trp Asp Val Lys
20 25 30
Val Phe Glu Ala Thr Glu Trp Val Ser His Ala Pro Cys Gly Ile Pro
35 40 45
Tyr Val Val Glu Gly Ile Ser Pro Lys Glu Lys Leu Met His Tyr Pro
50 55 60
Pro Glu Val Phe Ile Lys Lys Arg Gly Ile Asp Leu His Leu Lys Ala
65 70 75 80
Glu Val Ile Glu Val Glu Gln Gly Arg Val Arg Val Arg Glu Glu Asp
85 90 95
Gly Glu Lys Thr Tyr Glu Trp Asp Tyr Leu Val Phe Ala Asn Gly Ala
100 105 110
Ser Pro Gln Val Pro Ala Ile Glu Gly Ile Asp Leu Pro Gly Val Phe
115 120 125
Thr Ala Asp Leu Pro Pro Asp Ala Val Ala Ile Thr Glu Tyr Leu Glu
130 135 140
Lys Asn Pro Val Glu Asn Val Val Val Ile Gly Thr Gly Tyr Ile Ala
145 150 155 160
Ile Glu Met Ala Glu Ala Phe Val Glu Arg Gly Lys Asn Val Thr Leu
165 170 175
Ile Gly Arg Ser Glu Arg Val Leu Arg Lys Thr Phe Asp Lys Glu Ile
180 185 190
Thr Asp Ile Val Glu Glu Lys Leu Arg Asn His Leu Asn Leu Arg Leu
195 200 205
Glu Glu Val Thr Leu Arg Ile Glu Gly Lys Glu Arg Val Glu Arg Val
210 215 220
Val Thr Asp Ala Gly Glu Tyr Pro Ala Asp Leu Val Ile Val Ala Thr
225 230 235 240
Gly Ile Lys Pro Asn Thr Glu Leu Ala Arg Gly Leu Gly Val Arg Ile
245 250 255
Gly Glu Thr Gly Ala Ile Trp Thr Asn Asp Arg Met Gln Thr Ser Val
260 265 270
Glu Asn Val Tyr Ala Ala Gly Asp Val Ala Glu Thr Lys His Leu Ile
275 280 285
Thr Gly Arg Arg Val Trp Met Pro Leu Ala Pro Ala Gly Asn Lys Val
290 295 300
Ser His Gly Asx Tyr Val Ala Gly Ser Asn Ile Ala Gly Lys Glu Ile
305 310 315 320
His Phe Pro Gly Val Leu Gly Thr Ser Ile Thr Lys Phe Leu Asp Leu
325 330 335
Glu Ile Gly Lys Thr Gly Leu Thr Glu Ala Glu Ala Met Lys Glu Gly
340 345 350
Tyr Asp Val Arg Thr Ala Phe Ile Lys Ala Gly Thr Arg Pro His Tyr
355 360 365
Tyr Pro Gly Ser Lys Thr Ile Trp Leu Lys Gly Val Val Asp Asn Glu
370 375 380
Thr Asn Arg Leu Leu Gly Val Gln Ala Val Gly Gly Asp Ile Leu Pro
385 390 395 400
Arg Ile Asp Thr Ala Ala Ala Met Ile Thr Ala Gly Phe Thr Thr Lys
405 410 415
Asp Val Phe Phe Thr Asp Leu Ala Tyr Ala Pro Pro Phe Ala Pro Val
420 425 430
Trp Asp Pro Leu Ile Val Leu Ala Arg Val Leu Lys Phe
435 440 445
<210> 4
<211> 1326
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 4
atggaacgta aaaccgtggt ggttattggt ggtggtgcgg ccggtatgag caccgcgagc 60
cgtgtgaaac gtctgaaacc ggaatgggat gtgaaagttt ttgaagcaac cgaatgggtg 120
agccatgcac cgtgtggaat tccgtatgtt gttgagggaa ttagcccgaa agaaaaactg 180
atgcattatc cgccggaagt gtttattaaa aagcgtggta ttgatctgca tctgaaagca 240
gaagttattg aggttgaaca gggtcgtgtt cgtgtgcgtg aagaagatgg agaaaaaacc 300
tatgaatggg attatctggt ttttgcaaat ggtgcaagcc cgcaggttcc ggcaattgaa 360
ggtattgatc tgccgggtgt ttttaccgca gatctgccgc cggatgcagt tgcaattacc 420
gaatatctgg aaaaaaatcc ggttgaaaat gttgttgtta ttggtaccgg ttatattgca 480
attgaaatgg cagaagcatt tgttgaacgt ggtaaaaatg ttaccctgat tggtcgtagc 540
gaacgtgttc tgcgtaaaac ctttgataaa gaaattaccg atattgttga agaaaaactg 600
cgtaatcatc tgaatctgcg tctggaagaa gttaccctgc gtattgaagg taaagaacgt 660
gttgaacgtg ttgttaccga tgcaggtgaa tatccggcag atctggttat tgttgcaacc 720
ggtattaaac cgaataccga actggcacgt ggtctgggtg ttcgtattgg tgaaaccggt 780
gcaatttgga ccaatgatcg tatgcagacc agcgttgaaa atgtttatgc agcaggtgat 840
gttgcagaaa ccaaacatct gattaccggt cgtcgtgttt ggatgccgct ggcaccggca 900
ggtaataaaa tgggttatgt tgcaggtagc aatattgcag gtaaagaaat tcattttccg 960
ggtgttctgg gtaccagcat taccaaattt ctggatctgg aaattggtaa aaccggtctg 1020
accgaagcag aagcaatgaa agaaggttat gatgttcgta ccgcatttat taaagcaggt 1080
acccgtccgc attattatcc gggtagcaaa accatttggc tgaaaggtgt tgttgataat 1140
gaaaccaatc gtctgctggg tgttcaggca gttggtggtg atattctgcc gcgtattgat 1200
accgcagcag caatgattac cgcaggtttt accaccaaag atgttttttt taccgatctg 1260
gcatacgctc cgccgtttgc accggtttgg gatccgctga ttgttctggc acgtgttctg 1320
aaattt 1326
<210> 5
<211> 150
<212> PRT
<213> 未知(Unknown)
<400> 5
Met Leu Asp Gln Gln Thr Ile Asn Ile Ile Lys Ala Thr Val Pro Val
1 5 10 15
Leu Lys Glu His Gly Val Thr Ile Thr Thr Thr Phe Tyr Lys Asn Leu
20 25 30
Phe Ala Lys His Pro Glu Val Arg Pro Leu Phe Asp Val Ser His Gly
35 40 45
Asx Arg Gln Glu Ser Leu Glu Gln Pro Lys Ala Leu Ala Met Thr Val
50 55 60
Leu Ala Ala Ala Gln Asn Ile Glu Asn Leu Pro Ala Ile Leu Pro Ala
65 70 75 80
Val Lys Lys Ile Ala Val Lys His Cys Gln Ala Gly Val Ala Ala Ala
85 90 95
His Tyr Pro Ile Val Gly Gln Glu Leu Leu Gly Ala Ile Lys Glu Val
100 105 110
Leu Gly Asp Ala Ala Thr Asp Asp Ile Leu Asp Ala Trp Gly Lys Ala
115 120 125
Tyr Gly Val Ile Ala Asp Val Phe Ile Gln Val Glu Ala Asp Leu Tyr
130 135 140
Ala Gln Ala Val Glu Phe
145 150
<210> 6
<211> 441
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 6
atgctggacc agcagaccat taatattatt aaagccaccg ttccggtgct gaaagaacac 60
ggggtgacca ttaccaccac cttttataaa aacctgtttg ccaaacaccc ggaagttcgc 120
cctctgtttg atatgggtcg ccaggagagc ctggaacagc caaaagcact ggcaatgacc 180
gttctggcag cagcacagaa tatcgaaaac ctgcctgcaa tcctgcctgc agtgaaaaag 240
attgccgtga aacattgtca ggcaggagtc gcagcagcac actatcctat tgtgggccaa 300
gaactgctgg gtgcaatcaa agaagtcctg ggtgatgcag caacagatga tattctggac 360
gcatggggta aagcctatgg agtgattgca gatgttttta ttcaggtgga agcagatctg 420
tacgctcagg cagttgaata a 441

Claims (7)

1.一种共表达烯醇脱氢酶、NADPH氧化酶和血红蛋白的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞是采用非融合方式或融合方式，将烯醇脱氢酶编码基因、NADPH氧化酶编码基因和血红蛋白编码基因共同导入宿主细胞构建而成；
所述烯醇脱氢酶编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示；所述NADPH氧化酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所述血红蛋白编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；
所述重组细胞采用非融合方式构建的方法为：将所述烯醇脱氢酶编码基因插入pACYCDuet-1载体上的第一克隆位点Nco I和Hind III之间，将所述NADPH氧化酶编码基因插入pACYCDuet-1载体上的第二克隆位点Nde I和XhoI之间，得到第一重组载体pACYCDuet-1-YsADH-TkNOX；将所述血红蛋白编码基因插入第二载体pET28a上的EcoRI和Hind III之间，得到第二重组载体pET28a-VsHGB；将第一重组载体pACYCDuet-1-YsADH-TkNOX导入宿主细胞E. coli BL21(DE3)，得到重组细胞E. coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-YsADH-TkNOX；利用CaCl2法将重组细胞E. coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-YsADH-TkNOX制成感受态细胞，然后将第二重组载体pET28a-VsHGB导入该感受态中，得到共表达烯醇脱氢酶、NADPH氧化酶和血红蛋白的重组细胞E. coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-YsADH-TkNOX/pET28a-VsHGB；
所述重组细胞采用融合方式构建的方法为：根据融合蛋白技术原理，设计带有四种不同柔性连接肽的多对特异性引物，将烯醇脱氢酶编码基因、NADPH氧化酶编码基因和血红蛋白编码基因通过基因工程手段进行克隆，得到多组目的重组DNA片段；将得到的重组DNA片段插入到载体pACYCDuet-1上的限制性内切酶活性位点Nco I和Hind III之间，将得到的重组质粒导入宿主细胞E. coli BL21(DE3)中，得到重组细胞；所述连接肽为GSG，GGGGS，(GSG)2或(GGGGS)2。
2.一种权利要求1所述的重组细胞在催化α,β-不饱和醇氧化生成α,β-不饱和醛中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的应用为：以含烯醇脱氢酶编码基因、NADPH氧化酶编码基因和血红蛋白编码基因的重组细胞经诱导培养后湿菌体的冻干菌粉为催化剂，以α,β-不饱和醇为底物，以FAD和/或NADP+为辅酶，以pH 6.0～8.5的缓冲液为反应介质构成转化体系，在40～65℃、400～900 rpm条件下进行反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得α,β-不饱和醛。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的α,β-不饱和醇包括2-丁烯-1-醇、3-甲基-2-丁烯-1-醇、2-己烯-1-醇、香叶醇、橙花醇、肉桂醇、视黄醇或法尼醇。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述转化体系中，底物加入终浓度为50~300mM，所述催化剂加入量以转化体系体积计为20～60 g/L，所述FAD加入终浓度为0～1.0 mM，所述NADP+加入终浓度为0～1.0 mM，所述缓冲液为pH7.5～8.5、50 mM Tris-HCl或pH 6.0～7.0、50 mM PIPES溶液。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述反应在纯氧条件下进行。
7.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述冻干菌粉按如下方法之一制备：（1）所述非融合共表达的重组细胞按如下方法制备冻干菌粉：将重组细胞接种于含有终浓度100 μg/mL卡那霉素和50 μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，在37℃和200 rpm培养过夜，取培养物以体积浓度2％的接种量转接于含有100 μg/mL卡那霉素和50 μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，在37℃和200 rpm培养至菌体浓度OD600至0.6～0.8，向培养物中加入终浓度0.1～0.5mM的IPTG，在16～37℃诱导培养6-14 h，然后离心洗涤收集湿菌体，-80℃条件下冻干24 h，获得冻干菌粉；
（2）所述融合表达的重组细胞按如下方法制备冻干菌粉：将重组细胞接种于含有终浓度50 μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，在37℃和200 rpm培养过夜，取培养物以体积浓度2％的接种量转接于含有终浓度50 μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，在37℃和200 rpm培养至菌体浓度OD600至0.6～0.8，向培养物中加入终浓度0.1～0.5 mM的IPTG，在16～37℃诱导培养6-14 h，然后离心洗涤收集湿菌体，-80℃条件下冻干24 h，获得冻干菌粉。
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