CN106047826B - 醛脱氢酶、其重组表达转化体及在他汀前体合成中的应用 - Google Patents

醛脱氢酶、其重组表达转化体及在他汀前体合成中的应用 Download PDF

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Abstract

醛脱氢酶、其重组表达转化体及在他汀前体合成中的应用。本发明涉及一种催化活性高、立体选择性好、底物耐受性好的醛脱氢酶LeADH及其突变体，含有该酶及突变体基因的重组表达载体和重组表达转化体，重组LeADH的制备，以及LeADH在制备他汀药物中间体(3R,5S)‑6‑氯‑2,4,6‑三脱氧‑D‑赤型吡喃己糖内酯(CTeHL)中的应用。所述氧化酶为来源于长孢洛德酵母的醛脱氢酶，以NADP+为辅酶，反应生成的还原型辅酶NADPH在NADPH氧化酶NOX的催化下，以氧气作为氧化剂，实现NADP+的氧化再生。与现有技术相比，本发明所述酶法催化制备CTeHL的方法无须使用环境污染严重的化学氧化剂，绿色环保，并且具有反应条件温和、底物浓度高等优点，因此在降血脂药物他汀中间体的工业生产中具有很好的应用前景。

Description

醛脱氢酶、其重组表达转化体及在他汀前体合成中的应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，尤其是涉及一种醛脱氢酶、其重组表达转化体及其在他汀前体合成中的应用。
背景技术
他汀类药物泛指一类羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂药物，这类药物通过竞争性抑制内源性HMG-CoA还原酶，阻断细胞内羟甲戊酸代谢途径，使细胞内胆固醇合成减少，从而反馈刺激提高细胞膜表面(主要为肝细胞)低密度脂蛋白受体的数量和活性、增强胆固醇清除能力、降低血清胆固醇水平。他汀类药物还可抑制肝脏合成载脂蛋白B-100，减少血浆载脂蛋白AV的合成和分泌，从而作为一类经典和有效的降脂药物，广泛应用于高脂血症的治疗。
大多数他汀类药物都拥有一个共同的双羟基酸手性侧链，在之前的工作中，研究人员开发了一条利用2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(DERA)催化的醛缩反应制备他汀侧链关键手性中间体的路线(J.Am.Chem.Soc.1994,116,8422–8423)。该路线实际包括两个步骤，第一步中使用醛缩酶DERA催化乙醛与氯乙醛的缩合，制备得到带有两个羟基手性中心的他汀侧链中间体(3R,5S)-6-氯-2,4,6-三脱氧-D-赤型吡喃己糖(CTeHP)(CN 104560832A)；在第二步反应中，CTeHP氧化得到(3R,5S)-6-氯-2,4,6-三脱氧-D-赤型吡喃己糖内酯(CTeHL)，后者再通过后续化学法转化制备获得阿伐他汀等他汀类药物。目前为止，已报道的CTeHP氧化制备CTeHL的方法都是采用化学氧化法，反应中需要大量使用磷酸、次氯酸钙、溴水等化学试剂，大规模工业化生产中不仅污染环境，而且会损害工人健康。
与传统化学合成法相比，生物催化法具有反应条件温和、环境友好、操作简单等优点，因此，开发一个高效生物催化CTeHP氧化制备CTeHL的方法，以满足工业化生产他汀中间体CTeHL的需求，具有重大应用价值。
发明内容
本发明提供了一种通过NADP+依赖型的醛脱氢酶催化CTeHP氧化，制备CTeHL的方法，同时提供了一种催化活性高、立体选择性好、底物耐受性好的醛脱氢酶LeADH及其突变体，含有该酶及突变体基因的重组表达载体和重组表达转化体，重组LeADH的制备，以及LeADH在制备CTeHL中的应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
技术方案之一：
一种醛脱氢酶，其是如下(a)或(b)的蛋白质：
蛋白质(a)：由序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列组成的蛋白质；
蛋白质(b)：由SEQ ID No.2所示氨基酸序列经过替换一个或多个氨基酸而得到的CTeHP氧化活性提高的蛋白质。
所述蛋白质(a)的制备可以是从长孢洛德酵母Lodderomyces elongisporusCGMCC 2.3958中分离获得，或者从重组表达该醛脱氢酶的转化体中分离获得，也可以是人工合成获得。
所述短乳杆菌长孢洛德酵母Lodderomyces elongisporus CGMCC 2.3958购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，之后由本实验室自行保藏。本发明中，发明人对实验室保藏的100余株细菌进行培养，培养液离心，取适量静息细胞，悬浮于含有50mM CTeHP的磷酸钾缓冲液(100mM,pH 7.0)中，振摇反应，检测氧化反应产物CTeHL的浓度，对这些菌株催化CTeHP氧化反应的活性进行评价。其中Lodderomyces elongisporus CGMCC 2.3958表现出最好的反应效果。采用鸟枪法对源于Lodderomyces elongisporus CGMCC 2.3958的醛脱氢酶进行了克隆，获得一个具有较高活性的重组醛脱氢酶，命名为LeADH，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示。
所述蛋白质(b)是在蛋白质(a)的基础上经过一个或多个氨基酸单点替换而得到的具有醛脱氢酶活性的衍生蛋白质。在筛选获得高活性及高区域选择性醛脱氢酶LeADH的基础上，发明人对野生型LeADH进行蛋白质改造，以进一步提高该酶的活性。通过易错PCR技术对LeADH进行定向进化以及对LeADH的活性口袋和底物通道附近的氨基酸残基进行半理性设计，发现在SEQ ID No.2所示氨基酸序列的基础上对第87位的异亮氨酸残基、第127位的缬氨酸、第217位的谷氨酸、第235位的天冬酰胺残基和第236位的脯氨酸残基进行单点取代后，具有较高的CTeHP氧化活性，在此基础上，通过精心设计、筛选获得了酶活性显著提高的突变体。
技术方案之二：
一种分离的核酸，所述核酸是编码如技术方案一所述醛脱氢酶的核酸。
本发明所述核酸的制备方法为本领域常规制备方法，所述制备方法较佳地为：从Lodderomyces elongisporus CGMCC 2.3958中提取编码LeADH的核酸分子，或通过基因克隆技术获得编码LeADH及其突变体的基因核酸分子，或通过人工全序列合成的方法得到编码LeADH及其突变体的核酸分子。
本发明所述通过基因克隆技术获得编码LeADH及其突变体的基因核酸分子的方法为：以正向引物(Primer F)5’-TTCCATATGATGTCACAAACTGTCTTTGTC-3’，反向引物(PrimerR)5’-TATCTCGAGTTACTTGGCTTCCACAATTTG-3’，利用PCR技术对技术方案一中获得的LeADH及其突变体的基因DNA序列进行扩增。
PCR体系(50μL):rTaq 0.25μL，10×Buffer 5μL，dNTP Mix 4μL，模板质粒约100ng，Primer F 2μL，Primer R 2μL，MnCl2(10mM)0.5μL，diH2O补足至50μL。
PCR反应程序：(1)98℃变性3min；(2)98℃变性30sec；(3)55℃退火30s；(4)72℃延伸1min；步骤(2)～(4)共进行30个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存产物。
技术方案之三：
一种包含本发明醛脱氢酶LeADH或其突变体核酸序列的重组表达质粒。
其可通过本领域常规方法将本发明的醛脱氢酶或其突变体核酸序列连接于各种常规质粒载体上构建而成，所述载体质粒优选质粒pET28a。所述醛脱氢酶基因可以操作性地连接于适合表达的调控序列的下游，以实现所述醛脱氢酶的组成型或诱导型表达。
技术方案之四：
一种包含本发明醛脱氢酶基因或其重组表达质粒的重组表达转化体。
其可通过将本发明的重组表达质粒转化至合适的宿主细胞中来制得所述重组表达转化体。所述宿主细胞可以是本领域的各种常规宿主细胞，前提是能使所述重组表达质粒稳定地自行复制，且其所携带的醛脱氢酶基因可被有效表达。本发明优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌BL21(DE3)或大肠杆菌DH5α。
技术方案之五：
一种重组醛脱氢酶的制备方法，其包括如下步骤：培养本发明的重组表达转化体，获得重组醛脱氢酶。其中，培养所述重组表达转化体所用的培养基可选自本领域的常规培养基，前提是可使重组表达转化体生长并产生本发明所述的醛脱氢酶。其他培养转化体的具体操作均可按本领域常规操作进行。优选的，将上述技术方案构建的含有醛脱氢酶基因的重组大肠杆菌，接种至含50μg/ml硫酸卡那霉素的LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0)中，37℃振荡培养至OD600达到1.0，按1％(v/v)的接种量接入装有100mL LB培养基的500mL三角瓶中，置于37℃、180rpm摇床振荡培养，当培养液的OD600达到0.6时，加入终浓度为0.1mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)作为诱导剂，20℃诱导24h后，将培养液离心，收集细胞，并用生理盐水洗涤两次，获得静息细胞。将所得的静息细胞悬浮于10mL的缓冲液(pH 8.0)中，在冰浴中超声破碎，离心收集上清液，即得到重组醛脱氢酶的粗酶液。
醛脱氢酶的活性检测是在分光光度计上通过测定辅酶NADPH的生成量进行，CTeHP在LeADH及其突变体的催化下产生的NADPH，引起340nm波长下的吸光度上升(ε＝6.22mmol-1·cm-1)。吸光度上升的速率与CTeHL的生成速率是一致的。该反应在30℃下进行，反应体系：100mM磷酸钾缓冲液(pH 8.0)、2mM的CTeHP，1mM的NADP+以及适量的醛脱氢酶。连续监测10min内吸光度的变化，从而确定初始反应速率。一个ADH酶活单位(U)的定义为在上述条件下，每分钟氧化1μmol的CTeHP，生成1μmol的CTeHL所需要的酶量。
技术方案之六：
将本发明的醛脱氢酶应用于催化CTeHP的氧化反应以制备光学活性的CTeHL。
其中，CTeHP和CTeHL的结构如下所示：
其中，I：CTeHP，即(3R,5S)-6-氯-2,4,6-三脱氧-D-赤型吡喃己糖；II：CTeHL，即(3R,5S)-6-氯-2,4,6-三脱氧-D-赤型吡喃己糖内酯。
本发明所述的醛脱氢酶是NADP+依赖型的，反应过程中NADP+被还原生成NADPH，需要将NADPH氧化再生为NADP+。本发明优选NADPH氧化酶SmNOX(Comput.Struc.Biotechnol.J.2014,9,e201402005.)催化NADPH的氧化，以氧气作为最终的氧化剂。更优选的，本发明中将活性提高的醛脱氢酶突变体与NADPH氧化酶NOX共表达于大肠杆菌中，使用共表达的重组整细胞作为催化剂，催化CTeHP的氧化反应。由于细胞内自身存在低浓度的辅酶NADPH/NADP+，因此在较低底物浓度条件下，反应体系中可以无需外加辅酶NADPH/NADP+。
所述的NADPH氧化酶NOX是如序列表中SEQ ID No.4所示氨基酸序列的蛋白质。
氧化反应的底物CTeHP的浓度、反应条件如反应温度、底物浓度、pH、缓冲液组成、酶用量等可按本领域此类反应的常规条件进行选择。
优选的酶促CTeHP氧化的条件如下：将适量共表达重组醛脱氢酶LeADH突变体以及NADPH氧化酶NOX的整细胞，悬浮于缓冲液中，优选pH 7.0的磷酸钾缓冲液，加入底物CTeHP的浓度为50～500mM，加入适量NADP+，反应液充分混合反应。反应在20℃～40℃下进行，优选30℃。反应结束后用乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液，加无水硫酸钠干燥过夜。旋转蒸发除去溶剂即可得到高纯度的(3R,5S)-6-氯-2,4,6-三脱氧-D-赤型吡喃己糖内酯。
本发明的积极进步效果在于：本发明醛脱氢酶LeADH及其突变体具有高效催化CTeHP氧化，制备光学活性(3R,5S)-6-氯-2,4,6-三脱氧-D-赤型吡喃己糖内酯的性能。在CTeHP浓度高达200mmol/L，催化剂使用量为10g/L时，6h产物的得率高于99％。相对于其它制备方法，使用本发明方法制备所得的产物浓度高，光学纯度好，反应条件温和，对环境友好，操作简便，易于工业放大，因此具有很好的工业应用前景。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1醛脱氢酶LeADH基因的克隆
将菌株Lodderomyces elongisporus CGMCC 2.3958在LB培养基中进行培养，采用CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法提取大片段的高纯度基因组总DNA。将适量培养的Lodderomyces elongisporus CGMCC 2.3958细胞加入液氮冷冻，研磨成粉，加入适量2×CTAB提取缓冲液(100mmol/L Tris-HCl,20mmol/L EDTA,1.4mol/L NaCl,20g/L CTAB，40mmol/L巯基乙醇,pH 8.0)，65℃保温10分钟，间歇摇动。随后加入等体积的氯仿/异戊醇，轻缓颠倒离心管混匀，室温下，12000rpm离心10min，将上清液转移到另一离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇，来回颠倒离心管混匀，室温，12000rpm离心10分钟。将上层水相转移到新的离心管中，加入等体积异丙醇混匀，室温放置30分钟。4000rpm离心10分钟，移去上清液，用70％乙醇漂洗，风干后加入20μl的TE缓冲液(100mM Tris-HCl,10mM EDTA,pH 8.0)溶解DNA，-20℃保存备用。
采用Sau3AI对提取的总DNA进行部分酶切，酶切后的DNA片段通过电泳进行纯化，采用胶回收纯化试剂盒回收大约2～6kb的片段，回收的DNA溶解于Tris-HCl(10mmol/L,pH8.0)中，置于-20℃保藏。
按如下反应体系与载体pUC118进行连接：
16℃温育12小时，取10μL酶连产物转化200μL大肠杆菌DH5α感受态细胞(TaKaRa，Code:D9057)，涂布含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基平板，从平板上挑取单克隆接入加有300μL含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基的深孔板，37℃振荡培养过夜，接种50μL至加有600μL含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基的二级深孔板，37℃振荡培养3h后加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG诱导24h。取50μL菌液加入到300μL含有终浓度为100mM的CTeHP的反应混合液中，37℃振荡反应1h，然后加入等体积乙醇终止反应，薄板层析检测产物的生成，有明显产物生成的定义为阳性克隆子。对20000个克隆进行了活性检测，将获得的阳性克隆子委托上海桑尼生物技术有限公司进行序列测定，依据测序结果，对推测的开放阅读框序列进行亚克隆以及活性鉴定，最终获得如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，根据该核苷酸序列所推测的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，将该序列表达的醛脱氢酶命名为LeADH。
实施例2重组LeADH的质粒以及重组菌、重组酶的制备
以正向引物5’-TTCCATATGATGTCACAAACTGTCTTTGTC-3’，反向引物5’-TATCTCGAGTTACTTGGCTTCCACAATTTG-3’，利用聚合酶链式反应技术对实施例1中获得的LeADH的核苷酸序列进行扩增，将获得的含有LeADH基因序列的DNA片段分别用限制性内切酶EcoR I和Hind III双酶切，随后与同样经过EcoRI和HindIII双酶切的质粒pET28a进行连接，获得重组质粒pET28a-LeADH。
将获得的质粒pET28a-LeADH转化到大肠杆菌E.coli BL21中，构建的重组大肠杆菌接种至含有50μg/ml硫酸卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，按1％(v/v)的接种量接入装有600mL LB培养基的2L三角瓶中，置37℃、180rpm摇床振荡培养，当培养液的OD600达到1.2时，加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG作为诱导剂，20℃诱导24h后，将培养液离心，收集细胞，并用生理盐水洗涤两次，获得静息细胞。将所得的静息细胞悬浮于KPB缓冲液(20mM,pH 7.0)中，高压匀浆机破碎，离心收集上清液，冷冻干燥即获得LeADH重组酶，活力为2.1U/mg。
实施例3活性提高的LeADH突变体
对LeADH的三维结构中，距离结合口袋范围内的氨基酸残基进行组合饱和突变。设计相应简并引物，采用II Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene,Catalog#200522)所述方案进行酶的突变改造操作。其中进行突变的引物分别为：
85&87_for
CTTCACACAGCATCACCCNDTGTTNDTAAGACCACAGATGTTGAA
85&87_rev
TTCAACATCTGTGGTCTTAHNAACAHNGGGTGATGCTGTGTGAAG
127&128_for
ACGTTGTGGTTACTTCTTCTNDTNDTACAATGTTTAATTCCGTAGC
127&128_rev
GCTACGGAATTAAACATTGTAHNAHNAGAAGAAGTAACCACAACGT
129&131_for
TGGTTACTTCTTCTGTTGTCNDTATGNDTAATTCCGTAGCTGCACCCG
129&131_rev
CGGGTGCAGCTACGGAATTAHNCATAHNGACAACAGAAGAAGTAACCA
161&162_for
ACACATTGAAGAATCCTNDTNDTTACGGATACCCAGCATC
161&162_rev
GATGCTGGGTATCCGTAAHNAHNAGGATTCTTCAATGTGT
195&196_for
CTCAGTTGCCACAATCCATCCANDTNDTGTTTTCGGTCCCCAAG
195&196_rev
CTTGGGGACCGAAAACAHNAHNTGGATGGATTGTGGCAACTGAG
213&217_for ggacaaaagtcagttgaacNDTtcaagtgagNDTataaacaagattttgaagctg
213&217_rev cagcttcaaaatcttgtttatAHNctcacttgaAHNgttcaactgacttttgtcc
235&236_for
ACAAACTTCCAGCAGGTGCTNDTNDTTTTACTGACGTGAGAGAC
235&236_rev
GTCTCTCACGTCAGTAAAAHNAHNAGCACCTGCTGGAAGTTTGT
其中N＝A/C/G/T，D＝A/G/T，H＝A/C/T。
PCR反应体系(50μl)：模板0.5～20ng，5μl 10×KOD plus buffer，5μl dNTP(各2.0mM)，2μl MgSO4(25mM)，一对突变引物各1μl(20μM)，1个单位的KOD酶(TOYOBO CO.,LTD.,Osaka,Japan)，加灭菌蒸馏水至50μl。其中所述的模板为实施例2获得的质粒pET28a-LeADH。
PCR反应程序：(1)94℃变性5min；(2)94℃变性30sec；(3)55℃退火1min；(4)68℃延伸7min，步骤(2)～(4)共进行30个循环，最后68℃延伸10min，4℃保存产物。
扩增得到的PCR产物在37℃经内切酶DpnI消化2h后转化E.coli BL21感受态细胞，并均匀涂布于含有50μg/ml硫酸卡那霉素的LB琼脂平板。37℃过夜培养后，分别挑取单克隆进行活力测定，将活力显著提高的克隆子送上海桑尼生物科技有限公司进行测序，结果如表1所示。在此基础上，对获得的突变点以及P150Q突变进行组合，获得活力进一步提高的组合突变体，如表1所示。
表1 LeADH突变体的活性
其中：+代表活力提高1-3倍；++代表活力提高3-10倍；+++代表活力提高10-20倍。
实施例4重组LeADHN235H/P236H粗酶制备
将获得的表达重组LeADHN235H/P236H的大肠杆菌接种至含50μg/ml硫酸卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，按1％(v/v)的接种量接入装有600mL LB培养基的2L三角瓶中，置37℃、180rpm摇床振荡培养，当培养液的OD600达到1.2时，加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG作为诱导剂，20℃诱导24h后，将培养液离心，收集细胞，并用生理盐水洗涤两次，获得静息细胞。将所得的静息细胞悬浮于KPB缓冲液(20mM,pH 7.0)中，高压匀浆机破碎，破碎液离心，冷冻干燥即得LeADHN235H/P236H重组酶，活力为9.6U/mg。
实施例5突变体LeADHN235H/P236H与SmNOX的共表达
SmNOX的基因如SEQ ID No.3所示，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，并构建在pETDuet质粒上(pETDuet-SmNOX)。以正向引物5’-TTCCATATGATGTCACAAACTGTCTTTGTC-3’，反向引物5’-TATCTCGAGTTACTTGGCTTCCACAATTTG-3’，利用聚合酶链式反应技术对实施例3中获得的LeADHN235H/P236H的核苷酸序列进行扩增，将获得的含有LeADHN235H/P236H基因序列的DNA片段分别用NdeI和XhoI双酶切，随后与同样经过NdeI和XhoI双酶切的质粒pETDuet-SmNOX进行连接，获得质粒pETDuet-SmNOX-LeADHN235H/P236H。
将获得的质粒pET28a-SmNOX-LeADHN235H/P236H转化到大肠杆菌E.coli BL21中，构建的重组大肠杆菌接种至含有50μg/ml硫酸卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，按1％(v/v)的接种量接入装有600mL LB培养基的2L三角瓶中，置37℃、180rpm摇床振荡培养，当培养液的OD600达到1.2时，加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG作为诱导剂，20℃诱导24h后，将培养液离心，收集细胞，并用生理盐水洗涤两次，获得静息细胞，冷冻干燥即得E.coliBL21(DE3)/pETDuet-smnox-leadhN235H/P236H。
实施例6-8共表达重组细胞催化CTeHP的氧化反应
将100mg如实施例5获得的重组E.coli BL21(DE3)/pETDuet-smnox-leadhN235H/P236H冻干细胞加入到10mL磷酸钾缓冲液(100mM,pH 6.0)中，加入底物CTeHP终浓度分别为100mM，在20-40℃下混匀反应。每隔30min取样500μL，加入800μL乙酸乙酯萃取，加无水硫酸钠干燥过夜，用气相色谱(毛细管柱HP-5MS)分析测定产物得率。具体分析条件为：以氮气为载气，进样口温度250℃，检测器温度280℃，初始柱温50℃，以20℃/min的速率升温至200℃，保持5min。反应最终结果列于表2，30℃条件下产物得率最高。
表2温度对重组共表达细胞催化CTeHP氧化反应的影响
实施例9-13不同底物浓度下共表达细胞催化CTeHP氧化反应
将适量如实施例5获得的重组E.coli BL21(DE3)/pETDuet-smnox-leadhN235H/P236H冻干细胞加入到10mL磷酸钾缓冲液(100mM,pH 7.0)中，加入CTeHP至终浓度分别为50mM～500mM，在30℃下混匀反应。每隔30min取样500μL，加入800μL乙酸乙酯萃取，加无水硫酸钠干燥过夜，用气相色谱(毛细管柱HP-5MS)分析测定产物得率。具体分析条件为：以氮气为载气，进样口温度250℃，检测器温度280℃，初始柱温50℃，以20℃/min的速率升温至200℃，保持5min。结果列于表3。
表3.不同底物浓度下，E.coli BL21(DE3)/pETDuet-smnox-leadhN235H/P236H冻干细胞催化CTeHP的氧化反应
实施例14(3R,5S)-6-氯-2,4,6-三脱氧-D-赤型吡喃己糖内酯的十克级制备
反应在1L三口烧瓶中进行，加入500mL磷酸钾缓冲液(100mM，pH 7.0)，加入CTeHP至终浓度为0.2M，加入10g如实施例5制备的E.coli BL21(DE3)/pETDuet-smnox-leadhN235H/P236H整细胞，在25℃，100rpm机械搅拌下反应。反应4h后，转化率达到98％。停止反应，加入500mL乙酸乙酯进行萃取，重复三次，合并萃取液，旋转蒸发除去溶剂，获得(3R,5S)-6-氯-2,4,6-三脱氧-D-赤型吡喃己糖内酯13.8g，收率为84.1％，产品GC纯度为98.0％。
对比实施例
经序列比对，本发明所述的醛脱氢酶LeADH与已公开的序列XP_001527075.1具有99％的同源性，其区别在于，本发明所述醛脱氢酶LeADH的150位的氨基酸残基为脯氨酸残基，而已公开序列XP_001527075.1的相应位点氨基酸残基为谷氨酰胺残基。我们通过蛋白质工程技术将LeADH的150位脯氨酸残基改造为谷氨酰胺残基，经测定，后者也具有催化CTeHP氧化的活性，但其比活力仅为1.4U/mg，低于本发明所述野生型醛脱氢酶LeADH(2.1U/mg)。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种醛脱氢酶，其特征在于，其为NADP+依赖型的醛脱氢酶，是蛋白质(a)或蛋白质(b)：
蛋白质(a)：如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的蛋白质；
蛋白质(b)：选自如下序列对应的蛋白质：
(1)SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第87位的异亮氨酸残基替换为苯丙氨酸残基；或，
(2)SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第127位的缬氨酸残基替换为半胱氨酸残基；或，
(3)SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第217位的谷氨酸残基替换为缬氨酸残基；或，
(4)SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第235位的天冬酰胺残基替换为组氨酸残基；或，
(5)SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第236位的脯氨酸残基替换为组氨酸残基；或，
(6)SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第236位的脯氨酸残基替换为酪氨酸残基；或，
(7)SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第235位的天冬酰胺残基替换为组氨酸残基，第236位的脯氨酸残基替换为酪氨酸残基；或，
(8)SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第235位的天冬酰胺残基替换为组氨酸残基，第236位的脯氨酸残基替换为组氨酸残基；或，
(9)SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第150位的脯氨酸残基替换为谷氨酰胺残基，第235位的天冬酰胺残基替换为组氨酸残基，第236位的脯氨酸残基替换为组氨酸残基；或，
(10)SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第87位的异亮氨酸残基替换为丙氨酸残基，第235位的天冬酰胺残基替换为组氨酸残基，第236位的脯氨酸残基替换为组氨酸残基；或，
(11)SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第87位的异亮氨酸残基替换为丙氨酸残基，第150位的脯氨酸残基替换为谷氨酰胺残基，第235位的天冬酰胺残基替换为组氨酸残基，第236位的脯氨酸残基替换为组氨酸残基；或，
(12)SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第87位的异亮氨酸残基替换为丙氨酸残基，第127位的缬氨酸残基替换为半胱氨酸残基，第235位的天冬酰胺残基替换为组氨酸残基，第236位的脯氨酸残基替换为组氨酸残基。
2.一种分离的核酸，其特征在于，所述的核酸是编码如权利要求1所述的醛脱氢酶的核酸分子。
3.一种重组表达质粒，其特征在于，含有如权利要求2所述的核酸。
4.一种重组表达转化子，其特征在于，含有如权利要求3所述的重组表达质粒。
5.一种如权利要求1所述的醛脱氢酶的应用，其特征在于，使用所述的醛脱氢酶催化(3R,5S)-6-氯-2,4,6-三脱氧-D-赤型吡喃己糖氧化生成(3R,5S)-6-氯-2,4,6-三脱氧-D-赤型吡喃己糖内酯。
6.根据权利要求5所述的醛脱氢酶的应用，其特征在于，所述的醛脱氢酶催化(3R,5S)-6-氯-2,4,6-三脱氧-D-赤型吡喃己糖氧化生成(3R,5S)-6-氯-2,4,6-三脱氧-D-赤型吡喃己糖内酯的反应与NADPH氧化酶NOX催化的NADPH氧化反应耦联，实现辅酶NADP+的循环再生。
7.根据权利要求6所述的醛脱氢酶的应用，其特征在于，所述的NADPH氧化酶NOX是如序列表中SEQ ID No.4所示氨基酸序列的蛋白质。
8.根据权利要求6所述的醛脱氢酶的应用，其特征在于，(3R,5S)-6-氯-2,4,6-三脱氧-D-赤型吡喃己糖的浓度为50～500mM，反应温度为20～40℃。
9.根据权利要求6所述的醛脱氢酶的应用，其特征在于，所述的(3R,5S)-6-氯-2,4,6-三脱氧-D-赤型吡喃己糖和(3R,5S)-6-氯-2,4,6-三脱氧-D-赤型吡喃己糖内酯的结构如下所示：
其中，I：(3R,5S)-6-氯-2,4,6-三脱氧-D-赤型吡喃己糖；II：(3R,5S)-6-氯-2,4,6-三脱氧-D-赤型吡喃己糖内酯。
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