CN112662638A

CN112662638A - 一种新型r-选择性苯乙烯单加氧酶的功能

Info

Publication number: CN112662638A
Application number: CN202110065751.1A
Authority: CN
Inventors: 吴中柳; 肖虎; 刘艳; 裴小琼
Original assignee: Chengdu Institute of Biology of CAS
Current assignee: Chengdu Institute of Biology of CAS
Priority date: 2021-01-18
Filing date: 2021-01-18
Publication date: 2021-04-16
Anticipated expiration: 2041-01-18
Also published as: CN112662638B

Abstract

本发明公开了一种来源于Streptomyces exfoliatus sp.A1013Y的新型苯乙烯单加氧酶SeStyA及其在催化不对称环氧化中的应用。该酶与传统的苯乙烯单加氧酶相比，对苯乙烯类底物具有相反的选择性，生成的环氧产物为R型，且该酶具有较宽的底物谱，催化溴和氯取代苯乙烯等底物均有活性。本发明为R型环氧化合物的生物催化制备提供了可供选择的新酶源。

Description

一种新型R-选择性苯乙烯单加氧酶的功能

技术领域

本发明涉及一种新型苯乙烯单加氧酶SeStyA的催化功能，经该酶催化苯乙烯类底物可获得R-构型环氧产物，属于应用微生物及酶工程领域。

背景技术

手性环氧化物是有机合成中的重要组成部分，它们被广泛用作合成活性药物成分、天然产品、香料和香精、其他精细化学品和高级聚合材料的中间体。与化学催化相比，酶催化具有优异的立体选择性、温和的反应条件以及对环境友好等优点，因此近年来生物催化已成为有机合成中的重要手段。苯乙烯单加氧酶(Styrene Monooxygenase,SMO，EC1.14.14.11)是由单加氧酶(StyA，EC1.14.14.11)和黄素还原酶(StyB，EC 1.5.1.36)组成，其中单加氧酶StyA组分决定环氧化反应的立体选择性。SMO以FADH₂作为电子供体，可立体选择性催化苯乙烯及其衍生物环氧化生成相应的环氧化合物。SMOs首次报道于假单胞菌属(Pseudomonas sp.)物种中，研究者对已报道的10余个苯乙烯单加氧酶进行了深入研究，这些SMOs序列相似度高，酶学性能差异较小，并且催化形成的环氧化合物的立体选择性单一，野生型酶催化只能生成S构型的环氧产物，且试图通过酶的人工进化得到相反构型的产物也非常困难，限制了其应用范围。

随着全基因组测序技术的不断发展，NCBI数据库中已经公布了大量的基因序列，为我们提供了丰富的酶资源库，通过数据库挖掘的方法是寻找新型苯乙烯单加氧酶的有效途径。目前，仅报道了一个来源于链霉菌的苯乙烯单加氧酶StStyA能催化生成R构型环氧产物(Enzyme Microb.Tech.2020,132:109391)。但是该酶催化效率较低，立体选择性也有待提高，底物谱范围窄，因此进一步深入挖掘出更多优异的R型SMOs很有必要。

发明内容

本发明目的是公开一种来源于Streptomyces exfoliatus sp.A1013Y新型苯乙烯单加氧酶SeStyA的功能，并提供了该基因构建的重组菌用于催化不对称环氧化反应的方法。

该新型苯乙烯单加氧酶SeStyA的特征是：核苷酸长度为1284bp，序列为SEQ IDNo.1所示，所编码的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。

本发明的苯乙烯单加氧酶SeStyA基因是通过NCBI数据库挖掘的方法获得，之后通过分子克隆构建相关载体并进行异源表达及生物转化，从而得到了R型环氧产物。

根据本领域公共知识，构建的相关载体、基因工程菌等也属于本发明的保护范围。

本发明的苯乙烯单加氧酶SeStyA是通过基因组数据库挖掘的方法获得的：我们以已报道的来源于Streptomyces sp.NRRL S-3的StStyA蛋白序列(GenBank登录号WP_030740546.1)为参考序列在NCBI数据库中进行BLAST，选取相似度大于49％的序列，通过系统发育分析后选取目的基因，由上海生工生物工程有限公司合成，并连接至pET28a(+)载体，上、下游限制性内切酶位点分别为EcoR I/Hind III，获得的质粒命名为pETSeStyA。

由于苯乙烯单加氧酶环氧化过程需要黄素氧化还原酶StyB的参与，因此进一步构建了包含SeStyA、linker和StyB(GenBank登录号ADE62391.1)共表达载体，Linker为连接SeStyA和黄素氧化还原酶StyB的一段核苷酸序列；黄素氧化还原酶StyB为环氧化反应提供辅酶FADH₂。将共表达载体在大肠杆菌中异源表达，以全细胞催化体系验证苯乙烯单加氧酶SeStyA的功能，反应可以得到(R)-苯乙烯环氧，ee为95％，详见实施例1。本发明还提供了SeStyA以全细胞催化体系在不同底物生物转化中的应用，详见实施例2。

本发明构建了纯酶催化体系以测定酶动力学参数，详见实施例3，该体系涉及的酶包括SeStyA纯酶、黄素氧化还原酶StyB，羰基还原酶ChKRED20(NCBI登录号：KC342020)。体系的辅酶循环过程见说明书附图1。羰基还原酶ChKRED20按照文献报道方法对该酶进行异源表达(J.Mol.Catal.B:Enzym.2014,105:82-88)。纯酶催化反应体系包括：磷酸钾缓冲液、SeStyA纯酶、StyB纯酶，ChKRED20纯酶、FAD⁺、NAD⁺、异丙醇、过氧化氢酶，苯乙烯。

本发明与已有技术相比具有如下优势：

本发明涉及的苯乙烯单加氧酶SeStyA对大部分苯乙烯类底物具有相反的立体选择性，生成的环氧产物为R型，且该酶较之前公开的R型苯乙烯单加氧酶StStyA具有更高的活性和更广的底物谱，SeStyA催化溴和氯取代苯乙烯均有活性，为这些底物对应的(R)-构型环氧的合成提供了高选择性的生物催化途径，同时也为生物催化合成R型环氧产物提供了更多可供选择的酶源。

附图说明

图1SeStyA纯酶催化体系；

图2蛋白质电泳图。M：蛋白质marker；1：pET28a(+)空载体上清液；2：SeStyA上清液；3：SeStyA纯酶液。

具体实施方式

以下结合实施例详细地说明本发明。实施方案为便于更好的理解本发明，但并非对本发明的限制。

实施例1苯乙烯单加氧酶SeStyA共表达载体构建和活性验证

pETAB是我们以前工作中构建的质粒(J.Mol.Catal.B:Enzym.2010,67:236-241),包含StyA、linker和StyB的DNA片段。本发明将SeStyA替换pETAB中StyA基因，保留linker和StyB，从而构建一个具有完整催化体系的人工双组分质粒pETSeStyAB。

具体做法如下：

(1)以质粒pETAB为模板，通过定点突变技术将pETAB的Linker区引入Spe I限制性位点。所用引物5'-GCCGACCATTGCAGCCTGAACTAGTCTCCGCTGGCCATGCCAGC-3'和5'-CTGGCATGGCCAGCGGAGACTAGTTCAGGCTGCAATGGTCGG-3'。将得到的质粒用Nde I和Spe I进行双酶切，获得酶切后的载体片段。具体方法为本领域常规方法。

(2)扩增SeStyA的DNA片段：引物5'-TAATTACATATGACCGACACCGGCA-3'和5'-TATACTAGTTCATCCATGCGCCACGT-3'，模板为实施例1中的质粒pET28-SeStyA，并用Nde I和Spe I进行双酶切。将(1)获得的载体片段和此处SeStyA的DNA片段进行连接。通过DNA测序验证新构建的质粒并将其命名为pETStStyAB(SEQ ID No.3)。具体方法为本领域常规方法。

SeStyA活性验证：将重组质粒通过化学法转入E.coli BL21(DE3)，涂布含有卡那霉素(50μg/mL)的LB平板，37℃过夜培养。挑取单克隆于含有卡那霉素(50μg/mL)LB培养基中，37℃、180rpm过夜培养。以1％的接种量接种于TB培养基中，37℃振荡培养3h，待OD₆₀₀约为0.8时，加入终浓度为0.05mM的IPTG，将温度调为20℃诱导18h后，6000rpm、4℃离心10min，弃上清，菌体用生理盐水清洗两次，收集新鲜菌体备用。全细胞催化体系：0.5g湿菌体，5mL 0.1M磷酸钾缓冲液(pH＝7.0)，4mM苯乙烯；反应在30℃摇床中以200rpm振荡反应2h后，用乙酸乙酯萃取终止反应后，GC和HPLC检测产物转化率和ee值，结果显示SeStyA催化苯乙烯生成(R)-苯乙烯环氧，转化率为100％，ee为95％。

实施例2不同底物的生物催化

全细胞反应体系同实施例1，底物浓度为4mM。底物谱如表1所示，从表1可以看出，SeStyA对苯乙烯、1，2-二氢萘、3-溴苯乙烯具有较高的催化活性，其中对苯乙烯和1，2-二氢萘的转化率可达100％,而对2-溴苯乙烯、4-溴苯乙烯、4-氯苯乙烯的活性较低；SeStyA催化4-溴苯乙烯、4-氯苯乙烯生成S型环氧产物，而催化其他底物均生成R型环氧产物。

表1 SeStyA全细胞生物转化结果

a表示反应时间4小时.

实施例3SeStyA的酶动力学参数测定

SeStyA异源表达：将pETSeStyA质粒通过化学法转入E.coli BL21(DE3)，涂布含有卡那霉素(50μg/mL)的LB平板，37℃过夜培养。挑取单克隆至含有卡那霉素(50μg/mL)的LB培养基中，37℃、180rpm过夜培养。以1％的接种量接种于TB培养基中，37℃振荡培养3h，待OD₆₀₀约为0.8时，加入终浓度为0.05mM的IPTG，将温度调为20℃诱导18h后，6000rpm、4℃离心10min，弃上清，菌体用生理盐水清洗两次，加入0.1M的pH 7.0磷酸钾缓冲液重悬菌体并混匀，超声波破碎细胞(工作条件：功率200W，工作3s，间歇3s，工作次数99次)，离心，上清即为粗酶液。

SeStyA纯化：将上述粗酶液通过Ni²⁺-NTA柱(Qiagen，Valencia，CA)纯化，纯化方法为常规方法，参见手册。洗脱液为Tris-HCl缓冲液(10mM，pH 7.5)、300mM NaCl和250mM咪唑，收集目的蛋白并透析。透析液组分为：Tris-HCl缓冲液(25mM，pH 7.5)、50mM NaCl、2mMDTT和1mM EDTA。用SDS-PAGE分析样品纯度，SeStyA蛋白电泳图见附图2；用Nano-drop 2000分光光度计(Nano Drop Technologies，USA)测定蛋白浓度。

SeStyA的酶动力学参数测定：

反应体系为1mL，包括0.1M磷酸钾缓冲液(pH＝7.0)，20μM SeStyA，10μM StyB，8μMChKRED20，650U过氧化氢酶，100μM NAD⁺，50μM FAD⁺，260mM异丙醇，0.2～20mM苯乙烯。反应在30℃水浴中、150rpm反应5min，用乙酸乙酯萃取终止反应，GC检测转化率。GraphpadPrism软件非线性回归拟合Michaelis-Menten方程得到酶动力学参数：SeStyA的Km＝1.544±0.269mM，k_cat＝0.208±0.010s^-1。

该反应体系中黄素氧化还原酶StyB的获得方法为：含有黄素氧化还原酶StyB基因的质粒pETB为先前构建，其蛋白表达纯化方法为文献报道的方法(J.Mol.Catal.B:Enzym.2010,67:236-241)。

序列表

<110> 中国科学院成都生物研究所

<120> 一种新型R-选择性苯乙烯单加氧酶的功能

<141> 2021-01-11

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1284

<212> DNA

<213> Streptomyces exfoliatus sp. A1013Y

<400> 1

atgaccgaca ccggcaccgg caccggcaac accgagaccg acatcggcat catcggttcc 60

ggtatctccg ggctgcaact ggccttacgc ctccagcagc tcggcgtacc agtgacgctg 120

tactccgcgc agaccgccga agagctcggc tcggcgcggc cgcggaactt ccccgcccgg 180

ttcgccccga cgcaagcgcg cgaggactcg ctcggcgtgc acgcctggca gttcgacgac 240

gcccgggtgc acagctgggc gatcaccatc cacggcgagg gcgccgacct ggagttcgcc 300

gcggcgctcg caccgccgtc gagcgtggtg gacttccgcc tctacctgcc gcacctgctc 360

accgagttcg cccggcgcgg cgggaacgta cggatcggcc cggtcgtggt ggacgaggtc 420

gcccgtcggc acgacctggt ggtggtcgcc aacggcgacc ggtccatgcg ggagctgttc 480

cccgtggacc ccgagcggtc gccccacacg acaccccagc ggatcctgtg cagcggcttc 540

taccacggca tccgggagga cgtcccgcac gagctggaca tccacttcct gcccgggatc 600

ggggagatcc tgcggatacc gttcctgtcc cgcctcggtc cggcccacgt gctggccttc 660

gaggcggtgc cgggcggccc gctggaggcg cccgcccacc tggacgccgc cgccgatccg 720

gccggcttcc accgcgaggt gctgcgtctg ctggccgcgt acgcgccgag tctgcgcgaa 780

cgcgtcgaca ccgcgcggtt cggcctcgtc gcaccgggcg aactggcgca gggcggcgtc 840

acgccgaccg tccgccgggg atgggcgcgc ctcgccgacg gcacgtgcgc cctggccatc 900

ggtgacgcct ggatcaccaa cgatccgctc accgcccagg gcgccaacct cggctcgcac 960

acggcgttcg cgctggccga tctcatcgcc tccgccaccg gtccgctcga cgacgcgttc 1020

tgccgcgacg cgtcggcccg gctgtgggac cacgcacgcc atgtcgtcga gtggagcaac 1080

gccttcctgg cgccgccccc gccgcacgtc atggagctgt tcggccgggc ggccggcgac 1140

aagcagatcg cggacgcgtt cgtcggccgg ttccacgacc cggtggcgat gtgggccgtg 1200

ctgtccagcc cggaaggggt ggattccttt gtcaggagct gcaccgaagg cggtcggcac 1260

gtcacggacg tggcgcatgg atga 1284

<210> 2

<211> 427

<212> PRT

<213> Streptomyces exfoliatus sp. A1013Y

<400> 2

Met Thr Asp Thr Gly Thr Gly Thr Gly Asn Thr Glu Thr Asp Ile Gly

1 5 10 15

Ile Ile Gly Ser Gly Ile Ser Gly Leu Gln Leu Ala Leu Arg Leu Gln

20 25 30

Gln Leu Gly Val Pro Val Thr Leu Tyr Ser Ala Gln Thr Ala Glu Glu

35 40 45

Leu Gly Ser Ala Arg Pro Arg Asn Phe Pro Ala Arg Phe Ala Pro Thr

50 55 60

Gln Ala Arg Glu Asp Ser Leu Gly Val His Ala Trp Gln Phe Asp Asp

65 70 75 80

Ala Arg Val His Ser Trp Ala Ile Thr Ile His Gly Glu Gly Ala Asp

85 90 95

Leu Glu Phe Ala Ala Ala Leu Ala Pro Pro Ser Ser Val Val Asp Phe

100 105 110

Arg Leu Tyr Leu Pro His Leu Leu Thr Glu Phe Ala Arg Arg Gly Gly

115 120 125

Asn Val Arg Ile Gly Pro Val Val Val Asp Glu Val Ala Arg Arg His

130 135 140

Asp Leu Val Val Val Ala Asn Gly Asp Arg Ser Met Arg Glu Leu Phe

145 150 155 160

Pro Val Asp Pro Glu Arg Ser Pro His Thr Thr Pro Gln Arg Ile Leu

165 170 175

Cys Ser Gly Phe Tyr His Gly Ile Arg Glu Asp Val Pro His Glu Leu

180 185 190

Asp Ile His Phe Leu Pro Gly Ile Gly Glu Ile Leu Arg Ile Pro Phe

195 200 205

Leu Ser Arg Leu Gly Pro Ala His Val Leu Ala Phe Glu Ala Val Pro

210 215 220

Gly Gly Pro Leu Glu Ala Pro Ala His Leu Asp Ala Ala Ala Asp Pro

225 230 235 240

Ala Gly Phe His Arg Glu Val Leu Arg Leu Leu Ala Ala Tyr Ala Pro

245 250 255

Ser Leu Arg Glu Arg Val Asp Thr Ala Arg Phe Gly Leu Val Ala Pro

260 265 270

Gly Glu Leu Ala Gln Gly Gly Val Thr Pro Thr Val Arg Arg Gly Trp

275 280 285

Ala Arg Leu Ala Asp Gly Thr Cys Ala Leu Ala Ile Gly Asp Ala Trp

290 295 300

Ile Thr Asn Asp Pro Leu Thr Ala Gln Gly Ala Asn Leu Gly Ser His

305 310 315 320

Thr Ala Phe Ala Leu Ala Asp Leu Ile Ala Ser Ala Thr Gly Pro Leu

325 330 335

Asp Asp Ala Phe Cys Arg Asp Ala Ser Ala Arg Leu Trp Asp His Ala

340 345 350

Arg His Val Val Glu Trp Ser Asn Ala Phe Leu Ala Pro Pro Pro Pro

355 360 365

His Val Met Glu Leu Phe Gly Arg Ala Ala Gly Asp Lys Gln Ile Ala

370 375 380

Asp Ala Phe Val Gly Arg Phe His Asp Pro Val Ala Met Trp Ala Val

385 390 395 400

Leu Ser Ser Pro Glu Gly Val Asp Ser Phe Val Arg Ser Cys Thr Glu

405 410 415

Gly Gly Arg His Val Thr Asp Val Ala His Gly

420 425

<210> 3

<211> 1850

<212> DNA

<213> Streptomyces exfoliatus sp. A1013Y

<400> 3

atgaccgaca ccggcaccgg caccggcaac accgagaccg acatcggcat catcggttcc 60

ggtatctccg ggctgcaact ggccttacgc ctccagcagc tcggcgtacc agtgacgctg 120

tactccgcgc agaccgccga agagctcggc tcggcgcggc cgcggaactt ccccgcccgg 180

ttcgccccga cgcaagcgcg cgaggactcg ctcggcgtgc acgcctggca gttcgacgac 240

gcccgggtgc acagctgggc gatcaccatc cacggcgagg gcgccgacct ggagttcgcc 300

gcggcgctcg caccgccgtc gagcgtggtg gacttccgcc tctacctgcc gcacctgctc 360

accgagttcg cccggcgcgg cgggaacgta cggatcggcc cggtcgtggt ggacgaggtc 420

gcccgtcggc acgacctggt ggtggtcgcc aacggcgacc ggtccatgcg ggagctgttc 480

cccgtggacc ccgagcggtc gccccacacg acaccccagc ggatcctgtg cagcggcttc 540

taccacggca tccgggagga cgtcccgcac gagctggaca tccacttcct gcccgggatc 600

ggggagatcc tgcggatacc gttcctgtcc cgcctcggtc cggcccacgt gctggccttc 660

gaggcggtgc cgggcggccc gctggaggcg cccgcccacc tggacgccgc cgccgatccg 720

gccggcttcc accgcgaggt gctgcgtctg ctggccgcgt acgcgccgag tctgcgcgaa 780

cgcgtcgaca ccgcgcggtt cggcctcgtc gcaccgggcg aactggcgca gggcggcgtc 840

acgccgaccg tccgccgggg atgggcgcgc ctcgccgacg gcacgtgcgc cctggccatc 900

ggtgacgcct ggatcaccaa cgatccgctc accgcccagg gcgccaacct cggctcgcac 960

acggcgttcg cgctggccga tctcatcgcc tccgccaccg gtccgctcga cgacgcgttc 1020

tgccgcgacg cgtcggcccg gctgtgggac cacgcacgcc atgtcgtcga gtggagcaac 1080

gccttcctgg cgccgccccc gccgcacgtc atggagctgt tcggccgggc ggccggcgac 1140

aagcagatcg cggacgcgtt cgtcggccgg ttccacgacc cggtggcgat gtgggccgtg 1200

ctgtccagcc cggaaggggt ggattccttt gtcaggagct gcaccgaagg cggtcggcac 1260

gtcacggacg tggcgcatgg atgaactagt ctccgctggc catgccagcg gaccctttaa 1320

atttgcaggt gatccaaatg acgctaaaga cagatgcggc ggtggaaatc gacgccgcta 1380

gctttcgcca agctgtagca ctattcgcca cgggcattgc tgtactgagc gctgaaacag 1440

ccgacggtga agttcatggc atgaccgtta acagcttcac ttctatcagt ctcgatccac 1500

cgacagtcat ggtttcgctg aaaacgggtc gcatgcatga gcttttgact cagggccggc 1560

gcttcggtgt aagcctgctg ggtgaagggc aaaaggtact gtcggccttc ttcagcaagc 1620

ggatgctcga tgacagtccg cctccggcct tcaccgtgca gaacagcctg cccacgctac 1680

aggacgccat ggcctggttt gagtgtgaag tggagtcgac agtccaaatc cacgatcaca 1740

cgcttttttt cgcacgtgtc agcgcatgtg gtcgacctga ggctacggct ccccagccgc 1800

ttctgttctt cgccagccgt tatcacggca atccgctgcc cctgaattaa 1850

Claims

1.一种苯乙烯单加氧酶SeStyA，其特征是：核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，所编码的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。

2.如权利要求1所述的苯乙烯单加氧酶SeStyA在催化苯乙烯类底物中的应用，所述的底物包括以下1a～8a