CN111662887A - 一种来自根瘤菌的苯乙烯环氧化酶及其功能 - Google Patents

一种来自根瘤菌的苯乙烯环氧化酶及其功能 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种来源于根瘤菌Bradyrhizobium sp.ORS 375的新型苯乙烯单环氧化酶BrSMO及其在催化不对称氧化反应中的应用。该酶能催化苯乙烯类或硫醚类底物进行不对称氧化反应，具有较高的活性。其中，不对称氧化苯乙烯类底物生成S型环氧，对映体选择性优异，ee>99％；不对称氧化硫醚类底物生成R型亚砜，生成的(R)‑对溴甲基苯基亚砜ee值最高为90％。

Description

一种来自根瘤菌的苯乙烯环氧化酶及其功能
技术领域
本发明涉及一种来自根瘤菌Bradyrhizobium sp.ORS 375的新型苯乙烯环氧化酶BrSMO基因及其催化功能，该酶能催化苯乙烯类或硫醚类底物进行氧化反应，属于应用微生物及酶工程领域。
背景技术
手性纯环氧化合物是生产药物和精细化学品的重要合成砌块，然而获得高收率和优异光学纯度的环氧化物仍然是有机合成中的巨大挑战。迄今为止，已经开发了许多化学和酶促策略来合成手性环氧化物。其中，烯烃的生物催化环氧化被认为是制备手性纯环氧化合物的绿色、有效途径。
苯乙烯环氧化酶，可以催化烯烃环氧化获得具有优异对映体选择性的环氧化物，是制备手性环氧化物的极佳生物催化剂。目前，已经从苯乙烯降解菌株、元基因组或通过数据库挖掘等手段鉴定出许多苯乙烯环氧化酶基因，并对其功能进行了表征。这些基因主要来源于放线菌纲(Rhodococcus,Streptomyces,Gordonia)，γ-变形杆菌纲(Pseudomonas,Paraglaciecola,Marinobacterium)和β-变形杆菌纲(Variovorax)等微生物中。但总体来说，苯乙烯环氧化酶的来源仍然很有限，进一步挖掘具有更广泛底物谱或优异立体选择性的新型酶，丰富酶源多样性，并发展其在不对称催化中的应用具有重要意义。
根瘤菌在生态系统中发挥着重要的作用，可以与豆科植物共生，形成根瘤并固定空气中的氮气以供给植物营养。到目前为止，还没有来源于根瘤菌的苯乙烯环氧化酶报道。随着测序技术的不断发展，数据库中大量的基因序列为研究者们提供了丰富的酶资源库，通过基因组数据库挖掘能有效的获得新型酶源。
发明内容
本发明目的是公开一种来源于根瘤菌Bradyrhizobium sp.ORS 375的新型苯乙烯环氧化酶BrSMO的基因，并提供了该基因构建的重组菌BL21(pET-BrSMO)用于催化不对称氧化反应的方法。
本发明的苯乙烯环氧化酶BrSMO特征是：基因包含styA、styB以及两者之间的连接序列，其中styA的核苷酸长度为1248bp，序列为SEQ ID No.1所示，其编码的苯乙烯单加氧酶StyA的氨基酸序列为SEQ ID No.4所示；连接序列长度为23bp，序列为SEQ ID No.2所示；styB的核苷酸长度为528bp，序列为SEQ ID No.3所示，其编码的还原酶StyB的氨基酸序列为SEQ ID No.5所示。
本发明的苯乙烯环氧化酶BrSMO的新颖性：
本发明涉及的蛋白StyA和StyB与NCBI数据库中已报道序列的相似性见下表1，从表1中可以看出环氧化酶BrSMO在蛋白质水平上的相似度<70％，具有新颖性。
表1 BrSMO氨基酸序列相似度分析
Figure BDA0002521846870000021
本发明的苯乙烯环氧化酶BrSMO是通过基因组数据库挖掘的方法获得的。
首先以Pseudomona sp.LQ26的StyA蛋白序列(GenBank登录号ADE62390.1)为探针序列在NCBI数据库中进行BLAST得到数量较为庞大的序列，排除已研究过的序列，然后根据来源菌株、序列相似度以及保守序列，我们最后筛选到该蛋白序列(StyA，序列为SEQ IDNo.4)和StyB(SEQ ID No.5)。然后将StyA的基因(SEQ ID No.1)、StyB的基因(SEQ IDNo.3)以及两者之间的连接序列(SEQ ID No.2)在上海生工生物工程有限公司合成，并连接至pET28a(+)载体，两端的酶切位点为Bam HI/SacⅠ，获得的质粒命名为pET-BrSMO。我们将该质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)，构建重组表达菌E.coli(pET-BrSMO)。采用同样的方法，将合成的StyB酶的基因连接到pET28a(+)载体，获得该基因的表达载体pET-BrStyB，并构建重组表达菌E.coli(pET-BrStyB)。
本发明还提供了BrSMO全细胞催化体系及该体系对于不同底物的生物转化。
生物催化反应体系包括：缓冲液、E.coli(pET-BrSMO)全细胞、环己烷或异丙醇、底物，具体方案见实施例2和实施例3。苯乙烯环氧化酶BrSMO能够催化实施例3中的底物1a～15a。
本发明与已有技术相比具有如下优势：
本发明涉及的苯乙烯环氧化酶BrSMO底物谱广，能催化苯乙烯或硫醚类底物进行不对称氧化反应，分别生成具有优异对映体选择性的S型环氧化物或R型亚砜。该酶能催化8种苯乙烯类底物转化生成相应的环氧产物，对苯乙烯的活性最高。对多种苯乙烯类底物显示出优异的对映体选择性(>99％ee)，因此利用该酶制备环氧化合物具有明显的优势。
同时，BrSMO也能催化多种硫化物进行不对称氧化反应生成相应的R型亚砜，与其他已报道的酶相比，BrSMO能以高转化率催化硫代苯甲醚(实施例3，底物9a)的硫氧化反应，生成中等选择性的R型亚砜(84％ee)。其他来源的酶，如来自Pseudomonas sp.VLB120，Pseudomonas sp.LQ26，Marinobacterium litorale DSM 23545和Paraglaciecolaagarilytica NO2的酶催化该底物的对映选择性只有19～42％ee。
另外，BrSMO催化4-氯硫代苯甲醚(实施例3，底物12a,90％ee)和4-溴硫代苯甲醚(实施例3，底物15a，89％ee)也显示出优异的对映体选择性。BrSMO为首次报道的能催化氯取代和溴取代硫醚的苯乙烯环氧化酶。
附图说明
图1重组质粒pET-BrSMO和pET-BrStyB表达蛋白电泳图，M：Marker；1：pET-BrSMO粗酶；2：pET-BrStyB粗酶；3：pET-28a(+)空载体粗酶。
具体实施方式
以下结合实施例详细地说明本发明。实施方案为便于更好的理解本发明，但并非对本发明的限制。
实施例1 BrSMO异源表达
将质粒pET-BrSMO转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态后，挑取单克隆并接种于含有卡那霉素(50mg/L)的LB培养基中，在37℃、180rpm下过夜培养用作种子液。以1％接种率转接该种子液至200mL含有卡那霉素(50mg/L)的TB培养基，并在37℃、180rpm下培养3h，当OD600达到0.8后，加入IPTG(终浓度0.05mM)，在20℃下诱导20小时。然后以8000rpm、4℃离心10分钟获得菌体，再用0.9％的NaCl溶液重悬洗涤两次，得到湿菌体。该湿菌体作为生物催化剂用于后续的生物催化。
将得到的湿菌体重悬于磷酸钾缓冲液(0.1M，pH 7.0)中，用高压均质机破碎细胞得到细胞破碎液，然后以12500rpm、4℃离心25分钟除去细胞碎片得到粗酶液。SDS-PAGE分析蛋白表达(见附图1)，在图中可以清楚的看到46KDa的BrStyA条带，在大约19kDa处出现了模糊的条带，这表明BrStyB相对于BrStyA表达水平较低。为验证StyB的表达情况，我们用同样条件培养重组表达菌E.coli(pET-BrStyB)并得到粗酶液，能够清晰地看到大约19KDa的StyB条带(见附图1)。
实施例2苯乙烯环氧化酶BrSMO全细胞生物催化条件优化
2.1最适反应pH值优化
反应体系为5mL，包括0.5g E.coli(pET-BrSMO)湿菌体，不同pH的0.1M磷酸钾缓冲液PBK(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)，环己烷(10％)和苯乙烯(8mM)，在30℃、200rpm震荡反应2h。反应完成后，等体积乙酸乙酯终止反应并萃取，加入适量无水硫酸钠干燥，以GC检测分析。所用仪器为Agilent Technologies 7890B GC气相色谱仪，手性柱为Cyclodex-B column(30m×0.25mm×0.25μm，USA)，进样器温度、检测器样温度和柱温分别为260℃、280℃和100℃。结果如表2所示，在pH＝7.0的0.1M磷酸钾缓冲液中环氧产率最高。
表2 BrSMO最适反应pH优化
Figure BDA0002521846870000041
2.2最适反应温度优化
反应体系为5mL，包括0.5g E.coli(pET-BrSMO)湿菌体，磷酸钾缓冲液(0.1M、pH7.0)，环己烷(10％)和苯乙烯(8mM)，分别在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃和45℃，200rpm震荡反应2h。反应完成后，等体积乙酸乙酯终止反应并萃取，加入无水硫酸钠干燥，以GC检测分析。结果如表3所示，30℃时环氧产率最高。
表3 BrSMO最适反应温度优化
Figure BDA0002521846870000042
Figure BDA0002521846870000051
综上所述，以30℃，pH＝7.0的0.1M磷酸钾缓冲液为BrSMO全细胞生物转化的较优条件。
实施例3苯乙烯环氧化酶BrSMO对不同底物进行生物转化
反应体系为5mL，包括0.1M磷酸钾缓冲液(pH 7.0)，0.5g E.coli(pET-BrSMO)湿菌体，100μL异丙醇，5mM底物(见表4、表5)，在30℃，200rpm的振荡反应2小时后，用乙酸乙酯终止反应并萃取，加入无水硫酸钠进行干燥，旋蒸去除溶剂，以GC和HPLC检测分析，见表6和表7。GC检测所用仪器：Agilent Technologies 7890B GC系统-FID检测器。HPLC检测所用仪器：Shimadzu Prominence LC-20AD系统-PDA检测器。
从表4可以看出，本发明公开的苯乙烯环氧化酶BrSMO对8种苯乙烯类底物转化生成相应的环氧产物，选择性均为S型。除2a(97％ee)和5a(95％ee)外，对其它6种苯乙烯类底物显示出优异的对映体选择性(>99％ee)。从表5可以看出，该酶也能催化多种硫化物的不对称氧化反应，以高的转化率生成相应的R型亚砜(20％-90％ee)。该酶催化4-氯硫代苯甲醚(12a，89％ee)和4-溴硫代苯甲醚(15a，90％ee)的对映选择性高于硫代苯甲醚(9a)，后者可生成(R)-亚砜(84％ee)。该酶催化硫代苯甲醚(9a)的生成(R)-亚砜(84％ee)的对映选择性均高于其它苯乙烯环氧化酶，也是首次报道苯乙烯环氧化酶催化氯取代和溴取代的硫醚。
表4 BrSMO全细胞生物转化烯烃
Figure BDA0002521846870000052
Figure BDA0002521846870000061
表5 BrSMO全细胞生物转化硫醚
Figure BDA0002521846870000062
Figure BDA0002521846870000071
表6 HPLC分析条件
Figure BDA0002521846870000072
Figure BDA0002521846870000081
表7 GC分析条件
Figure BDA0002521846870000082
序列表
<110> 中国科学院成都生物研究所
<120> 一种来自根瘤菌的苯乙烯环氧化酶及其功能
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1248
<212> DNA
<213> Bradyrhizobium sp. ORS 375
<400> 1
atggagaagt cgattggcat cgtcggcgcc ggcatcggcg gactgcatct ggcgctctat 60
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ccctacaacc agccgcagcg cctgctctgc gtcggcctct atgacggcgt cgatcatggc 540
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gagctcggca aggcgatcgt cgacgccgtc gcgttcgacg accgcttcgt cgagacggtc 1020
gatcgcgcgc gcgagaaccg ggtgatcgcg gcggcgcgct ggaccaatct gatgctgcag 1080
ccgccgtcgg aggcgatggg ccggctgatt gttacgatgg cgcagaaccg cgcgctctgc 1140
gacgagttca ccgacaattt caactatccg gagcggcaat gggaccgcct cgccagcgac 1200
cggcgcatcc atgcctggat cgacgagcgc acgccgcttg cggcgtga 1248
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<211> 23
<212> DNA
<213> Bradyrhizobium sp. ORS 375
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<211> 528
<212> DNA
<213> Bradyrhizobium sp. ORS 375
<400> 3
atgagccatc atccggaccc cgcgagcttt cgcgcggcag cctcgcggtt ctccaccggc 60
gtcaccgtgg tgacgagcag tgacgccgag ggcgctccgg tcggcatgac ggccaacagc 120
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tcagtcgaga ttgccgacca cacgctgttc atcggcgagg tccgctggtg ccggcatcgc 420
gacggcctgc cgctggcgtt ctatgccagc cggtttcgca atggtttggg tgcggagata 480
tcgccgggcg acgcgctggc gtatccggcg gagggatgga gtatttga 528
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<211> 415
<212> PRT
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<400> 4
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1 5 10 15
Leu Ala Leu Thr Leu Gly Leu His Gly Ile Gly Ala Thr Val Leu Thr
20 25 30
Ala Ala Gly Pro Gly Gly Thr Ala Ala Thr Ala Leu Met Ala Thr Val
35 40 45
Ala His His Gly Ile Thr Val Ala Ala Gly Ala Gly Leu Gly Val Ala
50 55 60
His Thr Ala Ala Pro Ala Val Val Thr His His His Ala His Pro Pro
65 70 75 80
Ala Pro Pro Gly Ser Pro Leu Leu Pro Ala Gly Ala Pro Leu Gly Pro
85 90 95
Ser Ala Ala Val Ala Thr Ala Ile Thr Leu Pro Ala Leu Met Leu Ala
100 105 110
Pro Gly Ala Ala Gly Gly Thr Ile Gly Thr Ala Ser Ile Gly Ala Ala
115 120 125
Ala Ile Ala Ala Leu Val Ala Ala Pro Ala Leu Leu Val Val Ser Thr
130 135 140
Gly Leu Gly Ala Leu Gly Ala Met Pro Ala His Ala Pro Gly Leu Ser
145 150 155 160
Pro Thr Ala Gly Pro Gly Ala Leu Leu Cys Val Gly Leu Thr Ala Gly
165 170 175
Val Ala His Gly Ser Pro Ala Gly Ala Ala Pro Ala Gly Val Thr Leu
180 185 190
Ser Val Ser Pro Gly His Gly Gly Met Ile Val Ile Pro Thr Leu Thr
195 200 205
Pro Gly Gly Met Leu Thr Ala Leu Leu Met Gly Ala Ile Pro Gly Gly
210 215 220
Ala Met Ala Gly Leu Val Ser Leu Ala Thr Ala Ala Ala Pro Ala Gly
225 230 235 240
Pro Ala Gly Thr Met Leu Ala Leu Leu Gly Leu His His Pro His Thr
245 250 255
Thr Ala Leu Ile Ala Thr His Ala Pro Ala Leu Gly Pro Leu Ala Leu
260 265 270
Leu Gly Gly Ala Val Val Pro Thr Val Ala Ala Ser Ser Val Ser Pro
275 280 285
Ala Ala Gly Leu Leu Ala Ile Ala Leu Gly Ala Val His Ser Val Val
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Ala Pro Met Met Gly Gly Gly Ala Ala Met Ala Ser Thr Ala Ala Pro
305 310 315 320
Gly Leu Gly Leu Ala Ile Val Ala Ala Val Ala Pro Ala Ala Ala Pro
325 330 335
Val Gly Thr Val Ala Ala Ala Ala Gly Ala Ala Val Ile Ala Ala Ala
340 345 350
Ala Thr Thr Ala Leu Met Leu Gly Pro Pro Ser Gly Ala Met Gly Ala
355 360 365
Leu Ile Val Thr Met Ala Gly Ala Ala Ala Leu Cys Ala Gly Pro Thr
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Ala Ala Pro Ala Thr Pro Gly Ala Gly Thr Ala Ala Leu Ala Ser Ala
385 390 395 400
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50 55 60
Thr Ala Thr Ala Ala Thr Ala Val Ala Val Leu Ala Ala Ala Ala Val
65 70 75 80
Ala Ile Gly Ala His Pro Ala Gly Ala Pro Leu Ala Gly Gly Ala Pro
85 90 95
Ala Leu Gly Ala Ala Ala Gly Pro Pro Leu Leu Pro Gly Ala Ile Ala
100 105 110
Gly Pro Gly Cys Gly Val Val Ser Ser Val Gly Ile Ala Ala His Thr
115 120 125
Leu Pro Ile Gly Gly Val Ala Thr Cys Ala His Ala Ala Gly Leu Pro
130 135 140
Leu Ala Pro Thr Ala Ser Ala Pro Ala Ala Gly Leu Gly Ala Gly Ile
145 150 155 160
Ser Pro Gly Ala Ala Leu Ala Thr Pro Ala Gly Gly Thr Ser Ile
165 170 175

Claims (1)

1.一种苯乙烯环氧化酶BrSMO以及功能，其特征是：BrSMO基因包含styA、styB以及两者之间的连接序列，其中styA的核苷酸长度为1248bp，序列为SEQ ID No.1所示，其编码的苯乙烯单加氧酶氨基酸序列为SEQ ID No.4所示；连接序列长度为23bp，序列为SEQ ID No.2所示；styB的核苷酸长度为528bp，序列为SEQ ID No.3所示，其编码的还原酶氨基酸序列为SEQ ID No.5所示；BrSMO催化的底物为1a～15a。
Figure FDA0002521846860000011
。
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