CN116622686A - L-苏氨酸醛缩酶关键结构域改造高效合成β-羟基-α-氨基酸 - Google Patents

L-苏氨酸醛缩酶关键结构域改造高效合成β-羟基-α-氨基酸 Download PDF

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Abstract

本发明公开了L‑苏氨酸醛缩酶关键结构域改造高效合成β‑羟基‑α‑氨基酸,属于生物催化工程领域。本发明获得的最优突变菌株N12Q/Y35W/A176V催化100mM的底物4‑甲磺酰基苯甲醛(MSBA),1M的甘氨酸,添加50μM PLP启动反应,反应8h,底物的摩尔转化率为78.3%,产物L‑thero‑对甲磺酰基苯丝氨酸的非对映选择性高达95.1%,转化率和非对映选择性分别是野生型酶的2.4和5.5倍。同时该突变菌株对其它一系列苯甲醛衍生物表现出提高的转化率和非对映选择性。本发明为基于蛋白结构理性改造L‑苏氨酸醛缩酶,实现β‑羟基‑α‑氨基酸的高效生物制备奠定了坚实的研究和工业制备基础。

Description

L-苏氨酸醛缩酶关键结构域改造高效合成β-羟基-α-氨基酸
技术领域
本发明涉及L-苏氨酸醛缩酶关键结构域改造高效合成β-羟基-α-氨基酸,属于生物催化工程领域。
背景技术
β-羟基-α-氨基酸(βHAAs)是许多药物和天然产物的重要手性模块,在医药和化工领域具有广泛地应用价值。如L-threo-3,4-二羟基苯丝氨酸是治疗帕金森病的特效药。L-thero-对甲磺酰基苯基丝氨酸是合成甲砜霉素和氟苯尼考的重要中间体。甲砜霉素是一类广谱抗生素,对革兰氏阳性菌如肺类杆菌、淋球菌、及流感杆菌等有较强抗菌作用,对大部分革兰氏阴性菌也具有很强的抗菌作用。氟苯尼考也是一种抗生素类药物,通过抑制肽酰转移酶活性而产生广谱抑菌作用,对大部分革兰氏阳性、阴性菌和支原体等具有较强的抗菌作用。L-thero-对硝基苯基丝氨酸是合成氯霉素的重要前体物质。氯霉素是一种酰胺醇类抗生素,通过抑制细菌蛋白质的合成起到抑制细菌生长的作用,主要用于伤寒、副伤寒和沙门菌属的感染。L-threo-苯基丝氨酸是环胞菌素A的重要前体物质,其中环胞菌素A可以用来治疗结核病,并且具有抗疟疾和抗病毒活性。此外,由于βHAAs同时含有氨基、羧基和羟基三个官能团,被广泛应用于有机合成中,例如不对称合成糖肽及β-内酰胺等化合物,也是一些手性化合物的关键组成部分。
目前主要通过化学法合成这些关键中间体,例如化学法合成氯霉素,该法由乙苯作为底物,经硝化-氧化-溴化-成盐-水解-乙酰化-加成-还原-分解-分拆-二氯乙酰化,最终得到目标产物氯霉素。化学法合成步骤繁杂,副产物多,立体选择性低同时需要使用过度的重金属对环境不友好。生物催化由于反应条件温和,操作简单,不需要添加保护基和去保护基等步骤以及立体选择性高而备受关注。
L-苏氨酸醛缩酶以甘氨酸为供体底物,以脂肪族醛和芳香醛为受体底物,通过一步反应在温和的条件下合成βHAAs。然而目前报道并表征的L-苏氨酸醛缩酶均存在Cβ立体选择性低的问题,这一著名的“Cβ问题”极大地限制了其在工业生产中的应用。因而有必要挖掘及表征新型L-苏氨酸醛缩酶,通过理性设计手段,提高其Cβ立体选择性,实现βHAAs的高效制备,打破国外技术垄断,实现自主知识产权的生物催化制备技术。
发明内容
本发明采用来源于Pseudomonas putida的L-苏氨酸醛缩酶基因(ltaE),克隆到Escherichia coli BL21(DE3)中实现高效可溶性表达。为了提高其Cβ立体选择性,通过计算机辅助设计筛选出产物通道及辅因子结合域与催化功能相关的潜在靶点,然后应用三密码子饱和突变策略(triple code saturation mutagenesis,TCSM)构建突变文库并进行筛选,对有益突变株进行饱和突变及迭代组合突变,获得催化效率与立体选择性明显提升的突变株。实现了βHAAs的高效生物合成,为其工业化生产奠定了坚实的基础。
本发明提供了一种L-苏氨酸醛缩酶突变体,所述突变体为,将氨基酸序列如SEQID NO.1所示的L-苏氨酸醛缩酶的第12位、第35位、第176位中的一个或多个氨基酸进行突变得到的。
在本发明的一种实施方式中,所述突变体包含位点12、35、176位置的一个或者多个位置氨基酸取代,其中12位氨基酸替代为C、Y、Q、E,更优选的替代为Q,35位氨基酸替代为Q、N、D、E、W,更优选的替代为W,176位氨基酸替换为S、V、L、M,更优选的替代为V。所述突变体为以上位点更优选的替代的一种或多种组合,其中最优选的为N12Q-Y35W-A176V。
在本发明的一种实施方式中,所述L-苏氨酸醛缩酶突变体的催化效率是以甘氨酸和对甲磺酰基苯甲醛为底物进行纯酶反应,经HPLC检测其产物峰面积衡量的。
本发明提供了一种L-苏氨酸醛缩酶突变体,所述突变体为:
将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的L-苏氨酸醛缩酶的第12位的天冬酰胺突变为谷氨酰胺得到的,命名为N12Q;
或所述突变体为,将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的L-苏氨酸醛缩酶的第35位的酪氨酸突变为色氨酸得到的,命名为Y35W;
或所述突变体为,将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的L-苏氨酸醛缩酶的第176位的丙氨酸突变为缬氨酸得到的,命名为A176V;
或所述突变体为,将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的L-苏氨酸醛缩酶的第12位的天冬酰胺突变为谷氨酰胺,同时将第35位的酪氨酸突变为色氨酸得到的,命名为N12Q/Y35W;
或所述突变体为,将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的L-苏氨酸醛缩酶的第12位的天冬酰胺突变为谷氨酰胺,同时将第176位的丙氨酸突变为缬氨酸得到的,命名为N12Q/A176V;
或所述突变体为,将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的L-苏氨酸醛缩酶的第176位的丙氨酸突变为缬氨酸得到的,同时将第35位的酪氨酸突变为色氨酸得到的,命名为Y35W/A176V;
或所述突变体为,将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的L-苏氨酸醛缩酶的第12位的天冬酰胺突变为谷氨酰胺,第35位的酪氨酸突变为色氨酸,同时将第176位的丙氨酸突变为缬氨酸得到的,命名为N12Q/Y35W/A176V;
在本发明的一种实施方式中,编码所述L-苏氨酸醛缩酶的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
本发明还提供了编码上述突变体的基因。
本发明还提供了一种携带所述突变体,或携带上述基因的重组载体。
在本发明的一种实施方式中,所述重组载体是以pET系列载体为表达载体。
在本发明的一种实施方式中,所述重组载体以pET28a、pET21a、pRSF或pET-Duet表达载体。
本发明还提供了一种表达上述突变体,携带上述基因,或携带上述重组载体的重组细胞。
在本发明的一种实施方式中,所述重组细胞以细菌或真菌为表达宿主。
在本发明的一种实施方式中,所述重组细胞的表达宿主包括但不限于大肠杆菌。
在本发明的一种实施方式中,所述重组细胞以大肠杆菌E.coli BL21(DE3)为表达宿主。
本发明提供了一种L-苏氨酸醛缩酶,所述L-苏氨酸醛缩酶氨基酸序列包括但不限于与SEQ ID NO.1所示序列同源性≥90%的氨基酸序列。
在本发明的一种实施方式中,所述的L-苏氨酸醛缩酶活性的测定是以甘氨酸为供体底物,对甲磺酰基苯甲醛为受体底物,磷酸吡哆醛为辅酶,2,4-二硝基苯肼为显色剂,在碱性条件下检测470nm处红棕色溶液的吸光度。
本发明还提供了一种纯酶制备β-羟基-α-氨基酸的方法,所述方法为,以甘氨酸为供体底物,以苯甲醛或其衍生物为受体底物,经纯酶转化制备得到β-羟基-α-氨基酸,所述β-羟基-α-氨基酸为苯基丝氨酸衍生物,所述纯酶为上述L-苏氨酸醛缩酶或其突变体。
在本发明的一种实施方式中,所述苯甲醛衍生物的结构通式为:
所述R基团包括但不限于:磺酰基、硝基和卤素;R基位置为邻、间或对位。
在本发明的一种实施方式中,所述苯基丝氨酸衍生物的结构通式为:
所述R基团包括但不限于:磺酰基、硝基和卤素;R基位置为邻、间或对位。
在本发明的一种实施方式中,所述苯基丝氨酸衍生物的获得以甘氨酸为供体底物,以苯甲醛衍生物为受体底物,经L-苏氨酸醛缩酶纯酶催化获得,所述反应通式如下所示:
在本发明的一种实施方式中,所述R基团包括但不限于:磺酰基、硝基和卤素;R基位置为邻、间或对位。
在本发明的一种实施方式中,所述卤素为F、Cl、Br。
在本发明的一种实施方式中,所述L-苏氨酸醛缩酶的纯酶催化体系为:甘氨酸1M,苯甲醛衍生物100mM,磷酸吡哆醛50μM,反应时间为8h,反应缓冲液100mM HEPES-NaOH溶液(pH 8.0)。
在本发明的一种实施方式中,反应条件为:1M甘氨酸、100mM 4-甲磺酰基苯甲醛、50μM PLP、10%(v v-1)DMSO和1mg·mL-1的目的蛋白;30℃,200rpm震荡反应8h。
本发明还提供了一种提高L-苏氨酸醛缩酶转化苯甲醛或其衍生物制备β-羟基-α-氨基酸的转化率的方法,所述方法为,将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的L-苏氨酸醛缩酶的第12位、第35位、第176位中的一个或多个氨基酸进行突变。
在本发明的一种实施方式中,所述方法为,将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的L-苏氨酸醛缩酶的第12位的天冬酰胺突变为谷氨酰胺;或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的L-苏氨酸醛缩酶的第35位的酪氨酸突变为色氨酸;或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的L-苏氨酸醛缩酶的第176位的丙氨酸突变为缬氨酸;
或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的L-苏氨酸醛缩酶的第12位的天冬酰胺突变为谷氨酰胺,第35位的酪氨酸突变为色氨酸;或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的L-苏氨酸醛缩酶的第12位的天冬酰胺突变为谷氨酰胺,第176位的丙氨酸突变为缬氨酸;或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的L-苏氨酸醛缩酶的第176位的丙氨酸突变为缬氨酸得到的,第35位的酪氨酸突变为色氨酸;
或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的L-苏氨酸醛缩酶的第12位的天冬酰胺突变为谷氨酰胺,第35位的酪氨酸突变为色氨酸,同时将第176位的丙氨酸突变为缬氨酸。
本发明还提供了上述L-苏氨酸醛缩酶突变体,或上述基因,或上述重组载体,或上述重组细胞在制备苯基丝氨酸及其衍生物或含有苯基丝氨酸及其衍生物的产品中的应用。
在本发明的一种实施方式中,所述苯基丝氨酸及其衍生物的结构通式为:
所述R基团包括但不限于:磺酰基、硝基和卤素;R基位置为邻、间或对位。
在本发明的一种实施方式中,所述卤素为F、Cl、Br。
在本发明的一种实施方式中,所述产品为化学品。
有益效果
(1)本发明通过氨基酸序列和结构比对,挖掘到一种来源于P.putida的L-苏氨酸醛缩酶,实现其在E.coli BL21(DE3)中的高效可溶性表达。通过分子对接、亲和性分析确定产物通道和辅因子PLP结合域附近关键氨基酸残基,并应用三密码子饱和突变策略筛选出酶活提高的优势菌株,结合饱和突变及迭代饱和突变获得催化效率显著提高的优势突变菌株。
(2)本发明以廉价的甘氨酸及4-甲磺酰基苯甲醛为底物,经过L-苏氨酸醛缩酶一步催化,获得转化效率与立体选择性高的4-甲磺酰基苯基丝氨酸。并对其它一系列苯甲醛衍生物表现出提高的转化率和立体选择性且生物催化反应不需要繁琐的步骤,无多余的副产物生成,反应条件温和,对环境友好。本发明通过生物催化一步法获得目标产物,是一种绿色高效的生物合成βHAAs的方法。
(3)本发明获得的最优突变菌株N12Q/Y35W/A176V催化100mM的底物MSBA,1M的甘氨酸,添加50μM PLP启动反应,反应8h,底物的摩尔转化率为78.3%,产物L-thero-对甲磺酰基苯丝氨酸的非对映选择性高达95.1%,转化率和非对映选择性分别是野生型酶的2.4和5.5倍。同时该突变菌株对其它一系列苯甲醛衍生物表现出提高的转化率和非对映选择性。本发明为β-羟基-α-氨基酸的高效生物制备奠定了坚实的研究基础。
附图说明
图1:KT2440、CHA0和PSALD在E.coli BL21(DE3)中的表达;其中,Lane M:Proteinmolecular weight markers;Line 1:没有诱导的重组菌株E.coli/pET-28a;Line 2,4,6:KT2440、CHA0和PSALD的发酵液上清;Line 3,5,7:KT2440、CHA0和PSALD的发酵液沉淀。
图2:纯化的KT2440、CHA0和PSALD的SDS-PAGE分析;其中,Lane M:Proteinmolecular weight markers;Line 1,2,3:纯化后的目的蛋白KT2440、CHA0和PSALD。
图3:辅因子PLP(A)和产物MSPS(B)结合口袋附近以内氨基酸位点。
图4:辅因子PLP和产物MSPS结合口袋附近氨基酸位点的亲和性分析。
图5:将MSPS和PLP结合袋中的九个残基随机分成三个组:A(绿色)、B(蓝色)和C(黄色)。
图6:野生型酶L-PpTA的保守性分析。
图7:文库Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ中突变体的筛选结果。
图8:野生型酶L-PpTA及其突变体在醇醛缩合反应方向的酶活测定。
图9:野生型酶L-PpTA及其突变酶的SDS-PAGE分析。
图10:野生型酶L-PpTA及其突变酶的动力学参数。
图11:苯甲醛衍生物的结构式。
具体实施方式
技术术语:
L-苏氨酸醛缩酶:术语“L-苏氨酸醛缩酶”是指如酶命名法所定义的EC 4.1.2.5类中的酶。出于本发明的目的,根据实例中所述的程序确定L-苏氨酸醛缩酶的合成活性。在一方面,本发明的突变体具有SEQ ID NO.1的多肽的“L-苏氨酸醛缩酶活性的至少20%,例如至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或100%。苏氨酸醛缩酶(TA)(EC 4.1.2.5)能够以磷酸吡哆醛(PLP)为辅因子,催化甘氨酸与各种芳香族和脂肪族醛发生醛醇缩合反应,产生含有两个手性立体中心的β-羟基-α-氨基酸。
表达:术语“表达”包括涉及L-苏氨酸醛缩酶突变体产生的任何步骤,包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。
表达载体:术语“表达载体”意指直链或环状DNA分子,所述分子包含编码本发明的L-苏氨酸醛缩酶突变体的多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。
片段:术语“片段”意指在多肽的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(例如,若干个)氨基酸的多肽;其中所述片段具有L-苏氨酸醛缩酶活性。在一方面,片段含有SEQ IDNO.1的氨基酸1至331(即不包含酶原区序列长度)的数目的至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、或至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%,但小于100%。
宿主细胞:术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不完全相同的任何亲本细胞子代。
宿主细胞可以是在L-苏氨酸醛缩酶突变体的重组生产中有用的任何细胞,例如原核细胞或真核细胞。
原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于:芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、大洋芽孢杆菌属(Oceanic Bacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)和链霉菌属(Streptomyces)。革兰氏阴性细菌包括但不限于弯曲杆菌属(Campylobacter)、大肠杆菌(E.coli)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、螺杆菌属(Helicobacter)、泥杆菌属(Mycobacterium)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、以及脲原体属(Ureaplasma)。
宿主细胞还可以是真核生物,如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。
衍生物:指母体化合物分子中的原子或原子团被其他原子或原子团取代所形成的化合物,称为该母体化合物的衍生物。
衍生物命名时,一般以原母体化合物为主体,以其他基团为取代基。如:卤代烃,醇,醛,羧酸可看成是烃的衍生物,因为它们是烃的氢原子被取代为卤素、羟基、氧等的产物;又如:酰卤、酸酐、酯是羧酸衍生物,因为他们是羧酸中的羟基被卤素和一些有机基团取代的产物。
基团:有机物失去一个原子或一个原子团后剩余的部分。
下述实施例中所涉及的培养基如下:
LB培养基:胰蛋白胨10g·L-1,酵母提取物5g·L-1,NaCl 10g·L-1
下述实施例中所涉及的检测方法如下:
L-苏氨酸醛缩酶酶活的检测
(1)样品与试剂准备:将诱导表达后的重组酶破碎离心后取上清作为粗酶液进行后续反应;在避光条件下配置20mM的2,4-二硝基苯肼(DNPH)溶液作为显色剂待用;配置2.5mM4-甲磺酰基苯甲醛(MSBA)与25mM甘氨酸作为反应底物;配置50μM PLP作为辅因子溶液;配置4M NaOH溶液作为显色碱溶液。
(2)显色反应:反应体系为200μL,包含150μL 4-甲磺酰基苯甲醛(MSBA)溶液,30μL甘氨酸溶液,10μL PLP溶液,10μL酶溶液。将反应体系在30℃,200rpm条件下震荡反应5min,取10μL的反应液加入90μL 20mM的2,4-二硝基苯肼(DNPH)溶液充分混匀反应1min以形成白色絮状物,然后加入100μL 4mM的NaOH与白色絮状物反应,反应溶液变成红棕色,通过分光光度计扫描470nm处红棕色溶液的吸光度,从而进行阳性克隆的筛选,并确定重组酶的酶活性。
酶活定义为:在上述条件下,将每分钟消耗1μM的4-甲磺酰基苯甲醛(MSBA)所需的酶量定义为一个酶活单位。
产物L-thero-对甲磺酰基苯丝氨酸的液相检测方法:
以邻苯二甲醛(OPA)/N-乙酰-半胱氨酸(NAC)进行柱前衍生,分别称取20mg的OPA与NAC,溶解于4mL硼酸缓冲液(0.2M,pH 9.8)和1mL乙腈中,将反应体系进行稀释,然后用0.22μm水系滤头进行过滤后置于液相小瓶中,使用C18柱和Agilent-1260高效液相色谱柱前衍生系统检测产物浓度和非对映选择性(diastereoselectivity,de),柱前衍生程序如表1所示,液相色谱检测条件如下,流动相:KH2PO4(50mM,pH 8.0):乙腈=81:19;流速:0.8mL·min-1;温度:40℃;运行时间:30min。其中L-threo-对甲磺酰基苯丝氨酸非对映体选择性(de值)计算公式为:de=(L-threo-对甲磺酰基苯丝氨酸峰面积+L-erythro-对甲磺酰基苯丝氨酸)/(L-threo-对甲磺酰基苯丝氨酸峰面积L-erythro-对甲磺酰基苯丝氨酸)×100%。
表1:安捷伦1260柱前衍生程序
下述实施例中所涉及的引物序列如下表2~3所示:
表2:构建L-苏氨酸醛缩酶突变文库所用引物
表3:构建L-苏氨酸醛缩酶饱和突变文库所用引物
实施例1:不同来源的L-苏氨酸醛缩酶基因的获得及表达
具体步骤如下:
(1)从NCBI中获取来自P.putida KT2440、P.protegens CHA0、P.putida PSALD的L-苏氨酸醛缩酶氨基酸序列(GenBank分别为:LT799039.1、LS999205.1、AB191192.1),根据大肠杆菌的密码子偏好性,对基因进行密码子优化(核苷酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4所示),委托生物公司化学合成,将优化后的序列构建至载体pET28a上,进一步转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中,分别获得重组菌E.coli BL21(DE3)/pET-KT2440、E.coli BL21(DE3)/pET-CHA0、E.coli BL21(DE3)/pET-PSALD。
(2)分别将重组菌E.coli BL21(DE3)/pET-KT2440、E.coli BL21(DE3)/pET-CHAO、E.coli BL21(DE3)/pET-PSALD涂布卡那抗性的LB平板(50μg·mL-1),37℃倒置培养12h。挑取单菌落于卡那抗性的LB试管中,37℃培养10h,转接于500mL卡那抗性的LB培养基中,37℃培养至OD600为0.6~0.8,加入IPTG(0.1mM)进行诱导,25℃诱导12-14h。
(3)SDS-PAGE凝胶电泳:将诱导后发酵液12,000×g离心10min,用生理盐水洗涤3次,然后用0.1M的磷酸钾缓冲液重悬菌体细胞,超声破碎30min(工作2s,间歇3s,300W),4℃,12,000×g离心30min,分别收集破碎后的上清液与沉淀。分别取15μL上清液和沉淀与5μL 4×上样缓冲液轻轻混匀,沸水浴10min,SDS-PAGE凝胶电泳分析。
结果如图1所示,KT2440、CHA0和PSALD在上清和沉淀中均出现明显的蛋白表达条带,蛋白分子量约为40kDa,与理论蛋白分子量大小相符,表明KT2440、CHA0和PSALD在E.coli BL21中均高效可溶性表达。
实施例2:不同来源的L-苏氨酸醛缩酶的纯化
具体步骤如下:
(1)目的蛋白L-苏氨酸醛缩酶的纯化
分别将实施例1离心后收集到的重组菌体细胞用结合A液(20mM Tris,150mMNaCl,pH 8.0)进行重悬,用高压匀浆仪进行破碎,4℃,12,000×g离心30min,上清液用0.22μm水系滤膜进行过滤,用AKTA纯化系统进行纯化,上样至预先用结合A液平衡好的镍柱,用洗脱B液(20mM Tris,150mM NaCl,1M咪唑pH 8.0)进行洗脱得到含有目的蛋白的洗脱液,然后上样Resource-Q阴离子交换柱,收集目的蛋白,最后用Superdex-200凝胶柱根据蛋白分子量大小进行分离,收集目的蛋白,所有操作在4℃条件下进行。
结果如图2所示,目的蛋白基本为单一条带,分子量大小约为40kDa,与理论分子量相符。
(2)检测纯化后的L-苏氨酸醛缩酶的比酶活
经检测,来自P.putida KT2440、P.protegens CHA0、P.putida PSALD的L-苏氨酸醛缩酶的比酶活为:7.54U·mg-1、6.72U·mg-1、7.11U·mg-1
可见,野生型的L-苏氨酸醛缩酶的比酶活都比较低,因此,我们以P.putidaKT2440来源的L-苏氨酸醛缩酶为研究对象进行后续的实验改造,将得到的重组酶命名为L-PpTA。
实施例3:L-苏氨酸醛缩酶的分子对接及亲和性分析
具体步骤如下:
(1)以与实施例2制备得到的来自P.putida KT2440的重组酶L-PpTA序列相似性为98%的来源于P.putida LTA(PDB ID:5VYE)的分子晶体结构为模板,以产物4-甲磺酰基苯基丝氨酸(MSPS)为配体使用Discovery Studio软件包利用柔性对接的方式进行分子对接并对关键氨基酸残基的结合能进行分析。利用可视化软件Pymol对蛋白结构进行分析与绘制。以构建的酶-配体复合结构为研究对象,将其分为产物MSPS结合区和辅因子PLP结合区两个结合区域,分别挑选出距离产物MSPS和辅因子以内的所有氨基酸位点。
结果如图3所示,在产物MSPS结合区域中挑选出的氨基酸具体为S10A、D11A、N12A、Y13A、H89A、T92A、D93A、E147A、R177A、K207A、Y312A、R321A、A34B、Y35B、K232B、D131D、I132D、H133D和Y134D。在辅因子PLP结合区域中挑选出的氨基酸具体为N12A、N63A、G64A、T65A、A66A、N68A、H89A、E94A、T143A、E147A、D174A、A176A、R177A、T206A、K207A、E214A、Y35B、K232B、L237B和S239B。共挑选出32个环绕在产物MSPS和辅因子PLP周围的氨基酸残基作为潜在的突变位点。
(2)采用计算机辅助设计对挑选出32个氨基酸残基进行亲和性分析,使用DS软件包对酶-配体复合物结构进行结合能计算,将这32个氨基酸残基均突变为其它19种氨基酸计算其结合能得出的值越低表明酶-配体复合物的亲和性越高。
结果如图4所示,其中在MSPS结合区,N12A和D93A位点的大多数突变以及S10A位点的近一半突变显示出结合效率的提高,因此将N12A和S10A确定为目标突变位点,为了避免丢失潜在的阳性变体,还选择了同时位于MSPS和范围内的两个位点H89A和Y35B;同样地在PLP结合区,A176A和S239B位点的大多数突变体显示出与PLP的结合能降低,此外它们相邻的两个残基N63A和T65B也有一些突变体显示出对PLP的结合效率提高,因此一共选择9个氨基酸位点具体为S10A、N12A、H89A、E94A、N63A、T65A、A176A、Y35B和S239B作为潜在靶点进行后续突变设计。
实施例4:应用三密码子饱和突变策略构建重组酶的突变文库
为了缩小文库的大小并提高筛选效率,对筛选出的9个氨基酸残基应用三密码子饱和突变(triple code saturation mutagenesis,TCSM)策略来构建一个小而精的突变文库。即基于目的蛋白的氨基酸序列比对结果选取三种特定的氨基酸作为突变模块来代替饱和突变,将这些氨基酸残基随机分成不同的组(每组包含3~4个位点),用选取的三种特定的氨基酸残基对每个组都进行突变,从每个组中再选取活性提高的优势变体进行迭代组合突变,最终获得具有所需表型的变体。具体步骤如下:
(1)首先将筛选出的9个氨基酸残基随机分成三组:(Ⅰ)S10、N12和A176;(Ⅱ)H89、E94和S239;(Ⅲ)Y35、N63和T65。这三个组的氨基酸残基均环绕在产物MSPS和辅因子PLP周围(图5),然后用GREMLIN在线网站比对与野生型酶L-PpTA相似的前100条不同来源的苏氨酸醛缩酶的氨基酸序列,同时用在线保守型分析网站对野生型酶L-PpTA的氨基酸序列进行分析(图6)。基于这9个位点的氨基酸残基保守程度和相应的密码子简并性,最终选择缬氨酸(V)、谷氨酰胺(Q)和酪氨酸(Y)作为TCSM的三联体密码子。
(2)以重组质粒pET28a-KT2440作为模板,分别使用表2中所列出的引物S-F1/S-R1、S-F2/S-R2和S-F3/S-R3对包含突变位点的短片段基因进行扩增,用L-F1/L-R1、L-F2/L-R2和L-F3/L-R3对包含载体的长片段进行扩增,然后通过一步克隆试剂盒将长片段与短片段进行连接并转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中,涂布含有50μg·mL-1卡那霉素的LB平板,37℃倒置培养12h以获得三个组的突变文库。
将平板上单菌落经培养、诱导表达后,经超声破碎处理并离心从而获得突变体的粗酶液,将粗酶液用建立的DNPH比色的筛选方法进行优势突变菌株的筛选。筛选结果如图7及表4所示:
表4:不同突变体的比酶活
结果显示,文库II中的所有突变体都显示出酶活性的降低或丧失;文库Ⅲ中突变体Y35Q显示出提高的酶活性,而另外两个突变体N63Q/T65Y/Y35Q和N63Q/T65Q/Y35Q保留了约一半的酶活性,因此推测只有Y35位点对酶活性有正向促进作用;相比文库II和文库Ⅲ,文库Ⅰ中则筛选出相对较多的酶活提高的突变体,其中最好的突变体N12Q/A176V其酶活性提高了约2倍,在文库Ⅰ中的三个突变位点中,S10位点的突变被认为对酶活有抑制作用,N12和A176位点则被认为对酶活有促进作用。因此确定出三个氨基酸位点N12、Y35和A176可能是对催化效率产生积极影响的潜在靶点。
实施例5:位点N12、Y35和A176饱和突变文库的构建
具体步骤如下:
由于三个氨基酸位点N12、Y35和A176可能是与催化功能相关的潜在靶点,因此进一步对位点N12、Y35和A176进行饱和突变。使用简并密码子NNK构建这3个氨基酸残基的饱和突变文库,使用表3所列引物分别扩增出这3个氨基酸残基含有突变位点的短片段以及含有pET28a全长的长片段,然后将短片段和长片段经柱纯化试剂盒提纯后用一步克隆试剂盒利用同源重组的方法进行连接,然后转化到E.coli BL21(DE3)感受态细胞中,涂布含有50μg·mL-1卡那霉素的LB平板,37℃倒置培养12h以获得这三个氨基酸残基的饱和突变文库。将平板上单菌落经培养、诱导表达后,经超声破碎处理并离心从而获得突变体的粗酶液,再次使用DNPH筛选方法从饱和突变文库中筛选优势菌株,同时对筛选出的优势菌株进行迭代组合突变。结果如图8及表5所示,
表5:不同突变体的比酶活
结果显示,共筛选出13株酶活提高的突变菌株,其中在每个氨基酸位点中N12Q、Y35W和A176V有最优的酶活,分别为13.33、12.81和10.64U·mg-1,与野生型酶相比酶活提高了1.5倍左右。将这三个优势突变体进一步进行迭代组合突变,发现酶活比单突变有所提高,其中三位点突变体N12Q/Y35W/A176V酶活为16.32U·mg-1,相比野生型酶酶活提高了约2倍。SDS-PAGE分析表明这些突变不影响酶在E.coli中的表达(图9)。
实施例6:重组酶动力学参数的测定
具体步骤如下:
配置不同浓度的甘氨酸溶液(2.5~50mM),按照DNPH酶活测定方法确定突变酶的初始反应速率。用GraphPad Prism 8软件处理数据,采用非线性模拟方法计算突变酶对甘氨酸的Km、kcat及kcat/Km值。每次测量重复三次,结果如图10所示。
结果显示,对于N12位点的四个突变体N12C、N12Y、N12Q和N12E的kcat和kcat/Km值均表现出不同程度地提高,野生型酶的kcat/Km值0.41s-1·mM-1,其中突变体N12Q的kcat/Km值为0.95s-1·mM-1,大大提高了其催化效率。
针对Y35位点的五个突变体,Y35W表现出最高的催化效率,其kcat/Km值为0.88s-1·mM-1,高于野生型酶的kcat/Km值2倍。
而在A176的四个突变体中,A176S、A176V、A176L和A176M的kcat/Km值分别为0.77、0.91、0.52和0.47s-1·mM-1,比野生型酶的kcat/Km值分别提高1.88、2.22、1.27和1.25倍。
此外,对于迭代组合突变N12Q/Y35W、N12Q/A176V和Y13W/A176V也不同程度地提高了其催化效率,三突变菌株N12Q/Y35W/A176V则有着最高的催化活性,其kcat/Km值为1.13s-1·mM-1,是野生型酶的kcat/Km值的2.8倍。
实施例7:生物合成对甲磺酰基苯基丝氨酸
具体步骤如下:
(1)将实施例1~6制备得到的经分离纯化后的野生型酶L-PpTA及其突变体酶N12C、N12Y、N12Q、N12E、Y35Q、Y35N、Y35D、Y35E、Y35W、A176S、A176V、A176L、A176M、N12Q/Y35W、N12Q/A176V、Y35W/A176V、N12Q/Y35W/A176V为生物催化剂,以甘氨酸和MSBA(4-甲磺酰基苯甲醛)为底物催化醇醛缩合反应生物合成MSPS。
反应体系为:2mL KH2PO4(50mM,pH 8.0)、1M甘氨酸、100mM MSBA、50μM PLP、10%(v/v)DMSO和1mg·mL-1的目的蛋白。
反应条件:30℃,200rpm震荡反应8h。
(2)反应结束后,将反应体系煮沸10min,然后12,000×g离心10min,离心后的上清液用50mM KH2PO4(pH 8.0)的缓冲液进行稀释。然后用0.22μm水系滤头进行过滤后置于液相小瓶中,使用C18柱和Agilent-1260高效液相色谱柱前衍生系统检测产物浓度和非对映选择性。液相色谱检测条件如下,流动相:KH2PO4(50mM,pH 8.0):乙腈=81:19;流速:0.8mL·min-1;温度:40℃;运行时间:30min,结果如表6所示。
表6:野生型酶L-PpTA及其突变酶合成MSPS的转化率和de值
结果显示,所有突变体的转化率和de值均表现出一定程度的提高。
其中对于N12的四个突变体,N12Q表现出最优良的催化活性,其转化率为51.6%,de值为52.9%,比野生型酶的转化率和de值分别高1.6和3.1倍,其它三个突变体的转化率为40.5~47.1%,de值为38.2~49.6%。
在Y35的五个突变体中,Y35W的转化率和de值分别提高到62.1%和69.2%,而突变体Y35Q、Y35N、Y35D和Y35E的转化率比野生型提高了1.3~1.5倍,de值提高了1.7~2.8倍。
在A176位点的四个突变体中,A176M和A176V的转化率为47.2~57.3%,de值为61.4~64.1%,而A176S和A176L的转化率为41.7~45.4%,de值为43.6~57.8%。
为了获得具有更高合成MSPS催化活性的突变酶,对N12Q、Y35W和A176V进行了迭代组合突变(引物序列如表2~表3所示),结果显示,双突变N12Q/Y35W、N12Q/A176V和Y35W/A176V的转化率比野生型提高了1.9~2.2倍,de值提高了4.2~4.4倍。三位点突变N12Q/Y35W/A176V表现出最高的催化效率,转化率为78.3%,de值为95.1%,分别比野生型酶高2.4和5.5倍,大大高于之前报道的结果。
因此,采用三位点突变体N12Q/Y35W/A176V进行后续苯基丝氨酸及其衍生物的制备实验。
实施例8:苯基丝氨酸及其衍生物的制备
具体步骤如下:
(1)分别将经分离纯化后的野生型酶L-PpTA和三突变菌株N12Q/Y35W/A176V为生物催化剂,以甘氨酸和苯甲醛衍生物为底物催化醇醛缩合反应不对称合成β-羟基-α-氨基酸,所述苯甲醛衍生物分别为:2-氟苯甲醛、3-氟苯甲醛、4-氟苯甲醛、2-氯苯甲醛、3-氯苯甲醛、4-氯苯甲醛、2-溴苯甲醛、3-溴苯甲醛、4-溴苯甲醛、2-硝基苯甲醛、3-硝基苯甲醛、4-硝基苯甲醛,表7中分别以2-F、3-F、4-F、2-Cl、3-Cl、4-Cl、2-Br、3-Br、4-Br、2-NO2、3-NO2、4-NO2代替,结构式如图11所示。
反应体系为:2mL KH2PO4(50mM,pH 8.0):1M甘氨酸、100mM苯甲醛衍生物、50μMPLP、10%(v/v)DMSO和1mg·mL-1的目的蛋白。
反应条件为:30℃,200rpm震荡反应8h。
(2)反应结束后,将反应体系煮沸10min,然后12,000×g离心10min,离心后的上清液用50mM KH2PO4(pH 8.0)的缓冲液进行稀释。然后用0.22μm水系滤头进行过滤后置于液相小瓶中,使用C18柱和Agilent-1260高效液相色谱柱前衍生系统检测产物浓度和de值,结果如表7所示。
表7:野生型酶L-PpTA及其突变酶N12Q/Y35W/A176V的底物特异性
结果显示,所有测试的底物均显示出不同程度提高的转化率和非对映选择性,且在转化率和de值方面总体表现出邻位>间位>对位,这可能是由于不同的取代基对空间的需求不同,同时相应醛的低溶解度也会影响其转化率和立体选择性。
此外对于以4-硝基苯甲醛为底物的氯霉素前体4-硝基苯基丝氨酸,突变体N12Q/Y35W/A176V的转化率比野生型提高了3.9倍,de值提高了4.8倍。
这些结果表明该突变体不仅大大提高了模式底物MSBA的转化率和非对映选择性,同时还提高了其他苯甲醛衍生物的转化率和非对映选择性。因此,突变体N12Q/Y35W/A176V在高价值化学品的不对称合成中具有更广泛的应用潜力。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上,但其并非用以限定本发明,任何熟悉此技术的人,在不脱离本发明的精神和范围内,都可做各种的改动与修饰,因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (24)

1.一种L-苏氨酸醛缩酶突变体,其特征在于,所述突变体为,将氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的L-苏氨酸醛缩酶的第12位、第35位、第176位中的一个或多个氨基酸进行突变得到的。
2.根据权利要求1所述的L-苏氨酸醛缩酶突变体,其特征在于,所述第12位、第35位、第176位中的一个或多个氨基酸进行突变为:将第12位氨基酸突变为C、Y、Q或E,和/或将第35位氨基酸突变为Q、N、D、E或W,和/或将第176位氨基酸突变为S、V、L或M。
3.根据权利要求2所述的L-苏氨酸醛缩酶突变体,其特征在于,所述突变体为,将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的L-苏氨酸醛缩酶的第12位的天冬酰胺突变为谷氨酰胺得到的;或所述突变体为,将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的L-苏氨酸醛缩酶的第35位的酪氨酸突变为色氨酸得到的;或所述突变体为,将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的L-苏氨酸醛缩酶的第176位的丙氨酸突变为缬氨酸得到的;
或所述突变体为,将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的L-苏氨酸醛缩酶的第12位的天冬酰胺突变为谷氨酰胺,同时将第35位的酪氨酸突变为色氨酸得到的;或所述突变体为,将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的L-苏氨酸醛缩酶的第12位的天冬酰胺突变为谷氨酰胺,同时将第176位的丙氨酸突变为缬氨酸得到的;或所述突变体为,将氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的L-苏氨酸醛缩酶的第176位的丙氨酸突变为缬氨酸得到的,同时将第35位的酪氨酸突变为色氨酸得到的;
或所述突变体为,将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的L-苏氨酸醛缩酶的第12位的天冬酰胺突变为谷氨酰胺,第35位的酪氨酸突变为色氨酸,同时将第176位的丙氨酸突变为缬氨酸得到的。
4.编码权利要求1~3任一所述突变体的基因。
5.携带权利要求1~3任一所述突变体,或携带权利要求3所述基因的重组载体。
6.根据权利要求5所述的重组载体,其特征在于,所述重组载体是以pET系列载体为表达载体。
7.根据权利要求6所述的重组载体,其特征在于,所述重组载体是以pET28a、pET21a或pET-Duet为表达载体。
8.表达权利要求1~3任一所述的突变体,或携带权利要求4所述的基因,或携带权利要求5~7任一所述重组载体的重组细胞。
9.根据权利要求8所述的重组细胞,其特征在于,所述重组细胞是以细菌或真菌为表达宿主。
10.根据权利要求9所述的重组细胞,其特征在于,所述重组细胞的表达宿主包括但不限于大肠杆菌。
11.一种制备β-羟基-α-氨基酸的方法,其特征在于,所述方法为,以甘氨酸为供体底物,以苯甲醛或其衍生物为受体底物,采用权利要求1~3任一所述的突变体或权利要求8~10任一所述的重组细胞全细胞转化制备得到β-羟基-α-氨基酸。
12.根据权利要求11所述的方法,其特征在于,所述β-羟基-α-氨基酸为苯基丝氨酸衍生物。
13.根据权利要求11所述的方法,其特征在于,所述苯甲醛衍生物的结构通式为:
14.根据权利要求13所述的方法,其特征在于,所述R基团包括但不限于:磺酰基、硝基和卤素;R基位置为邻、间或对位。
15.根据权利要求12所述的方法,其特征在于,所述苯基丝氨酸及其衍生物的结构通式为:
16.根据权利要求15所述的方法,其特征在于,所述R基团包括但不限于:磺酰基、硝基和卤素;R基位置为邻、间或对位。
17.根据权利要求14或16所述的方法,其特征在于,所述卤素为F、Cl、Br。
18.根据权利要求17所述的方法,其特征在于,反应条件为:1M甘氨酸、100mM 4-甲磺酰基苯甲醛、50μM PLP、10%(v v-1)DMSO和1mg·mL-1的目的蛋白;30℃,200rpm震荡反应8h。
19.一种提高L-苏氨酸醛缩酶转化苯甲醛或其衍生物制备β-羟基-α-氨基酸的转化率的方法,其特征在于,所述方法为,将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的L-苏氨酸醛缩酶的第12位、第35位、第176位中的一个或多个氨基酸进行突变。
20.根据权利要求19所述的方法,其特征在于,所述方法为,将氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的L-苏氨酸醛缩酶的第12位的天冬酰胺突变为谷氨酰胺;或将氨基酸序列如SEQID NO.1所示的L-苏氨酸醛缩酶的第35位的酪氨酸突变为色氨酸;或将氨基酸序列如SEQID NO.1所示的L-苏氨酸醛缩酶的第176位的丙氨酸突变为缬氨酸;
或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的L-苏氨酸醛缩酶的第12位的天冬酰胺突变为谷氨酰胺,第35位的酪氨酸突变为色氨酸;或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的L-苏氨酸醛缩酶的第12位的天冬酰胺突变为谷氨酰胺,第176位的丙氨酸突变为缬氨酸;或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的L-苏氨酸醛缩酶的第176位的丙氨酸突变为缬氨酸得到的,第35位的酪氨酸突变为色氨酸;
或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的L-苏氨酸醛缩酶的第12位的天冬酰胺突变为谷氨酰胺,第35位的酪氨酸突变为色氨酸,同时将第176位的丙氨酸突变为缬氨酸。
21.权利要求1~3任一所述的L-苏氨酸醛缩酶突变体,或权利要求4所述的基因,或权利要求5~7任一所述的重组载体,或权利要求8~10任一所述的重组细胞在制备苯基丝氨酸及其衍生物或含有苯基丝氨酸及其衍生物的产品中的应用。
22.根据权利要求21所述的应用,其特征在于,所述苯基丝氨酸及其衍生物的结构通式为:
所述R基团包括但不限于:磺酰基、硝基和卤素;R基位置为邻、间或对位。
23.根据权利要求22所述的方法,其特征在于,所述卤素为F、Cl、Br。
24.根据权利要求23所述的方法,其特征在于,所述产品为化学品。
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