WO2013187438A1 - シス－５－ヒドロキシ－ｌ－ピペコリン酸の生物学的な製造方法 - Google Patents

シス－５－ヒドロキシ－ｌ－ピペコリン酸の生物学的な製造方法 Download PDF

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WO2013187438A1
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cis
protein
acid
pipecolic acid
seq
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藤井　匡
圭輔 田村
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日本マイクロバイオファーマ株式会社
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    • C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom
    • C12P17/12—Nitrogen as only ring hetero atom containing a six-membered hetero ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts

Definitions

  • the present invention relates to a genetically modified microorganism having the ability to produce cis-5-hydroxy-L-pipecolic acid and a method for producing cis-5-hydroxy-L-pipecolic acid using these microorganisms.
  • Cis-5-hydroxy-L-pipecolic acid is a kind of modified amino acid having a structure in which a hydroxyl group is introduced into L-pipecolic acid, and is a useful substance as a synthetic intermediate material for pharmaceuticals.
  • L-pipecolic acid is produced from L-lysine by Escherichia coli having the following polynucleotide (sometimes referred to as DNA).
  • DNA polynucleotide
  • the lat gene (SEQ ID NO: 1) derived from Flavobacterium lutescens IFO3084 strain as an example of the above a), and the proC gene derived from E. coli (SEQ ID NO: 3) as an example of the above b) Yes. Since Escherichia coli originally has the proC gene, the lat gene has been introduced, and Escherichia coli expressing the gene has the ability to produce L-pipecolic acid. In addition, it has been reported that DNA encoding a protein having lysine-specific permeation activity, for example, E. coli having an lysP gene (SEQ ID NO: 4) derived from E. coli has improved the production rate of L-pipecolic acid.
  • BAB52605 protein or CAC47686 protein derived from Mesohizobium loti MAFF303099 has been reported to have the ability to convert L-proline to cis-4-hydroxyproline (Patent Document 2).
  • the amino acid sequence of the BAB52605 protein is registered as the accession number BAB52605 in the database GenBank.
  • the base sequence is registered in the database GenBank as accession number BA000012 (SEQ ID NO: 7: loti gene).
  • CAC47686 protein is considered to be a beneficial enzyme for unnatural amino acid synthesis, but has the following problems. Problem 1) When this protein is expressed in E. coli using a general method, it is insolubilized and inactivated. Problem 2) When this protein is subjected to in vitro reaction, it is quickly denatured. Problem 3) When this protein is subjected to an in vitro reaction, almost the same amount of cis-3-hydroxypipecolic acid accumulates from L-pipecolic acid together with cis-5-hydroxy-L-pipecolic acid.
  • Non-Patent Document 3 avoiding the problem 1), in order to express the CAC47686 protein in E. coli, the protein expression is induced at a low temperature by using a cold shock promoter, and GroEL / GroES of Streptomyces coelicolor is co-expressed. Etc.
  • L-pipecolic acid is used to hydroxylate live E. coli cells expressing this protein, but this method is actually effective. It is not clear whether there was. No workaround for problem 3) is presented. Thus, it was considered difficult to produce cis-5-hydroxy-L-pipecolic acid using E. coli expressing CAC47686 protein.
  • BAB52605 protein is also likely to have the ability to convert CAC47686 protein as well as L- pipecolic acid cis-5-hydroxy -L- pipecolic acid were considered, as shown in the examples herein, the loti gene The productivity of cis-5-hydroxy-L-pipecolic acid in E. coli expressing the encoded BAB52605 protein was found to be relatively low. In addition, the identity of the amino acid sequence of BAB52605 protein and CAC47686 protein is 66%.
  • EFV12517 protein as Seguniriparasu-Rugosasu (Segniliparus rugosus) ATCC BAA-974-derived protein, its amino acid sequence is registered as Accession No. EFV12517 database GenBank.
  • the base sequence is registered in the database GenBank as accession number ACZI01000186 (REGION: 1378..2229) (SEQ ID NO: 8: shortcis gene).
  • the EFV12517 protein is annotated in GenBank as aspartyl / Asparginyl beta-hydroxylase, and as shown in the Examples of the present invention, L-pipecolic acid was cis-expressed in E. coli expressing the EFV12517 protein.
  • Escherichia coli expressing a protein encoded by a polynucleotide (SEQ ID NO: 2: cis gene) expressed from 48 bases (corresponding to 16 amino acids) upstream of the annotation of the EFV12517 protein is cis-5th position of L-pipecolic acid.
  • SEQ ID NO: 2: cis gene a polynucleotide expressed from 48 bases (corresponding to 16 amino acids) upstream of the annotation of the EFV12517 protein is cis-5th position of L-pipecolic acid.
  • the present invention was completed by finding that it has hydroxylase activity and can convert L-pipecolic acid into cis-5-hydroxy-L-pipecolic acid.
  • the present invention provides the following: [1] A step of producing cis-5-hydroxy-L-pipecolic acid using L-pipecolic acid as a substrate by a microorganism containing in a state capable of expressing any one of the following polynucleotides (A) to (F): A process for producing cis-5-hydroxy-L-pipecolic acid or a pharmacologically acceptable salt thereof or a solvate thereof, comprising: (A) a polynucleotide comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 2; (B) cis-5-hydroxy-L-pipecolic acid which hybridizes with a polynucleotide comprising a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 under stringent conditions and uses L-pipecolic acid as a substrate A polynucleotide encoding a protein having an activity to catalyze a reaction to produce (C) having an activity of catalyzing a reaction having at least 85% identity with
  • a polynucleotide encoding a protein having an activity of catalyzing a reaction for producing L-aminoadipic acid-delta-semialdehyde using L-lysine as a substrate is derived from Flavobacterium lutescens [ [2] The production method according to [2].
  • the microorganism is Escherichia coli, and originally has a polynucleotide encoding a protein having an activity of catalyzing a reaction for producing L-pipecolic acid using delta1-piperidein-6-carboxylic acid as a substrate, [2] or [3] The production method according to [3].
  • polynucleotide according to any one of (A) to (F) below: (A) a polynucleotide comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 2; (B) cis-5-hydroxy-L-pipecolic acid which hybridizes with a polynucleotide comprising a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 under stringent conditions and uses L-pipecolic acid as a substrate; A polynucleotide encoding a protein having an activity to catalyze a reaction to produce (C) having an activity of catalyzing a reaction having at least 85% identity with the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 and producing cis-5-hydroxy-L-pipecolic acid using L-pipecolic acid as a substrate; A polynucleotide encoding a protein having; (D) a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 25; (
  • a protein having an activity to catalyze a reaction for producing ⁇ -ketoglutaric acid and / or a protein having an activity to catalyze a reaction for producing L-pipecolic acid using delta1-piperidein-6-carboxylic acid as a substrate The vector for transforming a microorganism according to [6] or [7], further comprising a polynucleotide.
  • [9] A genetically modified microorganism transformed with the vector according to any one of [6] to [8]. [10] transformed with the polynucleotide according to [5] and a polynucleotide encoding a protein having an activity of catalyzing a reaction to produce L-aminoadipate-delta-semialdehyde using L-lysine as a substrate; A genetically modified E. coli having the ability to produce cis-5-hydroxy-L-pipecolic acid using L-lysine as a starting material.
  • the protein according to any one of the following (d) to (f): (D) a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 25; (E) consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 25, and cis-5-hydroxy-L using L-pipecolic acid as a substrate A protein having the activity of catalyzing a reaction that produces pipecolic acid; (F) Catalyzing a reaction comprising an amino acid sequence having at least 85% identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 25 and producing cis-5-hydroxy-L-pipecolic acid using L-pipecolic acid as a substrate A protein having the activity of [12] Cis-5-hydroxy-L-pipecolic acid or a drug thereof comprising the step of producing the cis-5-hydroxy-L-pipecolic acid by allowing the protein according to [11] to act on L-pipecolic acid A method
  • a protein having an activity of catalyzing a reaction for producing L-aminoadipic acid-delta-semialdehyde using L-lysine as a substrate is allowed to act on L-lysine. And subsequent conversion of L-aminoadipic acid-delta-semialdehyde to delta1-piperidein-6-carboxylic acid; and the resulting delta1-piperidein-6-carboxylic acid is converted to delta1-piperidein
  • the production method according to [12] further comprising the step of producing a L-pipecolic acid by allowing a protein having an activity to catalyze a reaction of producing L-pipecolic acid using -6-carboxylic acid as a substrate.
  • the present invention provides a process for producing cis-5-hydroxy-L-pipecolic acid represented by the following structural formula (I), a pharmacologically acceptable salt thereof, or a solvate thereof.
  • the method for producing cis-5-hydroxy-L-pipecolic acid of the present invention may comprise the following steps (1) to (3): (1) Using L-lysine as a substrate, L-aminoadipic acid-delta-semialdehyde is produced, and then L-aminoadipic acid-delta-semialdehyde is converted to delta1-piperidein-6-carboxylic acid Process; (2) a step of producing L-pipecolic acid using delta 1-piperidein-6-carboxylic acid as a substrate; and (3) a step of producing cis-5-hydroxy-L-pipecolic acid using L-pipecolic acid as a substrate.
  • the method for producing cis-5-hydroxy-L-pipecolic acid of the present invention includes the step (3) described above.
  • Step (3) is a protein having an activity of catalyzing a reaction for producing cis-5-hydroxy-L-pipecolic acid using L-pipecolic acid as a substrate, ie, L-pipecolic acid cis-5-position hydroxylase (Cis). Is used to produce cis-5-hydroxy-L-pipecolic acid using L-pipecolic acid as a substrate.
  • This step can be carried out biologically by expressing Cis in an organism having the cis gene.
  • any one of the following polynucleotides (A) to (F) or any one of the following proteins (d) to (f) can be used as the cis gene or protein.
  • A a polynucleotide comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 2;
  • B cis-5-hydroxy-L-pipecolic acid which hybridizes with a polynucleotide comprising a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 under stringent conditions and uses L-pipecolic acid as a substrate
  • a polynucleotide encoding a protein having an activity to catalyze a reaction to produce C
  • D a polynucleotide compris
  • the Cis protein used in the examples is EFV12517 protein (in the present invention, sometimes referred to as “Shortcis protein”. It is encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8. In GenBank, it is annotated as aspartyl / asparginyl beta-hydroxylase. 48), that is, a protein comprising an upstream portion of 16 amino acids. However, the Shortcis protein itself is not known for its ability to convert L-pipecolic acid to cis-5-hydroxy-L-pipecolic acid, and was not actually detectable (see Example 2).
  • the Meliloti protein having 34% amino acid sequence identity with the Cis protein used in the examples has the ability to convert L-pipecolic acid into cis-5-hydroxy-L-pipecolic acid.
  • Non-Patent Document 3 is known to have various problems as described above.
  • the Loti protein having 33% amino acid sequence identity with the Cis protein used in the Examples was found to be cis-5-hydroxy-L-pipecoline when expressed in Escherichia coli. It is known that the acid productivity is relatively low (see Example 3), and the amino acid sequence identity between Loti (BAB52605) protein and Meliloti (CAC47686) protein is 66%, and the Loti protein depends on Escherichia coli. It is presumed that the production of cis-5-hydroxy-L-pipecolic acid using the protein obtained and expressed has the same difficulties as the meliloti protein.
  • cis gene and protein can be from Seguniriparasu genus, and more particularly, can be from Seguniriparasu-Rugosasu further when certain, Seguniriparasu-Rugosasu (Segniliparus rugosus) ATCC BAA-974 derived from possible.
  • the polynucleotides (B) to (F) and the proteins (e) to (f) described above should be referred to as mutants of the cis gene and the Cis protein used in the examples.
  • mutants of the cis gene and the Cis protein used in the examples Those skilled in the art consider that such a mutant has no desired activity in the case of lack of information on the motif related to the Cis protein used in the examples or the upstream 16 amino acid sequence, It can be designed as appropriate.
  • the Cis protein used in the examples includes Aspartyl / Asparaginyl beta-hydroxylase region (Position: 26..174) and L-proline 3-hydroxylase, C-terminal region (Position: 190. .274).
  • mutant Cis is used.
  • An example of mutant Cis is a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, encoded by a polynucleotide consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 23, which is used in the examples of the present specification.
  • the base sequence of SEQ ID NO: 23 differs from the base sequence of cis (SEQ ID NO: 2) used in the Examples by 2 bases (in 897 bases), and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26 is the amino acid sequence of Cis used in the Examples It differs from the sequence (SEQ ID NO: 25) by 1 amino acid (in 299 amino acids).
  • the identity between the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26 and that of SEQ ID NO: 25 is 99.7%.
  • the amino acid sequence (SEQ ID NO: 26) of the mutant Cis used in the Examples is also encoded by the base sequence of SEQ ID NO: 7 to 34% with respect to the amino acid sequence of the Meliloti protein encoded by the base sequence of SEQ ID NO: 6. It is 29% identical to the amino acid sequence of the Loti protein.
  • the hybridization conditions in any of the polynucleotides are Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 2nd ed. (According to Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press) and Hybridization of Nucleic Acid Immobilization on Solid Support (according to 198) Can do.
  • hybridization is performed at 45 ° C. in the presence of a 2 ⁇ concentration SSC solution and 50% formamide, and then a 0.1 ⁇ concentration SSC solution (1 ⁇
  • the composition of the concentration SSC solution is 150 mM sodium chloride and 15 mM sodium citrate), and the conditions for washing the filter at 60 ° C. may be used.
  • hybridization is performed at 50 ° C. in the presence of a 2 ⁇ concentration SSC solution and 50% formamide, and then a 0.1 ⁇ concentration SSC solution) is used. The conditions for washing the filter at 65 ° C. may be used.
  • the number of amino acids to be substituted when referred to as “an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted, and / or added” is, unless otherwise specified, Any protein is not particularly limited as long as the protein comprising the amino acid sequence has a desired function, but it is about 1 to 9 or 1 to 4 or a substitution with an amino acid having similar properties. There can be a greater number of substitutions and the like. Means for preparing polynucleotides or proteins according to such amino acid sequences are well known to those skilled in the art.
  • the search and analysis relating to the identity of the base sequence or amino acid sequence can be performed by an algorithm or program (for example, BLASTN, BLASTP, BLASTX, ClustalW) well known to those skilled in the art.
  • an algorithm or program for example, BLASTN, BLASTP, BLASTX, ClustalW
  • Those skilled in the art can appropriately set parameters when using a program, and the default parameters of each program may be used. Specific techniques for these analysis methods are also well known to those skilled in the art.
  • identity refers to at least 70%, preferably 80% or more, more preferably 85% or more, and still more preferably in any case, unless otherwise specified. It refers to sequence identity of 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 97.5% or more, more preferably 99% or more.
  • polynucleotide or gene and protein or enzyme used in the present invention can be prepared by those skilled in the art using conventional techniques.
  • the method for producing cis-5-hydroxy-L-pipecolic acid of the present invention may include the step (1) described above.
  • Step (1) uses L-lysine 6-aminotransferase (Lat) as a protein having an activity of catalyzing a reaction for producing L-aminoadipic acid-delta-semialdehyde using L-lysine as a substrate.
  • L-aminoadipic acid-delta-semialdehyde is produced using lysine as a substrate; and subsequently L-aminoadipic acid-delta-semialdehyde is converted to delta1-piperidein-6-carboxylic acid.
  • This step can be carried out biologically by expressing Lat in an organism having the lat gene.
  • any one of the following polynucleotides (A ′) to (F ′) or any one of the following proteins (d ′) to (f ′) is used. be able to.
  • a ′ a polynucleotide comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1;
  • B ′ L-aminoadipic acid-delta-semialdehyde which hybridizes with a polynucleotide comprising a base sequence complementary to the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 under stringent conditions and uses L-lysine as a substrate
  • nucleotide sequence and amino acid sequence of lat derived from Flavobacterium lutescens IFO 3084 are shown in SEQ ID NOs: 1 and 22 in the Sequence Listing.
  • the lat gene or protein can be from the genus Flavobacterium, more particularly from Flavobacterium lutecens, and more particularly from Flavobacterium lutesense IFO 3084. obtain.
  • the method for producing cis-5-hydroxy-L-pipecolic acid of the present invention may include the step (2) described above.
  • Step (2) uses a protein having an activity of catalyzing a reaction for producing L-pipecolic acid using delta1-piperidein-6-carboxylic acid as a substrate, that is, pyrophosphate-5-carboxylic acid reductase (ProC),
  • ProC pyrophosphate-5-carboxylic acid reductase
  • This step can be carried out biologically using an organism having the proC gene.
  • ProC is an enzyme that E. coli originally has.
  • ProC originally possessed by Escherichia coli may be used as the enzyme for the step (2), and exogenous ProC is used for the purpose of strengthening or the like. May be.
  • “including in an expressible state” is not limited to exogenous polynucleotides unless otherwise specified, and includes polynucleotides originally present.
  • any or all of the above steps (1) to (3) can be carried out biologically.
  • a typical example of biological implementation is in a microbial cell that contains the required gene in an expressible state.
  • a microorganism for use in the biological production method of cis-5-hydroxy-L-pipecolic acid can be obtained by transforming a host microorganism with a suitably constructed vector.
  • the present invention also provides such a genetically modified microorganism and vector.
  • An example of an organism used for the practice of the present invention is a microorganism, a more specific example is a prokaryote, and a more specific example is E. coli.
  • “genetically modified microorganism” refers to a microorganism (bacteria, actinomycetes, yeast, filamentous form) in which a gene derived from another organism is introduced into a specific microorganism using a gene recombination technique, unless otherwise specified.
  • the gene transfer technique used there means not only gene recombination using a vector such as a plasmid but also homologous recombination techniques.
  • cis-5-hydroxylase activity of L-lysine 6-aminotransferase enzyme activity protein (Lat), pyrroline-5-carboxylate reductase enzyme activity protein (ProC), and L-pipecolic acid It is possible to obtain a genetically modified microorganism capable of expressing a gene encoding each of the proteins (Cis) having a protein and capable of directly producing cis-5-hydroxy-L-pipecolic acid from L-lysine it can. Further, cis-5-hydroxy-L-pipecolic acid can be efficiently produced by culturing such a genetically modified microorganism and collecting it from the culture solution.
  • the genetically modified microorganism provided by the present invention may have a gene encoding a protein having a lysine-specific permeation protein activity (LysP) so that it can be expressed.
  • LysP lysine-specific permeation protein activity
  • SEQ ID NO: 4 shows the base sequence of the lysP gene derived from E. coli.
  • the genetically modified microorganism provided by the present invention may further contain a gene encoding a protein having an activity of catalyzing a reaction for producing ⁇ -ketoglutarate.
  • Amino acid hydroxylases represented by L-pipecolic acid cis-5-position hydroxylase require ⁇ -ketoglutaric acid in the hydroxylation reaction (Non-patent Document 3). It is also known that L-lysine 6-aminotransferase also requires ⁇ -ketoglutaric acid during its transamination reaction and converts it into glutamic acid (EC 2.6.1.36). Therefore, when L-pipecolic acid is produced from L-lysine using a microorganism capable of expressing these proteins, it is imagined that it is important to regenerate ⁇ -ketoglutarate.
  • Glutamate dehydrogenase (EC 1.4.1.2) is known as an enzyme that regenerates glutamate to ⁇ -ketoglutarate, and the reaction by this enzyme can be coupled with the reaction by L-lysine 6-aminotransferase.
  • SEQ ID NO: 5 Bacillus subtilis subsp. subtilis str. The base sequence of 168-derived locG gene is shown.
  • a polynucleotide encoding a protein having the cis-5-hydroxylase activity of L-pipecolic acid used in the biological method for producing cis-5-hydroxy-L-pipecolic acid of the present invention is known in the art. According to a known method (for example, the colony hybridization method described in Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 2nd ed), it can be obtained from the cells of an appropriate microorganism. Preferable examples of such microorganisms include a strain belonging to the genus Segniliparas, more specifically a strain belonging to Segniriparas rugosas, and more specifically, Segniriparas rugosas ATCC BAA-974. Alternatively, as in the examples of the present invention, DNA encoding a protein having the cis-5-hydroxylase activity of L-pipecolic acid may be artificially synthesized.
  • the DNA represented by SEQ ID NO: 2 contains an open reading frame (ORF) of cis (base 1 to base 897).
  • the recombinant which is one embodiment of the present invention includes a polynucleotide encoding an enzyme involved in L-pipecolic acid biosynthesis (eg, Lat, ProC, LysP, RocG), and L-pipecolic acid cis-5th water. It is a genetically modified microorganism having a polynucleotide encoding oxidase (Cis), and can be produced by a method of incorporating both of these DNAs into a host microorganism.
  • an enzyme involved in L-pipecolic acid biosynthesis eg, Lat, ProC, LysP, RocG
  • L-pipecolic acid cis-5th water eg, Lat, ProC, LysP, RocG
  • It is a genetically modified microorganism having a polynucleotide encoding oxidase (Cis), and can be produced by a method of incorporating both of these DNAs into a host microorganism.
  • any microorganism can be used as long as it can incorporate the target DNA and can produce the target cis-5-hydroxy-L-pipecolic acid.
  • Preferred microorganisms include strains belonging to Escherichia coli such as E. coli BL21 (DE3) strain.
  • the means for incorporating and expressing foreign polynucleotides in the host for example, Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 2nd ed, Current Protocols in Molecular Biology (edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987) and the like.
  • the host and plasmid-vector system is not particularly limited as long as the target polynucleotide can be stably maintained and expressed in the host.
  • the plasmid may contain an autonomously replicating sequence, a promoter sequence, a terminator sequence, a drug resistance gene, and the like.
  • the type of plasmid is not limited to an autonomously replicating plasmid, but is expected to be used. It may be an integrative plasmid having a sequence homologous to a certain region of the host genome.
  • the site for incorporating the polynucleotide of interest may be either on the plasmid or on the genome of the host microorganism.
  • pUC19 or pRSFDuet-1 is used as an autonomously replicating vector
  • lac or T7 is used as a promoter sequence
  • lacZ terminator or T7 terminator is used as a terminator sequence
  • ampicillin is used as a drug resistance gene.
  • a resistance gene, a kanamycin resistance gene, etc. can be mentioned, respectively.
  • Cis-5-hydroxy-L-pipecolic acid production strain can be obtained.
  • the method for measuring the product may follow the method described in the examples of the present invention.
  • the biological production method of cis-5-hydroxy-L-pipecolic acid of the present invention is typically carried out by culturing a genetically modified microorganism.
  • a genetically modified microorganism Those skilled in the art can appropriately design the culture conditions for microorganisms according to the microorganisms used.
  • Escherichia coli is used as a host, an appropriate amount of microorganism is inoculated on a general-purpose medium containing an antibiotic as a selection marker, if necessary, at 20 ° C. to 40 ° C. for 6 hours to 72 hours, preferably 9 hours to
  • the cells can be grown by culturing for 60 hours, more preferably 12 to 48 hours, with stirring or shaking at 100 to 400 rpm, if necessary.
  • L-lysine or a salt thereof as a starting material, if necessary, ⁇ -ketoglutaric acid or a salt thereof, and if necessary, an appropriate inducer (for example, isopropyrothio- ⁇ -galactoside (IPTG) And stirring or shaking at 100 to 400 rpm, if necessary, at 20 to 40 ° C. for 3 to 72 hours, preferably 4 to 60 hours, more preferably 6 to 48 hours.
  • IPTG isopropyrothio- ⁇ -galactoside
  • L-lysine or the like can be supplied and the culture can be terminated.
  • the initial concentration of L-lysine can be, for example, 2 to 32 g / L, more specifically 4 to 16 g / L
  • the initial concentration of ⁇ -ketoglutarate is, for example, 0 to 16 g / L, more specifically 0 to It can be 8 g / L.
  • the initial concentration of ⁇ -ketoglutaric acid can be, for example, 1 to 16 g / L, more specifically 2 to 8 g / L.
  • a preferred example of the recombinant E. coli of the present invention is a recombinant E. coli having the ability to produce 50 mg or more of cis-5-hydroxy-L-pipecolic acid per liter of culture solution.
  • cis-5-hydroxy-L-pipecolic acid or a pharmacologically acceptable salt thereof or a solvate thereof cis-5-hydroxy-L-pipecolic acid is described as an example.
  • the explanation also applies to pharmacologically acceptable salts of cis-5-hydroxy-L-pipecolic acid or solvates thereof, unless otherwise specified, and those skilled in the art
  • the method for producing cis-5-hydroxy-L-pipecolic acid can be modified to a method for producing a pharmacologically acceptable salt thereof or a solvate thereof.
  • the term “pharmacologically acceptable salt or solvate thereof” includes alkali metal salts (for example, sodium salts, potassium salts), alkaline earth metal salts (for example, magnesium salts, Calcium salt), ammonium salt, mono-, di- or tri-lower (alkyl or hydroxyalkyl) ammonium salt (eg ethanolammonium salt, diethanolammonium salt, triethanolammonium salt, tromethamine salt), hydrochloride, hydrobromic acid Salt, hydroiodide, nitrate, phosphate, sulfate, formate, acetate, citrate, oxalate, fumarate, maleate, succinate, malate, tartrate, Trichloroacetate, trifluoroacetate, methanesulfonate, benzenesulfonate, p-toluenesulfonate, It includes Chirensuruhon salts and naphthalene sulfonate.
  • the salt may be an anhydride or a solvate
  • the solvate includes a hydrate, a methanol solvate, an ethanol solvate, a propanol solvate, and a 2-propanol solvate.
  • Example 1 Construction of pRSF duet-Cis
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 as a reference, the 5 'end Nco I primer was added site lac-lat-NcoF2 (see SEQ ID NO: 9) and 5' end Spe I primer were added to the site lat-XhoR (SEQ Designed and created.
  • a PCR reaction was performed using these two primers and Flavobacterium lutescens IFO3084 genomic DNA as a template. PCR reaction was performed using KOD-Plus-Ver. 2 (TOYOBO) was used, and a two-stage reaction in which denaturation was performed at 98 ° C. for 20 seconds, annealing was performed at 60 ° C.
  • primer lysP-SD-XhoF (see SEQ ID NO: 11) with an Xho I site added to the 5 ′ end and primer lysP-KpnR (sequence with a Kpn I site added to the 5 ′ end) No. 12) was designed and created (SIGMA GENOSSYS).
  • SIGMA GENOSSYS a PCR reaction was performed in the same manner as described above using these two primers and E. coli K12-derived JM109 strain genomic DNA as a template. From this PCR amplification reaction solution, a DNA fragment having a size of about 1.5 kbp containing lysP was recovered. The obtained DNA fragment was digested with restriction enzymes Xho I and Kpn I to obtain a lysP fragment.
  • primer proC-SD-KpnF (see SEQ ID NO: 13) with a Kpn I site added at the 5 ′ end and primer proC-BamR (sequence with a Bam HI site added at the 5 ′ end) No. 14) was designed and created.
  • a PCR reaction was performed in the same manner as described above using these two kinds of primers and E. coli K12 JM109 strain genomic DNA as a template. From this PCR amplification reaction solution, a DNA fragment having a size of about 1.0 kbp containing proC was recovered. The obtained DNA fragment was digested with restriction enzymes Kpn I and Bam HI to obtain a proC fragment.
  • plasmid digests pRSFDuet-1 a obtained by digesting with restriction enzymes Nco I and Bam HI, lat fragment, LysP fragments, and proC fragments DNA Ligation Kit ver. 2 (Takara Bio Inc.) was used for ligation into four parties.
  • pRSFDuet-1 a Natural Chemical Company
  • restriction enzymes Nco I and Bam HI restriction enzymes Nco I and Bam HI
  • lat fragment lat fragment
  • LysP fragments fragments
  • proC fragments DNA Ligation Kit ver. 2
  • primer locG-SD-BamF (see SEQ ID NO: 15) with a Bam HI site added to the 5 ′ end and primer rcG- with an Xba I site added to the 5 ′ end XbaR (see SEQ ID NO: 16) was designed and created.
  • these two types of primers and Bacillus subtilis subtilis subsp. subtilis str. PCR reaction was performed in the same manner as described above using 168 strain genomic DNA as a template. From this PCR amplification reaction solution, a DNA fragment having a size of about 1.3 kbp containing rcG was recovered. The obtained DNA fragment was digested with restriction enzymes Bam HI and Xba I to obtain a locG fragment.
  • the plasmid digest obtained by digesting pRSF-LLP with the restriction enzymes BamHI and XbaI and the locG fragment were ligated to construct a plasmid pRSF-PA having lat , lysP , proC and locG genes.
  • nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8 send 5 'primer terminus was added Nde I site segni-short-NdeF (SEQ reference numeral 17) and 5' end by adding a Bgl II site primer segni-cis-BglR (See SEQ ID NO: 18) designed and created.
  • artificial gene synthesis was performed according to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8 (GenScript), and PCR was performed in the same manner as described above using this as a template.
  • a DNA fragment having a size of about 0.9 kbp containing cis was recovered from the PCR amplification reaction solution. That the obtained DNA fragment was digested with restriction enzymes Nde I and Bgl II were the cisShort fragment.
  • plasmid digest the pRSF-PA was obtained by digesting with restriction enzymes Nde I and Bgl II, and ligated cisShort fragment, lat, lysP, proC, each gene RocG, and genes encoding EFV12517 protein (shortcis)
  • a plasmid pRSF-CisShort was constructed.
  • nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 as a reference, 5 were added to Bgl II site 'primer terminus was added Nde I site segni-cis-NdeF2 (SEQ reference numeral 19) and 5' end primer segni-cis-BglR (See SEQ ID NO: 18) designed and created.
  • artificial gene synthesis was performed according to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 (GenScript), and a PCR reaction was performed in the same manner as described above using this as a template.
  • a DNA fragment having a size of about 0.9 kbp containing cis was recovered from the PCR amplification reaction solution. The obtained DNA fragment was digested with restriction enzymes Nde I and Bgl II to obtain a cis fragment.
  • plasmid digest the pRSF-PA was obtained by digesting with restriction enzymes Nde I and Bgl II, and ligated cis fragment, lat, lysP, proC, rocG , and plasmid pRSF-Cis with cis each gene (Fig. 2) Built.
  • nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 as a reference 5 primers were added 'primer was added Nco I sites on the ends lac-lat-NcoF2 (SEQ ID NO: 9 refer) and 5' end Afl II site lat- (Spe) AflR2 (see SEQ ID NO: 20) was designed and created.
  • a PCR reaction was performed using these two primers and the plasmid pRSF-Cis as a template. From this PCR amplification reaction solution, a DNA fragment having a size of about 1.5 kbp containing lat was recovered. That the obtained DNA fragment was digested with restriction enzymes Nco I and Afl II was used as a lat2 fragment.
  • plasmid digest the pRSF-Cis obtained was digested with the restriction enzymes Nco I and Afl II, and ligated lat2 fragment to construct plasmid pRSF-LatCis having lat and cis gene.
  • the 5 'end Nco I primer was added site loti-SD-PacF (see SEQ ID NO: 21) and 5' end Avr II primers were added to the site loti-AvrR (SEQ No. 22) was designed and created.
  • PCR reaction was performed using these two primers and Mesozobium roti MAFF303099 genomic DNA as a template. From this PCR amplification reaction solution, a DNA fragment having a size of about 0.9 kbp containing a gene encoding the BAB52605 protein was recovered. The obtained DNA fragment was digested with restriction enzymes Pac I and Afl II to obtain a loti fragment.
  • a plasmid digest obtained by digesting pRSF-Cis with restriction enzymes Pac I and Afl II, and a loti fragment were ligated, and each gene of lat , lysP , proC , rotG and a gene encoding BAB52605 protein ( loti )
  • a plasmid pRSF-Loti was constructed.
  • segni-cis-NdeF2 and segni-cis-BglR were used as primers and pRSF-Cis was used as a template, respectively, and PCR was performed using conditions 5 of Diversify TM PCR Random Mutagenesis Kit (Clontech).
  • a DNA fragment having a size of about 0.9 kbp was recovered from the PCR amplification reaction solution. The obtained DNA fragment was digested with restriction enzymes Nde I and Bgl II to obtain a mutant-cis fragment.
  • plasmid digest the pRSF-PA was obtained by digesting with restriction enzymes Nde I and Bgl II, and ligated Mutant-cis fragment, plasmid digests obtained by digesting with restriction pRSF-PA enzyme Nde I and Bgl II
  • the mutant-cis fragment was ligated to construct a plasmid pRSF-MutCisLibrary having lat , lysP , proC , and locG genes, and a mutant cis gene.
  • Example 2 Production test 1 of cis-5-hydroxy-L-pipecolic acid] Using a plasmid pRSF-Cis (FIG. 2), pRSF-CisShort, pRSF-PA, pRSF-LatCis and pRSFDuet-1, an E. coli one-shot BL21 (DE3) competent cell (Life Technologies Japan) was transformed. BL21 (DE3) / pRSF-Cis, BL21 (DE3) / pRSF-CisShort, BL21 (DE3) / pRSF-PABL21 (DE3) / pRSF-LatCis and BL21 (DE3) / pRSFDuet-1, respectively.
  • M9SEED liquid medium 3.39% Na 2 HPO 4 , 1.5% KH 2 PO 4 , 0.25% calcium chloride, 0.5% ammonium chloride, containing kanamycin sulfate (25 ⁇ g / ml).
  • M9SEED liquid medium 3.39% Na 2 HPO 4 , 1.5% KH 2 PO 4 , 0.25% calcium chloride, 0.5% ammonium chloride, containing kanamycin sulfate (25 ⁇ g / ml).
  • kanamycin sulfate 25 ⁇ g / ml
  • 1% casamino acid 0.002% thymine
  • 0.1 mM calcium chloride 0.1 mM iron sulfate
  • 0.4% glucose 0.001 mM magnesium chloride
  • the sample solution was converted to FDLA by the following method using N ⁇ - (5-Fluoro-2,4-dinitrophenyl) -L-leucinamide (L-FDLA) (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.).
  • the amount of L-lysine, L-pipecolic acid and cis-5-hydroxy-L-pipecolic acid was measured by HPLC and LC / MS for the obtained FDLA solution.
  • the HPLC and LC / MS analysis charts are shown in FIGS.
  • the quantitative results are shown in Table 1.
  • the measurement conditions of HPLC and LC / MS are shown below.
  • the BL21 (DE3) / pRSF-Cis strain (containing lat , lysP , proC , locG , cis genes on the plasmid) and the BL21 (DE3) / pRSF-LatCis strain (containing lat and cis genes on the plasmid) are also cis. It produced -5-hydroxy-L-pipecolic acid and L-pipecolic acid.
  • E. coli expressing the EFV12517 protein encoded by the shortcis gene could not detect the ability to convert L-pipecolic acid to cis-5-hydroxy-L-pipecolic acid, but more than the annotation of EFV12517 protein.
  • E. coli expressing a protein encoded by a polynucleotide ( cis gene) expressed from 48 bases (corresponding to 16 amino acids) upstream converts L-pipecolic acid to cis-5-hydroxy-L-pipecolic acid. It had acid cis-5-hydroxylase activity.
  • the homology between the amino acid sequence of the protein encoded by the cis gene and the amino acid sequences of CAC47686 protein and BAB52605 protein was 34% and 33%, respectively.
  • Escherichia coli expressing the protein encoded by the cis gene exhibits the cis-5-hydroxylase activity of L-pipecolic acid, which converts L-pipecolic acid into cis-5-hydroxy-L-pipecolic acid. It was considered difficult to guess from the known information.
  • BL21 (DE3) / pRSF-Loti strain lat , lysP , proC on the plasmid
  • BL21 (DE3) / pRSF-Cis strain containing lat , lysP , proC , locG , cis genes on the plasmid.
  • RocG and loti genes the amount of cis-5-hydroxy-L-pipecolic acid produced was about 1/30. This indicates that the amount of cis-5-hydroxy-L-pipecolic acid obtained is relatively small when E. coli expressing the BAB52605 protein encoded by the loti gene is used.
  • the BL21 (DE3) / pRSF-Cis strain compared to the BL21 (DE3) / pRSF-Cis strain, the BL21 (DE3) / pRSF-MutCis1 strain (containing lat , lysP , proC , rocG and mutant cis genes on the plasmid) is also cis-5-hydroxy- The L-pipecolic acid production was equal or better.
  • the nucleotide sequence of this mutant cis gene was analyzed using BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems), and the result is shown in SEQ ID NO: 23.
  • Cis-5-hydroxy-L-pipecolic acid production test 3 Strains obtained by transforming E. coli one-shot BL21 (DE3) competent cells using plasmids pRSF-Cis and pRSF-Cis ⁇ proC ⁇ rocG were designated as BL21 (DE3) / pRSF-Cis and BL21 (DE3) / pRSF-Cis ⁇ proC ⁇ rocG, respectively. These strains were cultured and analyzed in the same manner as in Example 2, and the amounts of L-pipecolic acid and cis-5-hydroxy-L-pipecolic acid were measured. Table 3 shows the measurement results.
  • the BL21 (DE3) / pRSF-Cis ⁇ proC ⁇ rocG strain ( lat , lysP , cis on the plasmid) was compared to the BL21 (DE3) / pRSF-Cis strain (containing lat , lysP , proC , locG , and cis genes on the plasmid).
  • the cis-5-hydroxy-L-pipecolic acid production was about 2/3. From this, it was shown that the amount of cis-5-hydroxy-L-pipecolic acid obtained was larger when the proC and locG genes were contained on the plasmid in addition to both the lat and lysP genes.
  • Plasmid pRSF- Cis ⁇ proC in which the proC gene of plasmid pRSF-Cis was deleted was prepared as follows. A PCR reaction was performed using primer proCX-SpeF and primer proCrocGX-SpeR and pRSF-Cis as a template. A DNA fragment from which the proC gene of plasmid pRSF-Cis was deleted was recovered from this PCR amplification reaction solution. The resulting DNA fragment was digested with restriction enzymes Spe I, and self-ligated, E. pRSF-Cis ⁇ proC was constructed by transforming E. coli JM109 Competent Cells (Takara Bio Inc.).
  • plasmid pRSF-Cis ⁇ rocG shaved rocG gene of the plasmid pRSF-Cis uses primers rocGX-SpeF and primer procX-SPER
  • plasmid pRSF-Cis ⁇ proC ⁇ rocG shaved proC gene and rocG gene gene of the plasmid pRSF-Cis is It was prepared using the primer rocGX-SpeF and the primer proCrocGX-SpeR.
  • Strains transformed with E. coli one-shot BL21 (DE3) competent cells (Life Technologies Japan) using plasmids pRSF-Cis, pRSF-Cis ⁇ proC, pRSF-Cis ⁇ procG, and pRSF-Cis ⁇ proC ⁇ rocG were respectively BL21 (DE3) / pRSF -Cis, BL21 (DE3) / pRSF-Cis ⁇ proC, BL21 (DE3) / pRSF-Cis ⁇ rocG, and BL21 (DE3) / pRSF-Cis ⁇ proC ⁇ rocG.
  • M9SEED liquid medium 3.39% Na 2 HPO 4 , 1.5% KH 2 PO 4 , 0.25% calcium chloride, 0.5% ammonium chloride, containing kanamycin sulfate (25 ⁇ g / ml).
  • M9SEED liquid medium 3.39% Na 2 HPO 4 , 1.5% KH 2 PO 4 , 0.25% calcium chloride, 0.5% ammonium chloride, containing kanamycin sulfate (25 ⁇ g / ml).
  • kanamycin sulfate 25 ⁇ g / ml
  • 1% casamino acid 0.002% thymine
  • 0.1 mM calcium chloride 0.1 mM iron sulfate
  • 0.4% glucose 0.001 mM magnesium chloride
  • SEQ ID NO: 1 base sequence of lat SEQ ID NO: 2: base sequence of cis SEQ ID NO: 3: base sequence of proC SEQ ID NO: 4: base sequence of lysP SEQ ID NO: 5: base sequence of locG SEQ ID NO: 6: base sequence of SEQ ID NO: meliloti 7: nucleotide sequence of loti SEQ ID NO: 8: nucleotide sequence of shortcis SEQ ID NO: 9: primer lac-lat-NcoF2 SEQ ID NO: 10: primer lat-XhoR SEQ ID NO: 11: primer lysP-SD-XhoF SEQ ID NO: 12: primer lysP-KpnR SEQ ID NO: 13: proC-SD-KpnF SEQ ID NO: 14: primer proC-BamR SEQ ID NO: 15: primer locG-SD-BamF SEQ ID NO: 16: primer locG-XbaR Sequence number 17: Primer segni-short-

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Abstract

　本発明は、シス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸の製造方法を提供する。本発明の製造方法においては、シス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸を直接生産可能な遺伝子組換え微生物を用いることができる。本発明は、そのような遺伝子組換え微生物をも提供する。本発明の好ましい態様においては、Ｌ－ピペコリン酸の生合成に関与するタンパク質をコードするＤＮＡおよびＬ－ピペコリン酸のシス－５位水酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを有する遺伝子組換え微生物を培地で培養し、その培養液からシス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸を採取することを特徴とする。

Description

シス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸の生物学的な製造方法
　本発明は、シス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸を生産する能力を有する遺伝子組換え微生物、およびそれらの微生物を用いたシス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸の製造方法に関する。
　シス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸は、Ｌ－ピペコリン酸にヒドロキシル基が導入された構造を有する修飾アミノ酸の一種であり、医薬品の合成中間原料として有用な物質である。
　一方、Ｌ－ピペコリン酸（または２－ピペリジンカルボン酸もしくはＬ－ホモプロリン）の生物学的な製造方法は既に報告されている（非特許文献１、非特許文献２、および特許文献１）。これらの報告においては、以下のポリヌクレオチド(ＤＮＡということもある)を有する大腸菌により、Ｌ－リジンからＬ－ピペコリン酸を製造している。
ａ）Ｌ－リジン　６－アミノトランスフェラーゼ酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
ｂ）ピロリン－５－カルボン酸リダクターゼ酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
　これらの報告では、上記ａ）の例としてフラボバクテリウム　ルテセンス（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｕｔｅｓｃｅｎｓ）ＩＦＯ３０８４株由来のｌａｔ遺伝子（配列番号１）、上記ｂ）の例として大腸菌由来ｐｒｏＣ遺伝子（配列番号３）が挙げられている。大腸菌は元来ｐｒｏＣ遺伝子を有しているので、ｌａｔ遺伝子が導入されており、該遺伝子を発現する大腸菌はＬ－ピペコリン酸生産能を有する。またリジン特異的透過活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、例えば大腸菌由来ｌｙｓＰ遺伝子（配列番号４）をも有する大腸菌により、Ｌ－ピペコリン酸の生産速度が向上したことが報告されている。
　アルファルファ根粒菌シノリゾビウム・メリロチ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｉｌｏｔｉ）１０２１由来のＣＡＣ４７６８６タンパク質は、Ｌ－ピペコリン酸をシス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸に変換する能力を有することが報告されている（非特許文献３）。このアミノ酸配列は、データベースＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号ＣＡＣ４７６８６として登録されている。塩基配列は、データベースＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号ＡＬ５９１７９２として登録されている（配列番号６）。
　他方、ミヤコグサ根粒菌メソリゾビウム・ロチ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｌｏｔｉ）ＭＡＦＦ３０３０９９由来のＢＡＢ５２６０５タンパク質、またはＣＡＣ４７６８６タンパク質は、Ｌ－プロリンをシス－４－ヒドロキシプロリンに変換する能力を有することが報告されている（特許文献２）。ＢＡＢ５２６０５タンパク質のアミノ酸配列は、データベースＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号ＢＡＢ５２６０５として登録されている。塩基配列は、データベースＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号ＢＡ００００１２として登録されている（配列番号７：ｌｏｔｉ遺伝子）。
WO2001/048216（特許第4516712号） WO2009/139365
Biosci. Biotechnol. Biochem., 66 (3), 622-627, 2002 Biosci. Biotechnol. Biochem., 66 (9), 1981-1984, 2002 Adv. Synth. Catal., 353, 1375-1383, 2011
　ＣＡＣ４７６８６タンパク質は、非天然アミノ酸合成の為の有益な酵素であると考えられるが、以下の問題点を有している。
問題点１）このタンパク質を一般的な方法を用いて大腸菌で発現させた場合、不溶化して不活化する。
問題点２）このタンパク質をｉｎ　ｖｉｔｒｏの反応に供した場合、速やかに変性する。
問題点３）このタンパク質をｉｎ　ｖｉｔｒｏの反応に供した場合、Ｌ－ピペコリン酸から、シス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸と共に、シス－３－ヒドロキシピペコリン酸もほぼ同量蓄積する。
　非特許文献３中では、問題点１）を回避しつつ、ＣＡＣ４７６８６タンパク質を大腸菌で発現させるために、コールドショックプロモーターを用い、低温でタンパク質発現を誘導し、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのＧｒｏＥＬ／ＧｒｏＥＳを共発現させるなどしている。また、問題点２）を回避する方法の一つとして、このタンパク質を発現した大腸菌の生菌体にＬ－ピペコリン酸を供して水酸化させるアイディアを挙げているが、この方法が実際に有効であったかどうかまでは明らかにしていない。問題点３）の回避方法については提示されていない。このように、ＣＡＣ４７６８６タンパク質を発現した大腸菌を用いるシス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸の製造には困難が多いと考えられた。
　ＢＡＢ５２６０５タンパク質もＣＡＣ４７６８６タンパク質と同様にＬ－ピペコリン酸をシス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸に変換する能力を有する可能性が考えられたが、本明細書の実施例で示す通り、ｌｏｔｉ遺伝子にコードされたＢＡＢ５２６０５タンパク質を発現した大腸菌のシス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸の生産性は、比較的低いことが分かった。なお、ＢＡＢ５２６０５タンパク質とＣＡＣ４７６８６タンパク質とのアミノ酸配列の同一性は６６％である。
　一方、ＥＦＶ１２５１７タンパク質は、セグニリパラス・ルゴサス（Ｓｅｇｎｉｌｉｐａｒｕｓ　ｒｕｇｏｓｕｓ）ＡＴＣＣ　ＢＡＡ－９７４由来のタンパク質として、そのアミノ酸配列は、データベースＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号ＥＦＶ１２５１７として登録されている。塩基配列は、データベースＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号ＡＣＺＩ０１０００１８６　（ＲＥＧＩＯＮ：　１３７８．．２２２９）として登録されている（配列番号８：ｓｈｏｒｔｃｉｓ遺伝子）。ＥＦＶ１２５１７タンパク質はＧｅｎＢａｎｋではアスパルチル／アスパルギニル　ベータ－水酸化酵素　（ａｓｐａｒｔｙｌ／Ａｓｐａｒａｇｉｎｙｌ　ｂｅｔａ－ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ）としてアノテーションされており、本発明の実施例で示す通り、ＥＦＶ１２５１７タンパク質を発現した大腸菌にはＬ－ピペコリン酸をシス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸に変換する能力は検出できなかった。しかしながら、ＥＦＶ１２５１７タンパク質のアノテーションよりも４８塩基（１６アミノ酸相当）上流から発現させたポリヌクレオチド（配列番号２：ｃｉｓ遺伝子）にコードされたタンパク質を発現する大腸菌が、Ｌ－ピペコリン酸のシス－５位水酸化酵素活性を有しており、Ｌ－ピペコリン酸をシス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸に変換できることを見出し、本発明を完成した。
　本発明は、以下を提供する：
[１]  下記の（A）～（F）のいずれか一のポリヌクレオチドを発現可能な状態で含む微生物により、Ｌ－ピペコリン酸を基質としてシス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸を生成する工程を含む、シス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸もしくはその薬理学上許容される塩またはそれらの溶媒和物の製造方法：
（A）配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（B）配列番号２に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬ－ピペコリン酸を基質としてシス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（C）配列番号２に記載の塩基配列と少なくとも85％以上の同一性を有し、かつＬ－ピペコリン酸を基質としてシス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（D）配列番号２５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（E）配列番号２５に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつＬ－ピペコリン酸を基質としてシス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（F）配列番号２５に記載のアミノ酸配列と少なくとも85％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＬ－ピペコリン酸を基質としてシス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
[２]  微生物が、Ｌ－リジンを基質としてＬ－アミノアジピン酸－デルタ－セミアルデヒドを生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、およびデルタ１－ピペリデイン－６－カルボン酸を基質としてＬ－ピペコリン酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、発現可能な状態でさらに含み：
　Ｌ－リジンを基質として、Ｌ－アミノアジピン酸－デルタ－セミアルデヒドを生成し、続いてＬ－アミノアジピン酸－デルタ－セミアルデヒドがデルタ１－ピペリデイン－６－カルボン酸へ変換される工程；および
　デルタ１－ピペリデイン－６－カルボン酸を基質としてＬ－ピペコリン酸を生成する工程
をさらに含む、[１]に記載の製造方法。
[３]  Ｌ－リジンを基質としてＬ－アミノアジピン酸－デルタ－セミアルデヒドを生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、フラボバクテリウム　ルテセンス（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｕｔｅｓｃｅｎｓ）由来である、[２]に記載の製造方法。
[４]  微生物が大腸菌であり、デルタ１－ピペリデイン－６－カルボン酸を基質としてＬ－ピペコリン酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを元来有する、[２]または[３]に記載の製造方法。
[５]  下記の（A）～（F）のいずれか一のポリヌクレオチド：
（A）配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（B）配列番号２に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬ－ピペコリン酸を基質としてシス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（C）配列番号２に記載の塩基配列と少なくとも85％以上の同一性を有し、かつＬ－ピペコリン酸を基質としてシス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（D）配列番号２５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（E）配列番号２５に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつＬ－ピペコリン酸を基質としてシス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（F）配列番号２５に記載のアミノ酸配列と少なくとも85％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＬ－ピペコリン酸を基質としてシス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
[６]  [５]に記載のポリヌクレオチドを含む、形質転換用ベクター。
[７]  Ｌ－リジンを基質としてＬ－アミノアジピン酸－デルタ－セミアルデヒドを生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、[６]に記載の微生物の形質転換用ベクター。
[８]  α－ケトグルタル酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質および／またはデルタ１－ピペリデイン－６－カルボン酸を基質としてＬ－ピペコリン酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、[６]または[７]に記載の微生物の形質転換用ベクター。
[９]  [６]～[８]のいずれか一に記載のベクターにより形質転換された、遺伝子組換え微生物。
[１０]  [５]に記載のポリヌクレオチド、およびＬ－リジンを基質としてＬ－アミノアジピン酸－デルタ－セミアルデヒドを生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドにより形質転換され、Ｌ－リジンを出発物質としてシス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸を生成する能力を有する、遺伝子組換え大腸菌。
[１１]  下記の（d）～（f）のいずれか一のタンパク質：
（d）配列番号２５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（e）配列番号２５に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつＬ－ピペコリン酸を基質としてシス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質；
（f）配列番号２５に記載のアミノ酸配列と少なくとも85％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＬ－ピペコリン酸を基質としてシス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質。
[１２]  Ｌ－ピペコリン酸に、[１１]に記載のタンパク質を作用させ、シス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸を生成する工程を含む、シス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸もしくはその薬理学上許容される塩またはそれらの溶媒和物の製造方法。
[１３]  Ｌ－リジンに、Ｌ－リジンを基質としてＬ－アミノアジピン酸－デルタ－セミアルデヒドを生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質を作用させ、Ｌ－アミノアジピン酸－デルタ－セミアルデヒドを生成し、続いてＬ－アミノアジピン酸－デルタ－セミアルデヒドがデルタ１－ピペリデイン－６－カルボン酸へ変換される工程；および
　得られたデルタ１－ピペリデイン－６－カルボン酸に、デルタ１－ピペリデイン－６－カルボン酸を基質としてＬ－ピペコリン酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質を作用させ、Ｌ－ピペコリン酸を生成する工程
をさらに含む、[１２]に記載の製造方法。
[１４]  シス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸を培養液１Ｌ当り５０ｍｇ以上生産する能力を有する、[９]または[１０]に記載の遺伝子組換え微生物または遺伝子組換え大腸菌。
本発明の製造方法の一例、Ｌ－リジンからシス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸への変換経路 プラスミドｐＲＳＦ－Ｃｉｓ（実施例１参照） ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＲＳＦ－Ｃｉｓ株の生産物のＨＰＬＣチャート（実施例２参照） ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＲＳＦ－Ｃｉｓ株の生産物のＬＣ／ＭＳチャート（実施例２参照）。上３点は２００μｇ/ｍＬ標準品、下２点はＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＲＳＦ－Ｃｉｓ株が生産したもの。 酵素ｌａｔ、酵素ｃｉｓ、変異ｃｉｓの塩基配列およびアミノ酸配列
　本発明は、は、下記の式（Ｉ）構造式で表されるシス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸もしくはその薬理学上許容される塩またはそれらの溶媒和物の製造方法を提供する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
 　本発明のシス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸の製造方法は下記の工程（１）～（３）を含みうる：
（１）Ｌ－リジンを基質として、Ｌ－アミノアジピン酸－デルタ－セミアルデヒドを生成し、続いてＬ－アミノアジピン酸－デルタ－セミアルデヒドがデルタ１－ピペリデイン－６－カルボン酸へ変換される工程；
（２）デルタ１－ピペリデイン－６－カルボン酸を基質としてＬ－ピペコリン酸を生成する工程；および
（３）Ｌ－ピペコリン酸を基質としてシス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸を生成する工程。
　本発明のシス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸の製造方法は、上述した工程（３）を含む。工程（３）は、Ｌ－ピペコリン酸を基質としてシス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質、すなわちＬ－ピペコリン酸シス－５位水酸化酵素（Ｃｉｓ）を用いて、Ｌ－ピペコリン酸を基質としてシス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸を生成する工程である。この工程は、ｃｉｓ遺伝子を有する生物にＣｉｓを発現させ、生物学的に実施することができる。
　本発明においては、ｃｉｓ遺伝子またはタンパク質として、下記の（A）～（F）のいずれか一のポリヌクレオチド、または下記の（d）～（f）のいずれか一のタンパク質を用いることができる。
（A）配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（B）配列番号２に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬ－ピペコリン酸を基質としてシス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（C）配列番号２に記載の塩基配列と少なくとも85％以上の同一性を有し、かつＬ－ピペコリン酸を基質としてシス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（D）配列番号２５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（E）配列番号２５に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつＬ－ピペコリン酸を基質としてシス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（F）配列番号２５に記載のアミノ酸配列と少なくとも85％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＬ－ピペコリン酸を基質としてシス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（d）配列番号２５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（e）配列番号２５に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつＬ－ピペコリン酸を基質としてシス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質；
（f）配列番号２５に記載のアミノ酸配列と少なくとも85％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＬ－ピペコリン酸を基質としてシス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質。
　配列表の配列番号２および２５に、本発明者らが特定し、本明細書の実施例で用いたｃｉｓの塩基配列およびアミノ酸配列を示した。
　配列番号２５の全長のＣｉｓタンパク質のアミノ酸配列について、同一性の高い配列を検索したところ、配列番号６の塩基配列によりコードされるＣＡＣ４７６８６タンパク質（本発明では、「Ｍｅｌｉｌｏｔｉタンパク質」ということもある。）のアミノ酸配列に対して３４％、配列番号７の塩基配列によりコードされるＢＡＢ５２６０５タンパク質（本発明では、「Ｌｏｔｉタンパク質」ということもある。）のアミノ酸配列に対して３３％の同一性が認められた。詳細には、前者に関しては、Score = 163 bits (413), Expect = 6e-45, Method: Compositional matrix adjust. Identities = 93/275 (34%), Positives = 146/275 (53%), Gaps = 9/275 (3%)であり、後者に関しては、Score = 159 bits (402), Expect = 3e-43, Method: Compositional matrix adjust. Identities = 87/260 (33%), Positives = 139/260 (53%), Gaps = 6/260 (2%)であった。これらより高い同一性を有する配列は認められなかった。なお、同一性の確認には、NCBIより提供されているblastpを用いた。
　実施例で用いたＣｉｓタンパク質は、ＥＦＶ１２５１７タンパク質（本発明では、「Ｓｈｏｒｔｃｉｓタンパク質」ということもある。配列番号８の塩基配列によりコードされる。ＧｅｎＢａｎｋではアスパルチル／アスパルギニル　ベータ－水酸化酵素としてアノテーションされている。）の４８塩基、すなわち１６アミノ酸上流部分を含んで構成されるタンパク質である。しかし、Ｓｈｏｒｔｃｉｓタンパク質自体には、Ｌ－ピペコリン酸をシス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸に変換する能力は知られておらず、また実際にも検出できなかった（実施例２参照）。
　また、実施例で用いたＣｉｓタンパク質と３４％のアミノ酸配列同一性を有するＭｅｌｉｌｏｔｉタンパク質は、Ｌ－ピペコリン酸をシス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸に変換する能力を有することが知られている（前掲非特許文献３）が、すでに述べたように種々の問題点を有することが分かっている。一方で、実施例で用いたＣｉｓタンパク質と３３％のアミノ酸配列同一性を有するＬｏｔｉタンパク質は、本発明者らの検討によると、大腸菌で発現させた場合に、シス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸の生産性が比較的低いことがわかっている（実施例３参照）ほか、Ｌｏｔｉ（ＢＡＢ５２６０５）タンパク質とＭｅｌｉｌｏｔｉ（ＣＡＣ４７６８６）タンパク質とのアミノ酸配列の同一性は６６％であり、Ｌｏｔｉタンパク質の大腸菌による発現、得られたタンパク質を用いたシス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸の製造には、Ｍｅｌｉｌｏｔｉタンパク質と同様の困難を抱えていることが推測される。
　本発明の一態様においては、ｃｉｓ遺伝子およびタンパク質は、セグニリパラス属由来であり得、より特定すると、セグニリパラス・ルゴサス由来であり得、さらに特定すると、セグニリパラス・ルゴサス（Ｓｅｇｎｉｌｉｐａｒｕｓ　ｒｕｇｏｓｕｓ）ＡＴＣＣ　ＢＡＡ－９７４由来であり得る。
　上述した（B）～（F）のポリヌクレオチドおよび（e）～（f）のタンパク質は、実施例で用いたｃｉｓ遺伝子およびＣｉｓタンパク質の変異体というべきものである。このような変異体は、当業者であれば、実施例で用いたＣｉｓタンパク質に関するモチーフ等の情報や、上流の１６アミノ酸配列が欠如している場合には所望の活性がないことに配慮し、適宜設計することができる。本発明者らの検討によると、実施例で用いたＣｉｓタンパク質は、Aspartyl/Asparaginyl beta-hydroxylase領域（Position: 26..174）とL-proline 3-hydroxylase, C-terminal領域(Position: 190..274)を有することがわかっている。なおモチーフ解析は、配列が示されていれば、公開されているwebsite、例えば、GenomeNet (http://www.genome.jp/)）におけるPfam等を利用して、当業者であれば適宜実施でき、また、あるタンパク質がＬ－ピペコリン酸を基質としてシス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸を生成する反応を触媒する活性を有するか否かは、当業者であれば、本明細書の記載を参照にして、適宜評価することができる。
　本発明の一態様においては、変異型Ｃｉｓが用いられる。変異型Ｃｉｓの例は、本明細書の実施例で用いられている、配列番号２３の塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされる、配列番号２６のアミノ酸配列からなるタンパク質である。配列番号２３の塩基配列は、実施例で用いたｃｉｓの塩基配列（配列番号２）とは２塩基（８９７塩基中）が異なり、配列番号２６のアミノ酸配列は、実施例で用いたＣｉｓのアミノ酸配列（配列番号２５）とは１アミノ酸（２９９アミノ酸中）が異なる。配列番号２６のアミノ酸配列と配列番号２５のそれとの同一性は、９９．７％である。
　実施例で用いた変異型Ｃｉｓのアミノ酸配列（配列番号２６）はまた、配列番号６の塩基配列によりコードされるＭｅｌｉｌｏｔｉタンパク質のアミノ酸配列に対して３４％、配列番号７の塩基配列によりコードされるＬｏｔｉタンパク質のアミノ酸配列に対して２９％、同一である。
　本発明でポリヌクレオチドに関し、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」というときは、特に記載した場合を除き、いずれのポリヌクレオチドにおいても、ハイブリダイゼーションの条件は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ．　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ．　２ｎｄ　ｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）およびＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｎ Ｓｏｌｉｄ Ｓｕｐｐｏｒｔｓ（ＡＮＡＬＹＴＩＣＡＬ　ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ　１３８，２６７－２８４（１９８４））の記載に従い、取得しようとするポリヌクレオチドに合わせて適宜選定することができる。例えば８５％以上の同一性を有するＤＮＡを取得する場合、２倍濃度のＳＳＣ溶液および５０％ホルムアミドの存在下、４５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６０℃でフィルターを洗浄する条件を用いればよい。また９０％以上の同一性を有するＤＮＡを取得する場合、２倍濃度のＳＳＣ溶液および５０％ホルムアミドの存在下、５０℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１倍濃度のＳＳＣ溶液）を用い、６５℃でフィルターを洗浄する条件を用いればよい。
　また、本発明でタンパク質に関し、「１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列」というときの置換等されるアミノ酸の個数は、特に記載した場合を除き、いずれのタンパク質においても、そのアミノ酸配列からなるタンパク質が所望の機能を有する限り特に限定されないが、１～９個または１～４個程度であるか、性質の似たアミノ酸への置換であれば、さらに多くの個数の置換等がありうる。このようなアミノ酸配列に係るポリヌクレオチドまたはタンパク質を調製するための手段は、当業者にはよく知られている。
　本発明で塩基配列（ヌクレオチド配列ということもある。）またはアミノ酸配列に関し「「同一性」というときは、特に記載した場合を除き、いずれの塩基配列またはアミノ酸配列においても、２つの配列を最適の態様で整列させた場合に、２つの配列間で共有する一致したヌクレオチドまたはアミノ酸の個数の百分率を意味する。すなわち、同一性＝（一致した位置の数／位置の全数）×１００で算出でき、市販されているアルゴリズムを用いて計算することができる。また、このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５（１９９０）４０３－４１０に記載されるＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム中に組込まれている。より詳細には、塩基配列またはアミノ酸配列の同一性に関する検索・解析は、当業者には周知のアルゴリズムまたはプログラム（例えば、BLASTN、BLASTP、BLASTX、ClustalW）により行うことができる。プログラムを用いる場合のパラメーターは、当業者であれば適切に設定することができ、また各プログラムのデフォルトパラメーターを用いてもよい。これらの解析方法の具体的な手法もまた、当業者には周知である。
　本明細書において、塩基配列またはアミノ酸配列に関し、同一性というときは、特に記載した場合を除き、いずれの場合も、少なくとも７０％、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７．５％以上さらに好ましくは９９％以上の配列の同一性を指す。
　本発明で用いるポリヌクレオチドまたは遺伝子、およびタンパク質または酵素は、当業者であれば、従来技術を利用して調製することができる。
　本発明のシス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸の製造方法は、上述した工程（１）を含んでもよい。工程（１）は、Ｌ－リジンを基質としてＬ－アミノアジピン酸－デルタ－セミアルデヒドを生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質、すなわちＬ－リジン　６－アミノトランスフェラーゼ（Ｌａｔ）を用いて、Ｌ－リジンを基質として、Ｌ－アミノアジピン酸－デルタ－セミアルデヒドを生成し；続いてＬ－アミノアジピン酸－デルタ－セミアルデヒドがデルタ１－ピペリデイン－６－カルボン酸へ変換される工程である。この工程は、ｌａｔ遺伝子を有する生物にＬａｔを発現させ、生物学的に実施することができる。
　本発明においては、ｌａｔ遺伝子またはタンパク質として、下記の（A’）～（F’）のいずれか一のポリヌクレオチド、または下記の（d’）～（f’）のいずれか一のタンパク質を用いることができる。
（A’）配列番号１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（B’）配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬ－リジンを基質としてＬ－アミノアジピン酸－デルタ－セミアルデヒドを生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（C’）配列番号１に記載の塩基配列と少なくとも85％以上の同一性を有し、かつＬ－リジンを基質としてＬ－アミノアジピン酸－デルタ－セミアルデヒドを生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（D’）配列番号２４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（E’）配列番号２４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつＬ－リジンを基質としてＬ－アミノアジピン酸－デルタ－セミアルデヒドを生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（F’）配列番号２４に記載のアミノ酸配列と少なくとも85％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＬ－リジンを基質としてＬ－アミノアジピン酸－デルタ－セミアルデヒドを生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（d’）配列番号２４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（e’）配列番号２４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつＬ－リジンを基質としてＬ－アミノアジピン酸－デルタ－セミアルデヒドを生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質；
（f’）配列番号２４に記載のアミノ酸配列と少なくとも85％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＬ－リジンを基質としてＬ－アミノアジピン酸－デルタ－セミアルデヒドを生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質。
　配列表の配列番号１および２２に、フラボバクテリウム・ルテセンス（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｕｔｅｓｃｅｎｓ）ＩＦＯ３０８４由来のｌａｔの塩基配列およびアミノ酸配列を示した。
　本発明においては、ｌａｔ遺伝子またはタンパク質として、種々の生物由来のものを用いうる。本発明の一態様においては、ｌａｔ遺伝子およびタンパク質は、フラボバクテリウム属由来であり得、より特定すると、フラボバクテリウム・ルテセンス由来であり得、さらに特定すると、フラボバクテリウム・ルテセンス　ＩＦＯ３０８４由来であり得る。
　本発明のシス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸の製造方法は、上述した工程（２）を含んでもよい。工程（２）は、デルタ１－ピペリデイン－６－カルボン酸を基質としてＬ－ピペコリン酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質、すなわちピロリン酸－５－カルボン酸還元酵素（ＰｒｏＣ）を用い、デルタ１－ピペリデイン－６－カルボン酸を基質としてＬ－ピペコリン酸を生成する工程である。この工程は、ｐｒｏＣ遺伝子を有する生物を用い、生物学的に実施することができる。
　配列表の配列番号３および２５に、大腸菌由来のｐｒｏＣの塩基配列およびアミノ酸配列を示した。また、ｐｒｏＣについては、前掲特許文献１を参照することができる。
　ＰｒｏＣは、大腸菌が元来有する酵素である。本発明の製造方法を大腸菌を用いて実施する場合は、工程（２）のための酵素として、大腸菌が元来有するＰｒｏＣを利用してもよく、強化等の目的で、外来のＰｒｏＣを利用してもよい。本発明で「発現可能な状態で含む」というときは、特に記載した場合を除き、そのポリヌクレオチドは外来のものに限られず、元来有しているものも含む。
　本発明のシス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸の製造方法は、上記の工程（１）～（３）のいずれかまたはすべてを、生物学的に実施することができる。生物学的実施の典型的な例は、必要な遺伝子を発現可能な状態で含む微生物細胞内で実施することである。シス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸の生物学的な製造方法に用いるための微生物は、宿主微生物を適切に構成されたベクターにより形質転換することにより得ることができる。本発明は、このような遺伝子組換え微生物、ベクターをも提供する。本発明の実施のために用いられる生物の例は微生物であり、より具体的な例は、原核生物であり、さらに具体的な例は、大腸菌である。
　本発明で「遺伝子組換え微生物」というときは、特に記載した場合を除き、遺伝子組換え技術を用いて特定の微生物に別の生物由来の遺伝子を導入した微生物（細菌、放線菌、酵母、糸状菌等）を意味し、それに用いる遺伝子導入の手法は、プラスミド等のベクターを用いた遺伝子組換えだけでなく、相同組換え等の手法も包含する。
　本発明により、Ｌ－リジン　６－アミノトランスフェラーゼ酵素活性を有するタンパク質（Ｌａｔ）、ピロリン－５－カルボン酸リダクターゼ酵素活性を有するタンパク質（ＰｒｏＣ）、およびＬ－ピペコリン酸のシス－５位水酸化酵素活性を有するタンパク質（Ｃｉｓ）それぞれをコードする遺伝子を発現可能に有しており、Ｌ－リジンからシス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸を直接生産することが可能な遺伝子組換え微生物を得ることができる。また、そのような遺伝子組換え微生物を培養し、培養液中から採取することによりシス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸を効率よく生産することができる。
　本発明により提供される遺伝子組換え微生物は、いずれの態様においても、リジン特異的透過タンパク質活性を有するタンパク質（ＬｙｓＰ）をコードする遺伝子を発現可能に有していてもよい。Ｌ－ピペコリン酸の生物学的な製造方法においては、ＬｙｓＰの利用により、Ｌ－ピペコリン酸の生産速度が向上したことが報告されており、同様の観点から、シス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸の生物学的な製造方法においても、ＬｙｓＰが有用でありうる。配列番号４に大腸菌由来ｌｙｓＰ遺伝子の塩基配列を示した。
　本発明により提供される遺伝子組換え微生物は、いずれの態様においても、さらにα－ケトグルタル酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を発現可能な状態で含んでいてもよい。Ｌ－ピペコリン酸シス－５位水酸化酵素に代表されるアミノ酸水酸化酵素類は、その水酸化反応に際しα－ケトグルタル酸を要求する（非特許文献３）。また、Ｌ－リジン　６－アミノトランスフェラーゼもそのアミノ基転移反応に際しα－ケトグルタル酸を要求し、それをグルタミン酸に変換することが知られている（ＥＣ ２．６．１．３６ ）。従って、これらのタンパク質が発現可能な微生物を利用してＬ－リジンからＬ－ピペコリン酸を製造する際には、α－ケトグルタル酸を再生することが重要であることが想像される。
　グルタミン酸をα－ケトグルタル酸に再生する酵素としてはグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．４．１．２）が知られており、この酵素による反応はＬ－リジン　６－アミノトランスフェラーゼによる反応と共役しうる。配列番号５に、枯草菌バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｓｕｂｓｐ．　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　ｓｔｒ．　１６８由来のｒｏｃＧ遺伝子の塩基配列を示した。
　以下、本発明の実施態様についてさらに具体的に説明する。
　本発明のシス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸の生物学的な製造方法に用いる、Ｌ－ピペコリン酸のシス－５位水酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、当該技術分野で周知の方法（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ．　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ．　２ｎｄ　ｅｄに記載されたコロニーハイブリダイゼーション法）に従って、適切な微生物の菌体から得ることができる。このような微生物の好ましい例として、セグニリパラス属に属する菌株、より詳細にはセグニリパラス・ルゴサスに属する菌株、より具体的には、セグニリパラス・ルゴサス　ＡＴＣＣ　ＢＡＡ－９７４を挙げることができる。または、本発明の実施例のように、Ｌ－ピペコリン酸のシス－５位水酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを人工的に合成しても良い。
　実施例で人工合成した、ＥＦＶ１２５１７タンパク質のアノテーションよりも４８塩基（１６アミノ酸相当）上流から発現させたＬ－ピペコリン酸のシス－５位水酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドは配列表の配列番号２に示すとおりである。この配列番号２で示されるＤＮＡには、ｃｉｓ（塩基１～塩基８９７）のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）が含まれている。
　本発明の一態様である組換え体は、Ｌ－ピペコリン酸の生合成に関与する酵素（例えば、Ｌａｔ、ＰｒｏＣ、ＬｙｓＰ、ＲｏｃＧ）をコードするポリヌクレオチド、およびＬ－ピペコリン酸シス－５位水酸化酵素（Ｃｉｓ）をコードするポリヌクレオチドを保有する遺伝子組換え微生物であり、宿主微生物にこれらのＤＮＡの両方を組み込む方法により作製することができる。
　宿主は、目的のＤＮＡを組み込むことができ、目的のシス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸を生産できる微生物であれば特に制限はなく使用できる。好ましい微生物として大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）に属する菌株、例えば大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株等を挙げることができる。
　宿主に外来のポリヌクレオチドを組み込み発現させるための手段には、特に制限はないが、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ．　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ．　２ｎｄ　ｅｄ、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｅｄｉｔｅｄ　ｂｙ　Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ　Ｍ．　Ａｕｓｕｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ．，　１９８７）等に記載された方法を用いて行うことができる。宿主、プラスミド－ベクター系は、目的のポリヌクレオチドが宿主中で安定に保持、発現できる系であれば特に制限はない。またプラスミドは、目的のポリヌクレオチド以外に、自律複製配列、プロモーター配列、ターミネーター配列、薬剤耐性遺伝子等を含んでいてもよく、プラスミドの種類としては、自律複製性プラスミドだけでなく、使用が予定される宿主のゲノムの一定領域と相同の配列をもつ組込み型プラスミドであってもよい。目的のポリヌクレオチドを組み込む部位は、プラスミド上または宿主微生物のゲノム上のいずれでもあってもよい。
　宿主として大腸菌を用いる場合は、自律複製型ベクターとしてｐＵＣ１９やｐＲＳＦＤｕｅｔ－１等を、プロモーター配列としてはｌａｃやＴ７等を、ターミネーター配列としては、ｌａｃＺ　ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒやＴ７　ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ等を、薬剤耐性遺伝子としてはアンピシリン耐性遺伝子やカナマイシン耐性遺伝子等を、それぞれ挙げることができる。
　遺伝子組換え大腸菌で本発明を実施する場合、Ｌ－ピペコリン酸の生合成に関与するタンパク質のうちのＬａｔ、およびＣｉｓの導入は重要であるが、ＰｒｏＣ、ＬｙｓＰおよびＲｏｃＧの導入の適否は、目的生産物の量、同時に生産されるＬ－ピペコリン酸の有無および程度、出発物質であるＬ－リジンの利用率等を考慮し、適宜設計することができる。
　このようにして調製した遺伝子組換え微生物を培養し、シス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸の生産性を、従来技術の方法の方法により評価し、適切な組換体を選択することにより、有用なシス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸の生産株を得ることができる。生産物の測定方法は、本発明の実施例の記載の方法にしたがってもよい。
　本発明のシス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸の生物学的な製造方法は、典型的には遺伝子組換え微生物を培養することにより実施される。微生物の培養条件は、当業者であれば、用いる微生物に応じ、適宜設計することができる。宿主として大腸菌を用いる場合、必要に応じ、選択マーカーとしての抗生物質を含む汎用な培地に適切な量の微生物を接種し、２０℃～４０℃で、６時間～７２時間、好ましくは９時間～６０時間、より好ましくは１２時間～４８時間、必要に応じ、１００～４００ｒｐｍで撹拌または振とうしながら培養し、菌体を増殖させることができる。この培養中または培養後に、出発物質としてのＬ－リジンまたはその塩、必要に応じ、α－ケトグルタル酸またはその塩、さらに必要に応じ、適切な誘導物質（例えば、ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｔｈｉｏ－β－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ））を供給し、さらに２０℃～４０℃で、３時間～７２時間、好ましくは４時間～６０時間、より好ましくは６時間～４８時間、必要に応じ、１００～４００ｒｐｍで撹拌または振とうすることにより、培養液中に目的物質が得られる。Ｌ－リジン等の供給のタイミングや、培養の終点は、当業者であれば、目的物質の生産量等を勘案し、適宜決定できるが、事前に行った小スケールでの培養結果に基づいて、あらかじめ決定しておいた時間が経過した際に、Ｌ－リジン等を供給し、また培養を終了することができる。
　Ｌ－リジンの初発濃度は、例えば２～３２ｇ／Ｌ、より特定すると４～１６ｇ／Ｌとすることができ、α－ケトグルタル酸の初発濃度は、例えば０～１６ｇ／Ｌ、より特定すると０～８ｇ／Ｌとすることができる。あるいはα－ケトグルタル酸の初発濃度は、例えば１～１６ｇ／Ｌ、より特定すると２～８ｇ／Ｌとすることができる
　本発明の遺伝子組換え大腸菌の好ましい例は、シス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸を培養液１Ｌ当り５０ｍｇ以上生産する能力を有する、遺伝子組換え大腸菌である。
　本発明では、「シス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸もしくはその薬理学上許容される塩またはそれらの溶媒和物」のうち、シス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸を例に説明することがあるが、その説明は、特に記載した場合を除き、シス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸の薬理学上許容される塩またはそれらの溶媒和物にも当てはまり、また当業者であれば、適宜必要な工程を加えて、シス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸の製造方法を、その薬理学上許容される塩またはそれらの溶媒和物の製造方法に改変できる。なお、本発明で「薬理学上許容される塩またはそれらの溶媒和物」というときは、塩には、アルカリ金属塩（例えばナトリウム塩、カリウム塩）、アルカリ土類金属塩（例えばマグネシウム塩、カルシウム塩）、アンモニウム塩、モノ－、ジ－またはトリ－低級（アルキルまたはヒドロキシアルキル）アンモニウム塩（例えばエタノールアンモニウム塩、ジエタノールアンモニウム塩、トリエタノールアンモニウム塩、トロメタミン塩）、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、リン酸塩、硫酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩、酒石酸塩、トリクロロ酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、メシチレンスルホン酸塩およびナフタレンスルホン酸塩が含まれる。
　また、塩は、無水物、または溶媒和物であってよく、溶媒和物には、水和物、メタノール和物、エタノール和物、プロパノール和物、および２－プロパノール和物が含まれる。
　以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
　〔実施例１.ｐＲＳＦｄｕｅｔ－Ｃｉｓの構築〕
　配列番号１の塩基配列を参考にして、５’末端にＮｃｏＩサイトを付加したプライマーｌａｃ－ｌａｔ－ＮｃｏＦ２（配列番号９参照）および５’末端にＳｐｅＩサイトを付加したプライマーｌａｔ－ＸｈｏＲ（配列番号１０参照）を設計し、作成した。次に、この２種のプライマーとフラボバクテリウム　ルテセンス（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｕｔｅｓｃｅｎｓ）ＩＦＯ３０８４株ゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ社）を用い、変性を９８℃２０秒間、アニーリングを６０℃２０秒間、伸長を６８℃９０秒間行う２段階の反応を３０回繰り返した。このＰＣＲ増幅反応液からｌａｔを含む約１．５ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片をＷｉｚａｒｄ　ＰＣＲ　Ｐｒｅｐｓ　ＤＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）によって回収した。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＮｃｏＩとＸｈｏＩで消化したものをｌａｔ断片とした。
　配列番号４の塩基配列を参考にして、５’末端にＸｈｏＩサイトを付加したプライマーｌｙｓＰ－ＳＤ－ＸｈｏＦ（配列番号１１参照）および５’末端にＫｐｎＩサイトを付加したプライマーｌｙｓＰ－ＫｐｎＲ（配列番号１２参照）を設計し作成した（ＳＩＧＭＡ　ＧＥＮＯＳＹＳ社）。次に、この２種のプライマーと大腸菌Ｋ１２由来ＪＭ１０９株ゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて上記と同様にＰＣＲ反応を行った。このＰＣＲ増幅反応液からｌｙｓＰを含む約１．５ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片を回収した。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＸｈｏＩとＫｐｎＩで消化したものをｌｙｓＰ断片とした。
　配列番号３の塩基配列を参考にして、５’末端にＫｐｎＩサイトを付加したプライマーｐｒｏＣ－ＳＤ－ＫｐｎＦ（配列番号１３参照）および５’末端にＢａｍＨＩサイトを付加したプライマーｐｒｏＣ－ＢａｍＲ（配列番号１４参照）を設計し作成した。次に、この２種のプライマーと大腸菌　Ｋ１２　ＪＭ１０９株ゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて上記と同様にＰＣＲ反応を行った。このＰＣＲ増幅反応液からｐｒｏＣを含む約１．０ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片を回収した。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＫｐｎＩとＢａｍＨＩで消化したものをｐｒｏＣ断片とした。
　ｐＲＳＦＤｕｅｔ－１（Ｎｏｖｅｒｇｅｎ社）を制限酵素ＮｃｏＩとＢａｍＨＩにより消化して得たプラスミド消化物と、ｌａｔ断片、ｌｙｓＰ断片、およびｐｒｏＣ断片をＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　ｖｅｒ．２（タカラバイオ社）を用いて四者ライゲーションし、Ｅ．　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ社）を形質転換することにより、ｌａｔ、ｌｙｓＰ、およびｐｒｏＣ各遺伝子を有するプラスミドｐＲＳＦ－ＬＬＰを構築した。
　次に、配列番号５の塩基配列を参考にして、５’末端にＢａｍＨＩサイトを付加したプライマーｒｏｃＧ－ＳＤ－ＢａｍＦ（配列番号１５参照）および５’末端にＸｂａＩサイトを付加したプライマーｒｏｃＧ－ＸｂａＲ（配列番号１６参照）を設計し作成した。次に、この２種のプライマーと枯草菌バチルス・サブチリスｓｕｂｓｐ．　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　ｓｔｒ．　１６８株ゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて上記と同様にＰＣＲ反応を行った。このＰＣＲ増幅反応液からｒｏｃＧを含む約１．３ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片を回収した。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩとＸｂａＩで消化したものをｒｏｃＧ断片とした。
　ｐＲＳＦ－ＬＬＰを制限酵素ＢａｍＨＩとＸｂａＩにより消化して得たプラスミド消化物と、ｒｏｃＧ断片をライゲーションし、ｌａｔ、ｌｙｓＰ、ｐｒｏＣ、およびｒｏｃＧ各遺伝子を有するプラスミドｐＲＳＦ－ＰＡを構築した。
　配列番号８の塩基配列を参考にして、５’末端にＮｄｅＩサイトを付加したプライマーｓｅｇｎｉ－ｓｈｏｒｔ－ＮｄｅＦ（配列番号１７参照）および５’末端にＢｇｌＩＩサイトを付加したプライマーｓｅｇｎｉ－ｃｉｓ－ＢｇｌＲ（配列番号１８参照）を設計し作成した。次に、配列番号８の塩基配列の通りに人工遺伝子合成を行い（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社）、これをテンプレートとして用いて上記と同様にＰＣＲ反応を行った。このＰＣＲ増幅反応液からｃｉｓを含む約０．９ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片を回収した。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩとＢｇｌＩＩで消化したものをｃｉｓＳｈｏｒｔ断片とした。
　ｐＲＳＦ－ＰＡを制限酵素ＮｄｅＩとＢｇｌＩＩにより消化して得たプラスミド消化物と、ｃｉｓＳｈｏｒｔ断片をライゲーションし、ｌａｔ、ｌｙｓＰ、ｐｒｏＣ、ｒｏｃＧの各遺伝子、およびＥＦＶ１２５１７タンパク質をコードする遺伝子（ｓｈｏｒｔｃｉｓ）を有するプラスミドｐＲＳＦ－ＣｉｓＳｈｏｒｔを構築した。
　配列番号２の塩基配列を参考にして、５’末端にＮｄｅＩサイトを付加したプライマーｓｅｇｎｉ－ｃｉｓ－ＮｄｅＦ２（配列番号１９参照）および５’末端にＢｇｌＩＩサイトを付加したプライマーｓｅｇｎｉ－ｃｉｓ－ＢｇｌＲ（配列番号１８参照）を設計し作成した。次に、配列番号２の塩基配列の通りに人工遺伝子合成を行い（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社）、これをテンプレートとして用いて上記と同様にＰＣＲ反応を行った。このＰＣＲ増幅反応液からｃｉｓを含む約０．９ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片を回収した。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩとＢｇｌＩＩで消化したものをｃｉｓ断片とした。
　ｐＲＳＦ－ＰＡを制限酵素ＮｄｅＩとＢｇｌＩＩにより消化して得たプラスミド消化物と、ｃｉｓ断片をライゲーションし、ｌａｔ、ｌｙｓＰ、ｐｒｏＣ、ｒｏｃＧ、およびｃｉｓ各遺伝子を有するプラスミドｐＲＳＦ―Ｃｉｓ（図２）を構築した。
　配列番号１の塩基配列を参考にして、５’末端にＮｃｏＩサイトを付加したプライマーｌａｃ－ｌａｔ－ＮｃｏＦ２（配列番号９参照）および５’末端にＡｆｌＩＩサイトを付加したプライマーｌａｔ－（Ｓｐｅ）ＡｆｌＲ２（配列番号２０参照）を設計し作成した。次に、この２種のプライマーとプラスミドｐＲＳＦ－Ｃｉｓをテンプレートとして用いてＰＣＲ反応を行った。このＰＣＲ増幅反応液からｌａｔを含む約１．５ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片を回収した。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＮｃｏＩとＡｆｌＩＩで消化したものをｌａｔ２断片とした。
　ｐＲＳＦ－Ｃｉｓを制限酵素ＮｃｏＩとＡｆｌＩＩにより消化して得たプラスミド消化物と、ｌａｔ２断片をライゲーションし、ｌａｔおよびｃｉｓ遺伝子を有するプラスミドｐＲＳＦ－ＬａｔＣｉｓを構築した。
　配列番号７の塩基配列を参考にして、５’末端にＮｃｏＩサイトを付加したプライマーｌｏｔｉ－ＳＤ－ＰａｃＦ（配列番号２１参照）および５’末端にＡｖｒＩＩサイトを付加したプライマーｌｏｔｉ－ＡｖｒＲ（配列番号２２参照）を設計し作成した。次に、この２種のプライマーとメソリゾビウム・ロチ　ＭＡＦＦ３０３０９９株ゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いてＰＣＲ反応を行った。このＰＣＲ増幅反応液からＢＡＢ５２６０５タンパク質をコードする遺伝子を含む約０．９ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片を回収した。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＰａｃＩとＡｆｌＩＩで消化したものをｌｏｔｉ断片とした。
　ｐＲＳＦ－Ｃｉｓを制限酵素ＰａｃＩとＡｆｌＩＩにより消化して得たプラスミド消化物と、ｌｏｔｉ断片をライゲーションし、ｌａｔ、ｌｙｓＰ、ｐｒｏＣ、ｒｏｃＧの各遺伝子、およびＢＡＢ５２６０５タンパク質をコードする遺伝子（ｌｏｔｉ）を有するプラスミドｐＲＳＦ―Ｌｏｔｉを構築した。
　最後に、プライマーとしてｓｅｇｎｉ－ｃｉｓ－ＮｄｅＦ２およびｓｅｇｎｉ－ｃｉｓ－ＢｇｌＲ、テンプレートとしてｐＲＳＦ－Ｃｉｓをそれぞれ用い、ＤｉｖｅｒｓｉｆｙTM　ＰＣＲ　Ｒａｎｄｏｍ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｋ社）の条件５を用いてＰＣＲ反応を行った。このＰＣＲ増幅反応液から約０．９ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片を回収した。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩとＢｇｌＩＩで消化したものをｍｕｔａｎｔ－ｃｉｓ断片とした。ｐＲＳＦ－ＰＡを制限酵素ＮｄｅＩとＢｇｌＩＩにより消化して得たプラスミド消化物と、ｍｕｔａｎｔ－ｃｉｓ断片をライゲーションし、ｐＲＳＦ－ＰＡを制限酵素ＮｄｅＩとＢｇｌＩＩにより消化して得たプラスミド消化物と、ｍｕｔａｎｔ－ｃｉｓ断片をライゲーションし、ｌａｔ、ｌｙｓＰ、ｐｒｏＣ、ｒｏｃＧの各遺伝子、および変異型ｃｉｓ遺伝子を有するプラスミドｐＲＳＦ－ＭｕｔＣｉｓＬｉｂｒａｒｙを構築した。
　〔実施例２. シス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸生産試験１〕
　プラスミドｐＲＳＦ－Ｃｉｓ（図２）、ｐＲＳＦ－ＣｉｓＳｈｏｒｔ、ｐＲＳＦ－ＰＡ、ｐＲＳＦ－ＬａｔＣｉｓおよびｐＲＳＦＤｕｅｔ－１を用いて、大腸菌ワンショットＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセル（ライフテクノロジーズジャパン社）を形質転換した株をそれぞれＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＲＳＦ－Ｃｉｓ、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＲＳＦ－ＣｉｓＳｈｏｒｔ、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＲＳＦ－ＰＡＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＲＳＦ－ＬａｔＣｉｓおよびＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＲＳＦＤｕｅｔ－１とした。これらの株をカナマイシン硫酸塩（２５μｇ／ｍｌ）を含むＭ９ＳＥＥＤ液体培地（３．３９％　Ｎａ2ＨＰＯ4、１．５％　ＫＨ2ＰＯ4、０．２５％塩化カルシウム、０．５％塩化アンモニウム、１％　カザミノ酸、０．００２％　チミン、０．１ｍＭ塩化カルシウム、０．１ｍＭ硫酸鉄、０．４％　グルコース、０．００１ｍＭ　塩化マグネシウム）に接種し、３０℃で２２時間２２０ｒｐｍで振とう培養した。この培養液１０μＬをカナマイシン硫酸塩（３０μｇ／ｍＬ）とＯｖｅｒｎｉｇｈｔ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍｓ（メルク社）を含むＭ９Ｃｉｓ培地（３．３９％　Ｎａ2ＨＰＯ4、１．５％　ＫＨ2ＰＯ、０．２５％　塩化ナトリウム、０．５％　塩化アンモニウム、１％　カザミノ酸、０．００２％　チミン、０．１ｍＭ　塩化カルシウム、０．１ｍＭ　硫酸鉄、８０μｇ／ｍｌ　５－アミノレブリン酸、０．０１％）に添加した後、３０℃で９時間２２０ｒｐｍで振とう培養した。ここで４０％　Ｌ－リジン塩酸塩１０μＬ（終濃度８ｇ／Ｌ）、２０％　α－ケトグルタル酸　１０μＬ（終濃度４ｇ／Ｌ）、１００ｍＭ　ＩＰＴＧ　０．５μＬ（終濃度０．１ｍＭ）、および５０％　Ｇｌｙｃｅｒｏｌ　５μＬ（終濃度０．５％）を加え、さらに３０℃、２２０ｒｐｍで振とう培養した。培養開始後２４時間の時点で培養液の遠心上清を回収し、ＬＣ／ＭＳ分析サンプル調製に充てた。
　サンプリング液についてＮα－（５－Ｆｌｕｏｒｏ－２，４－ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）－Ｌ－ｌｅｕｃｉｎａｍｉｄｅ（Ｌ－ＦＤＬＡ）（東京化成工業社）を用い、以下の方法によりＦＤＬＡ化した。
　サンプリング液の遠心上清の１０倍希釈液２０μＬに１Ｍ　ＮａＨＣＯ3　６．２５μＬと１％　Ｌ－ＦＤＬＡアセトン溶液３０μＬとを加え３７℃で一時間保温した。１Ｎ　ＨＣＬを６．２５μＬ加え反応を停止し、アセトニトリル６０μＬを加え希釈したものをＦＤＬＡ化液とした。
　得られたＦＤＬＡ化液についてＨＰＬＣおよびＬＣ／ＭＳにてＬ－リジン、Ｌ－ピペコリン酸およびシス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸の量を測定した。ＨＰＬＣおよびＬＣ／ＭＳ分析チャートを図３および図４に示した。定量結果を表１に示した。また、ＨＰＬＣおよびＬＣ／ＭＳの測定条件を以下に示す。
　分析条件
カラム：ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫ　Ｃ１８　ＳＧ１２０，４．６×１５０ｍｍ，５μｍ
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
移動相：Ａ；０．１％酢酸　Ｂ；アセトニトリル
グラジエント：０－９ｍｉｎ（Ｂ：３０－６５％），９．０１－１２ｍｉｎ（Ｂ：９０％），１２．０１－１５ｍｉｎ（Ｂ：３０％）
検出：３４０ｎｍ
注入量：５μＬ
カラム温度：４０℃
ＭＳ：Ａｇｉｌｅｎｔ　６３２０　（Ｉｏｎ　ｔｒａｐ）
Ｍｏｄｅ：ＥＳＩ／ＡＰＣＩ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ
Ｓｃａｎ　Ｒａｎｇｅ：ｍ／ｚ　１００－９００
　分析時間：１５分
　保持時間：Ｌ－リジン　１０．０分
　　　　　　Ｌ－ピペコリン酸　８．５分
　　　　　　シス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸　５．８分
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　この結果、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＲＳＦＤｕｅｔ－１株ではＬ－ピペコリン酸およびシス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸の生産が確認できなかったのに対して、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＲＳＦ－ＣｉｓＳｈｏｒｔ株（プラスミド上にｌａｔ、ｌｙｓＰ、ｐｒｏＣ、ｒｏｃＧ、ｓｈｏｒｔｃｉｓ各遺伝子含有）およびＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＲＳＦ―ＰＡ株（プラスミド上にｌａｔ、ｌｙｓＰ、ｐｒｏＣ、ｒｏｃＧ各遺伝子含有）ではＬ－ピペコリン酸を生産していた。また、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＲＳＦ－Ｃｉｓ株（プラスミド上にｌａｔ、ｌｙｓＰ、ｐｒｏＣ、ｒｏｃＧ、ｃｉｓ各遺伝子含有）およびＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＲＳＦ―ＬａｔＣｉｓ株（プラスミド上にｌａｔおよびｃｉｓ遺伝子含有）ではシス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸とＬ－ピペコリン酸を生産していた。
　このことより、Ｌ－ピペコリン酸生産能を有する株にｃｉｓ遺伝子を導入すること（ここではｌａｔ遺伝子とｃｉｓ遺伝子の共発現）により、シス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸を直接生産できること、さらにｌｙｓＰ、ｐｒｏＣおよびｒｏｃＧ遺伝子をも共発現することによりその生産性が向上しうることが示された。尚、Ｌ－ピペコリン酸の標品としてＬ－Ｐｉｐｅｃｏｌｉｃ　Ａｃｉｄ（東京化成工業株式会社）、シス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸の標品として（２Ｓ，５Ｓ）－５－Ｈｙｄｒｏｘｙｐｉｐｅｃｏｌｉｃ　Ａｃｉｄ　（ＳＶ　ＣｈｅｍＢＩＯＴＥＣＨ．ＩＮＣ）を用いた。
　このように、ｓｈｏｒｔｃｉｓ遺伝子にコードされたＥＦＶ１２５１７タンパク質を発現した大腸菌にはＬ－ピペコリン酸をシス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸に変換する能力は検出できなかったが、ＥＦＶ１２５１７タンパク質のアノテーションよりも４８塩基（１６アミノ酸相当）上流から発現させたポリヌクレオチド（ｃｉｓ遺伝子）にコードされたタンパク質を発現した大腸菌は、Ｌ－ピペコリン酸をシス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸に変換するＬ－ピペコリン酸のシス－５位水酸化酵素活性を有していた。さらに、このｃｉｓ遺伝子にコードされるタンパク質のアミノ酸配列と、ＣＡＣ４７６８６タンパク質およびＢＡＢ５２６０５タンパク質のアミノ酸配列との相同性はそれぞれ３４％および３３％であった。
　以上のことから、ｃｉｓ遺伝子にコードされたタンパク質を発現した大腸菌が、Ｌ－ピペコリン酸をシス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸に変換するＬ－ピペコリン酸のシス－５位水酸化酵素活性を有することは、既知情報からは推測しがたいと考えられた。
　〔実施例３．シス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸生産試験２〕
　プラスミドｐＲＳＦ－Ｃｉｓ、ｐＲＳＦ－ＬｏｔｉおよびｐＲＳＦ－ＭｕｔＣｉｓを用いて大腸菌ワンショットＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセルを形質転換した株をそれぞれＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＲＳＦ－ＣｉｓおよびＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＲＳＦ－Ｌｏｔｉとした。また、プラスミドｐＲＳＦ－ＭｕｔＣｉｓＬｉｂｒａｒｙを用いて大腸菌ワンショットＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセルを形質転換した株のうちの一株を、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＲＳＦ－ＭｕｔＣｉｓ１とした。これらの株を実施例２と同様に培養および分析を行い、Ｌ－ピペコリン酸およびシス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸の量を測定した。測定結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　この結果、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＲＳＦ－Ｃｉｓ株（プラスミド上にｌａｔ、ｌｙｓＰ、ｐｒｏＣ、ｒｏｃＧ、ｃｉｓ各遺伝子含有）に比べ、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＲＳＦ－Ｌｏｔｉ株（プラスミド上にｌａｔ、ｌｙｓＰ、ｐｒｏＣ、ｒｏｃＧ、ｌｏｔｉ各遺伝子含有）では、シス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸生産量は約１／３０であった。このことより、ｌｏｔｉ遺伝子がコードするＢＡＢ５２６０５タンパク質を発現した大腸菌を用いた場合、得られるシス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸の量が比較的少ないことが示された。
　一方、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＲＳＦ－Ｃｉｓ株に比べ、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＲＳＦ―ＭｕｔＣｉｓ１株（プラスミド上にｌａｔ、ｌｙｓＰ、ｐｒｏＣ、ｒｏｃＧ、変異型ｃｉｓ各遺伝子含有）でも、シス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸生産量は同等以上であった。この変異型ｃｉｓ遺伝子の塩基配列をＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　ｖ３．１　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて解析した結果を配列番号２３に示した。この結果、ｃｉｓ遺伝子塩基配列とこの変異型ｃｉｓ遺伝子塩基配列は全８９７塩基中２塩基が異なる為、両遺伝子塩基配列の相同性は９９．７％であった。このことより、ｃｉｓ遺伝子塩基配列との相同性が９９．７％以上である遺伝子がコードするタンパク質を発現した大腸菌を用いたシス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸製造が可能であることが示された。
　〔実施例４．　シス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸生産試験３〕
　プラスミドｐＲＳＦ－Ｃｉｓ、およびｐＲＳＦ－ＣｉｓΔｐｒｏＣΔｒｏｃＧを用いて大腸菌ワンショットＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセルを形質転換した株をそれぞれＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＲＳＦ－ＣｉｓおよびＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＲＳＦ－ＣｉｓΔｐｒｏＣΔｒｏｃＧとした。これらの株を実施例２と同様に培養および分析を行い、Ｌ－ピペコリン酸およびシス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸の量を測定した。測定結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　この結果、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＲＳＦ－Ｃｉｓ株（プラスミド上にｌａｔ、ｌｙｓＰ、ｐｒｏＣ、ｒｏｃＧ、ｃｉｓ各遺伝子含有）に比べ、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＲＳＦ－ＣｉｓΔｐｒｏＣΔｒｏｃＧ株（プラスミド上にｌａｔ、ｌｙｓＰ、ｃｉｓ各遺伝子含有）では、シス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸生産量は約２／３であった。このことより、ｌａｔおよびｌｙｓＰ両遺伝子に加えｐｒｏＣおよびｒｏｃＧ遺伝子をもプラスミド上に含有する場合の方が、得られるシス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸の量が多いことが示された。
　〔実施例５．　シス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸生産試験４〕
　プラスミドｐＲＳＦ－ＣｉｓのｐｒｏＣ遺伝子、ｒｏｃＧ遺伝子、もしくはこれら両遺伝子を削る為、以下のプライマーを作製した。
プライマーｐｒｏＣｒｏｃＧＸ－ＳｐｅＲ　（配列番号２７参照）
プライマーｐｒｏＣＸ－ＳｐｅＲ　（配列番号２８参照）
プライマーｒｏｃＧＸ－ＳｐｅＦ　（配列番号２９参照）
プライマーｐｒｏＣＸ－ＳｐｅＦ　（配列番号３０参照）
　プラスミドｐＲＳＦ－ＣｉｓのｐｒｏＣ遺伝子を削ったプラスミドｐＲＳＦ－ＣｉｓΔｐｒｏＣは、以下のように作製した。プライマーｐｒｏＣＸ－ＳｐｅＦとプライマーｐｒｏＣｒｏｃＧＸ－ＳｐｅＲを用い、ｐＲＳＦ－Ｃｉｓをテンプレートとして用いてＰＣＲ反応を行った。このＰＣＲ増幅反応液からプラスミドｐＲＳＦ－ＣｉｓのｐｒｏＣ遺伝子を削ったＤＮＡ断片を回収した。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＳｐｅＩで消化し、セルフライゲーションし、Ｅ．　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ社）を形質転換することにより、ｐＲＳＦ－ＣｉｓΔｐｒｏＣを構築した。同様に、プラスミドｐＲＳＦ－ＣｉｓのｒｏｃＧ遺伝子を削ったプラスミドｐＲＳＦ－ＣｉｓΔｒｏｃＧはプライマーｒｏｃＧＸ－ＳｐｅＦとプライマーｐｒｏＣＸ－ＳｐｅＲを用い、プラスミドｐＲＳＦ－ＣｉｓのｐｒｏＣ遺伝子とｒｏｃＧ遺伝子遺伝子を削ったプラスミドｐＲＳＦ－ＣｉｓΔｐｒｏＣΔｒｏｃＧは、プライマーｒｏｃＧＸ－ＳｐｅＦとプライマーｐｒｏＣｒｏｃＧＸ－ＳｐｅＲを用いて作製した。
　プラスミドｐＲＳＦ－Ｃｉｓ、ｐＲＳＦ－ＣｉｓΔｐｒｏＣ、ｐＲＳＦ－ＣｉｓΔｒｏｃＧ、およびｐＲＳＦ－ＣｉｓΔｐｒｏＣΔｒｏｃＧを用いて、大腸菌ワンショットＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセル（ライフテクノロジーズジャパン社）を形質転換した株をそれぞれＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＲＳＦ－Ｃｉｓ、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＲＳＦ－ＣｉｓΔｐｒｏＣ、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＲＳＦ－ＣｉｓΔｒｏｃＧ、およびＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＲＳＦ－ＣｉｓΔｐｒｏＣΔｒｏｃＧとした。これらの株をカナマイシン硫酸塩（２５μｇ／ｍｌ）を含むＭ９ＳＥＥＤ液体培地（３．３９％　Ｎａ2ＨＰＯ4、１．５％　ＫＨ2ＰＯ4、０．２５％塩化カルシウム、０．５％塩化アンモニウム、１％　カザミノ酸、０．００２％　チミン、０．１ｍＭ塩化カルシウム、０．１ｍＭ硫酸鉄、０．４％　グルコース、０．００１　ｍＭ　塩化マグネシウム）に接種し、３０℃で９時間２２０ｒｐｍで振とう培養した。この培養液１０μＬをカナマイシン硫酸塩（３０μｇ／ｍＬ）、Ｌ－リジン塩酸塩（終濃度８ｇ／Ｌ）、α－ケトグルタル酸（終濃度２ｇ／Ｌ）およびＯｖｅｒｎｉｇｈｔ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍｓ（メルク社）を含むＭ９Ｃｉｓ培地（３．３９％　Ｎａ2ＨＰＯ4、１．５％　ＫＨ2ＰＯ、０．２５％　塩化ナトリウム、０．５％　塩化アンモニウム、１％　カザミノ酸、０．００２％　チミン、　０．１ｍＭ　塩化カルシウム、０．１ｍＭ　硫酸鉄、８０μｇ／ｍｌ　５－アミノレブリン酸、０．０１％）に添加した後、３０℃で１５時間２２０ｒｐｍで振とう培養した。ここで４０％　Ｌ－リジン塩酸塩５μＬ（終濃度４ｇ／Ｌ）、２０％　α－ケトグルタル酸　５μＬ（終濃度２ｇ／Ｌ）、１００ｍＭ　ＩＰＴＧ　０．５μＬ（終濃度０．１ｍＭ）、および５０％　グリセロール　５μＬ（終濃度０．５％）を加え、さらに３０℃、２２０ｒｐｍで振とう培養した。培養開始後３９時間の時点で培養液の遠心上清を回収し、ＬＣ／ＭＳ分析サンプル調製に充てた。測定結果を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　この結果、この培養条件では、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＲＳＦ－ＣｉｓΔｒｏｃＧおよびＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＲＳＦ－ＣｉｓΔｐｒｏＣΔｒｏｃＧの方が、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＲＳＦ－Ｃｉｓより、シス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸の生産量が多かった。
配列番号１：ｌａｔの塩基配列
配列番号２：ｃｉｓの塩基配列
配列番号３：ｐｒｏＣの塩基配列
配列番号４：ｌｙｓＰの塩基配列
配列番号５：ｒｏｃＧの塩基配列
配列番号６：ｍｅｌｉｌｏｔｉの塩基配列
配列番号７：ｌｏｔｉの塩基配列
配列番号８：ｓｈｏｒｔｃｉｓの塩基配列
配列番号９：プライマーｌａｃ－ｌａｔ－ＮｃｏＦ２
配列番号１０：プライマーｌａｔ－ＸｈｏＲ
配列番号１１：プライマーｌｙｓＰ－ＳＤ－ＸｈｏＦ
配列番号１２：プライマーｌｙｓＰ－ＫｐｎＲ
配列番号１３：ｐｒｏＣ－ＳＤ－ＫｐｎＦ
配列番号１４：プライマーｐｒｏＣ－ＢａｍＲ
配列番号１５：プライマーｒｏｃＧ－ＳＤ－ＢａｍＦ
配列番号１６：プライマーｒｏｃＧ－ＸｂａＲ
配列番号１７：プライマーｓｅｇｎｉ－ｓｈｏｒｔ－ＮｄｅＦ
配列番号１８：プライマーｓｅｇｎｉ－ｃｉｓ－ＢｇｌＲ
配列番号１９：プライマーｓｅｇｎｉ－ｃｉｓ－ＮｄｅＦ２
配列番号２０：プライマーｌａｔ－（Ｓｐｅ）ＡｆｌＲ２
配列番号２１：プライマーｌｏｔｉ－ＳＤ－ＰａｃＦ
配列番号２２：プライマーｌｏｔｉ－ＡｖｒＲ
配列番号２３：変異型ｃｉｓの塩基配列
配列番号２４：ｌａｔがコードするタンパク質のアミノ酸配列
配列番号２５：ｃｉｓがコードするタンパク質のアミノ酸配列
配列番号２６：変異型ｃｉｓがコードするタンパク質のアミノ酸配列
配列番号２７：プライマーｐｒｏＣｒｏｃＧＸ－ＳｐｅＲ
配列番号２８：プライマーｐｒｏＣＸ－ＳｐｅＲ
配列番号２９：プライマーｒｏｃＧＸ－ＳｐｅＦ
配列番号３０：プライマーｐｒｏＣＸ－ＳｐｅＦ

Claims (14)

  1. 　下記の（A）～（F）のいずれか一のポリヌクレオチドを発現可能な状態で含む微生物により、Ｌ－ピペコリン酸を基質としてシス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸を生成する工程を含む、シス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸もしくはその薬理学上許容される塩またはそれらの溶媒和物の製造方法：
    （A）配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
    （B）配列番号２に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬ－ピペコリン酸を基質としてシス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （C）配列番号２に記載の塩基配列と少なくとも85％以上の同一性を有し、かつＬ－ピペコリン酸を基質としてシス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （D）配列番号２５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （E）配列番号２５に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつＬ－ピペコリン酸を基質としてシス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （F）配列番号２５に記載のアミノ酸配列と少なくとも85％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＬ－ピペコリン酸を基質としてシス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
  2. 　微生物が、Ｌ－リジンを基質としてＬ－アミノアジピン酸－デルタ－セミアルデヒドを生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、およびデルタ１－ピペリデイン－６－カルボン酸を基質としてＬ－ピペコリン酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、発現可能な状態でさらに含み：
    　Ｌ－リジンを基質として、Ｌ－アミノアジピン酸－デルタ－セミアルデヒドを生成し、続いてＬ－アミノアジピン酸－デルタ－セミアルデヒドがデルタ１－ピペリデイン－６－カルボン酸へ変換される工程；および
    　デルタ１－ピペリデイン－６－カルボン酸を基質としてＬ－ピペコリン酸を生成する工程
    をさらに含む、請求項１に記載の製造方法。
  3. 　Ｌ－リジンを基質としてＬ－アミノアジピン酸－デルタ－セミアルデヒドを生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、フラボバクテリウム　ルテセンス（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｕｔｅｓｃｅｎｓ）由来である、請求項２に記載の製造方法。
  4. 　微生物が大腸菌であり、デルタ１－ピペリデイン－６－カルボン酸を基質としてＬ－ピペコリン酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを元来有する、請求項２または３に記載の製造方法。
  5. 　下記の（A）～（F）のいずれか一のポリヌクレオチド：
    （A）配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
    （B）配列番号２に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬ－ピペコリン酸を基質としてシス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （C）配列番号２に記載の塩基配列と少なくとも85％以上の同一性を有し、かつＬ－ピペコリン酸を基質としてシス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （D）配列番号２５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （E）配列番号２５に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつＬ－ピペコリン酸を基質としてシス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （F）配列番号２５に記載のアミノ酸配列と少なくとも85％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＬ－ピペコリン酸を基質としてシス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
  6. 　請求項５に記載のポリヌクレオチドを含む、形質転換用ベクター。
  7. 　Ｌ－リジンを基質としてＬ－アミノアジピン酸－デルタ－セミアルデヒドを生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項６に記載の微生物の形質転換用ベクター。
  8. 　α－ケトグルタル酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質および／またはデルタ１－ピペリデイン－６－カルボン酸を基質としてＬ－ピペコリン酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項６または７に記載の微生物の形質転換用ベクター。
  9. 　請求項６～８のいずれか１項に記載のベクターにより形質転換された、遺伝子組換え微生物。
  10. 　請求項５に記載のポリヌクレオチド、およびＬ－リジンを基質としてＬ－アミノアジピン酸－デルタ－セミアルデヒドを生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドにより形質転換され、Ｌ－リジンを出発物質としてシス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸を生成する能力を有する、遺伝子組換え大腸菌。
  11. 　下記の（d）～（f）のいずれか一のタンパク質：
    （d）配列番号２５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
    （e）配列番号２５に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつＬ－ピペコリン酸を基質としてシス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質；
    （f）配列番号２５に記載のアミノ酸配列と少なくとも85％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＬ－ピペコリン酸を基質としてシス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質。
  12. 　Ｌ－ピペコリン酸に、請求項１１に記載のタンパク質を作用させ、シス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸を生成する工程を含む、シス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸もしくはその薬理学上許容される塩またはそれらの溶媒和物の製造方法。
  13. 　Ｌ－リジンに、Ｌ－リジンを基質としてＬ－アミノアジピン酸－デルタ－セミアルデヒドを生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質を作用させ、Ｌ－アミノアジピン酸－デルタ－セミアルデヒドを生成し、続いてＬ－アミノアジピン酸－デルタ－セミアルデヒドがデルタ１－ピペリデイン－６－カルボン酸へ変換される工程；および
    　得られたデルタ１－ピペリデイン－６－カルボン酸に、デルタ１－ピペリデイン－６－カルボン酸を基質としてＬ－ピペコリン酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質を作用させ、Ｌ－ピペコリン酸を生成する工程
    をさらに含む、請求項１２に記載の製造方法。
  14. 　シス－５－ヒドロキシ－Ｌ－ピペコリン酸を培養液１Ｌ当り５０ｍｇ以上生産する能力を有する、請求項９または１０に記載の遺伝子組換え微生物または遺伝子組換え大腸菌。
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