JPWO2015098774A1 - 光学活性環状イミノ酸の製造方法 - Google Patents
光学活性環状イミノ酸の製造方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2015098774A1 JPWO2015098774A1 JP2015554848A JP2015554848A JPWO2015098774A1 JP WO2015098774 A1 JPWO2015098774 A1 JP WO2015098774A1 JP 2015554848 A JP2015554848 A JP 2015554848A JP 2015554848 A JP2015554848 A JP 2015554848A JP WO2015098774 A1 JPWO2015098774 A1 JP WO2015098774A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- hydroxy
- pipecolic acid
- lysine
- seq
- group
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 34
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 title description 3
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims abstract description 142
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims abstract description 71
- 235000019766 L-Lysine Nutrition 0.000 claims abstract description 70
- 108010074633 Mixed Function Oxygenases Proteins 0.000 claims abstract description 55
- 102000008109 Mixed Function Oxygenases Human genes 0.000 claims abstract description 55
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 55
- 101710095468 Cyclase Proteins 0.000 claims abstract description 45
- 239000007858 starting material Substances 0.000 claims abstract description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 76
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 76
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 64
- HXEACLLIILLPRG-RXMQYKEDSA-N l-pipecolic acid Natural products OC(=O)[C@H]1CCCCN1 HXEACLLIILLPRG-RXMQYKEDSA-N 0.000 claims description 63
- HXEACLLIILLPRG-UHFFFAOYSA-N pipecolic acid Chemical compound OC(=O)C1CCCCN1 HXEACLLIILLPRG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 53
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 51
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 48
- RKEYKDXXZCICFZ-UHFFFAOYSA-N trans-5-OH-L-pipecolic acid Natural products OC1CCC(C(O)=O)NC1 RKEYKDXXZCICFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 44
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 33
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 32
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 32
- RKEYKDXXZCICFZ-WHFBIAKZSA-N (2s,5s)-5-hydroxypiperidine-2-carboxylic acid Chemical compound O[C@H]1CC[C@@H](C(O)=O)NC1 RKEYKDXXZCICFZ-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 31
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 29
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 29
- YSMODUONRAFBET-UHNVWZDZSA-N erythro-5-hydroxy-L-lysine Chemical compound NC[C@H](O)CC[C@H](N)C(O)=O YSMODUONRAFBET-UHNVWZDZSA-N 0.000 claims description 26
- QJHBJHUKURJDLG-UHFFFAOYSA-N hydroxy-L-lysine Natural products NCCCCC(NO)C(O)=O QJHBJHUKURJDLG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 17
- HXEACLLIILLPRG-YFKPBYRVSA-N L-pipecolic acid Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]1CCCC[NH2+]1 HXEACLLIILLPRG-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 11
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 9
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 8
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 6
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 5
- 230000000640 hydroxylating effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000012450 pharmaceutical intermediate Substances 0.000 abstract description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 60
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 54
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 43
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 40
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 32
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 30
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 19
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 16
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 15
- 239000002585 base Substances 0.000 description 15
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 14
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 14
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 14
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 14
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 13
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 12
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 11
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 10
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 9
- 238000005805 hydroxylation reaction Methods 0.000 description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 9
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 9
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 8
- 230000033444 hydroxylation Effects 0.000 description 8
- 238000005580 one pot reaction Methods 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 8
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 8
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 7
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 7
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 7
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 7
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N subtilin Chemical compound CC1SCC(NC2=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(C)CC)C(=O)NC(=C)C(=O)NC(CCCCN)C(O)=O)CSC(C)C2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C1NC(=O)C(=C/C)/NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)CNC(=O)C(NC(=O)C(NC(=O)C2NC(=O)CNC(=O)C3CCCN3C(=O)C(NC(=O)C3NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CC=4C5=CC=CC=C5NC=4)CSC3)C(C)SC2)C(C)C)C(C)SC1)CC1=CC=CC=C1 WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N 0.000 description 6
- BRARRAHGNDUELT-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxypicolinic acid Chemical compound OC(=O)C1=NC=CC=C1O BRARRAHGNDUELT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- FDMYUQHVJYNDLI-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxypiperidine-2-carboxylic acid Chemical compound OC1CCCNC1C(O)=O FDMYUQHVJYNDLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 5
- -1 cyclic Schiff base Chemical class 0.000 description 5
- HSSWOFWCOAQLHZ-UHFFFAOYSA-L disodium;2-oxopentanedioate;dihydrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CCC(=O)C([O-])=O HSSWOFWCOAQLHZ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 5
- 125000002924 primary amino group Chemical class [H]N([H])* 0.000 description 5
- 235000010378 sodium ascorbate Nutrition 0.000 description 5
- PPASLZSBLFJQEF-RKJRWTFHSA-M sodium ascorbate Substances [Na+].OC[C@@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1[O-] PPASLZSBLFJQEF-RKJRWTFHSA-M 0.000 description 5
- 229960005055 sodium ascorbate Drugs 0.000 description 5
- PPASLZSBLFJQEF-RXSVEWSESA-M sodium-L-ascorbate Chemical compound [Na+].OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1[O-] PPASLZSBLFJQEF-RXSVEWSESA-M 0.000 description 5
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 4
- YSMODUONRAFBET-UHFFFAOYSA-N delta-DL-hydroxylysine Natural products NCC(O)CCC(N)C(O)=O YSMODUONRAFBET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 4
- KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-N 2-oxoglutaric acid Chemical compound OC(=O)CCC(=O)C(O)=O KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002262 Schiff base Substances 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 3
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 3
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 3
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 3
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- RKEYKDXXZCICFZ-UHNVWZDZSA-N (2s,5r)-5-hydroxypiperidin-1-ium-2-carboxylate Chemical compound O[C@@H]1CC[C@@H](C(O)=O)NC1 RKEYKDXXZCICFZ-UHNVWZDZSA-N 0.000 description 2
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- LCWXJXMHJVIJFK-UHFFFAOYSA-N Hydroxylysine Natural products NCC(O)CC(N)CC(O)=O LCWXJXMHJVIJFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 150000004753 Schiff bases Chemical class 0.000 description 2
- 241001135312 Sinorhizobium Species 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N sodium nitrate Chemical compound [Na+].[O-][N+]([O-])=O VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- DYHSDKLCOJIUFX-UHFFFAOYSA-N tert-butoxycarbonyl anhydride Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)OC(=O)OC(C)(C)C DYHSDKLCOJIUFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- RKEYKDXXZCICFZ-RFZPGFLSSA-N (2r,5r)-5-hydroxypiperidine-2-carboxylic acid Chemical compound O[C@@H]1CC[C@H](C(O)=O)NC1 RKEYKDXXZCICFZ-RFZPGFLSSA-N 0.000 description 1
- RKEYKDXXZCICFZ-CRCLSJGQSA-N (2r,5s)-5-hydroxypiperidine-2-carboxylic acid Chemical compound O[C@H]1CC[C@H](C(O)=O)NC1 RKEYKDXXZCICFZ-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 1
- RKEYKDXXZCICFZ-AKGZTFGVSA-N (2s)-5-hydroxypiperidine-2-carboxylic acid Chemical compound OC1CC[C@@H](C(O)=O)NC1 RKEYKDXXZCICFZ-AKGZTFGVSA-N 0.000 description 1
- VHSFUGXCSGOKJX-JTQLQIEISA-N (2s)-5-oxo-1-phenylmethoxycarbonylpyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCC(=O)N1C(=O)OCC1=CC=CC=C1 VHSFUGXCSGOKJX-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589291 Acinetobacter Species 0.000 description 1
- 241000187643 Amycolatopsis Species 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 description 1
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 1
- 241000186146 Brevibacterium Species 0.000 description 1
- 241001453380 Burkholderia Species 0.000 description 1
- KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-N Carbamic acid Chemical group NC(O)=O KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 241001495437 Dactylosporangium Species 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 101710085237 L-lysine 4-hydroxylase Proteins 0.000 description 1
- 229930182821 L-proline Natural products 0.000 description 1
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 1
- 102000005431 Molecular Chaperones Human genes 0.000 description 1
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 description 1
- 241000592260 Moritella Species 0.000 description 1
- SEWARTPIJFHCRP-UHFFFAOYSA-N N-hydroxypipecolic acid Chemical compound ON1CCCCC1C(O)=O SEWARTPIJFHCRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000221960 Neurospora Species 0.000 description 1
- 241000187654 Nocardia Species 0.000 description 1
- 241000588843 Ochrobactrum Species 0.000 description 1
- 241000588814 Ochrobactrum anthropi Species 0.000 description 1
- 241000114708 Ochrobactrum anthropi ATCC 49188 Species 0.000 description 1
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 235000019484 Rapeseed oil Nutrition 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000316848 Rhodococcus <scale insect> Species 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 241000235346 Schizosaccharomyces Species 0.000 description 1
- 241000823038 Segniliparus Species 0.000 description 1
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 241000187391 Streptomyces hygroscopicus Species 0.000 description 1
- 241000203590 Streptosporangium Species 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 description 1
- 101150056072 TUFB gene Proteins 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 description 1
- 241000223230 Trichosporon Species 0.000 description 1
- 241000235013 Yarrowia Species 0.000 description 1
- 241000235017 Zygosaccharomyces Species 0.000 description 1
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 125000005907 alkyl ester group Chemical group 0.000 description 1
- HWXBTNAVRSUOJR-UHFFFAOYSA-N alpha-hydroxyglutaric acid Natural products OC(=O)C(O)CCC(O)=O HWXBTNAVRSUOJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940009533 alpha-ketoglutaric acid Drugs 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 1
- 125000005129 aryl carbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000005002 aryl methyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 125000003236 benzoyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 125000001584 benzyloxycarbonyl group Chemical group C(=O)(OCC1=CC=CC=C1)* 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000010216 calcium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 125000001589 carboacyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 description 1
- 239000013601 cosmid vector Substances 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 125000002485 formyl group Chemical group [H]C(*)=O 0.000 description 1
- 235000003869 genetically modified organism Nutrition 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N hydrogen chloride Substances Cl.Cl IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000041 hydrogen chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 229910052741 iridium Inorganic materials 0.000 description 1
- GKOZUEZYRPOHIO-UHFFFAOYSA-N iridium atom Chemical compound [Ir] GKOZUEZYRPOHIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 1
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 125000004184 methoxymethyl group Chemical group [H]C([H])([H])OC([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000004492 methyl ester group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000003541 multi-stage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- UYWQUFXKFGHYNT-UHFFFAOYSA-N phenylmethyl ester of formic acid Chemical group O=COCC1=CC=CC=C1 UYWQUFXKFGHYNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000012805 post-processing Methods 0.000 description 1
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 description 1
- 229960002429 proline Drugs 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000001799 protein solubilization Methods 0.000 description 1
- 230000007925 protein solubilization Effects 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000036647 reaction Effects 0.000 description 1
- 101150079601 recA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000010344 sodium nitrate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004317 sodium nitrate Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 125000004044 trifluoroacetyl group Chemical group FC(C(=O)*)(F)F 0.000 description 1
- 125000002221 trityl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1C([*])(C1=C(C(=C(C(=C1[H])[H])[H])[H])[H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 101150099542 tuf gene Proteins 0.000 description 1
- 101150071165 tuf1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150010742 tuf2 gene Proteins 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom
- C12P17/12—Nitrogen as only ring hetero atom containing a six-membered hetero ring
Abstract
Description
1) L−ピペコリン酸にL−プロリン水酸化酵素を作用させて、シス−3−ヒドロキシ−L−ピペコリン酸、シス−5−ヒドロキシ−L−ピペコリン酸およびトランス−5−ヒドロキシ−L−ピペコリン酸を取得する方法(非特許文献1);
2) 3−ヒドロキシピコリン酸を高圧条件下で水素化することでシス−3−ヒドロキシ−DL−ピペコリン酸を取得する方法(非特許文献2,非特許文献3);
3) (S)−1−(ベンジルオキシカルボニル)−5−オキソピロリジン−2−カルボン酸を原料とし、イリジウム触媒を用いてシス−5−ヒドロキシ−L−ピペコリン酸のt−ブチルエステルを取得する方法(特許文献1)。
L−リジンを出発物質として、環化酵素を作用させる工程および水酸化酵素を作用させる工程を含むことを特徴とする製造方法。
L−リジンに環化酵素および水酸化酵素の両方を作用させることにより、中間体を単離することなくヒドロキシ−L−ピペコリン酸を生成させる工程を含むことを特徴とする製造方法。
(A) 配列番号1、139、140または141のアミノ酸配列を有する環化酵素;
(B) 配列番号1、139、140または141のアミノ酸配列の1または複数個のアミノ酸が置換、欠失および/または付加されたアミノ酸配列を有し、且つ、L−リジンまたはヒドロキシ−L−リジンに作用してL−ピペコリン酸またはヒドロキシ−L−ピペコリン酸を生成する活性を有する環化酵素;
(C) 配列番号1、139、140または141に記載のアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つ、L−リジンまたはヒドロキシ−L−リジンに作用してL−ピペコリン酸またはヒドロキシ−L−ピペコリン酸を生成する活性を有する環化酵素。
(D) 配列番号3、5または7に記載のアミノ酸配列を有する水酸化酵素;
(E) 配列番号3、5または7に記載のアミノ酸配列の1または複数個のアミノ酸が置換、欠失および/または付加されたアミノ酸配列を有し、且つ、L−リジンまたはL−ピペコリン酸に作用してヒドロキシ−L−リジンまたはヒドロキシ−L−ピペコリン酸を生成する活性を有する水酸化酵素;
(F) 配列番号3、5または7に記載のアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有し、且つ、L−リジンまたはL−ピペコリン酸に作用してヒドロキシ−L−リジンまたはヒドロキシ−L−ピペコリン酸を生成する活性を有する水酸化酵素。
(A1) 配列番号2に記載のDNA;
(B1) 配列番号1、139、140または141に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするDNA;
(C1) 配列番号2に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、L−リジンまたはヒドロキシ−L−リジンを環化する活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
(D1) 配列番号4、6または8に記載のDNA;
(E1) 配列番号3、5または7に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするDNA;
(F1) 配列番号4、6または8に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、L−リジンまたはL−ピペコリン酸を水酸化する活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
本発明方法で製造すべき目的化合物は、ヒドロキシ−L−ピペコリン酸である。本発明の目的化合物であるヒドロキシ−L−ピペコリン酸は水酸基の位置や、結合の方向、即ちカルボキシ基に対するシス位またはトランス位を問わないが、好ましくは下記式(1):
で表される5−ヒドロキシ−L−ピペコリン酸、および/または下記式(2):
で表される3−ヒドロキシ−L−ピペコリン酸である。具体的には、シス−5−ヒドロキシ−L−ピペコリン酸、トランス−5−ヒドロキシ−L−ピペコリン酸、シス−3−ヒドロキシ−L−ピペコリン酸、トランス−3−ヒドロキシ−L−ピペコリン酸からなる群より選択される少なくとも1種が挙げられる。
本発明に係るヒドロキシ−L−ピペコリン酸の製造方法は、L−リジンを出発物質として、環化酵素を作用させる工程および水酸化酵素を作用させる工程を含むことを特徴とする。本発明においては、上記両工程は何れを先に行ってもよい。
本発明で用いる「環化酵素」には、L−リジンを環化してL−ピペコリン酸を生成する活性を有する酵素か、或いはヒドロキシ−L−リジンを環化してヒドロキシ−L−ピペコリン酸を生成する活性を有する酵素のうちいずれか1つが含まれる。より具体的には、本発明で用いる環化酵素としては、下記(A)、(B)および(C)からなる群より選択されるものを挙げることができる:
(A) 配列番号1、139、140または141のアミノ酸配列を有する環化酵素;
(B) 配列番号1、139、140または141のアミノ酸配列の1または複数個のアミノ酸が置換、欠失および/または付加されたアミノ酸配列を有し、且つ、L−リジンまたはヒドロキシ−L−リジンに作用してL−ピペコリン酸またはヒドロキシ−L−ピペコリン酸を生成する活性を有する環化酵素;
(C) 配列番号1、139、140または141に記載のアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つ、L−リジンまたはヒドロキシ−L−リジンに作用してL−ピペコリン酸またはヒドロキシ−L−ピペコリン酸を生成する活性を有する環化酵素。
第2群:中性極性アミノ酸 − Ser,Thr,Gln,Asn,Trp,Tyr
第3群:酸性アミノ酸 − Glu,Asp
第4群:塩基性アミノ酸 − His,Lys,Arg
本発明において「L−リジンまたはヒドロキシ−L−リジンに作用してL−ピペコリン酸またはヒドロキシ−L−ピペコリン酸を生成する活性を有する」とは、L−リジンまたはヒドロキシ−L−リジンを基質とした場合に、その少なくとも一部からそれぞれL−ピペコリン酸またはヒドロキシ−L−ピペコリン酸を生成できる活性を有することをいう。L−ピペコリン酸またはヒドロキシ−L−ピペコリン酸が生成しているか否かは、例えば、反応液をHPLCで分析してL−ピペコリン酸またはヒドロキシ−L−ピペコリン酸のピークが確認できるか否かにより決定することができる。
本発明で用いる「水酸化酵素」には、L−ピペコリン酸に作用してヒドロキシ−L−ピペコリン酸を生成する活性を有する酵素か、或いはL−リジンに作用してヒドロキシ−L−リジンを生成する活性を有する酵素のうちいずれか1つが含まれる。より具体的には、本発明で用いる水酸化酵素としては、下記(D)、(E)および(F)からなる群より選択されるものを挙げることができる:
(D) 配列番号3、5または7に記載のアミノ酸配列を有する水酸化酵素;
(E) 配列番号3、5または7に記載のアミノ酸配列の1または複数個のアミノ酸が置換、欠失および/または付加されたアミノ酸配列を有し、且つ、L−リジンまたはL−ピペコリン酸に作用してヒドロキシ−L−リジンまたはヒドロキシ−L−ピペコリン酸を生成する活性を有する水酸化酵素;
(F) 配列番号3、5または7に記載のアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有し、且つ、L−リジンまたはL−ピペコリン酸に作用してヒドロキシ−L−リジンまたはヒドロキシ−L−ピペコリン酸を生成する活性を有する水酸化酵素。
本発明に係る環化酵素と水酸化酵素は、常法により得ることができる。例えば、これら酵素を生産する天然微生物や、これら酵素を生産するように遺伝子操作された微生物を培養する。酵素が菌体外へ分泌される場合には、液体培地などの培養物自体を使ったり、培養物から酵素を精製または粗精製すればよい。酵素が菌体内に存在する場合には、菌体自体またはその乾燥物を使ったり、菌体破砕液を用いたり、菌体破砕液から酵素を精製または粗精製すればよい。より具体的には、上記酵素を得るための方法は、例えば、WO98/35025を参照することができる。
(B1) 配列番号1、139、140または141に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするDNA
(C1) 配列表の配列番号2に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、L−リジンまたはヒドロキシ−L−リジンを環化する活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(D1) 配列番号4、6または8に記載のDNA;
(E1) 配列番号3、5または7に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするDNA;
(F1) 配列番号4、6または8に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、L−リジンまたはL−ピペコリン酸を水酸化する活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
本発明では、所望のヒドロキシ−L−ピペコリン酸が主生成物として得られるよう環化酵素と水酸化酵素を選択すればよいが、特に使用する水酸化酵素によっては、導入される水酸基の位置や絶対構造に関する異性体が生じ得る。このような場合には、目的化合物である異性体を単離精製してもよい。また、所望のヒドロキシ−L−ピペコリン酸が十分な選択性をもって生成する場合であっても、反応液から単離精製してもよい。
Molecular Cloning 2nd Edition(Joseph Sambrook,Cold Spring Harbor Laboratory Press)(1989);
Current Protocols in Molecular Biology(Frederick M.Ausubel,Greene Publishing Associates and Wiley−Interscience)(1989)。
オクロバクトラム・アンスロピー(Ochrobactrum anthropi)ATCC49188株より、L−リジンに対する環化活性を有するポリペプチド(表1に記載のCOA)をコードするDNAをPCRにより取得した。詳細な実験条件は、以下のとおりである。
500mL容坂口フラスコに、1L当たりバクトトリプトン16g、酵母エキス10g、塩化ナトリウム5g、アデカノールLG−109(日本油脂製)0.1gを含む組成を有する液体培地(pH7)50mLを調製し、120℃で20分間蒸気殺菌した。この培地に、予め同培地にて前培養しておいたオクロバクトラム・アンスロピーATCC49188株の培養液を5mL接種し、30℃で18時間振盪しながら培養した。この培養液から、Murray等の方法(Nucl.Acids Res.,8,4321(1980))に記載の方法に従って染色体DNAを抽出した。
プライマー1:5’−AGCATCGTACATATGACCCAACCGAACCTGAA−3’(配列表の配列番号9)と、プライマー2:5’−GCAGAATTCTTATCAGGCCGCTGGCTTGGTCT−3’(配列表の配列番号10)を用い、上記で得られたオクロバクトラム・アンスロピーATCC49188株の染色体DNAを鋳型としてPCRを行った。
実施例1で得られたCOA遺伝子を制限酵素であるNdeIとEcoRIで消化し、プラスミドpUCN18のlacプロモーターの下流のNdeI認識部位とEcoRI認識部位の間に挿入し、組換えベクターpNOAを構築した。なお、上記プラスミドpUCN18は、PCR法によりpUC18(タカラバイオ社製)の185番目のTをAに改変してNdeIサイトを破壊し、さらに471〜472番目のGCをTGに改変することにより新たにNdeIサイトを導入して作製したものである。
実施例2で構築した組換えベクターpNOAを用いて、E.coli HB101コンピテントセル(タカラバイオ社製)を形質転換し、組換え生物E.coli HB101(pNOA)を得た。また、プラスミドpUCN18を用いてE.coli HB101コンピテントセル(タカラバイオ社製)を形質転換し、組換え生物E.coli HB101(pUCN18)を得た。
実施例3で得た2種類の組換え生物であるE.coli HB101(pUCN18)とE.coli HB101(pCOA)を、200μg/mLのアンピシリンを含む2×YT培地(トリプトン1.6%,イーストエキス1.0%,塩化ナトリウム0.5%,pH7.0)5mLに接種し、37℃で24時間振盪培養した。各培養液について、遠心分離により菌体を集め、5mLの100mMリン酸緩衝液(pH7.0)に懸濁した。当該懸濁菌体を、UH−50型超音波ホモゲナイザー(SMT社製)を用いて破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。これら無細胞抽出液のL−リジン環化活性を測定した。
カラム: SUMICHIRAL OA5000(250mm,内径4.6μm,住化分析センター社製)
カラム温度: 30℃
検出波長: 254mm
移動相: 2mM CuSO4
流速: 1.0mL/min
保持時間: L−リジン − 約5.9分
L−ピペコリン酸 − 約13.8分
その結果、E.coli HB101(pCOA)の無細胞抽出液を用いた場合のみ、L−リジンから変換率100%でL−ピペコリン酸が生成していることが確認された。
シノリゾビウム・メリロチ(Sinorhizobium meliloti)NBRC14782株より、L−ピペコリン酸に対する水酸化活性を有するポリペプチド(表2に記載のHSM)をコードするDNA(配列番号4)の合成を外部(Eurogentec社)に委託し、当該DNAがpUC57に結合されたプラスミドの形態で得た。このプラスミドを制限酵素EcoRIとSacIで消化し、プラスミドpUC18のlacプロモーターの下流のEcoRI認識部位とSacI認識部位の間に挿入し、組換えベクターpNSMを構築した。
実施例5で構築した組換えベクターpNSMを用いて、E.coli HB101コンピテントセル(タカラバイオ社製)を形質転換し、組換え生物E.coli HB101(pNSM)を得た。また、pUCN18を用いてE.coli HB101コンピテントセル(タカラバイオ社製)を形質転換し、組換え生物E.coli HB101(pUCN18)を得た。
実施例6で得た2種類の組換え生物であるE.coli HB101(pUCN18)とE.coli HB101(pNSM)を、200μg/mLのアンピシリンを含む2×YT培地(トリプトン1.6%,イーストエキス1.0%,塩化ナトリウム0.5%,pH7.0)5mLに接種し、37℃で24時間振盪培養した。各培養液について、遠心分離により菌体を集め、5mLの100mM HEPES(pH7.0)に懸濁した。当該懸濁菌体を、UH−50型超音波ホモゲナイザー(SMT社製)を用いて破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。これら無細胞抽出液のL−ピペコリン酸水酸化活性を測定した。
カラム: SUMICHIRAL OA5000(250mmおよび150mmを直列に接続して使用,内径4.6μm,住化分析センター社製)
カラム温度: 30℃
検出波長:254mm
移動相: 2mM CuSO4
流速: 0.9mL/min
保持時間: L−ピペコリン酸 − 26.3分
シス−5−HPA − 22.3分
シス−3−HPA − 24.8分
シス−5−HPAの標品はAurum Pharmatech社から、シス−3−HPAの標品はNetChem社から購入した。
実施例3および実施例6で得た3種類の組換え生物であるE.coli HB101(pUCN18)、E.coli HB101(pNOA)、およびE.coli HB101(pNSM)を、200μg/mLのアンピシリンを含む2×YT培地(トリプトン1.6%,イーストエキス1.0%,塩化ナトリウム0.5%,pH7.0)5mLに接種し、37℃で24時間振盪培養した。各培養液について、遠心分離により菌体を集め、5mLの100mM HEPES(pH7.0)に懸濁した。当該懸濁菌体を、UH−50型超音波ホモゲナイザー(SMT社製)を用いて破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。これら無細胞抽出液を表3に示したように単独または等量ずつ混合し、L−リジンからのシス−5−HPAおよびシス−3−HPAへの変換活性を測定した。
A. 反応液中のL−リジンとL−ピペコリン酸の分析
カラム: SUMICHIRAL OA5000(250mm,内径4.6μm,住化分析センター社製)
カラム温度: 30℃
検出波長: 254mm
移動相: 2mM CuSO4
流速: 1.0mL/min
保持時間: L−リジン − 約5.9分
L−ピペコリン酸 − 約13.8分
B. 反応液中のL−ピペコリン酸、シス−5−HPA、シス−3−HPAの分析
カラム: SUMICHIRAL OA5000(250mm,内径4.6μm,住化分析センター社製)を2本直列に接続
カラム温度: 30℃
検出波長:254mm
移動相: 2mM CuSO4
流速: 0.5mL/min
保持時間: L−ピペコリン酸 − 約60.3分
シス−5−HPA − 約51.9分
シス−3−HPA − 約57.9分
分析結果を表3に示す。
メソリゾビウム・ロチ(Mesorhizobium loti)MAFF303099株よりL−ピペコリン酸に対する水酸化活性を有するポリペプチド(表2に記載のHML)をコードするDNAの合成を外部(Eurogentec社)に委託し、当該DNAがpUC57に結合されたプラスミドの形態で得た。このプラスミドを制限酵素KpnIとSacIで消化し、プラスミドpUC18のlacプロモーターの下流のKpnI認識部位とSacI認識部位の間に挿入し、組換えベクターpNMLを構築し、配列番号6に示すDNAを得た。
実施例9で構築した組換えベクターpNMLを用いて、E.coli HB101コンピテントセル(タカラバイオ社製)を形質転換し、組換え生物E.coli HB101(pNML)を得た。また、pUCN18を用いてE.coli HB101コンピテントセル(タカラバイオ社製)を形質転換し、組換え生物E.coli HB101(pUCN18)を得た。
実施例10で得た2種類の組換え生物であるE.coli HB101(pUCN18)とE.coli HB101(pNML)を、200μg/mLのアンピシリンを含む2×YT培地(トリプトン1.6%,イーストエキス1.0%,塩化ナトリウム0.5%,pH7.0)5mLに接種し、37℃で24時間振盪培養した。各培養液について、遠心分離により菌体を集め、5mLの100mM HEPES(pH7.0)に懸濁した。当該懸濁菌体を、UH−50型超音波ホモゲナイザー(SMT社製)を用いて破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。これら無細胞抽出液のL−ピペコリン酸水酸化活性を測定した。
カラム: SUMICHIRAL OA5000(250mmおよび150mmを直列に接続して使用,内径4.6μm,住化分析センター社製)
カラム温度: 30℃
検出波長: 254mm
移動相: 2mM CuSO4
流速: 0.9mL/min
保持時間: L−ピペコリン酸 − 26.3分
シス−5−HPA − 22.3分
シス−3−HPA − 24.8分
分析の結果、E.coli HB101(pNML)の無細胞抽出液を用いた場合にはL−ピペコリン酸から0.4mMのシス−5−HPAと2.1mMのシス−3−HPAが生成していることが確認された。
実施例3および実施例10で得た3種類の組換え生物であるE.coli HB101(pUCN18)、E.coli HB101(pNOA)、およびE.coli HB101(pNML)を、200μg/mLのアンピシリンを含む2×YT培地(トリプトン1.6%,イーストエキス1.0%,塩化ナトリウム0.5%,pH7.0)5mLに接種し、37℃で24時間振盪培養した。各培養液について、遠心分離により菌体を集め、5mLの100mM HEPES(pH7.0)に懸濁した。当該懸濁菌体を、UH−50型超音波ホモゲナイザー(SMT社製)を用いて破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。これら無細胞抽出液を表4に示したように単独または等量ずつ混合し、L−リジンからのシス−5−HPAおよびシス−3−HPAへの変換活性を測定した。
A. 反応液中のL−リジンとL−ピペコリン酸の分析
カラム: SUMICHIRAL OA5000(250mm,内径4.6μm,住化分析センター社製)
カラム温度: 30℃
検出波長: 254mm
移動相: 2mM CuSO4
流速: 1.0mL/min
保持時間: L−リジン − 約5.9分
L−ピペコリン酸 − 約13.8分
B. 反応液中のL−ピペコリン酸、シス−5−HPA、シス−3−HPAの分析
カラム: SUMICHIRAL OA5000(250mm,内径4.6μm,住化分析センター社製)を2本直列に接続
カラム温度: 30℃
検出波長: 254mm
移動相: 2mM CuSO4
流速: 0.5mL/min
保持時間: L−ピペコリン酸 − 約60.3分
シス−5−HPA − 約51.9分
シス−3−HPA − 約57.9分
分析結果を表4に示す。
実施例3および実施例6で得た2種類の組換え生物であるE.coli HB101(pNOA)とE.coli HB101(pNSM)を、200μg/mLのアンピシリンを含む2×YT培地(トリプトン1.6%,イーストエキス1.0%,塩化ナトリウム0.5%,pH7.0)100mLに接種し、37℃で24時間振盪培養した。各培養液について、遠心分離により菌体を集め、100mLの100mM HEPES(pH7.0)に懸濁した。当該懸濁菌体を、UH−50型超音波ホモゲナイザー(SMT社製)を用いて破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。これらの無細胞抽出液によるL−リジンからのシス−5−HPAおよびシス−3−HPAへの変換活性を測定した。
A. 反応液中のL−リジンとL−ピペコリン酸の分析
カラム: SUMICHIRAL OA5000(250mm,内径4.6μm,住化分析センター社製)
カラム温度: 30℃
検出波長: 254mm
移動相:2mM CuSO4
流速: 1.0mL/min
保持時間: L−リジン − 約5.9分
L−ピペコリン酸 − 約13.8分
B. 反応液中のL−ピペコリン酸、シス−5−HPA、シス−3−HPAの分析
カラム: SUMICHIRAL OA5000(250mm,内径4.6μm,住化分析センター社製)を2本直列に接続
カラム温度: 30℃
検出波長: 254mm
移動相:2mM CuSO4
流速: 0.5mL/min
保持時間: L−ピペコリン酸 − 約60.3分
シス−5−HPA − 約51.9分
シス−3−HPA − 約57.9分
分析の結果、L−リジンのピークが消失しており、5.2mM L−ピペコリン酸、18.7mM シス−5−HPAと9.4mM シス−3−HPAの生成が見られた。これらの結果から、ポリペプチドCOAとHSMの作用により、L−リジンからヒドロキシ−L−ピペコリン酸が生成することが確認された。
実施例3で得た組み換え生物であるE.coli HB101(pCOA)を、200μg/mLのアンピシリンを含む2×YT培地(トリプトン1.6%,イーストエキス1.0%,塩化ナトリウム0.5%,pH7.0)5mLに接種し、37℃で24時間振盪培養した。当該培養液について、遠心分離により菌体を集め、5mLの100mM HEPES(pH7.0)に懸濁した。当該懸濁菌体を、UH−50型超音波ホモゲナイザー(SMT社製)を用いて破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。当該無細胞抽出液のヒドロキシリジン環化活性を測定した。
カラム: SUMICHIRAL OA5000(250mm,内径4.6μm,住化分析センター社製)
カラム温度: 30℃
検出波長: 254mm
移動相: 2mM CuSO4
流速: 1.0mL/min
保持時間: 5−ヒドロキシ−DL−リジン − 約3.6分
シス−5−HPA − 約12.4分
トランス−5−HPA − 約11.4分
分析の結果、E.coli 5−ヒドロキシ−DL−リジンから変換率100%でシス−5−ヒドロキシピペコリン酸およびトランス−5−ヒドロキシピペコリン酸が生成していることが確認された。
上記実施例5に準じて、表5に示す水酸化活性を有するポリペプチドをコードするDNAを含む組換えベクターを構築した。なお、表5に示すポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号3のアミノ酸配列に対して1以上、14以下の変異を有するものであり、95%以上の相同性を示す。次いで、上記実施例6に準じて、得られた組換えベクターによりE.coli HB101コンピテントセル(タカラバイオ社製)を形質転換し、組換え生物を得た。さらに、上記実施例7に準じて、得られた組換え生物の無細胞抽出液を得て、そのL−ピペコリン酸水酸化活性を測定した。結果を表5に示す。なお、導入DNAの発現効率が悪い場合には、シャペロンも導入して共発現させた。また、表中の水酸化活性の評価基準は、生成した5−ヒドロキシピペコリン酸(5−HPA)または3−ヒドロキシピペコリン酸(3−HPA)の濃度から求めた生成比に基づいて、以下の通り定めた。
++: 5−HPA/3−HPA=3以上、5未満
+++: 5−HPA/3−HPA=5以上
上記実施例8に準じて、実施例3で得た組換え生物であるE.coli HB101(pUCN18)と実施例6で得た組換え生物であるE.coli HB101(pNSM)に加え、実施例3のE.coli HB101(pNOA)の代わりに、表6に示す環化酵素をコードする遺伝子を導入した組換え生物を用い、無細胞抽出液を得た。得られた無細胞抽出液を等量ずつ混合し、L−リジンからのシス−5−HPAおよびシス−3−HPAへの変換活性を測定した。結果を表6に示す。なお、表6中の「+」は、反応溶液中に1mM以上のHPAの生成が確認されたことを示す。
Claims (13)
- ヒドロキシ−L−ピペコリン酸の製造方法であって、
L−リジンを出発物質として、環化酵素を作用させる工程および水酸化酵素を作用させる工程を含むことを特徴とする製造方法。 - ヒドロキシ−L−ピペコリン酸の製造方法であって、
L−リジンに環化酵素および水酸化酵素の両方を作用させることにより、中間体を単離することなくヒドロキシ−L−ピペコリン酸を生成させる工程を含むことを特徴とする製造方法。 - 上記ヒドロキシ−L−ピペコリン酸が、シス−3−ヒドロキシ−L−ピペコリン酸、トランス−3−ヒドロキシ−L−ピペコリン酸、シス−5−ヒドロキシ−L−ピペコリン酸、トランス−5−ヒドロキシ−L−ピペコリン酸からなる群より選ばれる少なくとも一つである請求項1または2に記載の製造方法。
- 前記環化酵素が、下記(A)、(B)および(C)からなる群より選択されるものである請求項1〜3のいずれかに記載の製造方法:
(A) 配列番号1、139、140または141のアミノ酸配列を有する環化酵素;
(B) 配列番号1、139、140または141のアミノ酸配列の1または複数個のアミノ酸が置換、欠失および/または付加されたアミノ酸配列を有し、且つ、L−リジンまたはヒドロキシ−L−リジンに作用してL−ピペコリン酸またはヒドロキシ−L−ピペコリン酸を生成する活性を有する環化酵素;
(C) 配列番号1、139、140または141に記載のアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つ、L−リジンまたはヒドロキシ−L−リジンに作用してL−ピペコリン酸またはヒドロキシ−L−ピペコリン酸を生成する活性を有する環化酵素。 - 前記水酸化酵素が、下記(D)、(E)および(F)からなる群より選択されるものである請求項1〜4のいずれかに記載の製造方法:
(D) 配列番号3、5または7に記載のアミノ酸配列を有する水酸化酵素;
(E) 配列番号3、5または7に記載のアミノ酸配列の1または複数個のアミノ酸が置換、欠失および/または付加されたアミノ酸配列を有し、且つ、L−リジンまたはL−ピペコリン酸に作用してヒドロキシ−L−リジンまたはヒドロキシ−L−ピペコリン酸を生成する活性を有する水酸化酵素;
(F) 配列番号3、5または7に記載のアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有し、且つ、L−リジンまたはL−ピペコリン酸に作用してヒドロキシ−L−リジンまたはヒドロキシ−L−ピペコリン酸を生成する活性を有する水酸化酵素。 - 前記環化酵素が配列番号1のアミノ酸配列を有し、且つ、前記水酸化酵素が配列番号3のアミノ酸配列を有する請求項1〜5のいずれかに記載の製造方法。
- 前記環化酵素が、下記(A1)、(B1)および(C1)からなる群から選択されるDNAにコードされるポリペプチドである請求項1〜6のいずれかに記載の製造方法:
(A1) 配列番号2に記載のDNA;
(B1) 配列番号1、139、140または141に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするDNA;
(C1) 配列番号2に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、L−リジンまたはヒドロキシ−L−リジンを環化する活性を有するポリペプチドをコードするDNA。 - 前記水酸化酵素が、下記(D1)、(E1)および(F1)からなる群から選択されるDNAにコードされるポリペプチドである請求項1〜7のいずれかに記載の製造方法:
(D1) 配列番号4、6または8に記載のDNA;
(E1) 配列番号3、5または7に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするDNA;
(F1) 配列番号4、6または8に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、L−リジンまたはL−ピペコリン酸を水酸化する活性を有するポリペプチドをコードするDNA。 - 請求項7に記載の前記(A1)、(B1)および(C1)からなる群から選択されるDNAと、請求項8に記載の前記(D1)、(E1)および(F1)からなる群から選択されるDNAとを宿主細胞に導入し、得られた形質転換体および/またはその培養物を酵素源として用いる請求項1〜3のいずれかに記載の製造方法。
- 請求項7に記載の前記(A1)、(B1)および(C1)からなる群から選択されるDNAと、請求項8に記載の前記(D1)、(E1)および(F1)からなる群から選択されるDNAを、別々に含有する複数の組換えベクターを用いて宿主細胞を形質転換し、得られた形質転換体および/またはその培養物を酵素源として用いる請求項1〜3のいずれかに記載の製造方法。
- 請求項7に記載の前記(A1)、(B1)および(C1)からなる群から選択されるDNAと、請求項8に記載の前記(D1)、(E1)および(F1)からなる群から選択されるDNAとを両方含有する1つの組換えベクターを用いて宿主細胞を形質転換し、得られた形質転換体および/またはその培養物を酵素源として用いる請求項1〜3のいずれかに記載の製造方法。
- 前記宿主細胞が微生物である請求項9〜11のいずれかに記載の製造方法。
- さらに、生成したヒドロキシ−L−ピペコリン酸のアミノ基および/またはカルボキシ基を保護した後、目的のヒドロキシ−L−ピペコリン酸を精製する工程を含む請求項1〜12に記載の製造方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2013268331 | 2013-12-26 | ||
JP2013268331 | 2013-12-26 | ||
PCT/JP2014/083786 WO2015098774A1 (ja) | 2013-12-26 | 2014-12-19 | 光学活性環状イミノ酸の製造方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2015098774A1 true JPWO2015098774A1 (ja) | 2017-03-23 |
JP6539212B2 JP6539212B2 (ja) | 2019-07-03 |
Family
ID=53478631
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2015554848A Active JP6539212B2 (ja) | 2013-12-26 | 2014-12-19 | 光学活性環状イミノ酸の製造方法 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP6539212B2 (ja) |
WO (1) | WO2015098774A1 (ja) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP6476110B2 (ja) * | 2013-02-19 | 2019-02-27 | 株式会社エーピーアイ コーポレーション | L−リジン水酸化酵素およびそれを利用したヒドロキシ−l−リジンの製造法およびヒドロキシ−l−ピペコリン酸の製造法 |
CN116396991A (zh) * | 2015-10-02 | 2023-07-07 | 株式会社Api | 羟基-l-哌可酸的制造方法 |
CN109715817B (zh) | 2016-06-09 | 2022-12-09 | 科德克希思公司 | 用于化合物的羟基化的生物催化剂和方法 |
CA3113606A1 (en) | 2018-09-21 | 2020-03-26 | Api Corporation | Method for producing amino acid derivatives |
CN113512571B (zh) * | 2021-07-13 | 2023-02-24 | 浙江华睿生物技术有限公司 | 鸟氨酸环化脱氨酶催化合成l-哌啶酸的方法 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1996001901A1 (fr) * | 1994-07-08 | 1996-01-25 | Rhone-Poulenc Rorer S.A. | Streptogramines et procede de preparation de streptogramines par mutasynthese |
JP2004537296A (ja) * | 2001-06-08 | 2004-12-16 | ロディア・シミ | 環状l−アミノ酸の立体選択的製造 |
WO2013169725A2 (en) * | 2012-05-08 | 2013-11-14 | Codexis, Inc. | Biocatalysts and methods for hydroxylation of chemical compounds |
WO2013187438A1 (ja) * | 2012-06-13 | 2013-12-19 | 日本マイクロバイオファーマ株式会社 | シス-5-ヒドロキシ-l-ピペコリン酸の生物学的な製造方法 |
-
2014
- 2014-12-19 JP JP2015554848A patent/JP6539212B2/ja active Active
- 2014-12-19 WO PCT/JP2014/083786 patent/WO2015098774A1/ja active Application Filing
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1996001901A1 (fr) * | 1994-07-08 | 1996-01-25 | Rhone-Poulenc Rorer S.A. | Streptogramines et procede de preparation de streptogramines par mutasynthese |
JP2004537296A (ja) * | 2001-06-08 | 2004-12-16 | ロディア・シミ | 環状l−アミノ酸の立体選択的製造 |
WO2013169725A2 (en) * | 2012-05-08 | 2013-11-14 | Codexis, Inc. | Biocatalysts and methods for hydroxylation of chemical compounds |
WO2013187438A1 (ja) * | 2012-06-13 | 2013-12-19 | 日本マイクロバイオファーマ株式会社 | シス-5-ヒドロキシ-l-ピペコリン酸の生物学的な製造方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP6539212B2 (ja) | 2019-07-03 |
WO2015098774A1 (ja) | 2015-07-02 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR101632642B1 (ko) | 신규한 프로모터 및 그의 용도 | |
KR101783170B1 (ko) | 신규 프로모터 및 이의 용도 | |
EP3858987B1 (en) | A novel isopropylmalate synthase variant and a method of producing l-leucine using the same | |
JP6539212B2 (ja) | 光学活性環状イミノ酸の製造方法 | |
JP6476110B2 (ja) | L−リジン水酸化酵素およびそれを利用したヒドロキシ−l−リジンの製造法およびヒドロキシ−l−ピペコリン酸の製造法 | |
WO2010024445A1 (ja) | 光学活性なアミン誘導体を製造するための方法 | |
KR101530819B1 (ko) | L-라이신 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용한 l-라이신 생산방법 | |
WO2010024444A1 (ja) | 光学活性なアミン誘導体の製造方法 | |
JP6959379B2 (ja) | ピペコリン酸4位水酸化酵素およびそれを利用した4−ヒドロキシアミノ酸の製造法 | |
KR101521045B1 (ko) | 유기산을 생산하기 위한 재조합 미생물유기체 | |
JP5761641B2 (ja) | (r)−3−キヌクリジノールの製造方法 | |
US9783796B2 (en) | Amidase, gene for the same, vector, transformant, and method for production of optically active carboxylic acid amide and optically active carboxylic acid by using any one of those items | |
EP3964572A1 (en) | Mutant of corynebacterium glutamicum with enhanced l-lysine productivity and method for preparing l-lysine using the same | |
KR20040010202A (ko) | α-케토 산 환원효소, 이의 제조방법, 및 이를 이용한광학적으로 활성인 α-히드록시 산의 제조방법 | |
US7195900B2 (en) | Cloning and expression of D-amino acid oxidase from arthrobacter protophormiae | |
JPWO2005123921A1 (ja) | 新規グリセロール脱水素酵素、その遺伝子、及びその利用法 | |
KR101622460B1 (ko) | L-오르니틴 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 미생물 및 이를 이용한 l-오르니틴의 제조방법 | |
JP2011177029A (ja) | 光学活性なアミン誘導体の製造方法 | |
KR20220030866A (ko) | L-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 및 이를 이용한 l-라이신의 생산 방법 | |
KR20230053351A (ko) | L-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 및 이를 이용한 l-라이신의 생산 방법 | |
KR20230084993A (ko) | L-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 및 이를 이용한 l-라이신의 생산 방법 | |
KR101999975B1 (ko) | (s)-락트산 생산 호열성 세균의 유전자 변형 | |
JP2024511393A (ja) | L-シトルリン生産能が向上したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株およびこれを用いたl-シトルリンの生産方法 | |
WO2008047819A1 (fr) | Nouvelle ester hydrolase, gène codant pour ladite enzyme et utilisation | |
JPWO2005044973A1 (ja) | 新規アセトアセチルCoA還元酵素および光学活性アルコールの製造方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20171026 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20180828 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20181029 |
|
RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20181029 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20181211 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20190514 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20190607 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6539212 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |