JPWO2005044973A1 - 新規アセトアセチルＣｏＡ還元酵素および光学活性アルコールの製造方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、（Ｒ）−３−ヒドロキシペンタンニトリル、光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル及び光学活性１−フェニルエタノール誘導体の光学活性アルコールの簡便な製法の提供、並びに、上記光学活性アルコール、特に（Ｒ）−３−ヒドロキシペンタンニトリルの製造に有用な新規酵素の提供を目的とする。本発明は、３−ケトペンタンニトリルを不斉還元して、光学純度９９％ｅ．ｅ．以上の（Ｒ）−３−ヒドロキシペンタンニトリルを生成しうる新規アセトアセチルＣｏＡ還元酵素；３−ケトペンタンニトリル、アセト酢酸エステル及び１−フェニルエタノン誘導体それぞれに、当該新規酵素もしくは既知のアセトアセチルＣｏＡ還元酵素を作用させ、対応する光学活性アルコールを製造する方法である。

Description

本発明は、有用な新規アセトアセチルＣｏＡ還元酵素に関する。また、本発明は、当該酵素又は既知のアセトアセチルＣｏＡ還元酵素を用いた、光学活性アルコール類、とりわけ（Ｒ）−３−ヒドロキシペンタンニトリル、光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル及び光学活性１−フェニルエタノール誘導体の製造方法に関する。（Ｒ）−３−ヒドロキシペンタンニトリル、光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル及び光学活性１−フェニルエタノール誘導体等の光学活性アルコールは、各種医薬品・農薬等の合成原料あるいは中間体として有用な化合物である。

光学活性３−ヒドロキシペンタンニトリル、特に（Ｒ）−３−ヒドロキシペンタンニトリルは、種々の医薬品や農薬等の製造原料や合成中間体として非常に有用である。そのため、高光学純度の（Ｒ）−３−ヒドロキシペンタンニトリルを高収率かつ工業的に実施可能な製造方法の開発が強く求められてきた。

従来、（Ｒ）−３−ヒドロキシペンタンニトリルの製造方法としては、ラセミ体３−アセトキシペンタンニトリルをシュードモナス・セパシア・リパーゼ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａ ｌｉｐａｓｅ）を用いて不斉加水分解して、（Ｒ）−３−ヒドロキシペンタンニトリルと（Ｓ）−３−アセトキシペンタンニトリルに光学分割する方法が知られている（非特許文献１を参照）。この方法の場合、光学純度９０％ｅ．ｅ．の（Ｒ）−３−ヒドロキシペンタンニトリルが得られるが、酵素の使用量は基質の２分の１重量と多く、かつ収率も２９％と低く、経済的な製造方法とはいえない。

更に、上記非特許文献１には、前記の不斉加水分解反応において、チオクラウンエーテル（１，４，８，１１−テトラチアシクロテトラデカン）を添加することにより、光学純度９９％ｅ．ｅ．以上の（Ｒ）−３−ヒドロキシペンタンニトリルが収率４９％で得られると記載されている。しかしながら、反応に必要なチオクラウンエーテルの量は基質の１０分の１重量と非常に多いため、コスト面及び安全面から工業的な実施には適していない。また、この非特許文献１の技術では、反応生成物である（Ｒ）−３−ヒドロキシペンタンニトリルと（Ｓ）−３−アセトキシペンタンニトリルの分離をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて行っているが、この分離法も繁雑であって実用的ではなく、工業的に採用するには有利な方法ではない。

上記のような状況下、本発明者らは３−ケトペンタンニトリルを酵素で不斉還元して光学活性３−ヒドロキシペンタンニトリルを製造する方法を発明し、先に出願した（特許文献１を参照）。この方法では、非常に簡便な方法で高光学純度（９４．８％ｅ．ｅ．）の（Ｒ）−３−ヒドロキシペンタンニトリルを得ることができるが、更に高い光学純度の目的物を得るためには、改良の余地が残されていた。

また、光学活性３−ヒドロキシブタン酸エステル、特に（Ｒ）−３−ヒドロキシブタン酸エステルも、種々の医薬品や農薬等の製造原料や合成中間体として非常に有用である。（Ｒ）−３−ヒドロキシブタン酸エステルの製造方法の一つに、アセト酢酸エステルを生体触媒で不斉還元して製造する方法がある。例えば、パン酵母を用いた方法（非特許文献２を参照）、ゲオトリカム・キャンディダム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃａｎｄｉｄｕｍ）やアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）等の微生物を用いた方法（非特許文献３を参照）、ゲオトリカム・キャンディダム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃａｎｄｉｄｕｍ）由来のグリセロールデヒドロゲナーゼを用いた方法（非特許文献４を参照）等が知られている。しかしながら、これらの方法はいずれも、その基質仕込み濃度及び基質から生成物への転換率が実用上十分ではなく、より効率の良い合成法が待ち望まれていた。

また、光学活性１−フェニルエタノール誘導体も、種々の医薬品や農薬等の製造原料や合成中間体として非常に有用である。
光学活性１−フェニルエタノール誘導体を酵素的不斉還元によって製造する方法としては、２−ハロ−１−（置換フェニル）エタノンに、アシビア（Ａｓｈｂｙａ）属やオガタエア（Ｏｇａｔａｅａ）属等に属する微生物又はその処理物を作用させ、光学活性２−ハロ−１−（置換フェニル）エタノールを得る方法（特許文献２、３、４を参照）が開示されている。また、コリネバクテリウム・スピーシーズ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）ＳＴ−１０由来のフェニルアセトアルデヒド還元酵素の遺伝子を導入した組換え大腸菌を用いる同様の方法（非特許文献５を参照）が開示されている。しかしながら、これらの方法はいずれも、その基質の仕込み濃度及び基質から生成物への転換率が低く、より効率のよい製造方法が望まれていた。

一方、ＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨを補酵素としてアセトアセチルＣｏＡを還元する酵素（アセトアセチルＣｏＡ還元酵素）は、種々の微生物から単離され、その性質が報告されているが（非特許文献６、７を参照）、３−ケトペンタンニトリル、アセト酢酸エステルあるいは１−フェニルエタノン誘導体にアセトアセチルＣｏＡ還元酵素を作用させ、対応する光学活性アルコールを製造することは報告されていない。

ＷＯ０３／０３１６３６ ＷＯ９２／０１８０４ 特開平１１−２１５９９５ ＷＯ０３／００９１１ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６２，９１６５（１９９７） Ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３１，６５６（２００２） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ，７，４６１（１９８４） Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，２９，２４５３（１９８８） Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６９，２３９４（２００２） ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，５２，２５９−２６４（１９８８） Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，６，４２５−４３１（１９９６）

本発明の目的は、光学活性アルコール、とりわけ（Ｒ）−３−ヒドロキシペンタンニトリルの製造に極めて有用な、新規アセトアセチルＣｏＡ還元酵素を提供することである。
更に、本発明の目的は、光学活性アルコール、とりわけ（Ｒ）−３−ヒドロキシペンタンニトリル、（Ｒ）−３−ヒドロキシブタン酸エステル及び光学活性１−フェニルエタノール誘導体の効率的な製造方法を提供することである。

本発明者らは鋭意検討の結果、意外にもアセトアセチルＣｏＡ還元酵素が、３−ケトペンタンニトリル、アセト酢酸エステル、１−フェニルエタノン誘導体をそれぞれ不斉還元し、（Ｒ）−３−ヒドロキシペンタンニトリル、（Ｒ）−３−ヒドロキシブタン酸エステル、光学活性１−フェニルエタノール誘導体を生成しうることを見出した。
また、３−ケトペンタンニトリルを不斉還元し、光学純度９９％ｅ．ｅ．以上の（Ｒ）−３−ヒドロキシペンタンニトリルを生成する活性を有する今までに報告例のない新規アセトアセチルＣｏＡ還元酵素を見出し、単離することに成功した。更に、該酵素をコードするＤＮＡを単離し、組換えベクター並びに該酵素を大量発現する形質転換体を創製することにも成功し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、ＮＡＤＰＨもしくはＮＡＤＨを補酵素として、３−ケトペンタンニトリルに作用して、光学純度９９％ｅ．ｅ．以上の（Ｒ）−３−ヒドロキシペンタンニトリルを生成する新規アセトアセチルＣｏＡ還元酵素に関する。また、本アセトアセチルＣｏＡ還元酵素をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換えベクター、及び、上記アセトアセチルＣｏＡ還元酵素を高生産する形質転換体に関する。

また、本発明は、該形質転換体を用いた、光学純度９９％ｅ．ｅ．以上の（Ｒ）−３−ヒドロキシペンタンニトリルの実用的な製造方法に関する。
また、本発明は、アセトアセチルＣｏＡ還元酵素を用いた、（Ｒ）−３−ヒドロキシペンタンニトリル、（Ｒ）−３−ヒドロキシブタン酸エステル、光学活性１−フェニルエタノール誘導体といった有用な光学活性アルコールの実用的な製造方法に関する。

以下、詳細に本発明を説明する。
本発明におけるアセトアセチルＣｏＡ還元酵素とは、アセトアセチルＣｏＡを還元する能力（アセトアセチルＣｏＡ還元活性）を有する全ての酵素を包含する。
アセトアセチルＣｏＡ還元活性は、例えば、以下の方法により測定できる。
１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に、アセトアセチルＣｏＡ ０．２５ｍＭ、ＮＡＤＰＨもしくはＮＡＤＨ ０．２５ｍＭ、及び酵素を含む反応液を、３０℃で反応させ、ＮＡＤＰＨもしくはＮＡＤＨの消費に伴う波長３４０ｎｍの吸光度の減少により測定できる。

また、本発明で使用する３−ケトペンタンニトリルは、例えば、ＷＯ９４／２１６１７に記載の方法で合成可能である。また、３−ケトペンタンニトリルとして、ＷＯ０３／０３１６３６に記載の方法で得られる下記式（９）：

（式中、Ｍはアルカリ金属を示す）で表される３−ケトペンタンニトリルアルカリ金属塩、例えば３−ケトペンタンニトリルナトリウム塩等も使用し得る。

まず、本発明の一つである新規アセトアセチルＣｏＡ還元酵素について詳述する。
本発明のアセトアセチルＣｏＡ還元酵素としては、以下の（１）及び（２）の理化学的性質を有するアセトアセチルＣｏＡ還元酵素が挙げられる。
（１）作用：ＮＡＤＰＨもしくはＮＡＤＨを補酵素として、下記式（１）：

で表される３−ケトペンタンニトリルに作用して、下記式（２）：

で表される光学純度９９％ｅ．ｅ．以上の（Ｒ）−３−ヒドロキシペンタンニトリルを生成する、
（２）分子量：ゲル濾過分析において約８５５００、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動分析において約２６０００。

上記光学純度、ゲル濾過分析による分子量及びＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動分析による分子量の測定は、後述の実施例に記載のようにして行うことができる。

上記アセトアセチルＣｏＡ還元酵素は、更に、以下の（３）〜（５）の理化学的性質を有することが好ましい。
（３）至適温度：２７〜３３℃、
（４）至適ｐＨ：５．５〜６．５、
（５）阻害剤：ｐ−クロロメルクリ安息香酸、硫酸銅、硝酸銀、塩化水銀で阻害される。

また、本発明のアセトアセチルＣｏＡ還元酵素としては、例えば、（ａ）配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は、（ｂ）配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が付加、欠失又は置換したアミノ酸配列からなり、３−ケトペンタンニトリルに作用して、光学純度９９％ｅ．ｅ．以上の（Ｒ）−３−ヒドロキシペンタンニトリルを生成する活性を有するポリペプチドを挙げることができる。

配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が付加、欠失又は置換したアミノ酸配列からなるポリペプチドは、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９８９年）等に記載の公知の方法に準じて調製することが可能であり、３−ケトペンタンニトリルに作用して、光学純度９９％ｅ．ｅ．以上の（Ｒ）−３−ヒドロキシペンタンニトリルを生成する活性を有する限り、本発明のアセトアセチルＣｏＡ還元酵素に包含される。また、アミノ酸の変異は自然界において生じることもあり、人工的にアミノ酸を変異したポリペプチドのみならず、自然界においてアミノ酸が変異したポリペプチドについても、３−ケトペンタンニトリルに作用して、光学純度９９％ｅ．ｅ．以上の（Ｒ）−３−ヒドロキシペンタンニトリルを生成する活性を有する限り、本発明のアセトアセチルＣｏＡ還元酵素に包含される。

ここで、「３−ケトペンタンニトリルに作用して、光学純度９９％ｅ．ｅ．以上の（Ｒ）−３−ヒドロキシペンタンニトリルを生成する活性」は、例えば、以下のような反応並びに測定条件によって確認することができる。
あらかじめ３−ケトペンタンニトリル５ｍｇ、ＮＡＤＰＨ５０ｍｇ及び１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）５０μｌを入れた試験管に、酵素溶液（あるいは無細胞抽出液）４５０μｌを加えて、３０℃で１晩振とうする。反応液を酢酸エチル１ｍｌで抽出し、生成した３−ヒドロキシペンタンニトリルの光学純度をキャピラリーガスクロマトグラフィーにより測定する。

［キャピラリーガスクロマトグラフィー分析条件］
カラム：Ｃｈｉｒａｄｅｘ Ｇ−ＴＡ（２０ｍ×０．２５ｍｍ）（ＡＳＴＥＣ社製）、検出：ＦＩＤ
カラム温度：１２０℃
注入温度：２００℃
検出温度：２００℃
キャリアーガス：ヘリウム（１００ｋＰａ）
スプリット比：１００／１
溶出時間：（Ｒ）−３−ヒドロキシペンタンニトリル ４．３７分、（Ｓ）−３−ヒドロキシペンタンニトリル ５．１７分。

本発明のアセトアセチルＣｏＡ還元酵素は、３−ケトペンタンニトリルを（Ｒ）−３−ヒドロキシペンタンニトリルに変換する能力を有する微生物、動物又は植物から見いだすことができる。本発明のアセトアセチルＣｏＡ還元酵素の探索方法としては、例えば、ＷＯ０３／０３１６３６に記載の方法等が挙げられる。

例えば、酵母からは以下のように探索すればよい。グルコース４０ｇ、酵母エキス３ｇ、リン酸水素二アンモニウム６．５ｇ、リン酸二水素カリウム１ｇ、硫酸マグネシウム７水和物０．８ｇ、硫酸亜鉛７水和物６０ｍｇ、硫酸鉄７水和物９０ｍｇ、硫酸銅５水和物５ｍｇ、硫酸マンガン４水和物１０ｍｇ、塩化ナトリウム１００ｍｇ（いずれも１Ｌ当たり）の組成からなる液体培地（ｐＨ７）５ｍｌを、試験管に入れて殺菌後、無菌的に酵母を接種し、３０℃で２〜３日間振とう培養する。その後、菌体を遠心分離により集め、グルコース２〜１０重量％を含んだリン酸緩衝液１〜５ｍｌに懸濁し、あらかじめ３−ケトペンタンニトリルを２．５〜２５ｍｇいれた試験管に加えて、２〜３日間３０℃で振とうする。この反応の際、酵母を破砕してから実施しても良い。また、ＮＡＤ^＋及び／又はＮＡＤＰ^＋と、グルコース脱水素酵素及びグルコース、もしくは、ギ酸脱水素酵素及びギ酸を添加してもよい。変換反応の後、適当な有機溶媒で抽出を行い、生成する３−ヒドロキシペンタンニトリルをキャピラリーガスクロマトグラフィー等で分析すればよい。

本発明のアセトアセチルＣｏＡ還元酵素の由来としては、例えば、アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属細菌を挙げることができ、好ましくはアクロモバクター・キシロソキシダンス・サブスピー・デニトリフィカンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ ｓｕｂｓｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、より好ましくはアクロモバクター・キシロソキシダンス・サブスピー・デニトリフィカンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ ｓｕｂｓｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｉｃａｎｓ）ＩＦＯ１５１２５株である。

以下に、３−ケトペンタンニトリルを不斉還元して（Ｒ）−３−ヒドロキシペンタンニトリルを生成する能力を有する微生物から、本発明のアセトアセチルＣｏＡ還元酵素を取得する方法を記載するが、本発明はこれに限定されない。

微生物を適切な培地で培養し、培養液から菌体を遠心分離した後、菌体を適当な緩衝液中に懸濁する。該菌体をグラスビーズ等の物理的手法、酵素等の生化学的手法等を用いて破砕又は溶解し、更に遠心分離等により該溶液中の固形物を除去することにより、本発明の酵素を含む溶液を得ることができる。あるいは、培養液から菌体を分離することなく、直接上記と同様の方法で酵素溶液を得ることもできる。

また、当業者が通常用いる酵素の精製手法、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、透析、クロマトグラフィーを単独で又は組み合わせて実施しても良い。クロマトグラフィーとしては、例えば、疎水クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等が挙げられる。これにより、不要なタンパク質を含まない、より純度の高い酵素溶液を得ることができる。

本発明のアセトアセチルＣｏＡ還元酵素をコードするＤＮＡは、上述のアセトアセチルＣｏＡ還元酵素をコードするＤＮＡであればいずれも含まれる。例えば、配列表の配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡを挙げることができる。

以下に、本発明の酵素をコードするＤＮＡを取得する方法の例を記載するが、本発明はこれに限定されない。
まず、精製した酵素を適当なエンドペプチダーゼにより消化し、逆相ＨＰＬＣにより切断された断片を精製後、プロテインシークエンサーにより部分アミノ酸配列の一部を決定する。そして、得られた部分アミノ酸配列をもとにして、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）プライマーを合成する。次に、該ＤＮＡの起源となる微生物より、通常のＤＮＡ単離法、例えばＨｅｒｅｆｏｒｄ法（Ｃｅｌｌ，１８，１２６１（１９７９））により、該微生物の染色体ＤＮＡを調製する。この染色体ＤＮＡを鋳型として、先述のＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲを行い、該ポリペプチドをコードするＤＮＡの一部を増幅（コア配列）し、塩基配列決定を行う。塩基配列決定はジデオキシ・チェイン・ターミネーション法等により決定し得る。例えば、ＡＢＩ ３７３Ａ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）等を用いて行われ得る。

次に、コア配列の周辺領域の塩基配列を明らかにするために、該微生物の染色体ＤＮＡを、コア配列中にその認識配列が存在しない制限酵素により消化し、生成したＤＮＡ断片をＴ４リガーゼにより自己環化させることにより、逆ＰＣＲ（Ｉｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ）（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６，８１８６（１９８８））用の鋳型ＤＮＡを調製する。次に、コア配列をもとに、コア配列の外側に向かうＤＮＡ合成の開始点となるプライマーを合成し、逆ＰＣＲによりコア配列の周辺領域を増幅する。こうして得られたＤＮＡの塩基配列を明らかにすることにより、目的のアセトアセチルＣｏＡ還元酵素の全コード領域のＤＮＡ配列を明らかにし得る。

本発明のアセトアセチルＣｏＡ還元酵素をコードするＤＮＡを宿主微生物内に導入し、それをその導入された宿主微生物内で発現させるために用いられるベクターとしては、適切な宿主微生物内で該ポリペプチド遺伝子を発現できるものであればいずれもが用いられ得る。このようなベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクター等が挙げられる。また、他の宿主株との間での遺伝子交換が可能なシャトルベクターも使用され得る。
このようなベクターは、作動可能に連結されたプロモーター（ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔｕｆＢプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｐＬプロモーター）等の制御因子を含み、本発明のＤＮＡと作動可能に連結された発現単位を含む発現ベクターとして好適に用いられ得る。
例えば、ｐＵＣＮＴ（ＷＯ９４／０３６１３）等が好適に用いられ得る。

本明細書で用いる用語「制御因子」は、機能的プロモーター、及び、任意の関連する転写要素（例えばエンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位等）を有する塩基配列をいう。
本明細書で用いる用語「作動可能に連結」は、遺伝子が発現するように、ＤＮＡが、その発現を調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の調節エレメントとが宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。制御因子のタイプ及び種類が、宿主に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。

本発明のＤＮＡを有するベクターを導入する宿主細胞としては、細菌、酵母、糸状菌、植物細胞、動物細胞等が挙げられ、導入の容易さや発現効率の観点からは細菌が好ましく、大腸菌が特に好ましい。
本発明のＤＮＡは、定法により宿主細胞に導入し得る。宿主細胞として大腸菌を用いた場合、例えば塩化カルシウム法により本発明のＤＮＡを導入することができる。

本発明のアセトアセチルＣｏＡ還元酵素もしくは該還元酵素の生産能を有する形質転換体を用いて、３−ケトペンタンニトリルを不斉還元し、光学純度９９％ｅ．ｅ．以上の（Ｒ）−３−ヒドロキシペンタンニトリルを合成する場合、補酵素としてＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＨが必要となる。反応系にＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＨを必要な量だけ添加しても実施しうるが、酸化された該補酵素（ＮＡＤＰ^＋又はＮＡＤ^＋）を還元型（ＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＨ）に変換する能力（以後、補酵素再生能力と呼ぶ）を有する酵素をその基質と共に、つまり補酵素再生系を本発明の酵素と組み合わせて反応を行うことにより、高価な補酵素の使用量を大幅に削減することができる。

補酵素再生能力を有する酵素としては、ヒドロゲナーゼ、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素及びグルコース脱水素酵素等を用いることができる。好適には、グルコース脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素が用いられ、特にグルコース脱水素酵素が好ましい。
このような反応は、補酵素再生系を不斉還元反応系内に添加することによっても行われ得るが、本発明の酵素をコードするＤＮＡ及びグルコース脱水素酵素をコードするＤＮＡの両者により形質転換された形質転換体を触媒とした場合は、補酵素再生能を有する酵素を別に調製して反応系内に添加しなくても、効率的に反応を行うことができる。

このような形質転換体は、本発明のアセトアセチルＣｏＡ還元酵素をコードするＤＮＡ及びグルコース脱水素酵素をコードするＤＮＡを、同一のベクターに組み込み、これを宿主細胞に導入することにより得られる他、これら２種類のＤＮＡを不和合性グループの異なる２種のベクターにそれぞれ組み込み、それらを同一の宿主細胞に導入することによっても得られ得る。

なお、上述のように、本発明の組換えベクターは、上記アセトアセチルＣｏＡ還元酵素をコードするＤＮＡ、又は、配列表の配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡを含有するものである。好ましくは、後述の図２においてｐＮＴＡＸで示される組換えベクター等が挙げられる。
また、当該組換えベクターとしては、上記グルコース脱水素酵素をコードするＤＮＡを更に含有するものも挙げられる。なお、上記グルコース脱水素酵素が、バシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）由来のものであることが好ましい。

本発明の形質転換体は、上記組換えベクターを用いて宿主細胞を形質転換して得られたものである。
また、上記アセトアセチルＣｏＡ還元酵素をコードするＤＮＡ、又は、配列表の配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡを含有する第１の組換えベクター、及び、グルコース脱水素酵素をコードするＤＮＡを含有する第２の組換えベクターを用いて、宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体が好ましい。
より好ましい形質転換体としては、第１の組換えベクターが前記ｐＮＴＡＸであり、前記グルコース脱水素酵素がバシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）由来のものである形質転換体；第１の組換えベクターが前記ｐＮＴＡＸであり、第２の組換えベクターが後述の図２においてｐＳＴＶＧで示される組換えベクターである形質転換体等が挙げられる。
なお、宿主細胞としては、大腸菌が好ましい。

また、本発明の形質転換体として、具体的には、
組換え大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＡＸ）（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０１２６、原寄託日平成１５年１０月２３日の国内寄託をブダペスト条約に基づく国際寄託に移管）、
組換え大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＡＸ，ｐＳＴＶＧ）（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９５６７、寄託日平成１５年１０月２３日）
等が挙げられ、それぞれ、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６にある独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。

次に、３−ケトペンタンニトリルをアセトアセチルＣｏＡ還元酵素で不斉還元して、（Ｒ）−３−ヒドロキシペンタンニトリルを製造する方法について詳述する。

本方法に用いるアセトアセチルＣｏＡ還元酵素は、その起源を問わず使用することができる。微生物由来のものだけでなく、動物又は植物由来のものでも良い。

例えば、アシネトバクター・エスピー（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）ＲＡ３８４９由来のアセトアセチルＣｏＡ還元酵素（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７７，４５０１−４５０７（１９９５））、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）由来のアセトアセチルＣｏＡ還元酵素（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，５２，２５９−２６４（１９８８））、アルカリゲネス・ラタス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｌａｔｕｓ）由来のアセトアセチルＣｏＡ還元酵素（Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，６，４２５−４３１（１９９６））、アゾスピリラム・ブラシレンス（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ）由来のアセトアセチルＣｏＡ還元酵素（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３６，１１９１−１１９６（１９９０）、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２３１，３７５−３８４（１９９２））、アゾトバクター・バイジェリンキー（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）由来のアセトアセチルＣｏＡ還元酵素（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１３４，２２５−２３８（１９７３））、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）由来のアセトアセチルＣｏＡ還元酵素（Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４１（Ｓｕｐｐｌ．１），７７−７９（１９９５））、クロマチウム・ビノーサム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍ）Ｄ株由来のアセトアセチルＣｏＡ還元酵素（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０９，２３５−１５０（１９９２））、エクトチオロドスピラ・シャポシュニコビー（Ｅｃｔｏｔｈｉｏｒｈｏｄｏｓｐｉｒａ ｓｈａｐｏｓｈｎｉｋｏｖｉｉ）由来のアセトアセチルＣｏＡ還元酵素（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４０，２９２−３００（１９９３））、ルピナス・ルテウス（Ｌｕｐｉｎｕｓ ｌｕｔｅｕｓ）由来のアセトアセチルＣｏＡ還元酵素（Ｐｌａｎｔ Ｓｏｉｌ，５６，３７９−３９０（１９８０））、メチロバクテリウム・エクストークエンス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ）由来のアセトアセチルＣｏＡ還元酵素（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１５６，２７５−２７９（１９９７））、メチロバクテリウム・ロデシアナム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｏｄｅｓｉａｎｕｍ）ＭＢ１２６由来のアセトアセチルＣｏＡ還元酵素（Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１６１，２７７−２８０（１９９４））、パラコッカス・デニトリフィカンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）由来のアセトアセチルＣｏＡ還元酵素（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，１０３，２５７−２６４（１９９２）、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１３３，８５−９０（１９９５））、リゾビウム・ルピニ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｕｐｉｎｉ）由来のアセトアセチルＣｏＡ還元酵素（Ｆｉｚｉｏｌ．Ｒａｓｔ．（Ｍｏｓｃｏｗ），２７，５４４−５５０（１９８０））、リゾビウム・メリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）４１由来のアセトアセチルＣｏＡ還元酵素（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４１，２５５３−２５５９（１９９５））、ロドコッカス・ルーバー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｕｂｅｒ）ＮＣＩＭＢ４０１２６由来のアセトアセチルＣｏＡ還元酵素（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，１０３，９３−１０１（１９９２））、シネココッカス・エスピー（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）由来のアセトアセチルＣｏＡ還元酵素（特開平０８−１８７０８５号公報）、シントロフォモナス・ウォルフェイ・サブスピーシーズ・ウォルフェイ（Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｗｏｌｆｅｉ ｓｕｂｓｐ．ｗｏｌｆｅｉ）由来のアセトアセチルＣｏＡ還元酵素（Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１５９，１６−２０（１９９３））、チオカプサ・フェニギー（Ｔｈｉｏｃａｐｓａ ｐｆｅｎｎｉｇｉｉ）由来のアセトアセチルＣｏＡ還元酵素（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４０，２９２−３００（１９９３））、ズーグロエア・ラミゲラ（Ｚｏｏｇｌｏｅａ ｒａｍｉｇｅｒａ）Ｉ−１６−Ｍ由来のアセトアセチルＣｏＡ還元酵素（Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１１４，２１１−２１７（１９７７）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２，９７−１０２（１９８７））等、既知のアセトアセチルＣｏＡ還元酵素等が挙げられる。

また、先に詳述した本発明の新規アセトアセチルＣｏＡ還元酵素であってもよく、例えば、配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列からなるポリペプチドを挙げることができる。

更に、本方法に用いるアセトアセチルＣｏＡ還元酵素として、以下の（ｃ）〜（ｅ）のいずれかのポリペプチドを挙げることができる。
（ｃ）配列表の配列番号３に示したアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｄ）配列表の配列番号３に示したアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が付加、欠失又は置換したアミノ酸配列からなり、３−ケトペンタンニトリルを不斉還元し、光学純度９５％ｅ．ｅ．以上の（Ｒ）−３−ヒドロキシペンタンニトリルを生成する活性を有するポリペプチド、
（ｅ）配列表の配列番号４に示した塩基配列と相補する塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡがコードするポリペプチドであり、かつ、３−ケトペンタンニトリルを不斉還元し、光学純度９５％ｅ．ｅ．以上の（Ｒ）−３−ヒドロキシペンタンニトリルを生成する活性を有するポリペプチド。

本ポリペプチドの由来としては、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属に属する微生物が好ましく、特に好ましくはラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｏｒｏｐｈａ）である。

配列表の配列番号４に示した塩基配列と相補する塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは、配列表の配列番号４に示した全塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するＤＮＡをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、あるいはサザン・ハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味する。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃の条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡを挙げることができる。

ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂａｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９年）等に記載されている方法に準じて行うことができる。

ハイブリダイズ可能なＤＮＡとして具体的には、配列表の配列番号４に示した塩基配列と、配列同一性が６０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上のＤＮＡを挙げることができ、コードされるポリペプチドが、３−ケトペンタンニトリルを不斉還元し、光学純度９５％ｅ．ｅ．以上の（Ｒ）−３−ヒドロキシペンタンニトリルを生成する活性を有する限り、本発明に使用することができる。

ここで、「配列の同一性（％）」とは、対比される２つのＤＮＡを最適に整列させ、核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、又はＩ）が両方の配列で一致した位置の数を比較塩基総数で除し、そして、この結果に１００を乗じた数値で表される。

上記のアセトアセチルＣｏＡ還元酵素を３−ケトペンタンニトリルに作用させることにより、光学純度９５％ｅ．ｅ．以上の（Ｒ）−３−ヒドロキシペンタニトリルを得ることができる。特に、前述した新規アセトアセチルＣｏＡ還元酵素を用いた場合には、光学純度９９％ｅ．ｅ．以上の極めて光学純度の高い（Ｒ）−３−ヒドロキシペンタニトリルを得ることができる。

なお、上記のアセトアセチルＣｏＡ還元酵素のアミノ酸配列もしくは該酵素をコードするＤＮＡの塩基配列が既に明らかな場合は、先に詳述した本発明の新規アセトアセチルＣｏＡ還元酵素の場合と同様に操作することで、該酵素を大量発現する形質転換体を調製し、この形質転換体又はその培養物を用いて還元反応を行ってもよい。

ここで、上述の組換えベクター以外に、配列表の配列番号４で示される塩基配列からなるＤＮＡを含有し、後述の図３においてｐＮＴＲＥとして示される組換えベクター等も用いることができる。

更に、上述の形質転換体以外に、以下の形質転換体等も用いることができる。
組換え大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＲＥ）（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９５６６、寄託日平成１５年１０月２３日）、
組換え大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＲＥ，ｐＳＴＶＧ）（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０１２５、原寄託日平成１５年１０月２３日の国内寄託をブダペスト条約に基づく国際寄託に移管）。
これらはそれぞれ、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６にある独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。

アセトアセチルＣｏＡ還元酵素を発現させた形質転換体を用いて、３−ケトペンタンニトリルを還元して（Ｒ）−３−ヒドロキシペンタンニトリルを製造する場合、以下のように実施され得る。但し、以下の方法に限定されるわけではない。

まず最初に、適当な溶媒中に、基質３−ケトペンタンニトリルもしくは３−ケトペンタンニトリルアルカリ金属塩（例えば３−ケトペンタンニトリルのナトリウム塩等）を加え、ＮＡＤＰ^＋等の補酵素、及び該形質転換体の培養物を添加し、ｐＨ調整下、攪拌して反応させる。この反応は、５〜８０℃、好ましくは１０〜６０℃、より好ましくは２０〜４０℃の温度で行われ、反応中、反応液のｐＨは３〜１０、好ましくは４〜９、より好ましくは５〜８に維持する。反応はバッチ式あるいは連続方式で行われ得る。

バッチ方式の場合は、反応基質は０．０１〜７０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．１〜５０％、より好ましくは０．５〜３０％の仕込み濃度で添加されうる。反応の途中で基質である３−ケトペンタンニトリルを添加する場合は、３−ケトペンタンニトリルをそのまま添加しても良いし、また、３−ケトペンタンニトリルアルカリ金属塩（例えば３−ケトペンタンニトリルのナトリウム塩等）を添加しても良い。

なお、形質転換体の培養は、その微生物が増殖する限り、通常の、炭素源、窒素源、無機塩類、有機栄養素等を含む液体栄養培地を用いて行い得る。また、培養温度は、好ましくは４〜５０℃である。
ここで形質転換体の培養物とは、培養液、菌体は言うまでもなく、凍結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、あるいはそれらの磨砕物、粗酵素液、精製酵素であってもよく、更に公知の手段で固定化された固定化酵素若しくは固定化菌体であってもよい。

また、本反応を行う際、形質転換体としてアセトアセチルＣｏＡ還元酵素とグルコース脱水素酵素の両者を生産するものを用いる場合、反応系に更にグルコースを添加することによって、補酵素の使用量を大幅に減らすことが可能となる。

反応液からの（Ｒ）−３−ヒドロキシペンタンニトリルの採取方法は特に限定されないが、反応液から直接、あるいは菌体等を分離後、酢酸エチル、トルエン、ｔ−ブチルメチルエーテル、ヘキサン、塩化メチレン等の溶剤で抽出し、脱水後、蒸留あるいはシリカゲルカラムクロマトグラフィー等により精製すれば、高純度の（Ｒ）−３−ヒドロキシペンタンニトリルが容易に得られる。

また、下記一般式（３）

（式中、Ｒは置換されていても良く、分岐していても良い低級アルキル基を示す）で示されるアセト酢酸エステルに、アセトアセチルＣｏＡ還元酵素を作用させることにより、下記一般式（４）

（式中、Ｒは前記と同じ）で示される（Ｒ）−３−ヒドロキシブタン酸エステルを効率的に製造することができる。

Ｒの低級アルキル基としては、分岐していても良い炭素数１〜５のアルキル基が好ましく、より好ましくはメチル基、エチル基である。また、当該低級アルキル基は置換されていても良く、置換基としては、例えばバロゲン原子、水酸基、アルコキシ基、ニトロ基、アミノ基等が挙げられる。

本反応に用いるアセトアセチルＣｏＡ還元酵素は、アセト酢酸エステルを（Ｒ）−３−ヒドロキシブタン酸エステルへ還元するものであれば、その起源を問わず使用することができ、本発明の新規アセトアセチルＣｏＡ還元酵素や前記の既知のアセトアセチルＣｏＡ還元酵素を好適に用いることができる。また、これら酵素を大量発現させた形質転換体を先に述べた方法と同様に育種し、これを用いることもできる。本反応は、先に述べた３−ケトペンタンニトリルの還元反応と同様に実施すればよい。

また、下記式（５）：

（式中、Ｒ_１、Ｒ_２は水素原子、ハロゲン原子、アルコキシ基、又はニトロ基を示し、それぞれ同一でも異なっていてもよい。またＲ_３は水素原子、ハロゲン原子、水酸基、又は置換されていてもよいアルキル基を示す）で表される１−フェニルエタノン誘導体に、アセトアセチルＣｏＡ還元酵素を作用させることにより、下記式（６）

（式中、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３は前記と同じ）で表される光学活性１−フェニルエタノール誘導体を効率的に製造することができる。
特に、下記式（７）：

で表される２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノンに、アセトアセチルＣｏＡ還元酵素を作用させることにより、下記式（８）

で表される（Ｒ）−２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノールを効率的に製造することができる。

Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３におけるハロゲン原子としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられる。
Ｒ_１、Ｒ_２におけるアルコキシ基としては、炭素数１〜３のアルコキシ基であり、例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基等が挙げられる。好ましくはメトキシ基である。
Ｒ_３におけるアルキル基としては、炭素数１〜８のアルキル基であり、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ヘキシル基、オクチル基等が挙げられる。好ましくは炭素数１〜２のアルキル基である。なお、当該アルキル基は、置換基を有してもよく、置換基としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、水酸基、アミノ基等が挙げられる。

本反応に用いるアセトアセチルＣｏＡ還元酵素は、１−フェニルエタノン誘導体を光学活性１−フェニルエタノール誘導体へ還元する活性、特に２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノンを（Ｒ）−２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノールへ還元する活性を有するものであれば、その起源を問わず使用することができる。本発明の新規アセトアセチルＣｏＡ還元酵素や前記の既知のアセトアセチルＣｏＡ還元酵素を好適に用いることができる。また、これら酵素を大量発現させた形質転換体を先に述べた方法と同様に育種し、これを用いることもできる。本反応は、先に述べた３−ケトペンタンニトリルの還元反応と同様に実施すればよい。

本発明によれば、高光学純度の（Ｒ）−３−ヒドロキシペンタンニトリル、（Ｒ）−３−ヒドロキシブタン酸エステル、光学活性１−フェニルエタノール誘導体といった有用な光学活性アルコールを、簡便な方法で製造することができる。とりわけ、（Ｒ）−３−ヒドロキシペンタンニトリルに関しては、９５％ｅ．ｅ．以上、本発明の新規アセトアセチルＣｏＡ還元酵素を用いれば９９％ｅ．ｅ．以上の、従来にない極めて高い光学純度の製品を得ることが可能である。

以下、実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。なお、以下の記載において、「％」は特に断らない限り「重量％」を意味する。

また、生成した３−ヒドロキシペンタンニトリルの量及び光学純度については、下記キャピラリーガスクロマトグラフィー条件で分析して求めた。
［キャピラリーガスクロマトグラフィー分析条件］
カラム：Ｃｈｉｒａｄｅｘ Ｇ−ＴＡ（２０ｍ×０．２５ｍｍ）（ＡＳＴＥＣ社製）、検出：ＦＩＤ
カラム温度：１２０℃
注入温度：２００℃
検出温度：２００℃
キャリアーガス：ヘリウム（１００ｋＰａ）
スプリット比：１００／１
溶出時間：（Ｒ）−３−ヒドロキシペンタンニトリル ４．３７分、（Ｓ）−３−ヒドロキシペンタンニトリル ５．１７分

アクロモバクター・キシロソキシダンス・サブスピー・デニトリフィカンス ＩＦＯ１５１２５株からの新規アセトアセチルＣｏＡ還元酵素の精製
３−ケトペンタンニトリルから３−ヒドロキシペンタンニトリルへの還元活性は、以下のように測定した。３−ケトペンタンニトリル５ｍｇ及びＮＡＤＰＨ３０ｍｇを入れた試験管に、１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）０．０５ｍｌ及びポリペプチド（酵素）溶液０．４５ｍｌを加えて、３０℃で１時間振とうした。これに酢酸エチル１ｍｌを加えて十分に攪拌後、遠心分離した。有機層について上記キャピラリーガスクロマトグラフィー条件で分析を行い、生成した３−ヒドロキシペンタンニトリル量を求めた。この条件において、１分間に１μｍｏｌの３−ヒドロキシペンタンニトリルを生成させる還元活性を１ｕｎｉｔと定義した。また、３−ヒドロキシペンタンニトリルの光学純度についても、上記キャピラリーガスクロマトグラフィー条件で分析して求めた。

肉エキス１０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム３ｇ（いずれも１Ｌ当たり）の組成からなる液体培地（ｐＨ７）１００ｍｌを坂口フラスコに分注し、１２０℃で２０分間蒸気殺菌を行った。この液体培地を１０本用意し、これにアクロモバクター・キシロソキシダンス・サブスピー・デニトリフィカンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ ｓｕｂｓｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）ＩＦＯ１５１２５株を無菌的に一白金耳接種して、３０℃で４０時間振とう培養した。得られた培養液５００ｍｌについて、遠心分離により菌体を集め、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２００ｍｌで洗浄し、湿菌体を１ｍＭとなるようにβ−メルカプトエタノールを添加した１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）３０ｍｌに懸濁した。そして、菌体を超音波破砕機（ブランソン社製）で破砕し、遠心分離にて菌体残渣を除き、無細胞抽出液２５ｍｌを取得した。これを１ｍＭのβ−メルカプトエタノールを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）であらかじめ平衡化したＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＤＥＡＥ−６５０Ｍ（東ソー社製）カラム（１０ｍｌ）に供し、酵素を吸着させた後、塩化ナトリウム濃度（０ｍＭから５００ｍＭまで）を段階的に上げて溶出を行い、３−ケトペンタンニトリルの還元活性を有する画分を取得した。活性画分を集め、１ｍＭのβ−メルカプトエタノールを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）であらかじめ平衡化したＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ｐｒｅｐ ｇｒａｄｅ（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）カラムに供した。活性画分について、更に１ｍＭのβ−メルカプトエタノールを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）であらかじめ平衡化した２’５’ＡＤＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）カラム（１８ｍｌ）に供し、酵素を吸着させた後、塩化ナトリウム濃度（０ｍＭから１．０Ｍまで）のリニアグラジエントにより活性画分を溶出させた。以上の精製操作により、電気泳動的にほぼ単一な精製ポリペプチド標品を得た。ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動分析におけるバンドの分子量は、アマシャム・バイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）社製のＬＭＷ Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｆｏｒ ＳＤＳ−Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓのプロトコールに従って決定した。その結果、当該分子量は約２６０００であった。本精製酵素を、ＮＡＤＰＨ存在下で３−ケトペンタンニトリルに作用させると、光学純度９９．２％ｅ．ｅ．の（Ｒ）−３−ヒドロキシペンタンニトリルが生成した。以後、本アセトアセチルＣｏＡ還元酵素をＲＡＸと呼ぶこととした。

酵素の性質の測定
得られたＲＡＸの酵素化学的性質について調べた。
（１）作用
ＮＡＤＰＨを補酵素として、３−ケトペンタンニトリルに作用して、光学純度９９．２％ｅ．ｅ．の（Ｒ）−３−ヒドロキシペンタンニトリルへ還元した。ＮＡＤＰＨのかわりにＮＡＤＨを補酵素として、実施例１に記載の方法で３−ケトペンタンニトリル還元活性を測定したところ、ＮＡＤＰＨを補酵素とした場合の約１５％の活性を示した。
更に、アセトアセチルＣｏＡ及び４−クロロアセト酢酸エチルに対する還元活性を調べた。１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に、アセトアセチルＣｏＡ ０．２５ｍＭもしくは４−クロロアセト酢酸エチル１０ｍＭ、ＮＡＤＰＨ ０．２５ｍＭ及び酵素を含む反応液を３０℃で反応させ、ＮＡＤＰＨの消費に伴う波長３４０ｎｍの吸光度の減少を測定することにより、それぞれの基質に対する還元活性を求めた。この反応条件において、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＰＨをＮＡＤＰ^＋に酸化する酵素活性を１ｕｎｉｔと定義した。その結果、アセトアセチルＣｏＡ、４−クロロアセト酢酸エチルの両化合物に対して還元活性を有しており、実施例１に記載の方法で求めた３−ケトペンタンニトリルに対する還元活性のそれぞれ約７．６倍、約３．２倍の値を示した。

（２）作用至適温度
ＲＡＸの作用至適温度を調べるため、１０〜５０℃における４−クロロアセト酢酸エチル還元活性を測定した。活性測定は、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に、基質４−クロロアセト酢酸エチル１０ｍＭ、補酵素ＮＡＤＰＨ０．２５ｍＭ及び酵素を添加し、１０〜５０℃で３分間反応させ、波長３４０ｍＭの吸光度の減少を測定することにより行った。
その結果、至適温度は２７〜３３℃であった。

（３）作用至適ｐＨ
ＲＡＸの作用至適ｐＨを調べるため、ｐＨ４〜９における４−クロロアセト酢酸エチル還元活性を測定した。酵素活性は、緩衝液に、基質４−クロロアセト酢酸エチル１０ｍＭ、補酵素ＮＡＤＰＨ０．２５ｍＭ及び酵素を添加し、３０℃で３分間反応させ、波長３４０ｍＭの吸光度の減少を測定することにより行った。緩衝液として１００ｍＭリン酸緩衝液、１００ｍＭ酢酸緩衝液もしくは１００ｍＭトリス塩酸緩衝液を用いて、ｐＨ４〜９の範囲で活性を測定した。その結果、至適ｐＨは５．５〜６．５であった。

（４）阻害剤
４−クロロアセト酢酸エチルに対する還元活性を、各種化合物及び金属塩を添加した条件で測定した。活性測定は、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に基質４−クロロアセト酢酸エチル１０ｍＭ、補酵素ＮＡＤＰＨ０．２５ｍＭ、酵素及び阻害剤を添加し、３０℃で３分間反応させ、波長３４０ｍＭの吸光度の減少を測定することにより行った。阻害剤を添加しない時の活性を１００％とし、阻害剤添加時の活性を相対活性で表１にまとめた。

その結果、酵素活性はｐ−クロロメルクリ安息香酸、硫酸銅、硝酸銀、塩化水銀により阻害された。
（５）分子量
溶離液として１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用い、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＨＲ １０／３０（ファルマシアバイオテック社製）による精製酵素のゲル濾過クロマトグラフィー分析を行った結果、標準タンパク質との相対保持時間から算出した本酵素の分子量は約８５５００であった。

ＲＡＸ遺伝子のクローニング
実施例１で得られた精製酵素を８Ｍ尿素存在下で変性させた後、アクロモバクター由来のリシルエンドペプチダーゼ（和光純薬工業社製）で消化し、得られたペプチド断片のアミノ酸配列をエドマン法により決定した。
上記アミノ酸配列から予想されるＤＮＡ配列を考慮し、プライマー１（５’−ＣＡＲＧＧＮＴＡＹＡＣＮＴＴＹＴＡＹＧ−３’：配列番号５）及びプライマー２（５’−ＧＣＤＡＴＹＴＣＹＴＣＮＧＧＮＧＴＹＣＣ−３’：配列番号６）を合成した。プライマー２種（プライマー１及びプライマー２）各１００ｐｍｏｌ、アクロモバクター・キシロソキシダンス・サブスピー・デニトリフィカンス ＩＦＯ１５１２５株の染色体ＤＮＡ８６６ｎｇ、ｄＮＴＰ（デオキシヌクレオチド三リン酸）各１０ｎｍｏｌ、ＥｘＴａｑ（宝酒造社製）２．５Ｕを含むＥｘＴａｑ用緩衝液１００μｌを調製し、熱変性（９６℃、１分）、アニーリング（５０℃、１分）、伸長反応（７２℃、１分）を３０サイクル行い、４℃まで冷却後、アガロースゲル電気泳動により増幅ＤＮＡを確認した。

本反応に用いたアクロモバクター・キシロソキシダンス・サブスピー・デニトリフィカンス ＩＦＯ１５１２５株の染色体ＤＮＡの調製は、分子生物学実験プロトコール１（丸善）Ｐ．３６に記載されている細菌ゲノムＤＮＡの少量調製法により行った。増幅ＤＮＡをｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にサブクローニングし、その塩基配列を決定した。その結果、増幅ＤＮＡはプライマー配列を含めて５０３塩基からなっていた。その配列は、図１に示したＤＮＡ配列において、二重下線を引いたＤＮＡ配列部分である。以後この配列を「コア配列」と記す。

コア配列の５’−側に近い部分の塩基配列を元に、その相補配列となるプライマー３（５’−ＣＧＴＣＧＧＣＧＣＴＣＡＴＣＴＴＧＣＧＧＡＡＣＡＧ−３’：配列番号７）を作成し、更に３’−側に近い部分の塩基配列を元に、プライマー４（５’−ＡＧＧＧＣＡＴＣＡＣＧＧＴＣＡＡＣＡＣＧＧＴＧＴＣ−３’：配列番号８）を作製した。逆ＰＣＲの鋳型として、まずアクロモバクター・キシロソキシダンス・サブスピー・デニトリフィカンス ＩＦＯ１５１２５株の染色体ＤＮＡを制限酵素ＳｐｈＩにより消化し、消化物をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて自己閉環した。この自己閉環物３００ｎｇ、プライマー２種（プライマー３及びプライマー４）各５０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ各１０ｎｍｏｌ、ＥｘＴａｑ（宝酒造社製）２．５Ｕを含むＥｘＴａｑ用緩衝液５０μｌを調製し、熱変性（９７℃、０．５分）、アニーリング（６８℃、１分）、伸長反応（７２℃、５分）を３０サイクル行い、４℃まで冷却後、アガロースゲル電気泳動により増幅ＤＮＡを確認した。

増幅ＤＮＡをｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にサブクローニングし、その塩基配列を決定した。この結果とコア配列の結果より、ＲＡＸをコードする遺伝子の全塩基配列を決定した。全塩基配列を配列表の配列番号１５に示した。また、全塩基配列及び該遺伝子がコードする推定アミノ酸配列を図１にまとめた。図１中、一重下線は、精製ＲＡＸをリジルエンドペプチダーゼ消化して生じたペプチド断片において、エドマン法により決定できたアミノ酸配列を示す。

ＲＡＸ遺伝子を含む組換えベクターの作製
大腸菌においてＲＡＸを発現させるために、形質転換に用いる組換えベクターを作製した。まず、ＲＡＸ遺伝子の開始コドン部分にＮｄｅＩ部位を付加し、かつ終始コドンの直後に新たな終始コドンとＥｃｏＲＩ部位を付加した二本鎖ＤＮＡを以下の方法により取得した。
実施例３で決定した塩基配列に基づき、ＲＡＸ遺伝子の開始コドン部分にＮｄｅＩ部位を付加したプライマー５（５’−ＧＴＡＣＡＴＡＴＧＡＧＣＧＧＡＡＡＡＣＴＧＧＣＴＴＡＣＧ−３’：配列番号９）、及びＲＡＸ遺伝子の終始コドンの直後に新たな終始コドンとＥｃｏＲＩ部位を付加し、更にＮｄｅＩ部位を破壊するために一塩基置換したプライマー６（５’−ＧＴＡＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＣＡＧＣＣＣＡＴＧＴＧＣＡＧＧＣＣＧＣＣＧ−３’：配列番号１０）を合成した。プライマー２種（プライマー５及びプライマー６）各１００ｐｍｏｌ、アクロモバクター・キシロソキシダンス・サブスピー・デニトリフィカンス ＩＦＯ１５１２５株の染色体ＤＮＡ１３２ｎｇ、ｄＮＴＰ各２０ｎｍｏｌ、ＥｘＴａｑ（宝酒造社製）２．５Ｕを含むＥｘＴａｑ用緩衝液１００μｌを調製し、熱変性（９７℃、０．５分）、アニーリング（６５℃、１分）、伸長反応（７２℃、１分）を３０サイクル行い、４℃まで冷却後、アガロースゲル電気泳動により増幅ＤＮＡを確認した。この増幅断片をＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、プラスミドｐＵＣＮＴ（ＷＯ９４／０３６１３）のｌａｃプロモーターの下流のＮｄｅＩ、ＥｃｏＲＩ部位に挿入することにより、組換えベクターｐＮＴＡＸを得た。ｐＮＴＡＸの作製法及び構造を図２に示す。

ＲＡＸ遺伝子及びグルコース脱水素酵素遺伝子の両者を同時に含む組換えベクターの作製
バシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＩＡＭ１０３０株由来のグルコース脱水素酵素（以後ＧＤＨと記す）の遺伝子の開始コドンから５塩基上流に大腸菌のＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列（９ヌクレオチド）を、更にその直前にＥｃｏＲＩ切断点を、また、終始コドンの直後にＳａｌＩ切断点を付加した二本鎖ＤＮＡを、以下の方法により取得した。

ＧＤＨ遺伝子の塩基配列情報を基に、ＧＤＨの構造遺伝子の開始コドンから５塩基上流に大腸菌のＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列（９ヌクレオチド）を、更にその直前にＥｃｏＲＩ切断点を付加したプライマー７（５’−ＧＣＣＧＡＡＴＴＣＴＡＡＧＧＡＧＧＴＴＡＡＣＡＡＴＧＴＡＴＡＡＡＧＡＴＴＴＡＧＡＡＧＧ−３’：配列番号１１）と、終始コドンの直後にＳａｌＩ部位を付加したプライマー８（５’−ＧＣＧＧＴＣＧＡＣＴＴＡＴＣＣＧＣＧＴＣＣＴＧＣＴＴＧＧ−３’：配列番号１２）を常法に従って合成した。これら２つのプライマーを用いて、プラスミドｐＧＤＫ１（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１８６，３８９（１９８９））を鋳型としてＰＣＲによる二本鎖ＤＮＡを合成した。得られたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩで消化し、実施例４において構築したｐＮＴＡＸのＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ部位に挿入した組換えベクターｐＮＴＡＸＧを得た。ｐＮＴＡＸＧの作製法及び構造を図２に示す。

ＲＡＸを生産する組換え大腸菌の作製
実施例４で得た組換えベクターｐＮＴＡＸ及び実施例５で得た組換えベクターｐＮＴＡＸＧを用いて、大腸菌ＨＢ１０１（宝酒造社製）を形質転換し、各々から組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＡＸ）及びＨＢ１０１（ｐＮＴＡＸＧ）を得た。組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＡＸ）（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０１２６、原寄託日平成１５年１０月２３日の国内寄託をブダペスト条約に基づく国際寄託に移管）は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。

また、実施例５で作成した組換えベクターｐＮＴＡＸＧをＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩで二重消化して得られるＧＤＨ遺伝子を含む約０．８ｋｂのＤＮＡ断片を、プラスミドｐＳＴＶ２８（宝酒造社製）のＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ部位に挿入して、組換えベクターｐＳＴＶＧを構築した。ｐＳＴＶＧの作製法及び構造を図２に示す。このｐＳＴＶＧで、予め塩化カルシウム法でコンピテント化しておいた組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＡＸ）を形質転換し、組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＡＸ，ｐＳＴＶＧ）を得た。こうして得られた形質転換体である組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＡＸ，ｐＳＴＶＧ）（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９５６７、寄託日平成１５年１０月２３日）は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。

組換え大腸菌におけるＲＡＸ及びＧＤＨの発現
バクト・トリプトン１．６％（ｗ／ｖ）、バクト・イーストエキス１．０％（ｗ／ｖ）、ＮａＣｌ０．５％（ｗ／ｖ）の組成からなる２×ＹＴ培地（ｐＨ７）５０ｍｌを５００ｍｌ容坂口フラスコに分注し、１２０℃で２０分間蒸気殺菌を行った。実施例６で得た組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＡＸ）、ＨＢ１０１（ｐＮＴＡＸＧ）、ＨＢ１０１（ｐＮＴＡＸ，ｐＳＴＶＧ）、及びベクタープラスミドのみの形質転換体である組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＵＣＮＴ）のそれぞれを同培地に植菌後、３７℃で１８時間振とう培養した。但し、ＨＢ１０１（ｐＮＴＡＸ）、ＨＢ１０１（ｐＮＴＡＸＧ）、ＨＢ１０１（ｐＵＣＮＴ）の培養時には１２０μｇ／ｍｌとなるようにアンピシリンを加え、またＨＢ１０１（ｐＮＴＡＸ，ｐＳＴＶＧ）の培養時にはそれぞれ１２０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌとなるようにアンピシリン、クロラムフェニコールを加えた。集菌後、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）に懸濁し、超音波破砕を行うことにより無細胞抽出液を得た。各組換え大腸菌の無細胞抽出液について、３−ケトペンタンニトリル還元比活性及びＧＤＨ比活性を測定した。ＧＤＨ比活性の測定は、１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に、基質グルコース０．１Ｍ、補酵素ＮＡＤＰ^＋２ｍＭ及び酵素を添加し、２５℃で波長３４０ｍＭの吸光度の増加を測定することにより行った。この反応条件において、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＰ^＋をＮＡＤＰＨに還元する酵素活性を１ｕｎｉｔと定義した。結果を表２に示す。

組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＡＸ）では、ベクタープラスミドのみの形質転換体である組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＵＣＮＴ）と比較して、明らかな３−ケトペンタンニトリル還元比活性の増加がみられた。また、組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＡＸＧ）及び組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＡＸ，ｐＳＴＶＧ）では、ベクタープラスミドのみの形質転換体である組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＵＣＮＴ）と比較して、明らかな３−ケトペンタンニトリル還元比活性及びＧＤＨ比活性の増加がみられた。

組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＡＸ）を用いた３−ケトペンタンニトリルからの（Ｒ）−３−ヒドロキシペンタンニトリルの合成
組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＡＸ）を実施例７と同様に培養、菌体破砕を行い、無細胞抽出液を調製した。あらかじめ３−ケトペンタンニトリル５ｍｇ、ＮＡＤＰＨ５０ｍｇ及び１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）５０μｌを入れた試験管に、先の無細胞抽出液４５０μｌを加えて、３０℃で一晩振とうした。酢酸エチル１ｍｌで２回抽出を行い、生成物である３−ヒドロキシペンタンニトリルの生成量と光学純度を測定したところ、生成量３．７ｍｇ、光学純度（Ｒ）９９．２％ｅ．ｅ．であった。

組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＡＸＧ）を用いた３−ケトペンタンニトリルから の（Ｒ）−３−ヒドロキシペンタンニトリルの合成
組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＡＸＧ）を実施例７と同様に培養後、菌体破砕を行い、無細胞抽出液を調製した。無細胞抽出液４５０μｌに１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）５０μｌ、グルコース１３．９ｍｇ、ＮＡＤＰ^＋１ｍｇ、３−ケトペンタンニトリル５ｍｇを添加し、３０℃で一晩攪拌した。反応後、生成物である３−ヒドロキシペンタンニトリルの生成量と光学純度を測定したところ、生成量４．５ｍｇ、光学純度９９．２％ｅ．ｅ．であった。

組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＡＸ，ｐＳＴＶＧ）を用いた３−ケトペンタンニトリルからの（Ｒ）−３−ヒドロキシペンタンニトリルの合成
組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＡＸ，ｐＳＴＶＧ）を実施例７と同様に培養した。得られた培養液２０ｍｌにグルコース５．０ｇ、ＮＡＤＰ^＋３ｍｇ、３−ケトペンタンニトリルのナトリウム塩０．２ｇを添加し、５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を滴下することによりｐＨ６．５に調整しながら、３０℃で攪拌した。反応後１．５時間目、３時間目、４．８時間目、５．７時間目、７時間目、及び９時間目に各０．２ｇの３−ケトペンタンニトリルのナトリウム塩をそれぞれ添加した。また反応９．４時間目に培養液４ｍｌとＮＡＤＰ^＋３ｍｇを加えた。反応後２４時間目に生成物である３−ヒドロキシペンタンニトリルの生成量と光学純度を測定したところ、生成量１．１ｇ、光学純度９９．２％ｅ．ｅ．であった。

組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＡＸ，ｐＳＴＶＧ）を用いた３−ケトペンタンニトリルからの（Ｒ）−３−ヒドロキシペンタンニトリルの合成
組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＡＸ，ｐＳＴＶＧ）を実施例７と同様に培養した。１Ｌのセパラブルフラスコに、得られた培養液４００ｍｌ、グルコース３６．３ｇ、ＮＡＤＰ^＋５０ｍｇ、３−ケトペンタンニトリルのナトリウム塩３．５ｇを入れ、ｐＨを６．５に調整後、３０℃で攪拌した。３−ケトペンタンニトリルのナトリウム塩１８．５ｇをイオン交換水３７ｍｌに溶解した３−ケトペンタンニトリル水溶液を別に調製し、この溶液を加えることにより反応液のｐＨを６．５に保った。３−ケトペンタンニトリル水溶液を全量添加した後は、３０％水酸化ナトリウム水溶液を添加して反応液をｐＨ６．５に保った。反応終了後、反応液を酢酸エチルで抽出し、水相を更に酢酸エチルで抽出した。有機相を合わせて減圧下で溶媒を留去後、蒸留により精製を行った。そして、光学純度９９．２％ｅ．ｅ．の（Ｒ）−３−ヒドロキシペンタンニトリル１３．５ｇを取得した。

ラルストニア・ユートロファ ＡＴＣＣ１７６９９株由来アセトアセチルＣｏＡ還元酵素をコードする遺伝子を含む組換えベクターの作製
ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）由来のアセトアセチルＣｏＡ還元酵素（以後ＲＲＥと記す）を大腸菌で発現させるために、形質転換に用いる組換えベクターを作製した。ＲＲＥ遺伝子を取得するにあたり、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１５２９３（１９８９）で報告されているＲＲＥ遺伝子の塩基配列情報を参考にした。まず、ＲＲＥ遺伝子の開始コドン部分にＮｄｅＩ部位を付加し、かつ終始コドンの直後に新たな終始コドンとＥｃｏＲＩ部位を付加した二本鎖ＤＮＡを以下の方法により取得した。

ＲＲＥの構造遺伝子の開始コドン部分にＮｄｅＩ部位を付加したプライマー９（５’−ＡＡＧＧＡＧＴＧＣＡＴＡＴＧＡＣＴＣＡＧＣＧＣＡＴＴＧＣＧＴＡＴＧＴＧ−３’：配列番号１３）、及び終始コドンの直後に新たな終始コドンとＥｃｏＲＩ部位を付加し、更にＮｄｅＩ部位を破壊するために一塩基置換したプライマー１０（５’−ＧＴＡＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＣＡＧＣＣＣＡＴＧＴＧＣＡＧＧＣＣＧＣＣＧ−３’：配列番号１４）を合成した。プライマー２種（プライマー９及びプライマー１０）各１００ｐｍｏｌ、ラルストニア・ユートロファ ＡＴＣＣ１７６９９株の染色体ＤＮＡ１３２ｎｇ、ｄＮＴＰ各２０ｎｍｏｌ、ＥｘＴａｑ（宝酒造社製）２．５Ｕを含むＥｘＴａｑ用緩衝液１００μｌを調製し、熱変性（９７℃、０．５分）、アニーリング（６５℃、１分）、伸長反応（７２℃、１分）を３０サイクル行い、４℃まで冷却後、アガロースゲル電気泳動により増幅ＤＮＡを確認した。ＰＣＲに使用したラルストニア・ユートロファ ＡＴＣＣ１７６９９株の染色体ＤＮＡの調製は、実施例３で記載したアクロモバクター・キシロソキシダンス・サブスピー・デニトリフィカンス ＩＦＯ１５１２５株の染色体ＤＮＡの調製と同様に行った。
上記増幅断片をＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、プラスミドｐＵＣＮＴ（ＷＯ９４／０３６１３）のｌａｃプロモーター下流のＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＩ部位に挿入することにより、組換えベクターｐＮＴＲＥを得た。ｐＮＴＲＥの作製法及び構造を図３に示す。

ＲＲＥを生産する組換え大腸菌の作製
実施例１２で得た組換えベクターｐＮＴＲＥを用いて大腸菌ＨＢ１０１（宝酒造社製）を形質転換し、組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＲＥ）を得た。こうして得られた形質転換体である組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＲＥ）（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９５６６、寄託日平成１５年１０月２３日）は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。
また、実施例６で得られた組換えベクターｐＳＴＶＧで、予め塩化カルシウム法でコンピテント化しておいた組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＲＥ）を形質転換し、組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＲＥ，ｐＳＴＶＧ）を得た。こうして得られた形質転換体である組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＲＥ，ｐＳＴＶＧ）（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０１２５、原寄託日平成１５年１０月２３日の国内寄託をブダペスト条約に基づく国際寄託に移管）は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。

組換え大腸菌におけるＲＲＥ及びＧＤＨの発現
実施例１３で得た組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＲＥ）、ＨＢ１０１（ｐＮＴＲＥ，ｐＳＴＶＧ）、及びベクタープラスミドのみの形質転換体である組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＵＣＮＴ）を実施例７と同様に培養後、無細胞抽出液を調製した。各組換え大腸菌の無細胞抽出液について、３−ケトペンタンニトリル還元比活性及びＧＤＨ比活性を測定した。結果を表３に示す。

組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＲＥ）では、ベクタープラスミドのみの形質転換体である組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＵＣＮＴ）と比較して、明らかな３−ケトペンタンニトリル還元比活性の増加がみられた。また、組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＲＥ，ｐＳＴＶＧ）では、ベクタープラスミドのみの形質転換体である組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＵＣＮＴ）と比較して、明らかな３−ケトペンタンニトリル還元比活性及びＧＤＨ比活性の増加がみられた。

組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＲＥ）を用いた３−ケトペンタンニトリルからの（Ｒ）−３−ヒドロキシペンタンニトリルの合成
組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＲＥ）を実施例７と同様に培養、菌体破砕を行い、無細胞抽出液を調製した。あらかじめ３−ケトペンタンニトリル５．０ｍｇ、ＮＡＤＰＨ５０ｍｇ及び１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）５０μｌを入れた試験管に、先の無細胞抽出液４５０μｌを加えて、３０℃で一晩振とうした。酢酸エチル１ｍｌで２回抽出を行い、生成物である３−ヒドロキシペンタンニトリルの生成量と光学純度を測定したところ、生成量２．５ｍｇ、光学純度（Ｒ）９８．４％ｅ．ｅ．であった。

組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＲＥ，ｐＳＴＶＧ）を用いた３−ケトペンタンニトリルからの（Ｒ）−３−ヒドロキシペンタンニトリルの合成
組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＲＥ，ｐＳＴＶＧ）を実施例７と同様に培養し、培養液を取得した。培養液２０ｍｌにグルコース５．０ｇ、ＮＡＤＰ^＋３ｍｇ、３−ケトペンタンニトリルのナトリウム塩０．２ｇを添加し、５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を滴下することによりｐＨ６．５に調整しながら、３０℃で攪拌した。反応後２時間目、３時間目、５時間目、７時間目、８時間目、及び９時間目に各０．２ｇの３−ケトペンタンニトリルのナトリウム塩をそれぞれ添加した。また反応１０時間目に培養液４ｍｌとＮＡＤＰ^＋３ｍｇを加えた。反応後２４時間目に生成物である３−ヒドロキシペンタンニトリルの生成量と光学純度を測定したところ、生成量１．０ｇ、光学純度９８．３％ｅ．ｅ．であった。

組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＡＸ，ｐＳＴＶＧ）を用いたアセト酢酸メチルからの（Ｒ）−３−ヒドロキシブタン酸メチルの合成
組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＡＸ，ｐＳＴＶＧ）を実施例７と同様に培養した。得られた培養液２０ｍｌにグルコース５．０ｇ、ＮＡＤＰ^＋３ｍｇ、アセト酢酸メチル０．４ｇを添加し、５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を滴下することによりｐＨ６．５に調整しながら、３０℃で攪拌した。反応後１．５時間目、３時間目、４．５時間目、５．５時間目、７時間目に各０．４ｇのアセト酢酸メチルをそれぞれ添加した。反応後２４時間目に生成物である３−ヒドロキシブタン酸メチルの生成量をキャピラリーガスクロマトグラフィーで分析した。
［分析条件］
カラム：ＴＣ−ＷＡＸ（１５ｍ×０．２５ｍｍ）（ＧＬサイエンス社製）、検出：ＦＩＤ、カラム温度：８５℃、注入温度：２００℃、検出温度：２００℃、キャリアーガス：ヘリウム（７０ｋＰａ）、スプリット比：１００／１、溶出時間：アセト酢酸メチル ２．９分、３−ヒドロキシブタン酸メチル ３．８分。

また、生成した３−ヒドロキシブタン酸メチルの光学純度は、ジニトロベンゾイル化後、ＨＰＬＣ分析することにより測定した。３−ヒドロキシブタン酸メチルのジニトロベンゾイル化は、反応液から３−ヒドロキシブタン酸メチルを酢酸エチルで抽出後、ピリジン及び３，５−ジニトロ塩化ベンゾイルを３−ヒドロキシブタン酸メチルの１．２当量添加後、室温で２時間攪拌することにより行った。１規定塩酸で洗浄後、分取用薄層クロマトグラフィーにより精製取得し、これをエタノールに溶解後、下記ＨＰＬＣ条件で分析した。
［分析条件］
カラム：Ｃｈｉｒａｌｐａｋ ＡＤ−Ｈ（ダイセル化学社製）、検出波長：２３０ｎｍ、カラム温度：２０℃、溶出液：ｎ−ヘキサン／エタノール＝３／７、流速：０．７ｍｌ／ｍｉｎ、溶出時間：Ｓ体 ２１．７分、Ｒ体 ２９．８分。
その結果、３−ヒドロキシブタン酸メチルの生成量は１．９ｇ、光学純度９７．２％ｅ．ｅ．であった。

組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＲＥ，ｐＳＴＶＧ）を用いたアセト酢酸メチルからの（Ｒ）−３−ヒドロキシブタン酸メチルの合成
組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＡＸ，ｐＳＴＶＧ）のかわりに組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＲＥ，ｐＳＴＶＧ）を用いた以外は、実施例１７と同様に反応を行い、反応後２４時間目に生成した３−ヒドロキシブタン酸メチルの生成量と光学純度を測定した。その結果、３−ヒドロキシブタン酸メチルの生成量は１．９ｇ、光学純度９８．３％ｅ．ｅ．であった。

組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＡＸ，ｐＳＴＶＧ）を用いた２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノンからの（Ｒ）−２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノールの合成
組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＡＸ，ｐＳＴＶＧ）を実施例７と同様に培養した。得られた培養液２０ｍｌにグルコース５．０ｇ、ＮＡＤＰ^＋３ｍｇ、２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノン０．４ｇを添加し、５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を滴下することによりｐＨ６．５に調整しながら、３０℃で攪拌した。反応後２時間目、４時間目、６時間目、８時間目に各０．４ｇの２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノンをそれぞれ添加した。反応後２４時間目に生成物である２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノールの生成量及び光学純度を下記条件で分析して求めた。

［分析条件］
カラム：Ｃｈｉｒａｌｐａｋ ＯＪ（ダイセル化学社製）、検出波長：２１０ｎｍ、カラム温度：２０℃、溶出液：ｎ−ヘキサン／イソプロパノール＝３９／１、流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ、溶出時間：２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノン ２５．３分、（Ｒ）−２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノール ３８．４分、（Ｓ）−２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノール ４４．０分。
その結果、２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノールの生成量は１．９ｇ、光学純度９９．０％ｅ．ｅ．であった。

組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＲＥ，ｐＳＴＶＧ）を用いた２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノンからの（Ｒ）−２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノールの合成
組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＡＸ，ｐＳＴＶＧ）のかわりに組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＲＥ，ｐＳＴＶＧ）を用いた以外は、実施例１９と同様に反応を行い、反応後２４時間目に生成した２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノールの生成量と光学純度を測定した。その結果、２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノールの生成量は１．９ｇ、光学純度９９．９％ｅ．ｅ．であった。

本発明によれば、高光学純度の（Ｒ）−３−ヒドロキシペンタンニトリル、（Ｒ）−３−ヒドロキシブタン酸エステル、光学活性１−フェニルエタノール誘導体といった有用な光学活性アルコールを簡便な方法で製造することができる。とりわけ、（Ｒ）−３−ヒドロキシペンタンニトリルに関しては、９５％ｅ．ｅ．以上、本発明の新規アセトアセチルＣｏＡ還元酵素を用いれば９９％ｅ．ｅ．以上の、従来にない極めて高い光学純度の製品を得ることが可能である。

ＲＡＸをコードする遺伝子の塩基配列及びＲＡＸの推定アミノ酸配列。 組換えベクターｐＮＴＡＸ、ｐＮＴＡＸＧ、ｐＳＴＶＧの構築。 組換えベクターｐＮＴＲＥの構築。

Claims (35)

1. 以下の（１）及び（２）の理化学的性質を有するアセトアセチルＣｏＡ還元酵素：
   （１）作用：ＮＡＤＰＨもしくはＮＡＤＨを補酵素として、下記式（１）：
   

   

   で表される３−ケトペンタンニトリルに作用して、下記式（２）：
   

   

   で表される光学純度９９％ｅ．ｅ．以上の（Ｒ）−３−ヒドロキシペンタンニトリルを生成する、
   （２）分子量：ゲル濾過分析において約８５５００、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動分析において約２６０００。
2. 更に、以下の（３）〜（５）の理化学的性質を有する請求項１記載のアセトアセチルＣｏＡ還元酵素：
   （３）至適温度：２７〜３３℃、
   （４）至適ｐＨ：５．５〜６．５、
   （５）阻害剤：ｐ−クロロメルクリ安息香酸、硫酸銅、硝酸銀、塩化水銀で阻害される。
3. 下記（ａ）又は（ｂ）のいずれかに記載のポリペプチドであるアセトアセチルＣｏＡ還元酵素：
   （ａ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
   （ｂ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が付加、欠失又は置換したアミノ酸配列からなり、３−ケトペンタンニトリルに作用して、光学純度９９％ｅ．ｅ．以上の（Ｒ）−３−ヒドロキシペンタンニトリルを生成する活性を有するポリペプチド。
4. アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物由来である請求項１〜３のいずれか１項に記載のアセトアセチルＣｏＡ還元酵素。
5. アクロモバクター・キシロソキシダンス・サブスピー・デニトリフィカンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ ｓｕｂｓｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）に属する微生物由来である請求項１〜３のいずれか１項に記載のアセトアセチルＣｏＡ還元酵素。
6. アクロモバクター・キシロソキシダンス・サブスピー・デニトリフィカンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ ｓｕｂｓｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）ＩＦＯ１５１２５株由来である請求項１〜３のいずれか１項に記載のアセトアセチルＣｏＡ還元酵素。
7. 請求項１〜６のいずれか１項に記載のアセトアセチルＣｏＡ還元酵素をコードするＤＮＡ。
8. 配列表の配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡ。
9. 請求項７又は８に記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
10. 図２においてｐＮＴＡＸで示される請求項９記載の組換えベクター。
11. グルコース脱水素酵素をコードするＤＮＡを更に含有する請求項１０記載の組換えベクター。
12. 前記グルコース脱水素酵素がバシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）由来のものである請求項１１記載の組換えベクター。
13. 請求項９〜１２のいずれか１項に記載の組換えベクターを用いて宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
14. 請求項７又は８に記載のＤＮＡを含有する第１の組換えベクター、及びグルコース脱水素酵素をコードするＤＮＡを含有する第２の組換えベクターを用いて宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
15. 第１の組換えベクターが前記ｐＮＴＡＸであり、前記グルコース脱水素酵素がバシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）由来のものである請求項１４記載の形質転換体。
16. 第１の組換えベクターが前記ｐＮＴＡＸであり、第２の組換えベクターが図２においてｐＳＴＶＧで示される組換えベクターである請求項１４記載の形質転換体。
17. 宿主細胞が大腸菌である請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の形質転換体。
18. Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＡＸ）（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０１２６）である請求項１７に記載の形質転換体。
19. Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＡＸ，ｐＳＴＶＧ）（ＦＥＲＭ Ｐ−１９５６７）である請求項１７に記載の形質転換体。
20. 下記式（１）：
    

    

    で表される３−ケトペンタンニトリルに、アセトアセチルＣｏＡ還元酵素を作用させることを特徴とする、下記式（２）
    

    

    で表される（Ｒ）−３−ヒドロキシペンタンニトリルの製造方法。
21. 生成する（Ｒ）−３−ヒドロキシペンタンニトリルの光学純度が９５％ｅ．ｅ．以上である請求項２０に記載の製造方法。
22. 下記式（３）：
    

    

    （式中、Ｒは置換されていても良く、分岐していても良い低級アルキル基を示す）で表されるアセト酢酸エステルに、アセトアセチルＣｏＡ還元酵素を作用させることを特徴とする、下記式（４）
    

    

    （式中、Ｒは前記と同じ）で表される（Ｒ）−３−ヒドロキシブタン酸エステルの製造方法。
23. 下記式（５）：
    

    

    （式中、Ｒ_１、Ｒ_２は水素原子、ハロゲン原子、アルコキシ基、又はニトロ基を示し、それぞれ同一でも異なっていてもよい。またＲ_３は水素原子、ハロゲン原子、水酸基、又は置換されていてもよいアルキル基を示す）で表される１−フェニルエタノン誘導体に、アセトアセチルＣｏＡ還元酵素を作用させることを特徴とする、下記式（６）
    

    

    （式中、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３は前記と同じ）で表される光学活性１−フェニルエタノール誘導体の製造方法。
24. 下記式（７）：
    

    

    で表される２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノンに、アセトアセチルＣｏＡ還元酵素を作用させて、下記式（８）
    

    

    で表される（Ｒ）−２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノールを製造する、請求項２３記載の製造方法。
25. アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、アゾスピリラム（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロマチウム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ）、エクトチオロドスピラ（Ｅｃｔｏｔｈｉｏｒｈｏｄｏｓｐｉｒａ）、ルピナス（Ｌｕｐｉｎｕｓ）、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、シネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、シントロフォモナス（Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）、チオカプサ（Ｔｈｉｏｃａｐｓａ）、又はズーグロエア（Ｚｏｏｇｌｏｅａ）に属する微生物由来のアセトアセチルＣｏＡ還元酵素を用いる請求項２０〜２４のいずれか１項に記載の製造方法。
26. 請求項１〜６のいずれか１項に記載のアセトアセチルＣｏＡ還元酵素を用いる請求項２０〜２４のいずれか１項に記載の製造方法。
27. アセトアセチルＣｏＡ還元酵素として、請求項１３〜１９のいずれか１項に記載の形質転換体の培養物を用いる請求項２０〜２４のいずれか１項に記載の製造方法。
28. アセトアセチルＣｏＡ還元酵素として下記（ｃ）〜（ｅ）のいずれかに記載のポリペプチドを用いる請求項２０〜２４のいずれか１項に記載の製造方法：
    （ｃ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    （ｄ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が付加、欠失又は置換したアミノ酸配列からなり、３−ケトペンタンニトリルを不斉還元し、光学純度９５％ｅ．ｅ．以上の（Ｒ）−３−ヒドロキシペンタンニトリルを生成する活性を有するポリペプチド、
    （ｅ）配列表の配列番号４に記載の塩基配列と相補する塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡがコードするポリペプチドであって、３−ケトペンタンニトリルを不斉還元し、光学純度９５％ｅ．ｅ．以上の（Ｒ）−３−ヒドロキシペンタンニトリルを生成する活性を有するポリペプチド。
29. アセトアセチルＣｏＡ還元酵素がラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属に属する微生物由来である、請求項２８に記載の製造方法。
30. アセトアセチルＣｏＡ還元酵素がラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｏｒｏｐｈａ）に属する微生物由来である、請求項２８に記載の製造方法。
31. 請求項２８〜３０のいずれか１項に記載の製造方法で用いたアセトアセチルＣｏＡ還元酵素に加え、更にグルコース脱水素酵素を発現させた形質転換体を用いる、請求項２０〜２５のいずれか１項に記載の製造方法。
32. 配列表の配列番号４で示される塩基配列からなるＤＮＡを含有し、図３においてｐＮＴＲＥとして示される組換えベクター。
33. 組換え大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＲＥ）（ＦＥＲＭ Ｐ−１９５６６）である形質転換体。
34. 組換え大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＲＥ，ｐＳＴＶＧ）（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０１２５）である形質転換体。
35. アセトアセチルＣｏＡ還元酵素として、請求項３３又は３４に記載の形質転換体の培養物を使用することを特徴とする、請求項２０〜２４のいずれか１項に記載の製造方法。

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