WO2011071058A1 - 光学活性２－ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステルの製造方法 - Google Patents

光学活性２－ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステルの製造方法 Download PDF

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WO2011071058A1
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polypeptide
group
formula
genus
acid ester
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PCT/JP2010/071961
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川野茂
田中辰佳
西山章
八十原良彦
喜多恵子
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株式会社カネカ
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07B—GENERAL METHODS OF ORGANIC CHEMISTRY; APPARATUS THEREFOR
    • C07B53/00—Asymmetric syntheses
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters

Definitions

  • the present invention relates to a process for producing an optically active 2-hydroxycycloalkanecarboxylic acid ester, particularly an optically active 2-hydroxycyclopentanecarboxylic acid ester.
  • Optically active 2-hydroxycycloalkanecarboxylic acid esters especially optically active 2-hydroxycyclopentanecarboxylic acid esters, are useful compounds as synthetic raw materials and intermediates for pharmaceuticals, agricultural chemicals and the like.
  • One method for producing an optically active 2-hydroxycycloalkanecarboxylic acid ester is an asymmetric reduction method of 2-oxocycloalkanecarboxylic acid ester using a microbial cell or enzyme as a catalyst.
  • the following has been reported on a method for producing an optically active 2-hydroxycycloalkanecarboxylic acid ester, for example, 2-hydroxycyclopentanecarboxylic acid ester.
  • Patent Document 1 Non-Patent Document 1
  • Geotrichum candidum Geotrichum candidum
  • Mucor racemosus Geotrichum candidum
  • Mucor circinelloides Kningpomella guro
  • Non-patent document 2 Cunninghamella gloeosporoides
  • reductase KRED102, KRED103, and KRED106 Non-patent document 3
  • (1R, 2S) 2- Hydroxycyclopentanecarboxylic acid esters are reported to form.
  • Non-patent Document 3 reports that (1S, 2R) 2-hydroxycyclopentanecarboxylate is mainly produced. Has been.
  • An object of the present invention is to efficiently and industrially produce an optically active 2-hydroxycycloalkanecarboxylic acid ester, particularly an optically active 2-hydroxycyclopentanecarboxylic acid ester, useful as a pharmaceutical intermediate.
  • the production method according to any one of [1] to [3], wherein R is a methyl group or an ethyl group.
  • the polypeptide is a genus Candida, genus Rhodotorula, genus Devosia, genus Ogataea, genus Brevundimonas, genus Lactobacillus, thermoanaerobium.
  • [1] to [4] derived from a microorganism selected from the group consisting of the genus (Themoanaerobium), the genus Rhodococcus, the genus Sporobolomyces, and the genus Sporidiobolus. The manufacturing method in any one.
  • the polypeptide is the following (a1), (a2), and (a3); (A1) a polypeptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing; (A2) consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing, and acts on the above formula (8) and NADPH; A polypeptide having the activity to produce NADP with the formula (9), (A3) an activity having 85% or more sequence identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing and acting on the above formula (8) and NADPH to produce the above formula (9) and NADP; A polypeptide having, The production method according to [6] or [7], which is a polypeptide selected from the group consisting of: [9] The polypeptide is the following (A1), (A2), (A3), and (A4); (A1) DNA set forth in SEQ ID NO:
  • an optically active 2-hydroxycycloalkanecarboxylic acid ester particularly an optically active 2-hydroxycyclopentanecarboxylic acid ester, can be produced efficiently and industrially.
  • FIG. 4 is a schematic diagram of a Curtius dislocation route.
  • the present invention relates to a general formula (9); Wherein the optically active 2-hydroxycycloalkanecarboxylic acid ester represented by the general formula (8):
  • the 2-oxocycloalkanecarboxylic acid ester represented by the above is reacted with a polypeptide, an organism that produces the polypeptide, or a processed product of the organism to reduce the 2-oxocycloalkanecarboxylic acid ester. It is characterized by that.
  • the specificity of the stereoselective reaction greatly differs depending on the number of asymmetric carbons.
  • the optical activity 2 represented by the above formula (8) having two asymmetric carbons It is possible to produce hydroxycycloalkane carboxylic acid esters.
  • n represents an integer of 0 to 8. Among them, it is preferably 0 to 4, more preferably 1 to 3, and most preferably 1.
  • n 1, the 2-oxocycloalkanecarboxylic acid ester is 2-oxocyclopentanecarboxylic acid ester, and the product optically active 2-hydroxycycloalkanecarboxylic acid ester is 2-hydroxycyclopentanecarboxylic acid ester. It is.
  • R is a substituted or unsubstituted alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a substituted or unsubstituted aryl group having 6 to 10 carbon atoms, a substituted or unsubstituted group having 7 to 11 carbon atoms.
  • the substituted or unsubstituted alkyl having 1 to 6 carbon atoms include a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an isopropyl group, and an n-butyl group.
  • Examples of the substituted or unsubstituted aryl group having 6 to 10 carbon atoms include a phenyl group, p-methylphenyl group, o-methylphenyl group, m-methylbenzyl group, p-chlorophenyl group, p-nitrophenyl group, p -Trifluoromethylphenyl group, 1-naphthyl group, 2-naphthyl group and the like.
  • Examples of the aralkyl group having 7 to 11 carbon atoms include benzyl group, p-methylbenzyl group, o-methylbenzyl group, m-methylbenzyl group, p-nitrobenzyl group, p-trifluoromethylbenzyl group and the like. .
  • a substituted or unsubstituted alkyl group having 1 to 6 carbon atoms is preferable, and a methyl group and an ethyl group are more preferable.
  • * 1 and * 2 represent asymmetric carbon.
  • the (S) configuration may be independent of * 1 and * 2, respectively, or the (R) configuration may be used. Among these, * 1 and * 2 are preferably in the (R) configuration.
  • the optically active 2-hydroxycycloalkanecarboxylic acid ester (9) produced in the present invention means four kinds of stereoisomers of 2-hydroxycycloalkanecarboxylic acid ester (cis (1R, 2S)).
  • the ratio of the target stereoisomer in the (1S, 2R) isomer and the (1S, 2S) isomer and (1R, 2R) isomer of the trans isomer) is 50% or more, preferably 60% More preferably, it is 70% or more, more preferably 80% or more, still more preferably 85% or more, and most preferably 90% or more of 2-hydroxycycloalkanecarboxylic acid ester.
  • the ratio of (1R, 2R) body and (1S, 2S) in the formula (9) can be determined as follows, for example.
  • trans isomer ratio [Trans-body area] / ([Trans-body area] + [Cis-body area]) ⁇ 100
  • the proportion of (1R, 2R) or (1S, 2S) in the trans isomer was determined by derivatizing ethyl 2-hydroxycyclopentanecarboxylate with dinitrobenzoyl chloride under basic conditions. It can be easily calculated by analyzing under the conditions of high performance liquid chromatography.
  • the ratio of the (1S, 2R) body and (1R, 2S) in the generated formula (9) can be determined as follows.
  • the proportion of (1S, 2R) or (1S, 2R) in the cis isomer is, for example, dinitrobenzoyl chloride under basic conditions when the formula (9) is ethyl 2-hydroxycyclopentanecarboxylate. It can be easily calculated by derivatizing and analyzing under the conditions of the above-mentioned high performance liquid chromatography.
  • any polypeptide may be used as long as it has an activity to act on 2-oxocycloalkanecarboxylic acid ester to produce optically active 2-hydroxycycloalkanecarboxylic acid ester. .
  • the production method of the present invention can be performed by allowing not only a polypeptide but also an organism producing the polypeptide or a processed product of the organism to act.
  • the organism may be a naturally occurring organism or a genetically modified organism.
  • the treated product of the organism is, for example, a crushed cell, a crude extract, a cultured cell, a lyophilized organism, an acetone-dried organism, or a ground product thereof, a mixture thereof, and a catalyst for the polypeptide. This means that the activity remains.
  • the origin of the polypeptide is not limited, but preferably the genus Candida, Rhodotorula, Devosia, Ogataea, Brevundimonas, Lactobacillus ( It is derived from a microorganism selected from the group consisting of the genus Lactobacillus, the genus Thermoanaerobium, the genus Rhodococcus, the genus Sporobolomyces, and the genus Sporidiobolus.
  • polypeptides that produce (1R, 2R) -2-hydroxycycloalkanecarboxylic acid esters are described below.
  • the polypeptide to be used is a microorganism selected from the group consisting of the genus Sporobolomyces and the genus Sporidiobolus The thing of origin is preferable.
  • Sporobolomyces yeast examples include, for example, Sporobolomyces albidus, Sporobolomyces alborubescens, Sporobolomyces albus, Sporobolomyces albus, Sporobolomyces albus Sporobolomyces antarcticus, Sporobolomyces bischofiae, Sporobolomyces blumeae, Sporobolomyces carnicolor, Sporobolomyces carnicolor Sprorobolomyces coprophilus, Sporobolomyces coprosmae, Sporobolomyces coprosmicola, Sporobolomyces coloriformis (Sporobolomyces coprophilus) s coralliformis, Sporobolomyces dimmenae, Sporobolomyces diospyroris, Sporobolomyces dracophyllus, Sporobolomyces elongatos, Sporobat Sporobolomyces falcatus, Sporobol
  • yeasts belonging to the genus Sporidiobolus include Sporidiobolus johnsonii, Sporidiobolus microsporus, Sporidiobolus pararoseus, and Sporidiobolus pararoseus.
  • Examples include Sporidiobolus ruineniae, Sporidiobolus ruineniae bar coprophilus, Sporidiobolus salmonicolor.
  • Sporoboromyces salmonicolor Sporobolomyces salmonicolor
  • Sporidiobolus salmonicolor etc.
  • Sporoboromyces salmonicolor is the name of the asexual generation (Anamorph) of Sporidiobolus salmonicolor.
  • new species of sporoboromyces and sporidiobolus newly isolated from nature are also included.
  • polypeptide used in the production method of the present invention for example, when producing a (1R, 2R) 2-hydroxycycloalkanecarboxylic acid ester, a polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing is exemplified.
  • the polypeptide used in the present invention is a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, inserted, substituted and / or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing. (Polypeptide of (a2)).
  • polypeptides can be prepared according to known methods described in Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Inc., 1989), etc., and act on 2-oxocyclopentanecarboxylic acid ester and NADPH. Thus, as long as it has the activity of producing (1R, 2R) -2-hydroxycyclopentanecarboxylic acid ester and NADP, it is included in the polypeptide.
  • the “plural amino acids” are, for example, 50, preferably 30, more preferably 15, more preferably 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 Means 3 or less amino acids.
  • the place where amino acids are substituted, inserted, deleted and / or added is not particularly limited, but it is preferable to avoid a highly conserved region.
  • the highly conserved region represents a region in which amino acids are identical between a plurality of sequences when the amino acid sequences are optimally aligned and compared for a plurality of enzymes having different origins.
  • the highly conserved region can be confirmed by comparing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 with the amino acid sequence of a known microorganism-derived alcohol dehydrogenase using a tool such as GENETYX.
  • amino acid sequence modified by substitution, insertion, deletion and / or addition may include only one type (for example, substitution) of modification, or two or more types of modification (for example, substitution and substitution). Insertion).
  • the amino acid to be substituted is preferably an amino acid having a property similar to that of the amino acid before substitution (cognate amino acid).
  • amino acids in the same group of the following groups are regarded as homologous amino acids.
  • Group 1 neutral nonpolar amino acids
  • Group 2 neutral polar amino acids
  • Ser, Thr, Gln, Asn, Trp, Tyr Group 3: acidic amino acids
  • Glu Asp
  • Group 4 basic amino acids
  • the polypeptide used in the production method of the present invention has a sequence identity of 85% or more with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, and acts on 2-oxocyclopentanecarboxylic acid ester and NADPH.
  • it may be a polypeptide having the activity of producing (1R, 2R) -2-hydroxycyclopentanecarboxylic acid ester and NADP (polypeptide of (a3)).
  • sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing is preferably 85% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, and most preferably 98% or more or 99% or more.
  • sequence identity of the amino acid sequences is determined by comparing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing with the amino acid sequence to be evaluated, dividing the number of amino acid positions in both sequences by the total number of amino acids, Furthermore, it is represented by a value multiplied by 100.
  • amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 Amino acid sequences can be combined.
  • a tag sequence such as a histidine tag or HA tag may be added.
  • it can be a fusion protein with another protein.
  • it may be a peptide fragment as long as it has an activity of acting on 2-oxocyclopentanecarboxylic acid ester and NADPH to produce (1R, 2R) -2-hydroxycyclopentanecarboxylic acid ester and NADP.
  • any equivalent activity is encompassed by the polypeptide of the present invention.
  • “substantially equivalent activity” refers to an activity of, for example, 50% or more, usually 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more or 95% or more with respect to the original activity. .
  • the activity can be measured, for example, by the method for measuring the reduction activity for 2-oxocyclopentanecarboxylic acid ester described later.
  • the polypeptide used in the production method of the present invention can be obtained from a microorganism having the ability to reduce 2-oxocycloalkanecarboxylic acid ester to produce optically active 2-hydroxycycloalkanecarboxylic acid ester.
  • a microorganism having the polypeptide can be found, for example, by the following method.
  • Microorganisms are cultured in an appropriate medium, and after collection, they are reacted with 2-oxocycloalkanecarboxylic acid ester in a buffer solution in the presence of nutrients such as glucose. After the reaction, extraction with a solvent, etc., and analysis by gas chromatography, high performance liquid chromatography, etc. confirm the amount of 2-hydroxycycloalkanecarboxylic acid ester produced and the composition ratio of the four stereoisomers. do it.
  • a medium for culturing a microorganism a normal liquid nutrient medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, organic nutrients and the like can be used as long as the microorganism grows.
  • the culture can be performed, for example, by shaking or aeration at a temperature of 25 ° C. to 37 ° C. and a pH of 4 to 8.
  • Isolation of the polypeptide used in the present invention from a microorganism can be carried out by using an appropriate combination of known protein purification methods. For example, it can be implemented as follows. First, microorganisms are cultured in an appropriate medium, and the cells are collected from the culture solution by centrifugation or filtration. The obtained bacterial cells are crushed by an ultrasonic crusher or a physical method using glass beads or the like, and then the cell residue is removed by centrifugation to obtain a cell-free extract.
  • the polypeptide used in the present invention is isolated from the cell-free extract by using a technique such as external filtration alone or in combination.
  • the reduction activity of the isolated polypeptide against 2-oxocycloalkanecarboxylic acid ester is determined by reacting the polypeptide to be evaluated with 2-oxocycloalkanecarboxylic acid ester and then generating 2-hydroxycycloalkanecarboxylic acid ester. It can be evaluated by analyzing with gas chromatography or the like. Further, 2-oxocycloalkanecarboxylic acid ester reducing activity, for example, 2-oxocyclopentanecarboxylic acid ester reducing activity can be evaluated by the following simple method.
  • the reduction activity for 2-oxocyclopentanecarboxylic acid ester is 30 mM by adding 10 mM 2-oxocyclopentanecarboxylic acid ester, 0.25 mM coenzyme NADPH, and crude enzyme solution to 100 mM phosphate buffer (pH 6.5). The reaction is carried out at 1 ° C. for 1 minute, and it is calculated from the rate of decrease in absorbance at a wavelength of 340 nm. Under this reaction condition, the enzyme activity that oxidizes 1 ⁇ mol of NADPH to NADP per minute is defined as 1 U. NADH may be used instead of NADPH.
  • the polypeptide used in the production method of the present invention may be expressed by a host cell introduced with a DNA encoding this polypeptide.
  • the DNA may be any DNA that can express the polypeptide in the introduced host cell, and may contain any untranslated region.
  • DNA obtained by synthesis is also included.
  • Examples of the DNA encoding the polypeptide include a DNA encoding the polypeptide shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing (DNA of (A2)). Specifically, the DNA (DNA of (A1)) shown in SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing can be mentioned.
  • a DNA complementary to the DNA shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing and a complementary DNA are hybridized under stringent conditions and act on 2-oxocyclopentanecarboxylic acid ester and NADPH (1R, 2R)- It may be a DNA encoding a polypeptide having an activity to produce 2-hydroxycyclopentanecarboxylic acid ester and NADP (DNA of (A3)).
  • DNAs complementary to the DNA shown in SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing are hybridized under stringent conditions and act on 2-oxocyclopentanecarboxylic acid ester and NADPH (1R, 2R “) -DNA that encodes a polypeptide having an activity to produce 2-hydroxycyclopentanecarboxylic acid ester and NADP” is a probe of DNA comprising a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing As a DNA obtained by using a colony hybridization method, a plaque hybridization method, a Southern hybridization method, etc.
  • DNA that hybridizes under stringent conditions means, for example, complementation at 65 ° C. in the presence of 0.7 to 1.0 M NaCl using a filter on which colony or plaque-derived DNA is immobilized. After strand formation, the filter is washed under conditions of 65 ° C. using a 2 ⁇ concentration SSC solution (composition of 1 ⁇ concentration SSC solution consists of 150 mM sodium chloride and 15 mM sodium citrate). The DNA which can be acquired can be mentioned. It is preferably washed at 65 ° C.
  • the hybridization conditions are not particularly limited to these conditions. A plurality of factors such as temperature and salt concentration are conceivable as factors affecting the stringency of hybridization, and those skilled in the art can realize optimum stringency by appropriately selecting these factors.
  • the DNA hybridizable under the above conditions is 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, even more preferably 97% or more, with the DNA shown in SEQ ID NO: 2. Most preferably, 99% or more of DNA can be mentioned, and the encoded polypeptide acts on 2-oxocyclopentanecarboxylic acid ester and NADPH to produce (1R, 2R) -2-hydroxycyclopentanecarboxylic acid ester. As long as it has an activity to produce NADP, it is included in the DNA.
  • sequence identity means that the two DNAs to be compared are optimally aligned, and the nucleobases (eg, A, T, C, G, U, or I) match in both sequences.
  • the number of positions is divided by the total number of comparison bases, and the result is expressed by a value obtained by multiplying by 100.
  • Sequence identity can be calculated using, for example, the following sequence analysis tools: GCG Wisconsin Package (Program Manual for The Wisconsin Package, Version 8, September 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Medicine, Wisconsin, USA 53711; Rice, P. (1996) Program Manual for EGCG Package, Peter Rice, The Sanger Centre, Hinxton Hall, Cambridge, CB10 1RQ, England, and the ExPASy World Wide Web molecular biology server (Geneva University and Spital University of Geneva, Geneva, Switzerland).
  • polypeptide can be obtained, a person skilled in the art can obtain DNA from a microorganism that is the origin of the polypeptide by a known method. For example, it can be acquired by the method shown below.
  • polypeptide isolated by the above-described method is digested with an appropriate endopeptidase, and the resulting peptide fragment is fractionated by reverse phase HPLC. Then, for example, part or all of the amino acid sequences of these peptide fragments are determined by an ABI492 type protein sequencer (manufactured by Applied Biosystems).
  • a PCR (Polymerase Chain Reaction) primer for amplifying a part of the DNA encoding the polypeptide is synthesized.
  • chromosomal DNA of the microorganism that is the origin of the polypeptide is prepared by a conventional DNA isolation method, for example, a method such as Visser (Appl. Microbiol. Biotechnol., 53, 415 (2000)).
  • cDNA is prepared from the mRNA of the microorganism that is the origin of the polypeptide.
  • PCR is performed using the PCR primers described above, a part of the DNA encoding the polypeptide is amplified, and the base sequence is determined.
  • the base sequence can be determined using, for example, Applied Biosystems 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems). If the partial base sequence of DNA encoding the polypeptide is clarified, the entire sequence is determined by, for example, an inverse PCR method (Nucl. Acids Res., 16, 8186 (1988)). be able to.
  • the polypeptides to be used include the genus Candida, the genus Rhodotorula, and the genus Ogataea.
  • Preferred are those derived from microorganisms selected from the group consisting of the genus Thermoanaerobium. More preferably, Candida magnoliae, Candida boidinii, Rhodotorula glutinis var. Dairenensis, Ogataea minutavar. ), A polypeptide derived from Thermoanaerobium brockii.
  • Particularly preferred polypeptides are the reductase CR enzyme derived from Candida magnoliae (Example 4), the reductase RRG derived from Rhodotorula glutinis var. Dairenensis NBRC0415 (Example 5). ), A reductase derived from Ogataea minuta var. Minuta NBRC0975 (Example 6), and the like.
  • the CR enzyme is derived from International Publication WO01 / 040450
  • the RRG enzyme is derived from International Publication WO03 / 093477
  • Ogataea minuta var. Minuta NBRC0975 Reductases are described in International Publication WO06 / 013801.
  • the polypeptides to be used include Candida, Devosia, and Brevundimonas.
  • microorganisms selected from the group consisting of the genus Lactobacillus are preferred. More preferably, Candida maris, Devosia riboflavina, Brevundimonas diminuta, Lactobacillus brevis, Lactobacillus kefir polypeptide from Lactobacillus kefir It is.
  • Particularly preferred polypeptides are the reductase FPDH derived from Candida maris NBRC10003 (Example 9), the RDR reductase derived from Devosia riboflavina NBRC13584 (Example 10), and Bleundimonas diminuta. (Brevundimonas diminuta) NBRC13584-derived reductase (Example 11).
  • the FPDH enzyme is International Publication WO01 / 05996
  • the RRG enzyme is International Publication WO04 / 027055
  • the reductase derived from Brevundimonas diminuta NBRC13584 is the International Publication. WO07 / 114217.
  • the polypeptide to be used is selected from the group consisting of Candida genus and Rhodococcus genus. Those derived from microorganisms are preferred. More preferably, it is a polypeptide derived from Candida maltosa, Candida parapsilosis, Rhodococcus erythropolis. Particularly preferred polypeptides are the reductase derived from Candida maltosa NBRC1977 (Example 14), the reductase derived from Candida parapsilosis NBRC708 (Example 15), and the like.
  • the reductase derived from Candida maltosa NBRC1977 is the international publication WO08 / 066018, and the reductase derived from Candida parapsilosis NBRC708 is special. No. 2003-289874.
  • the above microorganisms can be obtained from, for example, the following culture collection. ⁇ National Biotechnology Headquarters, Biotechnology Headquarters, National Institute of Technology and Evaluation (NBRC) (2-5-8 Kazusa Kamashi, Kisarazu City, Chiba Prefecture 292-0818) ⁇ RIKEN BioResource Center Microbial Materials Development Office (JCM) (2-1 Hirosawa, Wako, Saitama 351-0198) ⁇ German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) (Marscheroder Weg 1b, D-38124 Brunschweig, Germany)
  • a genetically modified organism into which DNA encoding the polypeptide described above is introduced can be used.
  • a genetically modified organism can be obtained by inserting a DNA encoding a polypeptide into an expression vector to prepare a polypeptide expression vector, and introducing this vector into a host organism by transformation.
  • the polypeptide can be expressed by culturing using a medium in which the genetically modified organism can grow.
  • a genetically modified organism can also be obtained by introducing a DNA encoding a polypeptide into the chromosome of the host organism.
  • the expression vector is not particularly limited as long as it can express the polypeptide encoded by the DNA in a suitable host organism.
  • suitable host organisms include plasmid vectors, phage vectors, cosmid vectors, and shuttle vectors that can exchange genes with other host organisms can also be used.
  • such a vector when using E. coli as a host organism, such a vector usually contains regulatory elements such as lacUV5 promoter, trp promoter, trc promoter, tac promoter, lpp promoter, tufB promoter, recA promoter, pL promoter, etc. It can be suitably used as an expression vector comprising an expression unit operably linked to the DNA of the invention. Examples thereof include pUCN18 (see Example 2), pSTV28 (manufactured by Takara Bio Inc.), pUCNT (WO94 / 03613) and the like.
  • “Regulator” refers to a base sequence having a functional promoter and any associated transcription element (eg, enhancer, CCAAT box, TATA box, SPI site, etc.).
  • “Operably linked” means that a gene is operably linked to various regulatory elements such as promoters, enhancers and the like that regulate the expression of the gene in a host organism. It is well known to those skilled in the art that the type and kind of the control factor can vary depending on the host organism. Vectors and promoters that can be used in various organisms are described in detail in "Basic Course of Microbiology 8 Genetic Engineering / Kyoritsu Publishing".
  • the host organism used to express the polypeptide used in the present invention is an organism that is transformed with a polypeptide expression vector containing DNA encoding each polypeptide and can express the polypeptide encoded by the introduced DNA. If there is no particular limitation, organisms for which host vector systems have been developed are preferred.
  • microorganisms include, for example, the genus Escherichia, the genus Bacillus, the genus Pseudomonas, the genus Serratia, the genus Brevibacterium, Bacteria such as the genus Corynebacterium, Streptococcus, and Lactobacillus; actinomycetes such as the genus Rhodococcus and Streptomyces; the genus Saccharomyces; The genus Kluyveromyces, the genus Schizosaccharomyces, the genus Zygosaccharomyces, the genus Yarrowia, the genus Trichosporon, the genus Rhodosporidium, the genus Rhodosporidium a And Candida Candida) yeasts such as; Neurospora (Neurospora) genus Aspergillus (Aspergillus)
  • a microorganism In addition to microorganisms, various host and vector systems have been developed for plants and animals, especially in insects such as moths (Nature 315, 592-594 (1985)) and in large quantities in plants such as rapeseed, corn, and potatoes. Systems for expressing heterologous proteins have been developed and can be suitably used. Among these, from the viewpoint of introduction and expression efficiency, a microorganism is preferable, a bacterium is more preferable, and a genetically modified organism using Escherichia coli (commonly known as E. coli) as a host organism is particularly preferable.
  • Escherichia coli commonly known as E. coli
  • Polypeptide expression vectors can be introduced into host organisms by known methods.
  • the plasmid pUCAR2 Applied and Environmental Microbiology, 65 (12), 5207-5211, (1999)
  • the plasmid pUCAR2 prepared by introducing the DNA shown in SEQ ID NO: 2 into the vector pUC118
  • E. coli E. coli competent cell
  • E. coli competent cell manufactured by Takara Bio Inc.
  • a recombinant organism E. coli in which the vector is introduced into the host cell for example, E. coli HB101 ( pUCAR2) (see Example 1) is obtained.
  • NADH or NADPH is required as a coenzyme.
  • NADH or NADPH the ability to convert the oxidized coenzyme (NAD + or NADP + ) into a reduced form (NADH or NADPH) (hereinafter referred to as reduced complement)
  • reduced complement the ability to convert the oxidized coenzyme (NAD + or NADP + ) into a reduced form (NADH or NADPH)
  • reduced complement the amount of expensive coenzyme used can be greatly reduced by performing the reaction with an enzyme having an enzyme regeneration ability) together with its substrate, that is, a coenzyme regeneration system in combination with the polypeptide used in the present invention.
  • Such a reaction can be performed by adding a coenzyme regeneration system into the asymmetric reduction reaction system. It is also possible to breed a genetically modified organism in which both a polypeptide having asymmetric reduction activity and a polypeptide having reductive coenzyme regeneration ability are expressed in the same host organism. That is, it can be obtained by incorporating a DNA encoding a polypeptide having asymmetric reduction activity and a DNA encoding a polypeptide having reductive coenzyme regeneration ability into the same vector and introducing it into a host organism.
  • a DNA encoding a polypeptide having asymmetric reduction activity and a DNA encoding a polypeptide having reductive coenzyme regeneration ability are respectively incorporated into two different vectors of different incompatibility groups, and the same host is used.
  • a genetically modified organism obtained by introduction into an organism can also be used in the production method of the present invention.
  • Examples of the enzyme having the ability to regenerate reduced coenzyme include hydrogenase, formate dehydrogenase, alcohol dehydrogenase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, and glucose dehydrogenase. Preferably, glucose dehydrogenase is used.
  • 2-oxocycloalkanecarboxylic acid ester Using a polypeptide that reduces 2-oxocycloalkanecarboxylic acid ester or a recombinant organism that expresses the polypeptide, 2-oxocycloalkanecarboxylic acid ester (8); The optically active 2-hydroxycycloalkanecarboxylic acid ester (9); Can be carried out as follows. However, it is not necessarily limited to the following method.
  • the formula (8) When converting the formula (8) into the formula (9), the formula (8) is added to a suitable solvent such as 100 mM phosphate buffer (pH 6.5), and NADPH, NADP + , NADH Alternatively, a coenzyme such as NAD + and a polypeptide, an organism producing the polypeptide, or a processed product of the organism are added, and the mixture is reacted with stirring under pH adjustment.
  • a suitable solvent such as 100 mM phosphate buffer (pH 6.5), and NADPH, NADP + , NADH
  • a coenzyme such as NAD + and a polypeptide, an organism producing the polypeptide, or a processed product of the organism are added, and the mixture is reacted with stirring under pH adjustment.
  • the reaction is carried out at a temperature of 5 to 80 ° C., preferably 10 to 60 ° C., more preferably 20 to 40 ° C., and the pH of the reaction solution during the reaction is 3 to 10, preferably 4 to 9, more preferably 5 to 8. To maintain.
  • the reaction can be carried out batchwise or continuously.
  • the reaction substrate can be added at a feed concentration of 0.01 to 100% (w / v), preferably 0.1 to 70%, more preferably 0.5 to 50%. Further, a substrate may be newly added during the reaction.
  • a surfactant such as Triton (manufactured by Nacalai Tesque), Span (manufactured by Kanto Chemical Co., Ltd.), Tween (manufactured by Nacalai Tesque) to the reaction solution.
  • an organic solvent insoluble in water such as ethyl acetate, butyl acetate, isopropyl ether, toluene, hexane or the like is added to the reaction solution in order to avoid inhibition of the reaction by the substrate and / or the alcohol that is the product of the reduction reaction. May be.
  • an organic solvent soluble in water such as methanol, ethanol, acetone, tetrahydrofuran, dimethyl sulfoxide and the like can be added.
  • the collection of the optically active 2-hydroxycycloalkanecarboxylic acid ester produced by the reduction reaction is not particularly limited. However, it is possible to collect ethyl acetate, toluene, t-butyl methyl ether, hexane, Extraction with a solvent such as n-butanol or dichloromethane and the solvent may be distilled off by an operation such as heating under reduced pressure. Furthermore, if it refine
  • optically active 2-hydroxycycloalkanecarboxylic acid ester represented by the formula (9) produced by the method described above, a compound represented by the general formula (2); Or an optically active 2-aminocycloalkanol derivative particularly useful as a pharmaceutical intermediate represented by the general formula (2) ′;
  • the optically active 2-aminocycloalkanol represented by these can be manufactured.
  • R is a substituted or unsubstituted alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a substituted or unsubstituted aryl group having 6 to 10 carbon atoms, or a substituted or unsubstituted aralkyl group having 7 to 11 carbon atoms.
  • the substituted or unsubstituted alkyl having 1 to 6 carbon atoms include a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an isopropyl group, and an n-butyl group.
  • Examples of the substituted or unsubstituted aryl group having 6 to 10 carbon atoms include a phenyl group, p-methylphenyl group, o-methylphenyl group, m-methylbenzyl group, p-chlorophenyl group, p-nitrophenyl group, p -Trifluoromethylphenyl group, 1-naphthyl group, 2-naphthyl group and the like.
  • Examples of the aralkyl group having 7 to 11 carbon atoms include benzyl group, p-methylbenzyl group, o-methylbenzyl group, m-methylbenzyl group, p-nitrobenzyl group, p-trifluoromethylbenzyl group and the like. . Among them, preferred is a substituted or unsubstituted alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and more preferred are a methyl group and an ethyl group.
  • the formula (9) can be obtained by the reduction reaction of the corresponding ketoester using the microorganism or enzyme described above.
  • R ′ is, for example, a substituted or unsubstituted alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a substituted or unsubstituted aryl group having 6 to 10 carbon atoms, a substituted or unsubstituted group having 7 to 11 carbon atoms. And substituted aralkyl groups.
  • the substituted or unsubstituted alkyl group having 1 to 6 carbon atoms include a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an isopropyl group, and an n-butyl group.
  • Examples of the substituted or unsubstituted aryl group having 6 to 10 carbon atoms include a phenyl group, p-methylphenyl group, o-methylphenyl group, m-methylbenzyl group, p-chlorophenyl group, p-nitrophenyl group, p -Trifluoromethylphenyl group, 1-naphthyl group, 2-naphthyl group and the like.
  • Examples of the aralkyl group having 7 to 11 carbon atoms include benzyl group, p-methylbenzyl group, o-methylbenzyl group, m-methylbenzyl group, p-nitrobenzyl group, p-trifluoromethylbenzyl group and the like. .
  • a substituted or unsubstituted alkyl group having 1 to 6 carbon atoms and an aralkyl group having 7 to 11 carbon atoms are preferable, and a methyl group, an ethyl group, a t-butyl group, and a benzyl group are more preferable.
  • the route for producing the formula (2) or the formula (2) ′ from the formula (9) is to react 2-hydroxycycloalkanecarboxylic acid amide (3) by reacting the formula (9) with ammonia.
  • n represents an integer of 0 to 8. Among them, it is preferably 0 to 4, more preferably 1 to 3, and most preferably 1.
  • * 1 and * 2 represent asymmetric carbons.
  • the (S) configuration may be independent of * 1 and * 2, respectively, or the (R) configuration may be used. Among these, * 1 and * 2 are preferably in the (R) configuration.
  • This route is a route for producing the above formula (3) by reacting the above formula (9) with ammonia, followed by rearrangement reaction to produce the above formula (2) or the above formula (2) ′. is there.
  • a method for producing the formula (3) by reacting the formula (9) with ammonia will be described.
  • R is the same as described above.
  • Ammonia used may be diluted in a solvent, or may be used without dilution.
  • the solvent to be diluted include alcohol solvent solutions such as methanol, ethanol, n-propanol, isopropanol, and n-butanol, and aqueous solutions. Among these, a methanol solution or an aqueous solution is preferable.
  • ammonia When ammonia is used after being diluted, its concentration is not particularly limited, but is preferably a 5 to 40% by weight solution, more preferably a 10 to 30% by weight solution, and even more preferably 15 to 28% by weight.
  • the equivalent of ammonia to be used is not particularly limited, but is preferably 1 to 30 equivalents, more preferably 5 to 25 equivalents, and further preferably 10 to 20 equivalents with respect to the formula (9).
  • the reaction temperature is usually in the range of ⁇ 50 to 120 ° C. Preferably it is in the range of 0 to 100 ° C, more preferably in the range of 20 to 100 ° C.
  • the reaction can be carried out under normal pressure (1 atm), but can be carried out under pressure by heating using a sealed reaction can.
  • the solvent to be used is not particularly limited, and examples thereof include aprotic polar solvents such as N, N-dimethylformamide (DMF), dimethyl sulfoxide (DMSO), N-methylpyrrolidone, hexamethylphosphoric triamide, hexamethylbenzene, Hydrocarbon solvents such as toluene, n-hexane, cyclohexane, ether solvents such as diethyl ether, tetrahydrofuran (THF), diisopropyl ether, methyl tert-butyl ether, dimethoxyethane, chlorobenzene, methylene chloride, chloroform, 1,1,1 -Halogen solvents such as trichloroethane, ester solvents such as ethyl acetate and butyl acetate, nitrile solvents such as acetonitrile and butyronitrile, methanol, ethanol, isopropanol, n
  • alcohol solvents such as ethanol, ethanol, isopropanol, n-propanol, and water are more preferable.
  • the crude product can be obtained by concentrating the reaction solution. Moreover, you may acquire a composition by performing a general post-process.
  • a general post-treatment for example, an extraction operation is performed using water and a general extraction solvent such as ethyl acetate, diethyl ether, methylene chloride, toluene, hexane and the like.
  • a general extraction solvent such as ethyl acetate, diethyl ether, methylene chloride, toluene, hexane and the like.
  • the target product thus obtained may be used as it is in the next step, but may be further purified by a general method such as crystallization purification, fractional distillation, column chromatography or the like to further increase the purity.
  • the diastereomer is not particularly limited.
  • the diastereomer is (1R, 2S) -2-hydroxycyclo Alkaneamide and / or (1S, 2R) -2-hydroxycycloalkanamide.
  • the crystallization solvent is not particularly limited, and examples thereof include hydrocarbon solvents such as hexamethylbenzene, toluene, n-hexane, and cyclohexane, diethyl ether, tetrahydrofuran (THF), diisopropyl ether, methyl tert-butyl ether, and dimethoxyethane.
  • hydrocarbon solvents such as hexamethylbenzene, toluene, n-hexane, and cyclohexane
  • diethyl ether diethyl ether
  • tetrahydrofuran (THF) tetrahydrofuran
  • diisopropyl ether methyl tert-butyl ether
  • dimethoxyethane dimethoxyethane
  • Ether solvents such as chlorobenzene, methylene chloride, chloroform, 1,1,1-trichloroethane, ester solvents such as ethyl acetate and butyl acetate, nitrile solvents such as acetonitrile and butyronitrile, methanol, ethanol, isopropanol, Examples thereof include alcohol solvents such as n-propanol, butanol and octanol, and water. These may be used alone or in combination of two or more.
  • a combination of an ester solvent and an alcohol solvent is preferable, and a combination of ethyl acetate and methanol is more preferable, and a combination of ethyl acetate and isopropanol is more preferable.
  • the amount of the solvent used for crystallization is 1 to 200 times by weight, preferably 1 to 50 times by weight with respect to the compound represented by the formula (9).
  • the temperature at the time of crystallization is in the range of ⁇ 10 ° C. to 120 ° C., preferably in the range of ⁇ 10 ° C. to 70 ° C., and most preferably in the range of ⁇ 10 ° C. to 50 ° C.
  • the crystallization method is not particularly limited, and any method may be used.
  • a method may be used in which a crystallization solvent is added to a crude product containing the compound represented by the formula (9), heated to a uniform solution, and then cooled and crystallized. After dissolving in a rich solvent, crystallization may be performed by adding a poor solvent.
  • the crude product after dissolving the crude product containing the compound represented by the formula (9) in a mixed solution of a rich solvent and a poor solvent, the crude product may be crystallized by removing the good solvent by concentration distillation or the like. Furthermore, operations such as seed crystal addition can be appropriately combined with the above-described method.
  • the content of diastereomer contained in the formula (3) obtained by crystallization is 10.0 mol% or less, preferably 5.0 mol% or less, more preferably 2.0 mol, in terms of molar ratio. % Or less, even more preferably 1.0 mol% or less, and most preferably 0.5% or less.
  • the crystals of the compound represented by the formula (3) thus obtained are subjected to solid-liquid separation by, for example, centrifugal separation, pressure filtration, reduced pressure filtration, etc., and cake washing is performed as necessary. Can be obtained as Further, dry crystals can be obtained by further drying under reduced pressure.
  • crystallization for reaction of the following process it may be used as a dry crystal
  • the base used may be an inorganic base or an organic base.
  • the inorganic base include metal hydroxides such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, lithium hydroxide, magnesium hydroxide, and barium hydroxide, and carbonates such as sodium carbonate, potassium carbonate, and sodium bicarbonate.
  • Tertiary amine include, for example, trialkylamines having 1 to 12 carbon atoms such as trimethylamine, triethylamine, ethyldiisopropylamine, N, N-dimethylaniline, N, N-diethylaniline, N, N-dimethylaminopyridine and the like.
  • Tertiary amines consisting of alkyl groups having 1 to 4 carbon atoms and aryl groups or heteroaryl groups, nitrogen-containing organic bases such as pyridine, picoline, lutidine, N, N, N, N-tetramethyl-1,2-ethylenediamine N, N, N, N, N, N, N, N, N-tetramethyl-1,3-propanediamine, N, N, N, N-tetramethyl-1,6-hexanediamine, etc. -Tetramethyl- ⁇ , ⁇ -alkyldiamine and the like.
  • lithium hydroxide, sodium hydroxide, and potassium hydroxide are preferable because they are inexpensive and easily available.
  • the amount of the base used may be 1 equivalent or more with respect to the formula (3), preferably 1 to 10 equivalents, and more preferably 1 to 5 equivalents.
  • the base used in this reaction may be used without being diluted in a solvent, or may be used after being diluted.
  • halogenating agent used in this reaction examples include sodium hypochlorite, potassium hypochlorite, sodium hypobromite, chlorine, bromine, iodine, N-chlorosuccinimide (NCS), N-bromosuccinimide ( NBS), N-iodosuccinimide (NIS), N-chloroisocyanuric acid and the like.
  • sodium hypochlorite and sodium hypobromite are preferable, and sodium hypochlorite is more preferable.
  • halogenating agents may be used as they are, or those diluted with water or an organic solvent may be used.
  • an aqueous solution is usually used.
  • the halogenating agent may be prepared in the system.
  • a methanol solution of sodium hypobromite can be prepared by reacting bromine and sodium methoxide in a methanol solvent.
  • the amount of the halogenating agent used in this reaction may be 1 equivalent or more, preferably 1 to 10 equivalents, more preferably 1 to 5 equivalents, relative to the formula (3).
  • the reaction temperature is usually in the range of ⁇ 30 to 120 ° C., preferably ⁇ 20 to 80 ° C. More preferably, it is ⁇ 10 to 60 ° C.
  • the solvent used in this step is not particularly limited, and examples thereof include aprotic polar solvents such as N, N-dimethylformamide (DMF), dimethyl sulfoxide (DMSO), N-methylpyrrolidone, hexamethylphosphoric triamide, hexa Hydrocarbon solvents such as methylbenzene, toluene, n-hexane, cyclohexane, ether solvents such as diethyl ether, tetrahydrofuran (THF), diisopropyl ether, methyl tert-butyl ether, dimethoxyethane, chlorobenzene, methylene chloride, chloroform, 1, Halogen solvents such as 1,1-trichloroethane, ester solvents such as ethyl acetate and butyl acetate, nitrile solvents such as acetonitrile and butyronitrile, methanol, ethanol, isopropanol, n-
  • ether solvents such as benzyl alcohols, and water are preferable, and tetrahydrofuran (THF), methanol, ethanol, isopropanol, n-propanol, and water are more preferable.
  • THF tetrahydrofuran
  • a general post-treatment may be performed.
  • the extraction operation is performed using a general extraction solvent such as ethyl acetate, diethyl ether, methylene chloride, toluene, hexane and the like.
  • a general extraction solvent such as ethyl acetate, diethyl ether, methylene chloride, toluene, hexane and the like.
  • the reaction solvent and the extraction solvent are distilled off from the obtained extract by an operation such as heating under reduced pressure, the target compound is obtained.
  • the reaction solvent may be distilled off or replaced by an operation such as heating under reduced pressure, and then the same operation as described above may be performed.
  • R 4 represents a substituted or unsubstituted alkyloxycarbonyl group having 1 to 15 carbon atoms, a substituted or unsubstituted aralkyloxycarbonyl group having 7 to 12 carbon atoms, or a substituted group having 2 to 12 carbon atoms.
  • an unsubstituted acyl group is represented.
  • the substituent include the same as those described for R.
  • the substituted or unsubstituted alkyloxycarbonyl group having 1 to 15 carbon atoms include t-butyloxycarbonyl group (Boc group), methoxycarbonyl group (Moc group), 9-fluorenylmethoxycarbonyl group (Fmoc group).
  • Examples of the substituted or unsubstituted aralkyloxycarbonyl group having 7 to 12 carbon atoms include benzyloxycarbonyl group (Cbz group), p-methoxybenzyloxycarbonyl group and the like.
  • Examples of the substituted or unsubstituted acyl group having 2 to 12 carbon atoms include an acetyl group and a benzoyl group.
  • t-butyloxycarbonyl group (Boc group) methoxycarbonyl group (Moc group), 9-fluorenylmethoxycarbonyl group (Fmoc group), benzyloxycarbonyl group (Cbz group), and acetyl group are preferable. More preferred are t-butyloxycarbonyl group (Boc group) and benzyloxycarbonyl group (Cbz group).
  • * 1 and * 2 represent asymmetric carbons.
  • the (S) configuration may be independent of * 1 and * 2, respectively, or the (R) configuration may be used. Among these, * 1 and * 2 are preferably in the (R) configuration.
  • the method of deriving from the formula (2) ′ to the formula (6) may be performed under general protection conditions.
  • Theodora W. Greene, Peter G. M.M. It can be carried out according to the deprotection method described in Wuts Protective Groups in Organic Chemistry (3rd edition) published by JOHN WILEY & SONS, INC.
  • t-butyloxycarbonyl can be protected by reacting t-butyl dicarbonate in the presence of a base in an appropriate solvent, and benzyloxycarbonyl in the presence of a base in an appropriate solvent.
  • benzyloxycarbonyl (Cbz) protection can be performed.
  • the formula (2) ′ isolated by the method described above may be used to derive the formula (6), or the reaction solution containing the formula (2) ′ may be used as it is without performing an isolation operation.
  • general formula (7) It may be induced to a hydrazide represented by
  • a general Curtius rearrangement reaction condition may be used.
  • it can be carried out according to the method described in Strategic Applications of Named Reaction in Organic Synthesis Elsevier Inc. Publishing.
  • the formula (1) can be obtained by general hydrolysis using an acid or base of 2-hydroxycycloalkanecarboxylic acid ester produced by the above production method.
  • 2-hydroxycyclopentanecarboxylic acid methyl ester produced by a reduction reaction using an enzyme can be produced by allowing sodium hydroxide to act in a water-methanol mixed solvent.
  • the above formula (2) ′ can be produced.
  • the said Formula (2) can be manufactured by performing in the said alcohol (5) presence.
  • N- (benzyloxycarbonyl) -2-hydroxycyclopentanol can be produced by reacting 2-hydroxycyclopentanecarboxylic acid (1) with diphenylphosphoric acid azide in the presence of benzyl alcohol.
  • R is the same as described above.
  • R ′ is the same as described above.
  • n represents an integer of 0 to 8. Among these, 0 to 3 is preferable, 1 to 3 is more preferable, and 1 is most preferable.
  • * 1 and * 2 represent asymmetric carbons.
  • the (S) configuration may be independent of * 1 and * 2, respectively, or the (R) configuration may be used. Among these, * 1 and * 2 are preferably in the (R) configuration.
  • the said Formula (4) is used for reaction, without isolating.
  • the production method of the formula (4) is not particularly limited, and, in addition to the above-described commonly used conditions for the Curtius rearrangement, by reacting the formula (9) with hydrazine, the general formula (7);
  • the hydrazide represented by the formula (1) may be produced and subsequently produced by reacting nitrite.
  • n, * 1, * 2 is the same as the above.
  • Example 1 Production of E. coli HB101 (pUCAR2) that produces a polypeptide (ARII) derived from Sporobolomyces salmonicolor
  • plasmid pUCAR2 Plasmid in which the structural gene of polypeptide ARII was introduced into vector plasmid pUC118
  • Escherichia coli E. coli HB101 pUCAR2
  • E. coli HB101 (pUC118) comparative containing E.
  • coli HB101 (pUCAR2) and vector plasmid pUC118 was mixed with 2 x YT medium (200% tryptone, 1.6% tryptone, yeast extract 1). 0.0%, NaCl 0.5%, pH 7.0) was inoculated into 5 ml, and cultured with shaking at 37 ° C. for 20 hours.
  • the microbial cell was collected by centrifugation and suspended in 5 ml of 100 mM phosphate buffer (pH 6.5). This was crushed using a UH-50 type ultrasonic homogenizer (manufactured by SMT Co., Ltd.), and the cell residue was removed by centrifugation to obtain a cell-free extract. The cell-free extracts were measured for 2-oxocyclopentanecarboxylic acid ester reducing activity.
  • the reduction activity for 2-oxocyclopentanecarboxylic acid ester is 30 mM by adding 5 mM methyl 2-oxocyclopentanecarboxylate, 0.25 mM coenzyme NADPH, and crude enzyme solution to 100 mM phosphate buffer (pH 6.5). The reaction was carried out at 1 ° C. for 1 minute, and it was calculated from the rate of decrease in absorbance at a wavelength of 340 nm. Under these reaction conditions, the enzyme activity that oxidizes 1 ⁇ mol of NADPH to NADP + per minute was defined as 1 U.
  • E. coli HB101 (pUC118) (comparative example) has a 2-oxocyclopentanecarboxylic acid ester reduction activity of 0.1 U / mg or less
  • E. coli HB101 (pUCAR2) in which ARII was expressed was used.
  • the reduction activity of 2-oxocyclopentanecarboxylic acid ester was 3.3 U / mg.
  • polypeptide ARII had a reducing activity against the target 2-oxocyclopentanecarboxylic acid ester.
  • Example 2 Production of ethyl (1R, 2R) -2-hydroxycyclopentanecarboxylate using E. coli HB101 (pUCAR2) After culturing E. coli HB101 (pUCAR2) in the same manner as in Example 1, cell disruption with an ultrasonic homogenizer was performed to obtain 180 ml of a cell-free extract. To 180 ml of this cell-free extract, glucose dehydrogenase (trade name: GLUCDH “Amano” II, manufactured by Amano Enzyme) 2250 U, glucose 12.5 g, NADP + 22 mg, ethyl 2-oxocyclopentanecarboxylate 3.
  • glucose dehydrogenase trade name: GLUCDH “Amano” II, manufactured by Amano Enzyme
  • the product was extracted from the reaction solution with toluene, and the solvent was distilled off to obtain 8.35 g of ethyl 2-hydroxycyclopentanecarboxylate.
  • the obtained ethyl 2-hydroxycyclopentanecarboxylate was derivatized by the action of dinitrobenzoyl chloride under basic conditions and analyzed under the conditions of high performance liquid chromatography under the following conditions to analyze the optical purity. As a result, the optical purity of the (1R, 2R) isomer was 99.3% e.e. e. Met.
  • Example 3 Production of methyl (1R, 2R) -2-hydroxycyclopentanecarboxylate using E. coli HB101 (pUCAR2) After culturing E. coli HB101 (pUCAR2) in the same manner as in Example 1, cell disruption with an ultrasonic homogenizer was performed to obtain 1200 ml of a cell-free extract.
  • glucose dehydrogenase (trade name: GLUCDH “Amano” II, manufactured by Amano Enzyme Co., Ltd.), 164 g of glucose, NADP + 115 mg, and 25 g of methyl 2-oxocyclopentanecarboxylate were added, It stirred at 30 degreeC, adjusting pH6.5 by dripping 5N sodium hydroxide aqueous solution. At 1.5, 3, and 6 hours after the start of the reaction, 25 g each was added, and 12.5 g of methyl 2-oxocyclopentanecarboxylate was added at 9.5 hours, and the reaction was stirred for 27 hours. I let you.
  • the product was extracted from the reaction solution with toluene, and the solvent was distilled off to obtain 95.8 g of methyl 2-hydroxycyclopentanecarboxylate.
  • the obtained methyl 2-hydroxycyclopentanecarboxylate was derivatized with the action of dinitrobenzoyl chloride under basic conditions, and analyzed under high performance liquid chromatography under the following conditions to analyze optical purity. As a result, the optical purity of the (1R, 2R) isomer was 98.8% e.e. e. Met.
  • Example 4 Production of ethyl (1S, 2S) -2-hydroxycyclopentanecarboxylate using a polypeptide derived from Candida magnolia 2 ml of 100 mM phosphate buffer (pH 6.5), 46 mg of glucose and candy CR enzyme prepared from Candida magnoliae NBRC0705 (see International Publication WO01 / 040450 pamphlet, Example 1) 100 U, glucose dehydrogenase (trade name: GLUCDH “Amano” II, manufactured by Amano Enzyme Co., Ltd.) 25 U, NADP + 1 mg and ethyl 2-oxocyclopentanecarboxylate 20 mg were added, and the mixture was stirred at 30 ° C.
  • glucose dehydrogenase trade name: GLUCDH “Amano” II, manufactured by Amano Enzyme Co., Ltd.
  • Example 5 Production of ethyl (1S, 2S) -2-hydroxycyclopentanecarboxylate using a polypeptide derived from Rhodola glutinis bar derlenensis Instead of CR enzyme, Rhodotorula glutinis bar derlenensis (Rhodotorula The reaction was carried out in the same manner as in Example 4 using 100 U of reductase RRG (see International Publication WO03 / 093477 pamphlet, Example 1) prepared from NBRC0415. The conversion rate to ethyl 2-hydroxycyclopentanecarboxylate was 99%, and the trans isomer ratio was 97.9%. The optical purity is (1S, 2S) and 100% e.e. e. Therefore, the proportion of the (1S, 2S) isomer in the four stereoisomers of ethyl 2-hydroxycyclopentanecarboxylate was 97.9%.
  • Example 6 Production of ethyl (1S, 2S) -2-hydroxycyclopentanecarboxylate using polypeptide derived from Ogataea Minuta bar Minuta Instead of CR enzyme, Ogataea Minuta bar Minuta minuta var. minuta
  • the reaction was carried out in the same manner as in Example 4 using 100 U of reductase prepared from NBRC0975 (see International Publication WO06 / 013801 pamphlet, Example 1).
  • the conversion rate to ethyl 2-hydroxycyclopentanecarboxylate was 98%, and the trans isomer ratio was 70.0%.
  • the optical purity is (1S, 2S) and 100% e.e. e. Therefore, the proportion of (1S, 2S) isomer in the four stereoisomers of ethyl 2-hydroxycyclopentanecarboxylate was 70.0%.
  • Example 7 Production of ethyl (1S, 2S) -2-hydroxycyclopentanecarboxylate using a polypeptide derived from Candida boidini Alcohol dehydration derived from Candida boidinii instead of CR enzyme
  • the reaction was carried out in the same manner as in Example 4 using 20 mg of the enzyme enzyme CP (manufactured by Julich Fine chemicals).
  • the conversion rate to ethyl 2-hydroxycyclopentanecarboxylate was 60%, and the trans isomer ratio was 75.0%.
  • the optical purity is (1S, 2S) and 100% e.e. e. Therefore, the proportion of the (1S, 2S) isomer in the four stereoisomers of ethyl 2-hydroxycyclopentanecarboxylate was 75.0%.
  • Example 8 Production of ethyl (1S, 2S) -2-hydroxycyclopentanecarboxylate using a polypeptide derived from Thermoanaerobium brocci Instead of CR enzyme, Thermoanaerobium brockii
  • the reaction was carried out in the same manner as in Example 4 using 50 mg of the alcohol dehydrogenase derived from Sigma (Aldrich Japan Co., Ltd.).
  • the conversion rate to ethyl 2-hydroxycyclopentanecarboxylate was 100%, and the trans isomer ratio was 80.4%.
  • the optical purity is (1S, 2S) and 100% e.e. e. Therefore, the proportion of the (1S, 2S) isomer in the four stereoisomers of ethyl 2-hydroxycyclopentanecarboxylate was 80.4%.
  • Example 9 Production of ethyl (1S, 2R) -2-hydroxycyclopentanecarboxylate using a polypeptide derived from Candida maris Prepared from Candida maris NBRC10003 instead of CR enzyme The reaction was carried out in the same manner as in Example 4 using 100 U of reductase FPDH (see International Publication WO01 / 05996 pamphlet, Example 14). The conversion rate to ethyl 2-hydroxycyclopentanecarboxylate was 95%, and the cis-isomer ratio was 97.4%. The cis isomer ratio (%) was calculated by the following formula.
  • Example 10 Production of ethyl (1S, 2R) -2-hydroxycyclopentanecarboxylate using a polypeptide derived from Devosia riboflavina Reductase prepared from Devosia riboflavina NBRC13584 instead of CR enzyme
  • the reaction was carried out in the same manner as in Example 4 using 100 U of RDR (see International Publication WO 04/027055 pamphlet, Example 1).
  • the conversion to ethyl 2-hydroxycyclopentanecarboxylate was 96%, and the cis-isomer ratio was 95.7%.
  • the optical purity is 99.5% e.e. (1S, 2R) isomer. e. Therefore, the proportion of the (1S, 2R) isomer in the four stereoisomers of ethyl 2-hydroxycyclopentanecarboxylate was 95.5%.
  • Example 11 Production of ethyl (1S, 2R) -2-hydroxycyclopentanecarboxylate using a polypeptide derived from Brevundimonas diminuta Instead of CR enzyme, from Brevundimonas diminuta NBRC13584
  • the reaction was carried out in the same manner as in Example 4 using 100 U of the prepared reductase (International Publication WO07 / 114217 Pamphlet, see Example 4).
  • the conversion rate to ethyl 2-hydroxycyclopentanecarboxylate was 80%, and the cis-isomer ratio was 93.4%.
  • the optical purity is (1S, 2R) isomer, 98.6% e.e. e. Therefore, the proportion of the (1S, 2R) isomer in the four stereoisomers of ethyl 2-hydroxycyclopentanecarboxylate was 92.7%.
  • Example 12 Production of ethyl (1S, 2R) -2-hydroxycyclopentanecarboxylate using a polypeptide derived from Lactobacillus brevis Alcohol dehydrogenase derived from Lactobacillus brevis instead of CR enzyme The reaction was carried out in the same manner as in Example 4 using 100 ⁇ l (manufactured by Julich Fine chemicals). The conversion rate to ethyl 2-hydroxycyclopentanecarboxylate was 98%, and the cis-isomer ratio was 98.7%. The optical purity is 99.5% e.e. (1S, 2R) isomer. e. Therefore, the proportion of the (1S, 2R) isomer in the four stereoisomers of ethyl 2-hydroxycyclopentanecarboxylate was 98.5%.
  • Example 13 Production of ethyl (1S, 2R) -2-hydroxycyclopentanecarboxylate using a polypeptide derived from Lactobacillus kefir Alcohol dehydrogenase derived from Lactobacillus kefir instead of CR enzyme The reaction was carried out in the same manner as in Example 4 using 50 mg (Fluka). The conversion rate to ethyl 2-hydroxycyclopentanecarboxylate was 98%, and the cis-isomer ratio was 97.7%. The optical purity is 98.5% e.e. in (1S, 2R) isomer. e. Therefore, the proportion of the (1S, 2R) isomer in the four stereoisomers of ethyl 2-hydroxycyclopentanecarboxylate was 97.0%.
  • Example 14 Production of ethyl (1R, 2S) -2-hydroxycyclopentanecarboxylate using polypeptide derived from Candida maltosa Prepared from Candida maltosa NBRC1977 instead of CR enzyme The reaction was carried out in the same manner as in Example 4 using 100 U of reductase (see International Publication WO08 / 0666018, Example 1). The conversion rate to ethyl 2-hydroxycyclopentanecarboxylate was 40%, and the cis-isomer ratio was 98.2%. The optical purity was 99.0% e.e. in (1R, 2S) form. e. Therefore, the proportion of the (1R, 2S) isomer in the four stereoisomers of ethyl 2-hydroxycyclopentanecarboxylate was 97.7%.
  • Example 15 Production of ethyl (1R, 2S) -2-hydroxycyclopentanecarboxylate using a polypeptide derived from Candida parapsilosis Prepared from Candida parapsilosis NBRC708 instead of CR enzyme The reaction was carried out in the same manner as in Example 4 using 100 U of reductase (see JP 2003-289874 pamphlet, Example 1). The conversion rate to ethyl 2-hydroxycyclopentanecarboxylate was 40%, and the cis-isomer ratio was 98.2%. The optical purity was 99.0% e.e. in (1R, 2S) form. e. Therefore, the proportion of the (1R, 2S) isomer in the four stereoisomers of ethyl 2-hydroxycyclopentanecarboxylate was 97.7%.
  • Example 16 Production of ethyl (1R, 2S) -2-hydroxycyclopentanecarboxylate using polypeptide derived from Rhodococcus erythropolis Alcohol dehydration derived from Rhodococcus erythropolis instead of CR enzyme The reaction was carried out in the same manner as in Example 4 using 100 ⁇ l of elementary enzyme (manufactured by Julich Fine chemicals). The conversion rate to ethyl 2-hydroxycyclopentanecarboxylate was 40%, and the cis-isomer ratio was 99.8%. The optical purity was 97.5% e.e. (1R, 2S). e. Therefore, the proportion of the (1R, 2S) isomer in the four stereoisomers of ethyl 2-hydroxycyclopentanecarboxylate was 98.6%.
  • Example 17 Production of (1R, 2R) -2-hydroxycyclopentanecarboxylic acid amide Obtained by the method described in Example 3 (1R, 2R) -2-hydroxycyclopentanecarboxylic acid methyl ester (73.34 g) 0.52 mol) and a 20 wt% NH 3 / MeOH solution (658.20 g, 7.74 mol) were stirred in an autoclave for 48 hours at a bath temperature of 80 ° C. in a sealed state. After completion of the reaction, the autoclave was opened at room temperature, and the inner solution was concentrated using a rotary evaporator until the total amount became 110.14 g.
  • Example 18 Production of (1R, 2R) -2-aminocyclopentanol (1R, 2R) -2-hydroxycyclopentanecarboxylic acid amide (34.00 g, 0) obtained by the method described in Example 17 .26 mol) was diluted in water (170 g), and a 30 wt% aqueous sodium hydroxide solution (70.20 g, 0.53 mol) was added dropwise at a bath temperature of 0 ° C. over 35 minutes. Subsequently, at the same temperature, a 13 wt% aqueous sodium hypochlorite solution (226.10 g, 0.40 mol) was added dropwise over 2.5 hours.
  • Example 19 Production of (1R, 2R) -2- (t-butyloxycarbonylamino) cyclopentanol (1R, 2R) -2-Aminocyclopentanol obtained by the method described in Example 18 A 30 wt% aqueous sodium hydroxide solution was added to the aqueous solution (net amount: 27.61 g, 0.21 mol) to adjust the pH in the system to 10.4. Under a bath temperature of 20 ° C., t-butyl dicarbonate (68.94 g, 0.32 mol) was added. During the reaction, since the pH in the system was lowered, 30 wt% NaOH was appropriately added to adjust the pH to 10 ⁇ 0.5.
  • Example 20 Production of (1R, 2R) -2-aminocyclopentanol hydrochloride (1R, 2R) -2- (t-butyloxycarbonylamino) cyclopent obtained by the method described in Example 19 A 29.5 wt% hydrogen chloride / isopropanol solution (118.52 g, 0.96 mol) is added for 1.5 hours to a toluene solution of ethanol (net amount: 38.60 g, 0.19 mol) at a bath temperature of 50 ° C. It was dripped over.
  • Example 21 Production of (1R, 2R) -2-hydroxycyclopentanecarboxylic acid amide
  • (1R, 2R) -2-hydroxycyclopentanecarboxylic acid amide (62.02 g) obtained by the method described in Example 17 0.46 mol) was added ethyl acetate (223 g) and isopropanol (25 g), and the mixture was stirred for 18 hours under reflux conditions with a bath temperature of 80 ° C. Thereafter, the bath was cooled to 25 ° C. and stirred for 3 hours, and the precipitated solid was collected by filtration to obtain the title compound (yield 58.11 g, yield 94%).

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Abstract

本発明の課題は、医薬品の中間体として有用な光学活性２－ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステルの効率的かつ工業的な製造方法を提供することである。本発明は、２－オキソシクロアルカンカルボン酸エステルにポリペプチド、該ポリペプチドを産生する生物体、又は該生物体の処理物を作用させて還元することにより、光学活性２－ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステルを製造する方法に関する。

Description

光学活性２－ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステルの製造方法
本発明は、光学活性２－ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステル、特に光学活性２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エステルの製造方法に関する。
光学活性２－ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステル、特に光学活性２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エステルは、医薬品、農薬等の合成原料及び中間体として有用な化合物である。
２－オキソシクロアルカンカルボン酸エステルを水素化ホウ素ナトリウムなどで２位のカルボニル基を還元すると、２つの不斉炭素が生じるため、４種類の立体異性体（シス（ｃｉｓ）体の（１Ｒ，２Ｓ）体と（１Ｓ，２Ｒ）体、トランス（ｔｒａｎｓ）体の（１Ｓ，２Ｓ）体と（１Ｒ，２Ｒ）体）の混合した２－ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステルが生成する。このうち、医薬品や農薬等の合成原料として有用なのは、特定の立体の光学活性２－ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステルであり、他の立体異性体を含有しているとそれは不純物となる。そのため、不要な立体異性体をできるだけ含まない、目的にあった立体の光学活性２－ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステルの効率的な製造技術が求められている。
光学活性２－ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステルの製造方法の一つに、微生物菌体や酵素を触媒とした２－オキソシクロアルカンカルボン酸エステルの不斉還元法が挙げられる。光学活性２－ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステル、例えば、２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エステルの製造方法については、以下が報告されている。
クレブジラ・ニウモニエ（Klebsiella　pneumoniae）（特許文献１、非特許文献１）、ゲオトリカム・キャンディダム（Geotrichum　candidum）、ムコール・ラセモサス（Mucor　racemosus）、ムコール・サーシネロイデス（Mucor　circinelloides）、クニングガメラ・グロエオスポロイデス（Cunninghamella　gloeosporoides）（非特許文献２）、還元酵素ＫＲＥＤ１０２、ＫＲＥＤ１０３、ＫＲＥＤ１０６（非特許文献３）を用いた２－オキソシクロペンタンカルボン酸エステルの不斉還元では、主として（１Ｒ，２Ｓ）体の２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エステルが生成すると報告されている。
また、還元酵素ＫＲＥＤ１０７、ＫＲＥＤ１３１（非特許文献３）を用いた２－オキソシクロペンタンカルボン酸エステルの不斉還元では、主として（１Ｓ，２Ｒ）体の２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エステルが生成すると報告されている。
また、アブシディア・グラウカ（Absidia　glauca）、リゾプス・アーリズス（Rhizopus　arrhizus）、ペニシリウム・クリソゲナム（Penicillium　chrysogenum）（非特許文献２）、還元酵素ＫＲＥＤ１１３（非特許文献３）を用いた２－オキソシクロペンタンカルボン酸エステルの不斉還元では、主として（１Ｓ，２Ｓ）体の２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エステルが生成すると報告されている。
以上のように、微生物や酵素を用いた２－オキソシクロペンタンカルボン酸エステルの不斉還元例はあるものの、特定の微生物や酵素を用いた還元反応に限られており、特に、還元反応での主生成物が（１Ｒ，２Ｒ）体の２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エステルとする報告はこれまでに全く存在しない。
特平５－１９２１８７
Biosci.　Biotech.　Biochem.,　60(5),　760-764,(1996) Tetrahedron　Letters,　27(23),　2631-2634,(1986) Tetrahedron,　62,　901-905,(2006)
本発明の課題は、医薬品の中間体として有用な光学活性２－ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステル、特に光学活性２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エステルを効率的かつ工業的に製造することにある。
本発明者らは、光学活性２－ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステルの簡便かつ効率的な製造方法を開発すべく検討を重ねた結果、特定のポリペプチドを２－オキソシクロペンタンカルボン酸エステルに作用させて不斉還元することにより、２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エステルの特定の立体異性体を効率的に製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の１又は複数の特徴を有する。
［１］一般式（９）；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 （式中、Ｒは炭素数１～６の置換もしくは無置換のアルキル基、炭素数６～１０の置換もしくは無置換のアリール基、炭素数７～１１の置換もしくは無置換のアラルキル基を表す。ｎは０～８の整数を表す。＊１、＊２は不斉炭素を表す。）で表される光学活性２－ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステルの製造方法であって、一般式（８）；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 （式中、Ｒ，ｎは前記に同じ。）で表される２－オキソシクロアルカンカルボン酸エステルに、ポリペプチド、該ポリペプチドを産生する生物体、又は、該生物体の処理物を作用させて、２－オキソシクロアルカンカルボン酸エステルを還元することを特徴とする製造方法。
［２］ｎが１である［１］に記載の製造方法。
［３］Ｒが炭素数１～６の置換もしくは無置換のアルキル基である、［１］又は［２］に記載の製造方法。
［４］Ｒがメチル基もしくはエチル基である、［１］～［３］のいずれかに記載の製造方法。
［５］ポリペプチドが、キャンディダ（Candida）属、ロードトルーラ（Rhodotorula）属、デボシア（Devosia）属、オガタエア（Ogataea）属、ブレブンディモナス（Brevundimonas）属、ラクトバシラス（Lactobacillus）属、サーモアナエロビウム（Themoanaerobium）属、ロドコッカス（Rhodococcus）属、スポロボロマイセス（Sporobolomyces）属、スポリディオボラス（Sporidiobolus）属からなる群より選ばれた微生物由来のものである、［１］～［４］のいずれかに記載の製造方法。
［６］前記式（９）で表される光学活性２－ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステルが、（１Ｒ，２Ｒ）－２－ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステルである、［１］～［４］のいずれかに記載の製造方法。
［７］ポリペプチドが、スポロボロマイセス（Sporobolomyces）属、スポリディオボラス（Sporidiobolus）属からなる群より選ばれた微生物由来のものである、［６］に記載の製造方法。
［８］ポリペプチドが下記（ａ１）、（ａ２）、及び（ａ３）；
（ａ１）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ａ２）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつ前記式（８）とＮＡＤＰＨに作用して前記式（９）とＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチド、
（ａ３）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有し、かつ前記式（８）とＮＡＤＰＨに作用して前記式（９）とＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチド、
からなる群から選択されるポリペプチドである、［６］又は［７］に記載の製造方法。　
［９］ポリペプチドが、下記（Ａ１）、（Ａ２）、（Ａ３）、及び（Ａ４）；
（Ａ１）配列表の配列番号２に記載のＤＮＡ、
（Ａ２）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（Ａ３）配列表の配列番号２に記載のＤＮＡと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ前記式（８）とＮＡＤＰＨに作用して前記式（９）とＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（Ａ４）、配列表の配列番号２に記載の塩基配列と８５％以上の配列同一性を有し、かつ２－オキソシクロペンタンカルボン酸エステルとＮＡＤＰＨに作用して（１Ｒ，２Ｒ）－２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エステルとＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
からなる群から選択されるＤＮＡによりコードされるポリペプチドである、［６］～［８］のいずれかに記載の製造方法。
［１０］前記式（９）において、＊１が（Ｓ），＊２が（Ｓ）の絶対立体配置であり、かつポリペプチドがキャンディダ（Candida）属、ロードトルーラ（Rhodotorula）属、オガタエア（Ogataea）属、サーモアナエロビウム（Themoanaerobium）属からなる群から選ばれた微生物由来のものである、［１］～［４］のいずれかに記載の製造方法。
［１１］前記式（９）において、＊１が（Ｓ），＊２が（Ｒ）の絶対立体配置であり、かつポリペプチドがキャンディダ（Candida）属、デボシア（Devosia）属、ブレブンディモナス（Brevundimonas）属、ラクトバシラス（Lactobacillus）属からなる群から選ばれた微生物由来のものである、［１］～［４］のいずれかに記載の製造方法。
［１２］前記式（９）において、＊１が（Ｒ）、＊２が（Ｓ）の絶対立体配置であり、かつポリペプチドがキャンディダ（Candida）属、ロドコッカス（Rhodococcus）属からなる群から選ばれた微生物由来のものである、［１］～［４］のいずれかに記載の製造方法。
［１３］ポリペプチドを産生する生物体が、大腸菌を宿主とする遺伝子組換え生物である、［１］～［１２］のいずれかに記載の製造方法。
［１４］還元型補酵素再生能を有するポリペプチドを更に作用させる［１］～［１３］のいずれかに記載の製造方法。
［１５］形質転換体が、還元型補酵素再生能を有するポリペプチドの生産能を付与されている、［１３］又は［１４］に記載の製造方法。
［１６］還元型補酵素再生能を有するポリペプチドがグルコース脱水素酵素である［１４］又は［１５］に記載の製造方法。
［１７］［１］～［１６］のいずれかに記載の方法にて製造した一般式（９）；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 （式中、Ｒは炭素数１～６の置換もしくは無置換のアルキル基、炭素数６～１０の置換もしくは無置換のアリール基、炭素数７～１１の置換もしくは無置換のアラルキル基を表す。ｎは０～８の整数を表す。＊１、＊２は不斉炭素を表す。）で表される２－ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステルを、アンモニアと反応させ、一般式（３）；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
 （式中、＊１、＊２は前記に同じ。）で表される２－ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸アミド体を得ることを特徴とする製造方法。
［１８］前記式（３）で表される２－ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸アミドを、晶析精製することを特徴とする［１７］記載の製造方法。
［１９］前記式（３）中に存在するジアステレオマー含量が、モル比で５．０モル％以下である［１８］に記載の製造方法。
［２０］前記式（３）中に存在するジアステレオマー含量が、モル比で２．０モル％以下である［１８］又は［１９］に記載の製造方法。
［２１］［１７］～［２０］のいずれかに記載の方法にて製造した一般式（３）；
（式中、＊１、＊２は前記に同じ。）で表される２－ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸アミドを塩基存在下、ハロゲン化剤と反応させ、一般式（２）；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
 （式中、Ｒ’は炭素数１～６の置換もしくは無置換のアルキル基、炭素数６～１０の置換もしくは無置換のアリール基、炭素数７～１１の置換もしくは無置換のアラルキル基を表す。＊１、＊２は前記に同じ。）で表される２－アミノシクロアルカノール誘導体、もしくは一般式（２）’；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
 （式中、＊１、＊２は前記に同じ。）で表される２－アミノシクロアルカノールを得ることを特徴とする製造方法。
［２２］＊１、＊２がともに（Ｒ）の立体配置である［１７］～［２１］のいずれかに記載の製造方法。
本発明の方法によれば、光学活性２－ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステル、特に光学活性２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エステルを効率的かつ工業的に製造することができる。
光学活性２－ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステル（９）より、光学活性２－アミノシクロアルカノール誘導体（２）、もしくは光学活性－２－アミノシクロアルカノール（２）’を製造するための、Ｈｏｆｍａｎｎ転位ルート、及びＣｕｒｔｉｕｓ転位ルートの模式図である。
以下、本発明について実施形態を用いて詳細に説明する。なお、本発明はこれらにより限定されるものではない。
本発明は、一般式（９）；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
 で表される光学活性２－ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステルの製造方法であって、一般式（８）；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
 で表される２－オキソシクロアルカンカルボン酸エステルに、ポリペプチド、該ポリペプチドを産生する生物体、又は、該生物体の処理物を作用させて、２－オキソシクロアルカンカルボン酸エステルを還元することを特徴とする。一般に、立体選択的な反応の特異性は不斉炭素の数により大きく相違するが、本発明の方法であれば、不斉炭素を２つ有する、前記式（８）で表される光学活性２－ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステルを製造することが可能である。
前記式（８）、（９）中、ｎは０～８の整数を表す。中でも好ましくは０～４であり、さらに好ましくは１～３であり、最も好ましくは１である。ｎ＝１の場合、２－オキソシクロアルカンカルボン酸エステルは、２－オキソシクロペンタンカルボン酸エステルであり、生成物である光学活性２－ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステルは２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エステルである。
前記式（８）、（９）中、Ｒは炭素数１～６の置換もしくは無置換のアルキル基、炭素数６～１０の置換もしくは無置換のアリール基、炭素数７～１１の置換もしくは無置換のアラルキル基を表す。炭素数１～６の置換もしくは無置換のアルキルとしては例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基等が挙げられる。炭素数６～１０の置換もしくは無置換のアリール基としては例えば、フェニル基、ｐ－メチルフェニル基、ｏ－メチルフェニル基、ｍ－メチルベンジル基、ｐ－クロロフェニル基、ｐ－ニトロフェニル基、ｐ－トリフルオロメチルフェニル基、１－ナフチル基、２－ナフチル基等が挙げられる。炭素数７～１１のアラルキル基としては例えば、ベンジル基、ｐ－メチルベンジル基、ｏ－メチルベンジル基、ｍ－メチルベンジル基、ｐ－ニトロベンジル基、ｐ－トリフルオロメチルベンジル基等が挙げられる。中でも好ましくは炭素数１～６の置換もしくは無置換のアルキル基であり、さらに好ましくはメチル基、エチル基である。
前記式（９）中、＊１、＊２は不斉炭素を表す。＊１、＊２にそれぞれ独立して（Ｓ）の立体配置であっても良いし、（Ｒ）の立体配置であっても良い。中でも好ましくは＊１、＊２ともに（Ｒ）の立体配置である。
なお、本発明で製造する光学活性２－ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステル（９）とは、２－ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステルの４種類の立体異性体（シス（ｃｉｓ）体の（１Ｒ，２Ｓ）体と（１Ｓ，２Ｒ）体、トランス（ｔｒａｎｓ）体の（１Ｓ，２Ｓ）体と（１Ｒ，２Ｒ）体の４種類）に占める目的の立体異性体の比率が５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは８５％以上、最も好ましくは９０％以上の２－ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステルである。
前記式（９）に占める（１Ｒ，２Ｒ）体及び（１Ｓ，２Ｓ）の比率は、例えば、以下のように決定できる。
分析したい前記式（９）が、例えば、２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルの場合、下記のガスクロマトグラフィー条件で分析することにより、トランス体比（４つの立体異性体に占めるトランス体（（１Ｓ，２Ｓ）体と（１Ｒ，２Ｒ）体）の割合）を下記式により決定することができる。
［トランス体比（％）］＝［トランス体のエリア］／（［トランス体のエリア］+［シス体のエリア］）×１００
［ガスクロマトグラフィーによる分析条件］
カラム：ＵＬＢＯＮ　ＨＲ－２０Ｍ（０．２５ｍｍ（内径）×２５ｍ；信和化工株式会社製）、検出：ＦＩＤ、カラム温度：１３０℃、注入温度：２００℃、検出温度：２００℃、キャリアーガス：ヘリウム（１３０ｋＰａ）、溶出時間：２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチル（トランス体）約１５．７分、２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチル（シス体）約８．１分、２－オキソシクロペンタンカルボン酸エチル　約８．８分。
また、トランス体に占める（１Ｒ，２Ｒ）体もしくは（１Ｓ，２Ｓ）体の割合は、２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルを塩基条件下にてジニトロベンゾイルクロライドを作用させて誘導体化し、下記条件の高速液体クロマトグラフィーの条件で分析することにより容易に算出できる。
［高速液体クロマトグラフィーによる分析条件］
カラム：Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ　ＡＤ－Ｈ（４．６μｍ（内径）×２５０ｍｍ；ダイセル化学工業株式会社製）、カラム温度：３０℃、検出波長：２４５ｎｍ、移動相：ｎ－ヘキサン／エタノール＝７０／３０、保持時間：（１Ｒ，２Ｓ）－２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチル　約７．２分、（１Ｓ，２Ｒ）－２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチル　約９．２分、（１Ｓ，２Ｓ）-２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチル　約１５．３分、（１Ｒ，２Ｒ）－２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチル　約１７．０分。
上記の２つの分析結果より、２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エステルに占める（１Ｒ，２Ｒ）体もしくは（１Ｓ，２Ｓ）体の比率が容易に算出可能である。
生成した前記式（９）に占める（１Ｓ，２Ｒ）体及び（１Ｒ，２Ｓ）の比率は、以下のように決定できる。
分析したい前記式（９）が、例えば、２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルの場合、上記のガスクロマトグラフィー条件で分析することにより、シス体比（４つの立体異性体に占めるトランス体（（１Ｓ，２Ｒ）体と（１Ｒ，２Ｓ）体）の割合）を下記式により決定することができる。
［シス体比（％）］＝［シス体のエリア］／（［トランス体のエリア］+［シス体のエリア］）×１００
また、シス体に占める（１Ｓ，２Ｒ）体もしくは（１Ｓ，２Ｒ）体の割合は、例えば、前記式（９）が２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルの場合、塩基条件下にてジニトロベンゾイルクロライドを作用させて誘導体化し、上記条件の高速液体クロマトグラフィーの条件で分析することにより容易に算出できる。
上記の２つの分析結果より、前記式（９）に占める（１Ｓ，２Ｒ）体もしくは（１Ｓ，２Ｒ）体の比率が容易に算出可能である。
本発明の製造方法で用いるポリペプチドは、２－オキソシクロアルカンカルボン酸エステルに作用して光学活性２－ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステルを生成する活性を有するものであれば、いずれを用いても良い。
本発明の製造方法は、ポリペプチドだけではなく、該ポリペプチドを産生する生物体、又は、該生物体の処理物を作用させて行うことも可能である。生物体は、天然に存在する生物でもよく、遺伝子組換え生物でもよい。生物体の処理物とは、例えば、菌体破砕物、粗抽出液、培養菌体、凍結乾燥生物体、アセトン乾燥生物体、あるいはそれらの磨砕物、これらの混合物であり、該ポリペプチドの触媒活性が残存している物を意味する。
ポリペプチドの起源は限定されるものではないが、好ましくはキャンディダ（Candida）属、ロードトルーラ（Rhodotorula）属、デボシア（Devosia）属、オガタエア（Ogataea）属、ブレブンディモナス（Brevundimonas）属、ラクトバシラス（Lactobacillus）属、サーモアナエロビウム（Themoanaerobium）属、ロドコッカス（Rhodococcus）属、スポロボロマイセス（Sporobolomyces）属、スポリディオボラス（Sporidiobolus）属からなる群より選ばれた微生物由来のものである。
以下に、（１Ｒ，２Ｒ）－２－ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステルを製造するポリペプチドについて記載する。（１Ｒ，２Ｒ）－２－ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステルを製造する場合は、用いるポリペプチドとしてはスポロボロマイセス（Sporobolomyces）属、スポリディオボラス（Sporidiobolus）属からなる群より選ばれた微生物由来のものが好ましい。
スポロボロマイセス（Sporobolomyces）属酵母としては、例えば、スポロボロマイセス・アルビダス（Sporobolomyces　albidus）、スポロボロマイセス・アルボルベスセンス（Sporobolomyces　alborubescens）、スポロボロマイセス・アルバス（Sporobolomyces　albus）、スポロボロマイセス・アンタークティカス（Sporobolomyces　antarcticus）、スポロボロマイセス・ビスフォフィア（Sporobolomyces　bischofiae）、スポロボロマイセス・ブルーミ（Sporobolomyces　blumeae）、スポロボロマイセス・コルニカラー（Sporobolomyces　carnicolor）、スポロボロマイセス・コプロフィラス（Sporobolomyces　coprophilus）、スポロボロマイセス・コプロスマ（Sporobolomyces　coprosmae）、スポロボロマイセス・コプロスミコーラ（Sporobolomyces　coprosmicola）、スポロボロマイセス・コラリフォーミス（Sporobolomyces　coralliformis）、スポロボロマイセス・ディメナエ（Sporobolomyces　dimmenae）、スポロボロマイセス・ディオスピロリス（Sporobolomyces　diospyroris）、スポロボロマイセス・ドラコフィラス（Sporobolomyces　dracophyllus）、スポロボロマイセス・エロンガタス（Sporobolomyces　elongatus）、スポロボロマイセス・ファルカタス（Sporobolomyces　falcatus）、スポロボロマイセス・フォリーコラ（Sporobolomyces　foliicola）、スポロボロマイセス・グラシリス（Sporobolomyces　gracilis）、スポロボロマイセス・グリセオフラバス（Sporobolomyces　griseoflavus）、スポロボロマイセス・ホルサチカス（Sporobolomyces　holsaticus）、スポロボロマイセス・イノシトフィラス（Sporobolomyces　inositophilus）、スポロボロマイセス・インターメディウス（Sporobolomyces　intermedius）、スポロボロマイセス・クルイベリ－ニエリー（Sporobolomyces　kluyveri-nielii）、スポロボロマイセス・ラクトフィラス（Sporobolomyces　lactophilus）、スポロボロマイセス・ラクトサス（Sporobolomyces　lactosus）、スポロボロマイセス・リンデラ（Sporobolomyces　linderae）、スポロボロマイセス・ロファセリ（Sporobolomyces　lophatheri）、スポロボロマイセス・マグニスポラス（Sporobolomyces　magnisporus）、スポロボロマイセス・マルシラエ（Sporobolomyces　marcillae）、スポロボロマイセス・ミスカンチ（Sporobolomyces　miscanthi）、スポロボロマイセス・ナガノエンシス（Sporobolomyces　naganoensis）、スポロボロマイセス・ノバジアランディカス（Sporobolomyces　novazealandicus）、スポロボロマイセス・ナイランディ（Sporobolomyces　nylandii）、スポロボロマイセス・オドラタス（Sporobolomyces　odoratus）、スポロボロマイセス・オドラス（Sporobolomyces　odorus）、スポロボロマイセス・オガサワレンシス（Sporobolomyces　ogasawarensis）、スポロボロマイセス・オリジコーラ（Sporobolomyces　oryzicola）、スポロボロマイセス・パラロセウス（Sporobolomyces　pararoseus）、スポロボロマイセス・ファフィ（Sporobolomyces　phaffii）、スポロボロマイセス・フィラダス（Sporobolomyces　phylladus）、スポロボロマイセス・フィロマティス（Sporobolomyces　phyllomatis）、スポロボロマイセス・ポルアッシ（Sporobolomyces　pollaccii）、スポロボロマイセス・プーンスーキー（Sporobolomyces　poonsookiae）、スポロボロマイセス・プニセウス（Sporobolomyces　puniceus）、スポロボロマイセス・ピロシ（Sporobolomyces　pyrrosiae）、スポロボロマイセス・ロセウス（Sporobolomyces　roseus）、スポロボロマイセス・ルバー（Sporobolomyces　ruber）、スポロボロマイセス・ルバーリムス・バー・アルバス（Sporobolomyces　ruberrimus　var.　albus）、スポロボロマイセス・ルバーリムス・バー・ルバーリムス（Sporobolomyces　ruberrimus　var.　ruberrimus）、スポロボロマイセス・サリシナス（Sporobolomyces　salicinus）、スポロボロマイセス・サルモネウス（Sporobolomyces　salmoneus）、スポロボロマイセス・サルモニカラー（Sporobolomyces　salmonicolor）、スポロボロマイセス・サシコーラ（Sporobolomyces　sasicola）、スポロボロマイセス・シバタナス（Sporobolomyces　shibatanus）、スポロボロマイセス・シングラリス（Sporobolomyces　singularis）、スポロボロマイセス・スブルンネス（Sporobolomyces　subbrunneus）、スポロボロマイセス・スブロセウス（Sporobolomyces　subroseus）、スポロボロマイセス・シジギー（Sporobolomyces　syzygii）、スポロボロマイセス・タウポエンシス（Sporobolomyces　taupoensis）、スポロボロマイセス・テヌイス（Sporobolomyces　tenuis）、スポロボロマイセス・ツガエ（Sporobolomyces　tsugae）、スポロボロマイセス・バーミキュラタス（Sporobolomyces　vermiculatus）、スポロボロマイセス・ウェイマニ（Sporobolomyces　weijmanii）、スポロボロマイセス・ザンザス（Sporobolomyces　xanthus）、スポロボロマイセス・ヤマトアヌス（Sporobolomyces　yamatoanus）、スポロボロマイセス・ユチコーラ（Sporobolomyces　yuccicola）、スポロボロマイセス・ユンナネンシス（Sporobolomyces　yunnanensis）などが挙げられる。
スポリディオボラス（Sporidiobolus）属酵母としては、例えば、スポリディオボラス・ジョンソニ（Sporidiobolus　johnsonii）、スポリディオボラス・ミクロスポラス（Sporidiobolus　microsporus）、スポリディオボラス・パラロセウス（Sporidiobolus　pararoseus）、スポリディオボラス・ルイネニエ（Sporidiobolus　ruineniae）、スポリディオボラス・ルイネニエ・バー・コプロフィラス（Sporidiobolus　ruineniae　var.　coprophilus）、スポリディオボラス・サルモニカラー（Sporidiobolus　salmonicolor）などが挙げられる。
好ましくは、スポロボロマイセス・サルモニカラー（Sporobolomyces　salmonicolor）、スポリディオボラス・サルモニカラー（Sporidiobolus　salmonicolor）などが挙げられる。なお、スポロボロマイセス・サルモニカラー（Sporobolomyces　salmonicolor）はスポリディオボラス・サルモニカラー（Sporidiobolus　salmonicolor）の無性世代(Anamorph)の呼び名である。また、新たに自然界から分離した新種のスポロボロマイセス（Sporobolomyces）属やスポリディオボラス（Sporidiobolus）属酵母なども挙げられる。
本発明の製造方法で用いるポリペプチドとしては、例えば（１Ｒ、２Ｒ）体の２－ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステルを製造する場合は、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドを挙げることができる（（ａ１）のポリペプチド）。また、本発明で用いるポリペプチドとしては、配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換及び／又は付加したアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよい（（ａ２）のポリペプチド）。これらのポリペプチドは、Current　Protocols　in　Molecular　Biology（John　Wiley　and　Sons,　Inc.,　1989）等に記載の公知の方法に準じて調製することができ、２－オキソシクロペンタンカルボン酸エステルとＮＡＤＰＨに作用して（１Ｒ，２Ｒ）－２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エステルとＮＡＤＰを生成する活性を有する限りは、上記ポリペプチドに包含される。
ここで「複数個のアミノ酸」とは、例えば、５０個、好ましくは３０個、より好ましくは１５個、さらに好ましくは１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、又は２個以下のアミノ酸を意味する。
配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列において、アミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加される場所は特に制限されないが、高度保存領域を避けるのが好ましい。ここで、高度保存領域とは、由来の異なる複数の酵素について、アミノ酸配列を最適に整列させて比較した場合に、複数の配列間でアミノ酸が一致している領域を表す。高度保存領域は、配列番号１に示したアミノ酸配列と、公知の微生物由来のアルコール脱水素酵素のアミノ酸配列とを、ＧＥＮＥＴＹＸ等のツールを用いて比較することにより確認することができる。
置換、挿入、欠失及び／又は付加により改変されたアミノ酸配列としては、１種類のタイプ（例えば置換）の改変のみを含むものであっても良いし、２種以上の改変（例えば、置換と挿入）を含んでいても良い。
また、置換の場合には、置換するアミノ酸は、置換前のアミノ酸と類似の性質を有するアミノ酸（同族アミノ酸）であることが好ましい。ここでは、以下に挙げる各群の同一群内のアミノ酸を同族アミノ酸とする。
（第１群：中性非極性アミノ酸）Gly,　Ala,　Val,　Leu,　Ile,　Met,　Cys,　Pro,　Phe　
（第２群：中性極性アミノ酸）Ser,　Thr,　Gln,　Asn,　Trp,　Tyr
（第３群：酸性アミノ酸）Glu,　Asp　
（第４群：塩基性アミノ酸）His,　Lys,　Arg
また、本発明の製造方法で用いるポリペプチドとしては、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有し、かつ、２－オキソシクロペンタンカルボン酸エステルとＮＡＤＰＨに作用して（１Ｒ，２Ｒ）－２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エステルとＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチドであってもよい（（ａ３）のポリペプチド）。
配列表の配列番号１のアミノ酸配列に対する配列同一性は８５％以上が好ましく、９０％以上がより好ましく、９５％以上が更に好ましく、９８％以上もしくは９９％以上が最も好ましい。
アミノ酸配列の配列同一性は、配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列と評価したいアミノ酸配列とを比較し、両方の配列でアミノ酸が一致した位置の数を比較総アミノ酸数で除して、さらに１００を乗じた値で表される。
２－オキソシクロペンタンカルボン酸エステルとＮＡＤＰＨに作用して（１Ｒ，２Ｒ）－２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エステルとＮＡＤＰを生成する活性を有する限り、配列番号１に記載のアミノ酸配列に、付加的なアミノ酸配列を結合することができる。例えば、ヒスチジンタグやＨＡタグのようなタグ配列を付加しても良い。あるいは、他のタンパク質との融合タンパク質とすることもできる。また、２－オキソシクロペンタンカルボン酸エステルとＮＡＤＰＨに作用して（１Ｒ，２Ｒ）－２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エステルとＮＡＤＰを生成する活性を有する限り、ペプチド断片であってもよい。
また、２－オキソシクロペンタンカルボン酸エステルとＮＡＤＰＨに作用して（１Ｒ，２Ｒ）－２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エステルとＮＡＤＰを生成する活性のレベルが低下する場合であっても、実質的に同等の活性があれば、本発明のポリペプチドに包含される。ここで「実質的に同等の活性」とは、元の活性に対して、例えば５０％以上、通常７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上あるいは９５％以上の活性を言う。活性の測定は、例えば、後述の２－オキソシクロペンタンカルボン酸エステルに対する還元活性の測定方法で実施できる。
本発明の製造方法で用いるポリペプチドは、２－オキソシクロアルカンカルボン酸エステルを還元して、光学活性２－ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステルを生成する能力を有する微生物から取得できる。該ポリペプチドを有する微生物は、例えば、以下の方法で見出すことができる。
微生物を適当な培地で培養し、集菌後、緩衝液中、グルコースなどの栄養存在下で２－オキソシクロアルカンカルボン酸エステルと反応させる。反応後、溶剤などで抽出を行い、ガスクロマトグラフィー及び高速液体クロマトグラフィーなどで分析することにより、生成する２－ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステルの生成量、４種類の立体異性体の組成比を確認すればよい。微生物を培養するための培地としては、その微生物が増殖する限り、通常の、炭素源、窒素源、無機塩類、有機栄養素などを含む液体栄養培地を用いることができる。培養は、例えば、温度２５℃～３７℃、ｐＨ４～８で振とうもしくは通気することで行い得る。
微生物からの本発明に用いるポリペプチドの単離は、公知の蛋白質精製法を適当に組み合わせて用いることにより実施できる。例えば、以下のように実施できる。まず、微生物を適当な培地で培養し、培養液から遠心分離、あるいは、濾過により菌体を集める。得られた菌体を、超音波破砕機、あるいは、グラスビーズ等を用いた物理的手法で破砕した後、遠心分離にて菌体残渣を除き、無細胞抽出液を得る。そして、熱処理、塩析（硫酸アンモニウム沈殿、リン酸ナトリウム沈殿など）、溶媒沈殿（アセトン又はエタノールなどによる蛋白質分画沈殿法）、透析、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、限外濾過等の手法を単独で、又は組み合わせて用いることにより、該無細胞抽出液から本発明に用いるポリペプチドを単離する。
単離したポリペプチドの２－オキソシクロアルカンカルボン酸エステルに対する還元活性は、評価したいポリペプチドと２－オキソシクロアルカンカルボン酸エステルとを作用させた後に、２－ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステルの生成をガスクロマトグラフィーなどで分析することにより評価できる。また、２－オキソシクロアルカンカルボン酸エステル還元活性、例えば、２－オキソシクロペンタンカルボン酸エステル還元活性については、以下の簡便な方法でも評価できる。
［２－オキソシクロペンタンカルボン酸エステルに対する還元活性の測定方法］
２－オキソシクロペンタンカルボン酸エステルに対する還元活性は、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に、２－オキソシクロペンタンカルボン酸エステル１０ｍＭ、補酵素ＮＡＤＰＨ０．２５ｍＭ、及び粗酵素液を添加して３０℃で１分間反応を行い、波長３４０ｎｍにおける吸光度の減少速度より算出する。この反応条件において、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＰＨをＮＡＤＰに酸化する酵素活性を１Ｕと定義する。ＮＡＤＰＨのかわりにＮＡＤＨを用いても良い。
本発明の製造方法で使用するポリペプチドは、このポリペプチドをコードするＤＮＡを導入された宿主細胞により発現されたものであってもよい。ＤＮＡは、導入された宿主細胞内で該ポリペプチドを発現し得るものであればいかなるものでもよく、任意の非翻訳領域を含んでいてもよい。天然よりクローニングされたＤＮＡ、ｃＤＮＡの他、合成によって得られるＤＮＡも含まれる。
ポリペプチドをコードするＤＮＡとして、例えば、配列表の配列番号１に示すポリペプチドをコードするＤＮＡ（（Ａ２）のＤＮＡ）が挙げられる。具体的には、配列表の配列番号２に示すＤＮＡ（（Ａ１）のＤＮＡ）を挙げることができる。
また、配列表の配列番号２に記載のＤＮＡと相補的なＤＮＡとをストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ２－オキソシクロペンタンカルボン酸エステルとＮＡＤＰＨに作用して（１Ｒ，２Ｒ）－２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エステルとＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡであってもよい（（Ａ３）のＤＮＡ）。
また、配列表の配列番号２に記載の塩基配列と８５％以上の配列同一性を有し、かつ２－オキソシクロペンタンカルボン酸エステルとＮＡＤＰＨに作用して（１Ｒ，２Ｒ）－２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エステルとＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡであってもよい（（Ａ４）のＤＮＡ）。
ここで、「配列表の配列番号２に記載のＤＮＡと相補的なＤＮＡとをストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ２－オキソシクロペンタンカルボン酸エステルとＮＡＤＰＨに作用して（１Ｒ，２Ｒ）－２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エステルとＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ」とは、配列表の配列番号２に示した塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡをプローブとして、ストリンジェントな条件下にコロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、あるいはサザンハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡで、かつ２－オキソシクロペンタンカルボン酸エステルとＮＡＤＰＨに作用して（１Ｒ，２Ｒ）－２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エステルとＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを意味する。
ハイブリダイゼーションは、Molecular　Cloning,　A　laboratory　manual,　second　edition　（Cold　Spring　Harbor　Laboratory　Press,　1989）等に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、例えば、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７～１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃で相補鎖形成を行った後、２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃の条件下でフィルターを洗浄することにより取得できるＤＮＡを挙げることができる。好ましくは６５℃で０．３倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄、より好ましくは６５℃で０．１倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄、更に好ましくは６５℃で０．０５倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄することにより取得できるＤＮＡである。ただし、ハイブリダイゼーション条件はこれらの条件に特に制限されない。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれらの要素を適宜選択することで最適なストリンジェンシーを実現することが可能である。
上記の条件にてハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、配列番号２に示されるＤＮＡと、配列同一性が８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９７％以上、最も好ましくは９９％以上のＤＮＡを挙げることができ、コードされるポリペプチドが、２－オキソシクロペンタンカルボン酸エステルとＮＡＤＰＨに作用して（１Ｒ，２Ｒ）－２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エステルとＮＡＤＰを生成する活性を有する限り、上記ＤＮＡに包含される。
ここで、「配列同一性（％）」とは、対比される２つのＤＮＡを最適に整列させ、核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、又はＩ）が両方の配列で一致した位置の数を比較塩基総数で除し、そして、この結果に１００を乗じた数値で表される。
配列同一性は、例えば、以下の配列分析用ツールを用いて算出し得る：GCG　Wisconsin　Package（Program　Manual　for　The　Wisconsin　Package,　Version8,　1994年9月,　Genetics　Computer　Group,　575　Science　Drive　Medison,　Wisconsin,　USA　53711;　Rice,　P.　(1996)　Program　Manual　for　EGCG　Package,　Peter　Rice,　The　Sanger　Centre,　Hinxton　Hall,　Cambridge,　CB10　1RQ,　England）、及び、the　ExPASy　World　Wide　Web分子生物学用サーバー（Geneva　University　Hospital　and　University　of　Geneva,　Geneva,　Switzerland）。
該ポリペプチドが取得できれば、該ポリペプチドの起源となる微生物より、当業者であれば公知の方法で、ＤＮＡを取得できる。例えば、以下に示した方法で取得できる。
まず、上述の方法により単離されたポリペプチドを、適当なエンドペプチダーゼを用いて消化し、生じたペプチド断片を逆相ＨＰＬＣにより分取する。そして、例えば、ＡＢＩ４９２型プロテインシークエンサー（アプライドバイオシステムズ製）により、これらのペプチド断片のアミノ酸配列の一部又は全部を決定する。
このようにして得られたアミノ酸配列情報をもとにして、該ポリペプチドをコードするＤＮＡの一部を増幅するためのＰＣＲ（Polymerase　Chain　Reaction）プライマーを合成する。次に、通常のＤＮＡ単離法、例えば、Ｖｉｓｓｅｒ等の方法（Appl.　Microbiol.　Biotechnol.,　53,　415　(2000)）により、該ポリペプチドの起源となる微生物の染色体ＤＮＡを調製する。もしくは、該ポリペプチドの起源となる微生物のｍＲＮＡよりｃＤＮＡを調製する。これらのＤＮＡを鋳型として、先述のＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲを行い、該ポリペプチドをコードするＤＮＡの一部を増幅し、その塩基配列を決定する。塩基配列の決定は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３１３０ｘｌ　ジェネティックアナライザ（アプライドバイオシステムズ製）等を用いて行うことができる。該ポリペプチドをコードするＤＮＡの一部の塩基配列が明らかになれば、例えば、インバース（Ｉｎｖｅｒｓｅ）ＰＣＲ法（Nucl.　Acids　Res.,　16,　8186　(1988)）により、その全体の配列を決定することができる。
なお、ＤＮＡクローニング、ベクターの調製及び形質転換等の遺伝子操作は、特に明記しない限り、Molecular　Cloning　2nd　Edition（Cold　Spring　Harbor　Laboratory　Press,1989）等の成書に記載されている方法により実施することができる。また、本明細書の記述に用いられる％は、特に断りのない限り、％（ｗ／ｖ）を意味する。
本発明の製造方法において、（１Ｓ，２Ｓ）－２－ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステルを製造する場合は、用いるポリペプチドとしてはキャンディダ（Candida）属、ロードトルーラ（Rhodotorula）属、オガタエア（Ogataea）属、サーモアナエロビウム（Themoanaerobium）属からなる群から選ばれた微生物由来のものが好ましい。より好ましくは、キャンディダ・マグノリエ（Candida　magnoliae）、キャンディダ・ボイディニ（Candida　boidinii）、ロードトルーラ・グルチニス・バー・ダイレネンシス（Rhodotorula　glutinis　var.　dairenensis）、オガタエア・ミヌータ・バー・ミヌータ（Ogataea　minuta　var.　minuta）、サーモアナエロビウム・ブロッキ（Themoanaerobium　brockii）由来のポリペプチドである。特に好ましいポリペプチドは、キャンディダ・マグノリエ（Candida　magnoliae）由来の還元酵素ＣＲ酵素（実施例４）、ロードトルーラ・グルチニス・バー・ダイレネンシス（Rhodotorula　glutinis　var.　dairenensis）NBRC0415由来の還元酵素ＲＲＧ（実施例５）、オガタエア・ミヌータ・バー・ミヌータ（Ogataea　minuta　var.　minuta）NBRC0975由来の還元酵素（実施例６）などである。これら酵素の理化学的性質、アミノ酸配列、取得方法については、ＣＲ酵素は国際公報ＷＯ０１／０４０４５０、ＲＲＧ酵素は国際公報ＷＯ０３／０９３４７７、オガタエア・ミヌータ・バー・ミヌータ（Ogataea　minuta　var.　minuta）NBRC0975由来の還元酵素は国際公報ＷＯ０６／０１３８０１、に記載されている。
本発明の製造方法において、（１Ｓ，２Ｒ）－２－ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステルを製造する場合は、用いるポリペプチドとしてはキャンディダ（Candida）属、デボシア（Devosia）属、ブレブンディモナス（Brevundimonas）属、ラクトバシラス（Lactobacillus）属からなる群から選ばれた微生物由来のものが好ましい。より好ましくは、キャンディダ・マリス（Candida　maris）、デボシア・リボフラビナ（Devosia　riboflavina）、ブレブンディモナス・ディミヌータ（Brevundimonas　diminuta）、ラクトバシラス・ブレビス（Lactobacillus　brevis）、ラクトバシラス・ケフィア（Lactobacillus　kefir）由来のポリペプチドである。特に好ましいポリペプチドは、キャンディダ・マリス（Candida　maris）NBRC10003由来の還元酵素ＦＰＤＨ（実施例９）、デボシア・リボフラビナ（Devosia　riboflavina）NBRC13584由来のＲＤＲ還元酵素（実施例１０）、ブレブンディモナス・ディミヌータ（Brevundimonas　diminuta）NBRC13584由来の還元酵素（実施例１１）などである。これら酵素の理化学的性質、アミノ酸配列、取得方法については、ＦＰＤＨ酵素は国際公報ＷＯ０１／０５９９６、ＲＲＧ酵素は国際公報ＷＯ０４／０２７０５５、ブレブンディモナス・ディミヌータ（Brevundimonas　diminuta）NBRC13584由来の還元酵素は国際公報ＷＯ０７／１１４２１７、に記載されている。
本発明の製造方法において、（１Ｒ，２Ｓ）－２－ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステルを製造する場合は、用いるポリペプチドとしてはキャンディダ（Candida）属、ロドコッカス（Rhodococcus）属からなる群から選ばれた微生物由来のものが好ましい。より好ましくは、キャンディダ・マルトーサ（Candida　maltosa）、キャンディダ・パラプシロシス（Candida　parapsilosis）、ロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus　erythropolis）由来のポリペプチドである。特に好ましいポリペプチドは、キャンディダ・マルトーサ（Candida　maltosa）NBRC1977由来の還元酵素（実施例１４）、キャンディダ・パラプシロシス（Candida　parapsilosis）NBRC708由来の還元酵素（実施例１５）などである。これら酵素の理化学的性質、アミノ酸配列、取得方法については、キャンディダ・マルトーサ（Candida　maltosa）NBRC1977由来の還元酵素は国際公報ＷＯ０８／０６６０１８、キャンディダ・パラプシロシス（Candida　parapsilosis）NBRC708由来の還元酵素は特開２００３－２８９８７４、に記載されている。
上記の微生物は、例えば、以下のカルチャーコレクションより入手可能である。
・独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部　生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）（〒292-0818　千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）
・独立行政法人理化学研究所　バイオリソースセンター　微生物材料開発室（ＪＣＭ）（〒351-0198　埼玉県和光市広沢2-1）
・German　Collection　of　Microorganisms　and　Cell　Cultures　GmbH（ＤＳＭＺ）（Marscheroder　Weg　1b,　D-38124　Brunschweig,　Germany）
ポリペプチドを産生する生物体として、遺伝子組換え生物を使用する場合には、上記で述べたポリペプチドをコードするＤＮＡを導入された遺伝子組換え生物を使用することができる。遺伝子組換え生物は、ポリペプチドをコードするＤＮＡを発現ベクターに挿入してポリペプチド発現ベクターを作製し、このベクターを形質転換により宿主生物に導入することにより得られる。遺伝子組換え生物が生育しうる培地を用いて培養することにより、ポリペプチドを発現させることができる。更に、ポリペプチドをコードするＤＮＡを宿主生物の染色体中に導入することによっても、遺伝子組換え生物を得ることができる。
発現ベクターとしては、適当な宿主生物内で当該ＤＮＡがコードするポリペプチドを発現できるものであれば、特に限定されない。このようなベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクターなどが挙げられ、さらに、他の宿主生物との間での遺伝子交換が可能なシャトルベクターも使用できる。
このようなベクターは、例えば宿主生物として大腸菌を使用する場合では、通常、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔｕｆＢプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｐＬプロモーター等の制御因子を含み、本発明のＤＮＡと作動可能に連結された発現単位を含む発現ベクターとして好適に使用できる。例えば、ｐＵＣＮ１８（実施例２参照）、ｐＳＴＶ２８（タカラバイオ株式会社製）、ｐＵＣＮＴ（ＷＯ９４／０３６１３公報）などが挙げられる。「制御因子」は、機能的プロモーター及び、任意の関連する転写要素（例えばエンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位など）を有する塩基配列をいう。「作動可能に連結」は、遺伝子の発現を調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の調節エレメントと遺伝子が、宿主生物中で作動し得る状態で連結されることをいう。制御因子のタイプ及び種類が、宿主生物に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。各種生物において利用可能なベクター、プロモーターなどに関しては「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版」などに詳細に記述されている。
本発明で用いるポリペプチドを発現させるために用いる宿主生物は、各ポリペプチドをコードするＤＮＡを含むポリペプチド発現ベクターにより形質転換され、導入したＤＮＡがコードするポリペプチドを発現することができる生物であれば、特に制限されないが、宿主ベクター系の開発されている生物が好ましい。
宿主生物として微生物を使用する場合、利用可能な微生物としては、例えば、エシェリヒア（Escherichia）属、バチルス（Bacillus）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、セラチア（Serratia）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、コリネバクテリイウム（Corynebacterium）属、ストレプトコッカス（Streptococcus）属、及びラクトバチルス（Lactobacillus）属などの細菌；ロドコッカス（Rhodococcus）属及びストレプトマイセス（Streptomyces）属などの放線菌；サッカロマイセス（Saccharomyces）属、クライベロマイセス（Kluyveromyces）属、シゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）属、チゴサッカロマイセス（Zygosaccharomyces）属、ヤロウイア（Yarrowia）属、トリコスポロン（Trichosporon）属、ロドスポリジウム（Rhodosporidium）属、ピキア（Pichia）属、及びキャンディダ（Candida）属などの酵母；ノイロスポラ（Neurospora）属、アスペルギルス（Aspergillus）属、セファロスポリウム（Cephalosporium）属、及びトリコデルマ（Trichoderma）属などのカビなどが挙げられる。
また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が開発されており、特に蚕などの昆虫（Nature　315,　592-594　(1985)）や菜種、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物中に大量に異種タンパク質を発現させる系が開発されており、好適に利用できる。これらのうち、導入及び発現効率からは微生物が好ましく、細菌がより好ましく、エシェリヒア・コリ（Escherichia　coli）（通称は大腸菌）を宿主生物とする遺伝子組換え生物が特に好ましい。
ポリペプチド発現ベクターは、公知の方法により宿主生物に導入できる。例えば、ベクターｐＵＣ１１８に配列番号２に示すＤＮＡを導入して作成されたプラスミドｐＵＣＡＲ２（Applied　and　Environmental　Microbiology,　65(12),　5207-5211,　(1999)）を、宿主微生物である大腸菌に導入する場合、市販の　E.　coli　コンピテントセル（タカラバイオ株式会社製）などを用いて、そのプロトコールに従って操作することにより、当該ベクターを宿主細胞に導入した組換え生物　E.　coli、例えば　E.　coli　HB101（ｐＵＣＡＲ２）（実施例１参照）が得られる。
２－オキソシクロアルカンカルボン酸エステル（８）を還元して光学活性２－ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステル（９）を合成する場合、補酵素としてＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨが必要となる。反応系にＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨを必要な量だけ添加しても実施しうるが、酸化された該補酵素（ＮＡＤ＋もしくはＮＡＤＰ＋）を還元型（ＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨ）に変換する能力（以後還元型補酵素再生能力と呼ぶ）を有する酵素をその基質と共に、つまり補酵素再生系を本発明で用いるポリペプチドと組み合わせて反応を行うことにより、高価な補酵素の使用量を大幅に削減することができる。
このような反応は、補酵素再生系を不斉還元反応系内に添加することによって行うことができる。また、不斉還元活性を有するポリペプチド及び還元型補酵素再生能を有するポリペプチドの両ポリペプチドを、同一宿主生物内で発現させた遺伝子組換え生物を育種することもできる。すなわち、不斉還元活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ及び還元型補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを、同一のベクターに組み込み、これを宿主生物に導入することにより得られる。また、不斉還元活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ及び還元型補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを、不和合性グループの異なる２種のベクターにそれぞれ組み込み、それらを同一の宿主生物に導入することによって得られる遺伝子組換え生物も、本発明の製造方法に使用することができる。
還元型補酵素再生能力を有する酵素としては、ヒドロゲナーゼ、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、グルコース－６－リン酸脱水素酵素及びグルコース脱水素酵素等を用いることができる。好適には、グルコース脱水素酵素が用いられる。
２－オキソシクロアルカンカルボン酸エステルを還元するポリペプチドもしくは該ポリペプチドを発現させた組換え生物を用いて、２－オキソシクロアルカンカルボン酸エステル（８）；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
 を還元して光学活性２－ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステル（９）；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
 を製造する場合、以下のように実施され得る。但し、以下の方法に限定されるわけではない。
前記式（８）を前記式（９）へ変換する場合は、適当な溶媒、例えば１００ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ６．５）などの中に前記式（８）を加え、ＮＡＤＰＨ、ＮＡＤＰ＋、ＮＡＤＨ又はＮＡＤ＋等の補酵素、並びにポリペプチド、該ポリペプチドを産生する生物体、又は、該生物体の処理物を添加し、ｐＨ調整下、攪拌して反応させる。
反応は５～８０℃、好ましくは１０～６０℃、より好ましくは２０～４０℃の温度で行われ、反応中反応液のｐＨは３～１０、好ましくは４～９、より好ましくは５～８に維持する。反応はバッチ式あるいは連続方式で行われ得る。バッチ方式の場合は、反応基質は０．０１～１００％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．１～７０％、より好ましくは０．５～５０％の仕込み濃度で添加され得る。また、反応の途中で新たに基質を追加添加しても良い。
更に、トリトン（ナカライテスク株式会社製）、スパン（関東化学株式会社製）、ツイーン（ナカライテスク株式会社製）などの界面活性剤を反応液に添加することも効果的である。更に、基質及び／又は還元反応の生成物であるアルコール体による反応の阻害を回避する目的で、酢酸エチル、酢酸ブチル、イソプロピルエーテル、トルエン、ヘキサンなどの水に不溶な有機溶媒を反応液に添加してもよい。更に、基質の溶解度を高める目的で、メタノール、エタノール、アセトン、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシドなどの水に可溶な有機溶媒を添加することもできる。
還元反応により生成した光学活性２－ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステルの採取は、特に限定されないが、反応液から直接、あるいは菌体等を分離後、酢酸エチル、トルエン、ｔ－ブチルメチルエーテル、ヘキサン、ｎ－ブタノール、ジクロロメタン等の溶剤で抽出し、減圧加熱等の操作により溶剤を留去すると良い。さらには、蒸留やシリカゲルカラムクロマトグラフィー等により精製すれば高純度の前記式（９）を容易に得ることができる。
上記記載の方法にて製造した前記式（９）で表される光学活性２－ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステルより、一般式（２）；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
 で表される、医薬品中間体として特に有用な光学活性２－アミノシクロアルカノール誘導体、もしくは一般式（２）’；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
 で表される光学活性２－アミノシクロアルカノールを製造することができる。
前記式（９）において、Ｒは炭素数１～６の置換もしくは無置換のアルキル基、炭素数６～１０の置換もしくは無置換のアリール基、炭素数７～１１の置換もしくは無置換のアラルキル基を表す。炭素数１～６の置換もしくは無置換のアルキルとしては例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基等が挙げられる。炭素数６～１０の置換もしくは無置換のアリール基としては例えば、フェニル基、ｐ－メチルフェニル基、ｏ－メチルフェニル基、ｍ－メチルベンジル基、ｐ－クロロフェニル基、ｐ－ニトロフェニル基、ｐ－トリフルオロメチルフェニル基、１－ナフチル基、２－ナフチル基等が挙げられる。炭素数７～１１のアラルキル基としては例えば、ベンジル基、ｐ－メチルベンジル基、ｏ－メチルベンジル基、ｍ－メチルベンジル基、ｐ－ニトロベンジル基、ｐ－トリフルオロメチルベンジル基等が挙げられる。中でも好ましくは炭素数１～６の置換もしくは無置換のアルキル基あり、さらに好ましくはメチル基、エチル基である。
前記式（９）は、上記した微生物や酵素を用いた対応するケトエステルの還元反応により取得できる。
前記式（２）において、Ｒ’としては例えば、炭素数１～６の置換もしくは無置換のアルキル基、炭素数６～１０の置換もしくは無置換のアリール基、炭素数７～１１の置換もしくは無置換のアラルキル基等が挙げられる。炭素数１～６の置換もしくは無置換のアルキル基としては例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基等が挙げられる。炭素数６～１０の置換もしくは無置換のアリール基としては例えば、フェニル基、ｐ－メチルフェニル基、ｏ－メチルフェニル基、ｍ－メチルベンジル基、ｐ－クロロフェニル基、ｐ－ニトロフェニル基、ｐ－トリフルオロメチルフェニル基、１－ナフチル基、２－ナフチル基等が挙げられる。炭素数７～１１のアラルキル基としては例えば、ベンジル基、ｐ－メチルベンジル基、ｏ－メチルベンジル基、ｍ－メチルベンジル基、ｐ－ニトロベンジル基、ｐ－トリフルオロメチルベンジル基等が挙げられる。中でも好ましくは炭素数１～６の置換もしくは無置換のアルキル基、炭素数７～１１のアラルキル基であり、さらに好ましくはメチル基、エチル基、ｔ－ブチル基、ベンジル基である。
前記式（９）より前記式（２）もしくは前記式（２）’を製造するルートとしては、前記式（９）とアンモニアを反応させることで、２－ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸アミド（３）を製造し、続いて転位反応を行うＨｏｆｍａｎｎ転位ルート、もしくは、一般式（１）；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
 で表される２－ヒドロキシアシクロアルカンカルボン酸より２－ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸アジド（４）を経由し転位反応を行うＣｕｒｔｉｕｓ転位ルートが挙げられる（図１参照）。Ｃｕｒｔｉｕｓ転位は爆発危険性の伴うアジド化合物を使用するため、好ましくはＨｏｆｍａｎｎ転位を行うルートである。
前記式（１）、（２）、（２）’、（３）、及び図１に示す式（４）において、ｎは０～８の整数を表す。中でも好ましくは０～４であり、さらに好ましくは１～３であり、最も好ましくは１である。
前記式（１）、（２）、（２）’、（３）、及び図１に示す式（４）において、＊１、＊２は不斉炭素を表す。＊１、＊２にそれぞれ独立して（Ｓ）の立体配置であっても良いし、（Ｒ）の立体配置であっても良い。中でも好ましくは＊１、＊２ともに（Ｒ）の立体配置である。
以下、Ｈｏｆｍａｎｎ転位反応を用いるルートについて説明する。本ルートは、前記式（９）とアンモニアを反応させることで前記式（３）を製造し、続いて転位反応を行うことで前記式（２）もしくは前記式（２）’を製造するルートである。まず、前記式（９）とアンモニアを反応させ前記式（３）を製造する方法について述べる。
前記式（９）において、Ｒは前記に同じである。
用いるアンモニアは溶媒に希釈したものを用いても良いし、希釈することなく用いても良い。希釈する溶媒としてはメタノール、エタノール、ｎ－プロパノール、イソプロパノール、ｎ－ブタノール等のアルコール系溶媒溶液、水溶液等が挙げられる。中でも好ましくはメタノール溶液又は水溶液である。
アンモニアを希釈して用いる場合、その濃度は特に限定しないが、好ましくは５～４０重量％溶液であり、より好ましくは１０～３０重量％溶液であり、さらに好ましくは１５～２８重量％である。用いるアンモニアの当量は特に限定しないが、前記式（９）に対して好ましくは１～３０当量であり、より好ましくは５～２５当量であり、さらに好ましくは１０～２０当量である。
反応温度は、通常、－５０～１２０℃の範囲内で行えばよい。好ましくは０～１００℃の範囲内であり、更に好ましくは２０～１００℃の範囲内である。反応は常圧（１気圧）下に行うこともできるが、密閉された反応缶を用いて加熱することにより加圧条件下に行うことができる。
用いる溶媒としては、特に限定されず、例えば、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ－メチルピロリドン、ヘキサメチルリン酸トリアミド等の非プロトン性極性溶媒、ヘキサメチルベンゼン、トルエン、ｎ－ヘキサン、シクロヘキサン等の炭化水素系溶媒、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジイソプロピルエーテル、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル、ジメトキシエタン等のエーテル系溶媒、クロロベンゼン、塩化メチレン、クロロホルム、１，１，１－トリクロロエタン等のハロゲン系溶媒、酢酸エチル、酢酸ブチル等のエステル系溶媒、アセトニトリル、ブチロニトリル等のニトリル系溶媒、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ－プロパノール、ブタノール、オクタノール等のアルコール系溶媒、水などが挙げられる。これらは単独で用いてもよく、２種以上を併用しても良い。中でも好ましくは、アルコール系溶媒、炭化水素系溶媒、水であり、さらに好ましくは、トルエン、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ－プロパノール、水である。
反応終了後、反応液を濃縮することで粗生成物を取得することができる。また、一般的な後処理を行って組成物を取得しても良い。一般的な後処理としては例えば、水及び一般的な抽出溶媒、例えば、酢酸エチル、ジエチルエーテル、塩化メチレン、トルエン、ヘキサン等を用いて抽出操作を行う。得られた抽出液から、減圧加熱等の操作により反応溶媒及び抽出溶媒を留去すると、目的化合物が得られる。
このようにして得られる目的物は、そのまま次工程で使用しても良いが、晶析精製、分別蒸留、カラムクロマトグラフィー等、一般的な手法により精製を加え、さらに純度を高めても良い。
粗生成物に前記式（３）のジアステレオマーが含まれる場合、医薬品中間体として十分な品質の前記式（２）もしくは前記式（２）’を取得するためにも晶析操作を行う方が好ましい。即ち、前記式（３）を含む粗生成物の晶析を行うことで、ジアステレオマーを除去することができる。
ジアステレオマーとしては特に限定しないが、例えば、前記式（３）において好ましい立体配置、すなわち、＊１、＊２ともに（Ｒ）の場合、ジアステレオマーは（１Ｒ，２Ｓ）－２－ヒドロキシシクロアルカンアミド及び／又は（１Ｓ，２Ｒ）－２－ヒドロキシシクロアルカンアミドである。
晶析溶媒としては特に限定されず、例えば、ヘキサメチルベンゼン、トルエン、ｎ－ヘキサン、シクロヘキサン等の炭化水素系溶媒、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジイソプロピルエーテル、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル、ジメトキシエタン等のエーテル系溶媒、クロロベンゼン、塩化メチレン、クロロホルム、１，１，１－トリクロロエタン等のハロゲン系溶媒、酢酸エチル、酢酸ブチル等のエステル系溶媒、アセトニトリル、ブチロニトリル等のニトリル系溶媒、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ－プロパノール、ブタノール、オクタノール等のアルコール系溶媒、水などが挙げられる。これらは単独で用いてもよく、２種以上を併用しても良い。中でも好ましくは、エステル系溶媒とアルコール系溶媒の組合せであり、さらに好ましくは酢酸エチルとメタノールの組合せ、酢酸エチルとイソプロパノールの組合せである。
晶析に用いる溶媒の量としては前記式（９）で表される化合物に対して１～２００倍重量であり、好ましくは１～５０倍重量である。
晶析時の温度は－１０℃～１２０℃の範囲内であり、好ましくは－１０℃～７０℃の範囲内であり、最も好ましくは－１０℃～５０℃の範囲内である。
晶析の方法としては特に限定せずどのような方法をとっても良い。例えば、前記式（９）で表される化合物を含む粗生成物に晶析溶媒を添加し、均一溶液となるまで加熱したのち、冷却し結晶化させる方法でも良いし、粗生成物を適量の富溶媒にて溶解した後、貧溶媒を添加することで結晶化させても良い。また、前記式（９）で表される化合物を含む粗生成物を富溶媒と貧溶媒の混合液に溶解した後、濃縮留去等により良溶媒を除去する方法で結晶化させても良い。さらに上述した方法に種晶添加等の操作を適宜組み合わせることができる。
晶析によって取得した前記式（３）中に含まれるジアステレオマーの含量はモル比で１０．０モル％以下であり、好ましくは５．０モル％以下であり、さらに好ましくは２．０モル％以下であり、さらにより好ましくは１．０モル％以下であり、最も好ましくは０．５％以下である。
このようにして得られる前記式（３）で表される化合物の結晶は、例えば、遠心分離、加圧ろ過、減圧ろ過等により固液分離、更に、必要に応じてケーキ洗浄を行い、湿体として取得することができる。また、さらに減圧乾燥を行うことで、乾燥晶を取得することができる。取得した結晶を次工程の反応に用いる場合、乾燥晶として使用しても良いし、湿体のまま用いても良い。
次に前記式（３）を塩基存在下、ハロゲン化剤を反応させることにより前記式（２）もしくは化合物（２）’を製造する方法について述べる。
用いる塩基は、無機塩基であっても良いし、有機塩基であっても良い。無機塩基としては例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化マグネシウム、水酸化バリウム等の金属水酸化物、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素ナトリウム等の炭酸塩等が挙げられる。
有機塩基としては特に限定しないが、第三級アミンが好ましい。第三級アミンとしては例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルジイソプロピルアミンなど炭素数１～１２のトリアルキルアミンや、Ｎ，Ｎ－ジメチルアニリン、Ｎ，Ｎ－ジエチルアニリン、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノピリジンなどの炭素数１～４のアルキル基とアリール基又はヘテロアリール基からなる第三級アミン、ピリジン、ピコリン、ルチジンなどの含窒素有機塩基、Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ－テトラメチル－１，２－エチレンジアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ－テトラメチル－１，３－プロパンジアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ－テトラメチル－１，６－ヘキサンジアミンなど炭素数１～１０のＮ，Ｎ，Ｎ，Ｎ－テトラメチル－α，ω－アルキルジアミンなどが挙げられる。
これらの塩基は単独で用いても良いし、複数を同時に使用しても良い。中でも、安価で入手が容易である点から、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムが好ましい。
用いる塩基の量としては、前記式（３）に対して１当量以上使用すれば良く、好ましくは１～１０当量であり、さらに好ましくは１～５当量である。本反応に用いられる塩基は、溶媒に希釈することなく用いても良いし、希釈して用いても良い。
本反応に用いられるハロゲン化剤としては、例えば、次亜塩素酸ナトリウム、次亜塩素酸カリウム、次亜臭素酸ナトリウム、塩素、臭素、ヨウ素、Ｎ－クロロスクシンイミド（ＮＣＳ）、Ｎ－ブロモスクシンイミド（ＮＢＳ）、Ｎ－ヨードスクシンイミド(ＮＩＳ)、Ｎ－クロロイソシアヌル酸等が挙げられる。中でも好ましくは次亜塩素酸ナトリウム、次亜臭素酸ナトリウムであり、さらに好ましくは次亜塩素酸ナトリウムである。
これらハロゲン化剤は、そのまま用いても良いし、水又は有機溶媒に希釈されたものを用いても良い。特に次亜塩素酸ナトリウムを用いる場合は、通常、水溶液のものが用いられる。また、ハロゲン化剤は系内で調製する方法をとっても良い。例えば、メタノール溶媒中、臭素とナトリムメトキシドを反応させることで、次亜臭素酸ナトリウムのメタノール溶液を調製することができる。
本反応に用いるハロゲン化剤の量としては、前記式（３）に対して１当量以上使用すれば良く、好ましくは１～１０当量であり、さらに好ましくは１～５当量である。反応温度は、通常－３０～１２０℃の範囲内であり、好ましくは－２０～８０℃である。さらに好ましくは－１０～６０℃である。
本工程に用いる溶媒としては、特に限定されず、例えば、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ－メチルピロリドン、ヘキサメチルリン酸トリアミド等の非プロトン性極性溶媒、ヘキサメチルベンゼン、トルエン、ｎ－ヘキサン、シクロヘキサン等の炭化水素系溶媒、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジイソプロピルエーテル、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル、ジメトキシエタン等のエーテル系溶媒、クロロベンゼン、塩化メチレン、クロロホルム、１，１，１－トリクロロエタン等のハロゲン系溶媒、酢酸エチル、酢酸ブチル等のエステル系溶媒、アセトニトリル、ブチロニトリル等のニトリル系溶媒、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ－プロパノール、ブタノール、オクタノール等のアルコール系溶媒、水などが挙げられる。これらは単独で用いてもよく、２種以上を併用しても良い。中でも、エーテル系溶媒、アルコール系溶媒、水が好ましく、さらに好ましくは、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ－プロパノール、水である。
本反応は水存在下で行うことにより、前記式（２）’を得ることができる。また、一般式（５）；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
 で表されるアルコール存在下に行うことにより、前記式（２）を得ることができる。前記式（５）中、Ｒ’は前記に同じである。
反応終了後、反応液から粗生成物を取得するためには、一般的な後処理を行えばよい。例えば、一般的な抽出溶媒、例えば、酢酸エチル、ジエチルエーテル、塩化メチレン、トルエン、ヘキサン等を用いて抽出操作を行う。得られた抽出液から、減圧加熱等の操作により反応溶媒及び抽出溶媒を留去すると、目的化合物が得られる。さらに、反応終了後、減圧加熱等の操作により反応溶媒を留去もしくは溶媒置換等を行ってから、上記と同様の操作を行っても良い。
上記のようにして合成される一般式（２）’；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
 で表される２－アミノシクロペンタノールより、一般式（６）；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
 で表されるＮ－保護－２－アミノシクロペンタノール誘導体を取得することができる。
前記式（６）中、Ｒ４は炭素数１～１５の置換又は無置換のアルキルオキシカルボニル基、炭素数７～１２の置換又は無置換のアラルキルオキシカルボニル基、又は炭素数２～１２の置換又は無置換のアシル基を表す。置換基としては、Ｒにおいて記載したものと同様のものが挙げられる。炭素数１～１５の置換又は無置換のアルキルオキシカルボニル基としては例えば、ｔ－ブチルオキシカルボニル基（Ｂｏｃ基）、メトキシカルボニル基（Ｍｏｃ基）、９－フルオレニルメトキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基）等が挙げられる。炭素数７～１２の置換又は無置換のアラルキルオキシカルボニル基としては例えば、ベンジルオキシカルボニル基（Ｃｂｚ基）、ｐ－メトキシベンジルオキシカルボニル基等が挙げられる。炭素数２～１２の置換又は無置換のアシル基としては例えば、アセチル基、ベンゾイル基等が挙げられる。中でも好ましくは、ｔ－ブチルオキシカルボニル基（Ｂｏｃ基）、メトキシカルボニル基（Ｍｏｃ基）、９－フルオレニルメトキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基）、ベンジルオキシカルボニル基（Ｃｂｚ基）、アセチル基であり、さらに好ましくはｔ－ブチルオキシカルボニル基（Ｂｏｃ基）、ベンジルオキシカルボニル基（Ｃｂｚ基）である。
前記式（６）中、＊１、＊２は不斉炭素を表す。＊１、＊２にそれぞれ独立して（Ｓ）の立体配置であっても良いし、（Ｒ）の立体配置であっても良い。中でも好ましくは＊１、＊２ともに（Ｒ）の立体配置である。
前記式（２）’より前記式（６）へと誘導する方法については、一般的な保護を行う条件で実施すれば良い。例えばＴｈｅｏｄｏｒａ　Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ，　Ｐｅｔｅｒ　Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ著　Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　Ｇｒｏｕｐｓ　ｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第３版）ＪＯＨＮ　ＷＩＬＥＹ　＆　ＳＯＮＳ，ＩＮＣ社出版に記載の脱保護法に従い、実施することができる。
例えば、適当な溶媒中、塩基存在下、二炭酸ｔ－ブチルを作用させることで、ｔ－ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）保護を行うことが出来るし、適当な溶媒中、塩基存在下、ベンジルオキシカルボニルクロリドを作用させることで、ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）保護を行うことができる。
前述した方法により単離した前記式（２）’を用いて前記式（６）へと誘導しても良いし、単離操作を行うことなく、前記式（２）’を含む反応液をそのまま用いて、一般式（７）；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
 で表されるヒドラジドへと誘導しても良い。
次に、図１に示すように式（９）より式（４）を経由し、前記式（２）もしくは前記式（２）’を製造するＣｕｒｔｉｕｓ転位ルートについて説明する。
前記式（９）より前記式（２）を製造するためには、一般的なＣｕｒｔｉｕｓ転位の反応条件を用いれば良い。例えば、Ｓｔｒａｔｅｇｉｃ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｎａｍｅｄ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｅｌｓｅｖｉｒ　Ｉｎｃ社出版に記載の方法に従い、実施することができる。
本反応において、前記式（９）の加水分解反応によって製造できる一般式（１）；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
 で表される２－ヒドロキシアシクロアルカンカルボン酸を用いることもできる。
前記式（１）は上記製造方法により製造した２－ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステルの酸や塩基を用いた一般的な加水分解により取得可能である。例えば、酵素を用いた還元反応により製造した２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸メチルエステルを水－メタノールの混合溶媒中、水酸化ナトリウムを作用させることで製造できる。
本反応は水存在下で行うことにより、前記式（２）’を製造することができる。また前記アルコール（５）存在下に行うことにより、前記式（２）を製造することができる。
例えば、ベンジルアルコール存在下、２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸（１）とジフェニルリン酸アジドを反応させることで、Ｎ－（ベンジルオキシカルボニル）－２－ヒドロキシシクロペンタノールを製造することができる。
前記式（９）中、Ｒは前記に同じである。
前記式（２）（５）中、Ｒ’は前記に同じである。
前記式（１）、（２）、（２）’、(４)、(９)において、ｎは０～８の整数を表す。中でも好ましくは０～３であり、さらに好ましくは１～３であり、最も好ましくは１である。
前記式（１）、（２）、（２）’、(４)、（９）において、＊１、＊２は不斉炭素を表す。＊１、＊２にそれぞれ独立して（Ｓ）の立体配置であっても良いし、（Ｒ）の立体配置であっても良い。中でも好ましくは＊１、＊２ともに（Ｒ）の立体配置である。
通常、前記式（４）は単離することなく反応に用いられる。前記式（４）の製造方法は特に限定されず、上記したＣｕｒｔｉｕｓ転位の一般的に用いる条件の他に、前記式（９）とヒドラジンを反応させることで一般式（７）；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
 で表されるヒドラジドを製造した後、続いて亜硝酸塩を作用させることによって製造しても良い。
前記式（７）中、ｎ、＊１、＊２は前記に同じである。
以下、実施例で本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。なお、以下の実施例において用いた組換えＤＮＡ技術に関する詳細な操作方法などは、次の成書に記載されている：
Molecular　Cloning　2nd　Edition（Cold　Spring　Harbor　Laboratory　Press,1989）、Current　Protocols　in　Molecular　Biology（Greene　Publishing　Associates　and　Wiley-Interscience）
（実施例１）スポロボロマイセス・サルモニカラー（Sporobolomyces　salmonicolor）由来のポリペプチド（ＡＲＩＩ）を生産する大腸菌　E.　coli　HB101（ｐＵＣＡＲ２）の製造
Applied　and　Environmental　Microbiology,　65(12),　5207-5211,　(1999)　に記載の方法で、プラスミドｐＵＣＡＲ２（ベクタープラスミドｐＵＣ１１８にポリペプチドＡＲＩＩの構造遺伝子を導入したプラスミド）を構築後、これを用いた大腸菌E.　coli　HB101の形質転換により大腸菌　E.　coli　HB101（ｐＵＣＡＲ２）を育種した。E.　coli　HB101（ｐＵＣＡＲ２）及びベクタープラスミドｐＵＣ１１８を有する組換え大腸菌　E.　coli　HB101（ｐＵＣ１１８）（比較例）を、２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％、イーストエキス１．０％、ＮａＣｌ０．５％、ｐＨ７．０）５ｍｌに接種し、３７℃で２０時間振盪培養した。
上記の培養で得られたそれぞれの培養液について、遠心分離により菌体を集め、５ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁した。これを、ＵＨ－５０型超音波ホモゲナイザー（株式会社エスエムテー製）を用いて破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。これら無細胞抽出液の２－オキソシクロペンタンカルボン酸エステル還元活性を測定した。
２－オキソシクロペンタンカルボン酸エステルに対する還元活性は、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に、２－オキソシクロペンタンカルボン酸メチル５ｍＭ、補酵素ＮＡＤＰＨ０．２５ｍＭ、及び粗酵素液を添加して３０℃で１分間反応を行い、波長３４０ｎｍにおける吸光度の減少速度より算出した。この反応条件において、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＰＨをＮＡＤＰ ＋ に酸化する酵素活性を１Ｕと定義した。
E.　coli　HB101（ｐＵＣ１１８）（比較例）の２－オキソシクロペンタンカルボン酸エステル還元活性は、０．１Ｕ／ｍｇ以下であるのに対して、ＡＲＩＩを発現させた　E.　coli　HB101（ｐＵＣＡＲ２）の２－オキソシクロペンタンカルボン酸エステル還元活性は３．３Ｕ／ｍｇであった。
以上のように、ポリペプチドＡＲＩＩは、目的の２－オキソシクロペンタンカルボン酸エステルに対して還元活性を有した。
（実施例２）遺伝子組換え生物　E.　coli　HB101（ｐＵＣＡＲ２）を用いた（１Ｒ，２Ｒ）－２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルの製造
E.　coli　HB101（ｐＵＣＡＲ２）を実施例１と同様に培養後、超音波ホモゲナイザーによる菌体破砕を実施し、無細胞抽出液１８０ｍｌを得た。この無細胞抽出液１８０ｍｌに、グルコース脱水素酵素（商品名：ＧＬＵＣＤＨ”Ａｍａｎｏ”II、天野エンザイム株式会社製）２２５０Ｕ、グルコース１２．５ｇ、ＮＡＤＰ＋２２ｍｇ、２－オキソシクロペンタンカルボン酸エチルを３．６ｇ添加し、５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を滴下することによりｐＨ６．５に調整しながら、３０℃で攪拌した。反応開始後２時間目に３．６ｇ、４．７５時間目に１．８ｇの２－オキソシクロペンタンカルボン酸エチルを追加添加し、２７時間攪拌して反応させた。反応後に、反応液の一部をサンプリングし、酢酸エチルで抽出した。抽出液を下記のガスクロマトグラフィーの条件で分析し、２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルへの変換率とトランス体比を測定した。その結果、２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルへの変換率は１００％であり、そのトランス体比は７６．４％であった。なお、トランス体比（％）は以下の式で算出した。
［トランス体比（％）］＝［トランス体のエリア］／（［トランス体のエリア］+［シス体のエリア］）×１００
［ガスクロマトグラフィーによる分析条件］
カラム：ＵＬＢＯＮ　ＨＲ－２０Ｍ（０．２５ｍｍ（内径）×２５ｍ；信和化工株式会社製）、検出：ＦＩＤ、カラム温度：１３０℃、注入温度：２００℃、検出温度：２００℃、キャリアーガス：ヘリウム（１３０ｋＰａ）、溶出時間：２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチル（トランス体）約１５．７分、２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチル（シス体）約８．１分、２－オキソシクロペンタンカルボン酸エチル　約８．８分。
また反応液から生成物をトルエンで抽出後、溶媒を留去することで８．３５ｇの２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルが得られた。得られた２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルを塩基条件下にてジニトロベンゾイルクロライドを作用させて誘導体化し、下記条件の高速液体クロマトグラフィーの条件で分析することにより光学純度を分析した。その結果、（１Ｒ，２Ｒ）体の光学純度は９９．３％ｅ．ｅ．であった。
［高速液体クロマトグラフィーによる分析条件］
カラム：Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ　ＡＤ－Ｈ（４．６μｍ（内径）×２５０ｍｍ；ダイセル化学工業株式会社製）、カラム温度：３０℃、検出波長：２４５ｎｍ、移動相：ｎ－ヘキサン／エタノール＝７０／３０、保持時間：（１Ｒ，２Ｓ）－２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチル　約７．２分、（１Ｓ，２Ｒ）－２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチル　約９．２分、（１Ｓ，２Ｓ）-２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチル　約１５．３分、（１Ｒ，２Ｒ）－２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチル　約１７．０分。
２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルのトランス比及び光学純度の分析結果より、２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルの４種類の立体異性体に占める（１Ｒ，２Ｒ）体の割合は７６．１％であった。
（実施例３）遺伝子組換え生物　E.　coli　HB101（ｐＵＣＡＲ２）を用いた（１Ｒ，２Ｒ）－２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸メチルの製造
E.　coli　HB101（ｐＵＣＡＲ２）を実施例１と同様に培養後、超音波ホモゲナイザーによる菌体破砕を実施し、無細胞抽出液１２００ｍｌを得た。この無細胞抽出液１２００ｍｌに、グルコース脱水素酵素（商品名：ＧＬＵＣＤＨ”Ａｍａｎｏ”II、天野エンザイム株式会社製）１５０００Ｕ、グルコース１６４ｇ、ＮＡＤＰ＋１１５ｍｇ、２－オキソシクロペンタンカルボン酸メチルを２５ｇ添加し、５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を滴下することによりｐＨ６．５に調整しながら、３０℃で攪拌した。反応開始後１．５時間目、３時間目、及び６時間目に各２５ｇ、９．５時間目に１２．５ｇの２－オキソシクロペンタンカルボン酸メチルを追加添加し、２７時間攪拌して反応させた。反応後に、反応液の一部をサンプリングし、酢酸エチルで抽出した。抽出液を下記のガスクロマトグラフィーの条件で分析し、２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸メチルへの変換率とトランス体比を測定した。その結果、２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸メチルへの変換率は９８％であり、そのトランス体比は８３．１％であった。
［ガスクロマトグラフィーによる分析条件］
カラム：ＵＬＢＯＮ　ＨＲ－２０Ｍ（０．２５ｍｍ（内径）×２５ｍ；信和化工株式会社製）、検出：ＦＩＤ、カラム温度：１３０℃、注入温度：２００℃、検出温度：２００℃、キャリアーガス：ヘリウム（１３０ｋＰａ）、溶出時間：２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸メチル（トランス体）約１４．３分、２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸メチル（シス体）約７．６分、２－オキソシクロペンタンカルボン酸メチル　約８．０分。
また反応液から生成物をトルエンで抽出後、溶媒を留去することで９５．８ｇの２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸メチルが得られた。得られた２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸メチルを塩基条件下にてジニトロベンゾイルクロライドを作用させて誘導体化し、下記条件の高速液体クロマトグラフィーの条件で分析することにより光学純度を分析した。その結果、（１Ｒ，２Ｒ）体の光学純度は９８．８％ｅ．ｅ．であった。
［高速液体クロマトグラフィーによる分析条件］
カラム：Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ　ＡＤ－Ｈ（４．６μｍ（内径）×２５０ｍｍ；ダイセル化学工業株式会社製）、カラム温度：３０℃、検出波長：２４５ｎｍ、移動相：ｎ－ヘキサン／エタノール＝７０／３０、保持時間：（１Ｒ，２Ｓ）－２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸メチル　約９．５分、（１Ｓ，２Ｒ）－２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸メチル　約１３．４分、（１Ｓ，２Ｓ）-２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸メチル　約１９．１分、（１Ｒ，２Ｒ）－２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸メチル　約２２．４分。
２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸メチルのトランス比及び光学純度の分析結果より、２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸メチルの４種類の立体異性体に占める（１Ｒ，２Ｒ）体の割合は８２．６％であった。
（実施例４）キャンディダ・マグノリエ由来のポリペプチドを用いた（１Ｓ，２Ｓ）－２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルの製造
２ｍｌの１００ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ６．５）に、グルコース４６ｍｇ、キャンディダ・マグノリエ（Candida　magnoliae）NBRC0705から調製したＣＲ酵素（国際公報ＷＯ０１／０４０４５０パンフレット、実施例１参照）１００Ｕ、グルコース脱水素酵素（商品名：ＧＬＵＣＤＨ”Ａｍａｎｏ”II、天野エンザイム株式会社製）　２５Ｕ、ＮＡＤＰ＋　１ｍｇ、２－オキソシクロペンタンカルボン酸エチル２０ｍｇ　を加えて、３０℃で２４時間攪拌した。実施例２に記載の方法で、反応後の２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルへの変換率、トランス体比、その光学純度を測定した。その結果、変換率は４５％で、トランス体比は５７．６％であった。また、光学純度は（１Ｓ，２Ｓ）体で９３．６％ｅ．ｅ．であることから、２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルの４種類の立体異性体に占める（１Ｓ，２Ｓ）体の割合は５５．８％であった。
（実施例５）ロードトルーラ・グルチニス・バー・ダイレネンシス由来のポリペプチドを用いた（１Ｓ，２Ｓ）－２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルの製造
ＣＲ酵素のかわりに、ロードトルーラ・グルチニス・バー・ダイレネンシス（Rhodotorula　glutinis　var.　dairenensis）NBRC0415から調製した還元酵素ＲＲＧ（国際公報ＷＯ０３／０９３４７７パンフレット、実施例１参照）１００Ｕを用いて、実施例４と同様に反応を実施した。２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルへの変換率は９９％で、トランス体比は９７．９％であった。また、光学純度は（１Ｓ，２Ｓ）体で１００％ｅ．ｅ．であることから、２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルの４種類の立体異性体に占める（１Ｓ，２Ｓ）体の割合は９７．９％であった。
（実施例６）オガタエア・ミヌータ・バー・ミヌータ由来のポリペプチドを用いた（１Ｓ，２Ｓ）－２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルの製造
ＣＲ酵素のかわりに、オガタエア・ミヌータ・バー・ミヌータ（Ogataea　minuta　var.　minuta）NBRC0975から調製した還元酵素（国際公報ＷＯ０６／０１３８０１パンフレット、実施例１参照）１００Ｕを用いて、実施例４と同様に反応を実施した。２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルへの変換率は９８％で、トランス体比は７０．０％であった。また、光学純度は（１Ｓ，２Ｓ）体で１００％ｅ．ｅ．であることから、２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルの４種類の立体異性体に占める（１Ｓ，２Ｓ）体の割合は７０．０％であった。
（実施例７）キャンディダ・ボイディニ由来のポリペプチドを用いた（１Ｓ，２Ｓ）－２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルの製造
ＣＲ酵素のかわりに、キャンディダ・ボイディニ（Candida　boidinii）由来のアルコール脱水素酵素ＣＰ（Julich　Fine　chemicals　社製）２０ｍｇを用いて、実施例４と同様に反応を実施した。２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルへの変換率は６０％で、トランス体比は７５．０％であった。また、光学純度は（１Ｓ，２Ｓ）体で１００％ｅ．ｅ．であることから、２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルの４種類の立体異性体に占める（１Ｓ，２Ｓ）体の割合は７５．０％であった。
（実施例８）サーモアナエロビウム・ブロッキ由来のポリペプチドを用いた（１Ｓ，２Ｓ）－２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルの製造
ＣＲ酵素のかわりに、サーモアナエロビウム・ブロッキ（Themoanaerobium　brockii）由来のアルコール脱水素酵素（シグマ　アルドリッチ　ジャパン株式会社製）５０ｍｇを用いて、実施例４と同様に反応を実施した。２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルへの変換率は１００％で、トランス体比は８０．４％であった。また、光学純度は（１Ｓ，２Ｓ）体で１００％ｅ．ｅ．であることから、２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルの４種類の立体異性体に占める（１Ｓ，２Ｓ）体の割合は８０．４％であった。
（実施例９）キャンディダ・マリス由来のポリペプチドを用いた（１Ｓ，２Ｒ）－２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルの製造
ＣＲ酵素のかわりに、キャンディダ・マリス（Candida　maris）NBRC10003から調製した還元酵素ＦＰＤＨ（国際公報ＷＯ０１／０５９９６パンフレット、実施例１４参照）１００Ｕを用いて、実施例４と同様に反応を実施した。２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルへの変換率は９５％で、シス体比は９７．４％であった。なお、シス体比（％）は以下の式で算出した。
［シス体比（％）］＝［シス体のエリア］／（［トランス体のエリア］+［シス体のエリア］）×１００
また、光学純度は（１Ｓ，２Ｒ）体で９９．１％ｅ．ｅ．であることから、２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルの４種類の立体異性体に占める（１Ｓ，２Ｒ）体の割合は９７．０％であった。
（実施例１０）デボシア・リボフラビナ由来のポリペプチドを用いた（１Ｓ，２Ｒ）－２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルの製造
ＣＲ酵素のかわりに、デボシア・リボフラビナ（Devosia　riboflavina）NBRC13584から調製した還元酵素ＲＤＲ（国際公報ＷＯ０４／０２７０５５パンフレット、実施例１参照）１００Ｕを用いて、実施例４と同様に反応を実施した。２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルへの変換率は９６％で、シス体比は９５．７％であった。また、光学純度は（１Ｓ，２Ｒ）体で９９．５％ｅ．ｅ．であることから、２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルの４種類の立体異性体に占める（１Ｓ，２Ｒ）体の割合は９５．５％であった。
（実施例１１）ブレブンディモナス・ディミヌータ由来のポリペプチドを用いた（１Ｓ，２Ｒ）－２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルの製造
ＣＲ酵素のかわりに、ブレブンディモナス・ディミヌータ（Brevundimonas　diminuta）NBRC13584から調製した還元酵素（国際公報ＷＯ０７／１１４２１７パンフレット、実施例４参照）１００Ｕを用いて、実施例４と同様に反応を実施した。２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルへの変換率は８０％で、シス体比は９３．４％であった。また、光学純度は（１Ｓ，２Ｒ）体で９８．６％ｅ．ｅ．であることから、２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルの４種類の立体異性体に占める（１Ｓ，２Ｒ）体の割合は９２．７％であった。
（実施例１２）ラクトバシラス・ブレビス由来のポリペプチドを用いた（１Ｓ，２Ｒ）－２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルの製造
ＣＲ酵素のかわりに、ラクトバシラス・ブレビス（Lactobacillus　brevis）由来のアルコール脱水素酵素（Julich　Fine　chemicals　社製）１００μｌを用いて、実施例４と同様に反応を実施した。２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルへの変換率は９８％で、シス体比は９８．７％であった。また、光学純度は（１Ｓ，２Ｒ）体で９９．５％ｅ．ｅ．であることから、２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルの４種類の立体異性体に占める（１Ｓ，２Ｒ）体の割合は９８．５％であった。
（実施例１３）ラクトバシラス・ケフィア由来のポリペプチドを用いた（１Ｓ，２Ｒ）－２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルの製造
ＣＲ酵素のかわりに、ラクトバシラス・ケフィア（Lactobacillus　kefir）由来のアルコール脱水素酵素（Fluka　社製）５０ｍｇを用いて、実施例４と同様に反応を実施した。２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルへの変換率は９８％で、シス体比は９７．７％であった。また、光学純度は（１Ｓ，２Ｒ）体で９８．５％ｅ．ｅ．であることから、２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルの４種類の立体異性体に占める（１Ｓ，２Ｒ）体の割合は９７．０％であった。
（実施例１４）キャンディダ・マルトーサ由来のポリペプチドを用いた（１Ｒ，２Ｓ）－２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルの製造
ＣＲ酵素のかわりに、キャンディダ・マルトーサ（Candida　maltosa）NBRC1977から調製した還元酵素（国際公報ＷＯ０８／０６６０１８パンフレット、実施例１参照）１００Ｕを用いて、実施例４と同様に反応を実施した。２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルへの変換率は４０％で、シス体比は９８．２％であった。また、光学純度は（１Ｒ，２Ｓ）体で９９．０％ｅ．ｅ．であることから、２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルの４種類の立体異性体に占める（１Ｒ，２Ｓ）体の割合は９７．７％であった。
（実施例１５）キャンディダ・パラプシロシス由来のポリペプチドを用いた（１Ｒ，２Ｓ）－２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルの製造
ＣＲ酵素のかわりに、キャンディダ・パラプシロシス（Candida　parapsilosis）NBRC708から調製した還元酵素（特開２００３－２８９８７４パンフレット、実施例１参照）１００Ｕを用いて、実施例４と同様に反応を実施した。２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルへの変換率は４０％で、シス体比は９８．２％であった。また、光学純度は（１Ｒ，２Ｓ）体で９９．０％ｅ．ｅ．であることから、２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルの４種類の立体異性体に占める（１Ｒ，２Ｓ）体の割合は９７．７％であった。
（実施例１６）ロドコッカス・エリスロポリス由来のポリペプチドを用いた（１Ｒ，２Ｓ）－２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルの製造
ＣＲ酵素のかわりに、ロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus　erythropolis）由来のアルコール脱水素酵素（Julich　Fine　chemicals　社製）１００μｌを用いて、実施例４と同様に反応を実施した。２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルへの変換率は４０％で、シス体比は９９．８％であった。また、光学純度は（１Ｒ，２Ｓ）体で９７．５％ｅ．ｅ．であることから、２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルの４種類の立体異性体に占める（１Ｒ，２Ｓ）体の割合は９８．６％であった。
（実施例１７）（１Ｒ，２Ｒ）－２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸アミドの製造
実施例３に記載した方法にて取得した（１Ｒ，２Ｒ）－２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸メチル（７３．３４ｇ、０．５２ｍｏｌ）と２０重量％ＮＨ３／ＭｅＯＨ溶液（６５８．２０ｇ、７．７４ｍｏｌ）をオートクレーブ中、密閉下、バス温８０℃にて４８時間の攪拌を行った。反応終了後、常温下にオートクレーブを開封し、内溶液をロータリーエバポレーターを用いて全量が１１０．１４ｇとなるまで濃縮した。濃縮液に酢酸エチル（４９０ｇ）を添加した後、析出した固体をろ過操作により取得し、表題化合物を得た（収量３５．１７ｇ、収率５３％）。１Ｈ－ＮＭＲより(１Ｒ，２Ｒ）－２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸アミド中に存在するジアステレオマーは、モル比で２．０％であった。
１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）１．５４－１．８０（ｍ，４Ｈ），１．９０－２．０４（ｍ，２Ｈ），２．５１－２．５７（ｍ，１Ｈ），４．２６（ｄｔ，１Ｈ）
（実施例１８）（１Ｒ，２Ｒ）－２－アミノシクロペンタノールの製造
実施例１７に記載した方法にて取得した（１Ｒ，２Ｒ）－２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸アミド（３４．００ｇ、０．２６ｍｏｌ）を水（１７０ｇ）に希釈し、バス温０℃下、３０重量％水酸化ナトリウム水溶液（７０．２０ｇ、０．５３ｍｏｌ）を３５分間かけて滴下した。続いて同温下、１３重量％次亜塩素酸ナトリウム水溶液（２２６．１０ｇ、０．４０ｍｏｌ）を２．５時間かけて滴下した。同温下、３０分間の攪拌を行った後、バス温４０℃下、さらに１時間の攪拌を行った。反応液を２０℃まで冷却した後、３５重量％塩酸を添加することで、系内のｐＨを６．８に調整した。反応液の標準品（（１Ｒ，２Ｒ）－２－アミノシクロペンタノール塩酸塩）と比較したガスクロマトグラフィー定量分析を行った結果、表題化合物の含有が確認された（収量２７．６１ｇ、収率８０％）。
（実施例１９）（１Ｒ，２Ｒ）－２－（ｔ－ブチルオキシカルボニルアミノ）シクロペンタノールの製造
実施例１８に記載した方法にて取得した（１Ｒ，２Ｒ）－２－アミノシクロペンタノールの水溶液（ｎｅｔ量：２７．６１ｇ、０．２１ｍｏｌ）に３０重量％水酸化ナトリウム水溶液を加え、系内のｐＨを１０．４に調整した。バス温２０℃下、ジ炭酸ｔ－ブチル（６８．９４ｇ、０．３２ｍｏｌ）を添加した。反応中、系内のｐＨが低下するため、適宜３０重量％ＮａＯＨを添加し、ｐＨ＝１０±０．５に調整した。同温にて１４時間の攪拌を行った後、濃塩酸を加え、系内のｐＨを４．０とした。トルエンを用いて２回抽出し（７０ｇ×２）、得られた有機層を水（７０ｇ）にて洗浄した。反応液の標準品と比較したガスクロマトグラフィー定量分析を行った結果、表題化合物の含有が確認された（収量３９．０４ｇ、収率９３％）。ロータリーエバポレーターを用いて、有機層を全量が１４５．５５ｇとなるまで濃縮した。
１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）１．３３－１．３９（ｍ，１Ｈ），１．４５(ｓ，９Ｈ)，１．６１－１．７０（ｍ，２Ｈ），１．７５－１．８３（ｍ，１Ｈ），１．９７－２．１４（ｍ，２Ｈ），３．５９－３．６６（ｍ，１Ｈ），３．９６－４．００（１Ｈ，ｍ），４．０６（ｂｒ，１Ｈ），４．７１（ｂｒ，１Ｈ）
（実施例２０）（１Ｒ，２Ｒ）－２－アミノシクロペンタノール塩酸塩の製造
実施例１９に記載した方法にて取得した（１Ｒ，２Ｒ）－２－（ｔ－ブチルオキシカルボニルアミノ）シクロペンタノールのトルエン溶液（ｎｅｔ量：３８．６０ｇ、０．１９ｍｏｌ）に対して、バス温５０℃下、２９．５重量％塩化水素／イソプロパノール溶液（１１８．５２ｇ、０．９６ｍｏｌ）を１．５時間かけて滴下した。同温下にて１．０時間、バス温２０℃下に１．０時間、バス温１０℃下に３．０時間の攪拌を行った後、ろ過操作により析出固体を取得した。取得固体をトルエン（２１．７０ｇ）とイソプロパノール（３８．２０ｇ）の混合液にて洗浄後、減圧乾燥を行い、表題化合物を得た（収量２０．５０ｇ、収率７８％）。
１Ｈ－ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）１．４３－１．５７（ｍ，２Ｈ），１．６０－１．７１(ｍ，２Ｈ)，１．８５－２．０３（ｍ，２Ｈ），３．０９－３．１４（ｍ，１Ｈ），３．９６－４．０２（ｍ，１Ｈ），５．２０－５．２１（ｄ，１Ｈ），８．０８（ｂｒ，３Ｈ）
（実施例２１）（１Ｒ，２Ｒ）－２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸アミドの製造
実施例１７に記載した方法にて取得した（１Ｒ，２Ｒ）－２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸アミド（６２．０２ｇ、０．４６ｍｏｌ）に酢酸エチル（２２３ｇ）とイソプロパノール（２５ｇ）を添加して、バス温８０℃の還流条件にて１８時間の攪拌を行った。その後、バス温２５℃まで冷却して３時間攪拌し、析出した固体をろ過操作により取得することで表題化合物を得た（収量５８．１１ｇ、収率９４％）。１Ｈ－ＮＭＲより(１Ｒ，２Ｒ）－２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸アミド中に存在するジアステレオマーは、モル比で０．４％であった。
１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）１．５４－１．８０（ｍ，４Ｈ），１．９０－２．０４（ｍ，２Ｈ），２．５１－２．５７（ｍ，１Ｈ），４．２６（ｄｔ，１Ｈ）

Claims (22)

  1. 一般式（９）；
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式中、Ｒは炭素数１～６の置換もしくは無置換のアルキル基、炭素数６～１０の置換もしくは無置換のアリール基、炭素数７～１１の置換もしくは無置換のアラルキル基を表す。ｎは０～８の整数を表す。＊１、＊２は不斉炭素を表す。）で表される光学活性２－ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステルの製造方法であって、一般式（８）；
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （式中、Ｒ，ｎは前記に同じ。）で表される２－オキソシクロアルカンカルボン酸エステルに、ポリペプチド、該ポリペプチドを産生する生物体、又は、該生物体の処理物を作用させて、２－オキソシクロアルカンカルボン酸エステルを還元することを特徴とする製造方法。
  2. ｎが１である請求項１に記載の製造方法。
  3. Ｒが炭素数１～６の置換もしくは無置換のアルキル基である、請求項１又は２に記載の製造方法。
  4. Ｒがメチル基もしくはエチル基である、請求項１～３のいずれか１項に記載の製造方法。
  5. ポリペプチドが、キャンディダ（Candida）属、ロードトルーラ（Rhodotorula）属、デボシア（Devosia）属、オガタエア（Ogataea）属、ブレブンディモナス（Brevundimonas）属、ラクトバシラス（Lactobacillus）属、サーモアナエロビウム（Themoanaerobium）属、ロドコッカス（Rhodococcus）属、スポロボロマイセス（Sporobolomyces）属、スポリディオボラス（Sporidiobolus）属からなる群より選ばれた微生物由来のものである、請求項１～４のいずれか１項に記載の製造方法。
  6. 前記式（９）で表される光学活性２－ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステルが、（１Ｒ，２Ｒ）－２－ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステルである、請求項１～４のいずれか１項に記載の製造方法。
  7. ポリペプチドが、スポロボロマイセス（Sporobolomyces）属、スポリディオボラス（Sporidiobolus）属からなる群より選ばれた微生物由来のものである、請求項６に記載の製造方法。
  8. ポリペプチドが下記（ａ１）、（ａ２）、及び（ａ３）；
    （ａ１）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    （ａ２）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつ前記式（８）とＮＡＤＰＨに作用して前記式（９）とＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチド、
    （ａ３）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有し、かつ前記式（８）とＮＡＤＰＨに作用して前記式（９）とＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチド、
    からなる群から選択されるポリペプチドである、請求項６又は７に記載の製造方法。　
  9. ポリペプチドが、下記（Ａ１）、（Ａ２）、（Ａ３）、及び（Ａ４）；
    （Ａ１）配列表の配列番号２に記載のＤＮＡ、
    （Ａ２）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ、
    （Ａ３）配列表の配列番号２に記載のＤＮＡと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ前記式（８）とＮＡＤＰＨに作用して前記式（９）とＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
    （Ａ４）、配列表の配列番号２に記載の塩基配列と８５％以上の配列同一性を有し、かつ２－オキソシクロペンタンカルボン酸エステルとＮＡＤＰＨに作用して（１Ｒ，２Ｒ）－２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エステルとＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
    からなる群から選択されるＤＮＡによりコードされるポリペプチドである、請求項６～８のいずれか１項に記載の製造方法。
  10. 前記式（９）において、＊１が（Ｓ）、＊２が（Ｓ）の絶対立体配置であり、かつポリペプチドがキャンディダ（Candida）属、ロードトルーラ（Rhodotorula）属、オガタエア（Ogataea）属、サーモアナエロビウム（Themoanaerobium）属からなる群から選ばれた微生物由来のものである、請求項１～４のいずれか１項に記載の製造方法。
  11. 前記式（９）において、＊１が（Ｓ）、＊２が（Ｒ）の絶対立体配置であり、かつポリペプチドがキャンディダ（Candida）属、デボシア（Devosia）属、ブレブンディモナス（Brevundimonas）属、ラクトバシラス（Lactobacillus）属からなる群から選ばれた微生物由来のものである、請求項１～４のいずれか１項に記載の製造方法。
  12. 前記式（９）において、＊１が（Ｒ）、＊２が（Ｓ）の絶対立体配置であり、かつポリペプチドがキャンディダ（Candida）属、ロドコッカス（Rhodococcus）属からなる群から選ばれた微生物由来のものである、請求項１～４のいずれか１項に記載の製造方法。
  13. ポリペプチドを産生する生物体が、大腸菌（Escherichia　coli）を宿主とする遺伝子組換え生物である、請求項１～１２のいずれか１項に記載の製造方法。
  14. 還元型補酵素再生能を有するポリペプチドを更に作用させる請求項１～１３のいずれか１項に記載の製造方法。
  15. 形質転換体が、還元型補酵素再生能を有するポリペプチドの生産能を付与されている、請求項１３又は１４に記載の製造方法。
  16. 還元型補酵素再生能を有するポリペプチドがグルコース脱水素酵素である請求項１４又は１５に記載の製造方法。
  17. 請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法にて製造した一般式（９）；
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     （式中、Ｒは炭素数１～６の置換もしくは無置換のアルキル基、炭素数６～１０の置換もしくは無置換のアリール基、炭素数７～１１の置換もしくは無置換のアラルキル基を表す。ｎは０～８の整数を表す。＊１、＊２は不斉炭素を表す。）で表される２－ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステルを、アンモニアと反応させ、一般式（３）；
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     （式中、＊１、＊２は前記に同じ。）で表される２－ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸アミド体を得ることを特徴とする製造方法。
  18. 前記式（３）で表される２－ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸アミドを、晶析精製することを特徴とする請求項１７に記載の製造方法。
  19. 前記式（３）中に存在するジアステレオマー含量が、モル比で５．０モル％以下である請求項１８に記載の製造方法。
  20. 前記式（３）中に存在するジアステレオマー含量が、モル比で２．０モル％以下である請求項１８又は１９に記載の製造方法。
  21. 請求項１７～２０のいずれか１項に記載の方法にて製造した一般式（３）；
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     （式中、＊１、＊２は前記に同じ。）で表される２－ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸アミドを塩基存在下、ハロゲン化剤と反応させ、一般式（２）；
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     （式中、Ｒ’は炭素数１～６の置換もしくは無置換のアルキル基、炭素数６～１０の置換もしくは無置換のアリール基、炭素数７～１１の置換もしくは無置換のアラルキル基を表す。＊１、＊２は前記に同じ。）で表される２－アミノシクロアルカノール誘導体、もしくは一般式（２）’；
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
     （式中、＊１、＊２は前記に同じ。）で表される２－アミノシクロアルカノールを得ることを特徴とする製造方法。
  22. ＊１、＊２がともに（Ｒ）の立体配置である請求項１７～２１のいずれか１項に記載の製造方法。
    　
    　
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2020517284A (ja) * 2017-04-27 2020-06-18 コデクシス， インコーポレイテッド ケトレダクターゼポリペプチドおよびポリヌクレオチド
CN112458142A (zh) * 2020-12-11 2021-03-09 上海合全药物研发有限公司 生物催化制备(1r,2r)-2-羟基环戊腈的方法

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104163773B (zh) * 2013-08-30 2016-04-27 郑州后羿制药有限公司 一种四环素的精制方法
JP7021503B2 (ja) * 2017-11-02 2022-02-17 三菱瓦斯化学株式会社 脂肪族ジアミンの製造方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH05192187A (ja) * 1991-02-25 1993-08-03 Takeda Chem Ind Ltd 光学活性２−ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステル類の製造法
US20040101937A1 (en) * 2002-07-10 2004-05-27 Moore Jeffrey C. Process for reducing an alpha-keto ester

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH05192187A (ja) * 1991-02-25 1993-08-03 Takeda Chem Ind Ltd 光学活性２−ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステル類の製造法
US20040101937A1 (en) * 2002-07-10 2004-05-27 Moore Jeffrey C. Process for reducing an alpha-keto ester

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BUISSON D. ET AL.: "Diastereoselective and enantioselective microbial reduction of cyclic alpha-alkyl beta-ketoesters", TETRAHEDRON LETT., vol. 27, no. 23, 1986, pages 2631 - 2634, XP009019685, DOI: doi:10.1016/S0040-4039(00)84603-1 *
PADHI S.K. ET AL.: "Reduction of cyclic b- ketoester by individual Saccharomyces cerevisiae dehydrogenase & chemoenzymatic route to (1R,2S)-2-methyl-1-cyclohexanol", TETRAHEDRON ASYM., vol. 18, no. 18, 2007, pages 2133 - 2138 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2020517284A (ja) * 2017-04-27 2020-06-18 コデクシス， インコーポレイテッド ケトレダクターゼポリペプチドおよびポリヌクレオチド
US11021729B2 (en) 2017-04-27 2021-06-01 Codexis, Inc. Ketoreductase polypeptides and polynucleotides
JP7045725B2 (ja) 2017-04-27 2022-04-01 コデクシス， インコーポレイテッド ケトレダクターゼポリペプチドおよびポリヌクレオチド
US11746369B2 (en) 2017-04-27 2023-09-05 Codexis, Inc. Ketoreductase polypeptides and polynucleotides
CN112458142A (zh) * 2020-12-11 2021-03-09 上海合全药物研发有限公司 生物催化制备(1r,2r)-2-羟基环戊腈的方法
CN112458142B (zh) * 2020-12-11 2023-05-12 上海合全药物研发有限公司 生物催化制备(1r,2r)-2-羟基环戊腈的方法

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