KR20010071908A - 케톤의 입체 선택적인 환원적 아민화 - Google Patents

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메리 조 도노반
스티븐 골드버그
로날드 엘. 한슨
폴 에이. 쟤스
웬-센 리
라메쉬 엔. 파텔
케이쓰 라미그
라즐로 제이. 스자르카
죤 제이. 베니트
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스티븐 비. 데이비스
브리스톨-마이어스스퀴브컴파니
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Abstract

특정 케토 카르복실산 유도체를 입체선택적 효소로 전환하여 상응하는 알킬아미노산 화합물을 형성하는 방법이 기술된다. 본 발명은 또한, 페닐알라닌 디히드로게나제를 발현시킬 수 있는 재조합 핵산을 함유하는 조작된 효모 숙주 세포, 및 페닐알라닌 디히드로게나제 효소를 발현시킬 수 있는 재조합 핵산 및 포르메이트 디히드로게나제 효소를 발현시킬 수 있는 핵산을 포함하는 조작된 숙주 세포에 관한 것이다.

Description

케톤의 입체 선택적인 환원적 아민화 {STEREOSELECTIVE REDUCTIVE AMINATION OF KETONES}
미국 특허 제5,508,272호에서 로블(Robl)은 중성 엔도펩티다아제 (endopeptidase)및 안지오텐신 전환 효소 (angiotensin converting enzyme) 억제 활성을 갖는 것으로서 A가인 하기 화학식의 화합물을 개시한다.
이들 화합물 중 [4S-[4α(R*), 7α, 10αβ]]-옥타히드로-4-[(2-머캅토)-1-옥소-3-페닐프로필)아미노]-5-옥소-7H-피리도[2,1-b][1,3]티아제핀-7-카르복실산은 현재 임상 실험 중이다. 이 화합물은 BMS 186,716으로서 문헌에 보고된다.
로블은 BMS 186,716의 아미노 락탐 부분, 즉 하기 구조의 중간체가
(S)-2-아미노-6,6-디메톡시헥산산 메틸 에스테르와 같은 알킬 에스테르 화합물을 하기 구조의 N-보호된 아미노산과 커플링시켜,
하기 화학식의 디펩티드를 얻음으로써 제조될 수 있음을 개시한다
상기 식에서, P1은 아미노 보호기이고 P2는 황 보호기이다.
P2보호기 제거, 산 촉매 고리화, 및 P1보호기 제거를 행하여 [4S-(4α, 7α, 10αβ)]-옥타히드로-4-아미노-5-옥소-7H-피리도[2,1-b][1,3]티아제핀-7-카르복실산, 메틸 에스테르를 얻는다.
로블은 N-보호된 L-ε-히드록시노르류신을 그의 메틸 에스테르로 변환시키고, 이를 상응하는 하기 화학식과 같은 알데히드로 산화시키고,
이후 강산 촉매 존재 하에서 트리메틸 오르도포르메이트와 반응시키고, P3보호기를 제거시킴으로써 (S)-2-아미노-6,6-디메톡시헥산산 메틸 에스테르와 같은, (S)-2-아미노-6,6-디알콕시헥산산 알킬 에스테르를 제조하는 방법을 개시한다.
발명의 요약
본 발명은 특정한 케토 카르복실산 유도체를 입체 선택적인 효소적 변환으로 그의 상응하는 알킬아미노산 화합물을 형성하는 방법을 제공한다. 본 발명의 효소적 방법에 의해 제조된 아미노 화합물은 그의 상응하는 (S)-2-아미노-6,6-디알콕시헥산산 알킬 에스테르 또는 인산염, 옥살산염 또는 N-(트리플루오로아세틸)-L-호모시스테인, (1→1')-디설파이드와 같은 화합물과의 이염과 같은 이러한 화합물의 안정한 염으로 편리하게 변환될 수 있다.
더욱 구체적으로, 본 발명은 하기 화학식 (II)의 알킬케토 화합물을 화학식 (I)의 화합물 형성에 적합한 조건하에서 암모니아 및 보조 인자 존재 하 아미노산 디히드로게나제(dehydrogenase)와 접촉시키는 것을 포함하는, 하기 화학식 (I)의 알킬아미노산 화합물의 제조 방법에 대한 것이다:
상기 식에서, R1은 수소, 1가 양이온, 또는 C1-C18알킬 (바람직하게는 C1-C10알킬, 더욱 바람직하게는 저급 알킬)이고, R2는 하기 화학식의 잔기들 중 하나이다:
,, 또는
상기 식에서, 각각의 R3는 C1-C18알킬 (바람직하게는 C1-C10알킬, 더욱 바람직하게는 저급 알킬)이고, R4는 H 또는 R3이다.
상기 식에서, R2및 R1은 상기 정의한 바와 같다.
본 발명은 또한 페닐알라닌 디히드로게나제 효소를 발현시킬 수 있는 재조합 핵산 및 포르메이트 디히드로게나제 효소를 발현시킬 수 있는 내생적(endogeneous) 또는 재조합(recombinant) 핵산을 함유하는 유전 공학적으로 제조된 효모 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명은 입체 선택적인 효소 환원적 아민화 방법에 관한 것이다.
도 1. 플라스미드 pET-15b. 이 서열은 pBR322 관습에 의해 번호가 매겨진다. 서열 랜드마크는 453-469의 T7 프로모터; 452에서의 T7 전사 개시; 362-380의 His Tag 코딩 서열; 213-259의 T7 종결서열; 3882에서의 pBR322 원점; 및 4643-5500의bla코딩 서열을 포함한다.
도 2. 플라스미드 pET-9b.
도 3. 플라스미드 pPICZ A, B, C. 특징들로는 1-942의 5'AXO1프로모터 영역; 824의AOX1mRNA의 5' 말단; 855-875의 5'AXO1프라이밍 부위; 932-1011의 다중 클로닝 부위; 1012-1044의myc에피토프 태그; 1057-1077의 폴리히스티딘 태그; 1160-1180의 AOX 프라이밍 부위; 1251의 mRNA의 3' 말단; 1078-1419의AOX1전사 종결 영역; 1420-1831의 TEF1 프로모터를 함유하는 단편; 1832-1899의 EM7 프로모터; 1900-2274의Sh bleORF; 2275-2592의 CYC1 전사 종결 영역; 2603-3276의 ColE1 원점을 포함한다.
도 4. 플라스미드 pPIC9k. 특징들로는 1-948의 5'AOX1프로모터 단편; 855-875의 5'AOX1프라이머 부위; 949-1218의 알파-인자 분비 신호(들); 1152-1172의 알파-인자 프라이머; 1192-1241의 다중 클로닝 부위; 1327-1347의 3'AOX1프라이머 부위; 1253-1586의AOX1전사 종결 영역; 4514-1980의HIS4ORF; 5743-4928의 카나마이신 내성 유전자; 6122-6879의3' AOX1단편; 7961-7288의 ColE1 원점; 8966-8106의 암피실린 내성 유전자를 포함한다.
도 5. 플라스미드 pGAPZ A, B, C. 특징으로는 1-483의GAP프로모터 영역; 455-476의 pGAP 포워드 프라이밍 부위; 484-563의 다중 클로닝 부위; 564-593의myc에피토프 태그; 609-626의 폴리히스티딘 태그; 711-731의 3'AOX1프라이밍 부위; 630-970의AOX1전사 종결 영역; 971-1381의TEF1프로모터를 함유하는 단편; 1382-1449의 EM7 프로모터; 1450-1824의Sh bleORF; 1825-2142의 CYC1 전사 종결 영역; 2153-2826의 ColE1 원점을 포함한다.
도 6. 플라스미드 pGAPk는 pPIC9k의 8980 bp BamHI/NotI 단편내로 클로닝된, GAP 프로모터 및 다중 클로닝 부위를 함유하는 pGAPZ로부터의 546 염기쌍(bp) Bgl II/NOtI 단편을 갖는다.
상기 화학식에서 1가 양이온은 예를 들면, 리튬, 칼륨, 나트륨, 암모늄 등일 수 있다. R1이 수소, 암모늄, 리튬, 또는 칼륨이고, R2는 하기 화학식의 디옥솔란 잔기인 것이 바람직하다.
R3가 저급 알킬, 특히 메틸인 것이 또한 바람직하다.
본 발명의 가장 바람직한 환원적 아민화 방법은 5-(1,3-디옥솔란-2-일)-2-옥소-펜탄산을 하기에 도시된 환원적 아민화에 의해 5-(1,3-디옥솔란-2-일)-2S-아미노-펜탄산(L-알리신 에틸렌 아세탈)로 변환시키는 것을 포함한다:
상기 식에서 R1은 수소 또는 리튬이다.
본원에 단독으로 또는 또다른 기의 부분으로서 사용된 용어 "알킬" 또는 "알크"는 임의로 치환된, 그러나 바람직하게는 비치환된, 직쇄 및 분지쇄 포화 탄화수소기를 나타내고, 바람직하게는 쇄 내에 1 내지 10개의 탄소를 갖는다. 비치환된 이러한 기의 예로는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, t-부틸, 펜틸, 헥실, 이소헥실, 헵틸, 4,4-디메틸, 펜틸, 옥틸, 2,2,4-트리메틸펜틸, 노닐, 데실 등이 있다. 상기 알킬기는 본 발명의 용도에 적합한 화합물을 제공하는 적합한 치환기에 의해 치환될 수 있다. 알킬기의 치환기의 예로는 1개 이상의, 바람직하게는 3개 이하의 클로로기, 브로모기, 또는 요오도기가 있다.
본원에 사용된 용어 "저급 알킬"은 1 내지 3개의 탄소 원자를 갖는 알킬기를 나타낸다.
본 발명의 환원적 아민화 방법은 입체 특이적 결과를 얻는 잇점을 갖는다. 이 방법은 바람직한 에난티오머 및 바람직하지 않은 에난티오머의 라세미 혼합물 보다는 S 에난티오머를 주로 생성한다. 특정한 실시 양태의 추가적 잇점은 예를 들면, 다단계 화학적 합성과 비교해 단일 단계인 입체 특이적 환원을 포함한다.또한, 환원이 특히 약 40oC 및 주위 압력에서 촉매될 때, 케톤 화합물로부터 상응하는 아민 화합물의 바람직한 에난티오머로의 변환율이 높고, 이 아민 화합물의 에난티오머 순도가 높다.
효소 변환 방법을 위해, R1이 리튬과 같은, 1가 양이온일 때, 대체로 분리 방법은 이 양이온을 수소로 변환시키는 pH를 낮추는 것을 포함한다.
본 발명에 사용된 아미노산 디히드로게나제는 본원에 기술된 입체 선택적인 효소 환원적 아민화를 촉매할 수 있는 임의의 아미노산 디히드로게나제일 수 있다. 효소원으로서 효소 또는 미생물 물질은 유동적 상태 또는 물리적 흡수 또는 엔트랩먼트 (entrapment)에 의해서와 같이 지지대에 비유동적으로 고정된 상태로 사용될 수 있다.
원천 또는 순도에 상관 없이, 적합한 효소는 아미노산 디히드로게나제로 언급되는 효소들이다. 사용되는 효소는 예를 들면, 세포 현탁액의 균질화, 붕해, 원심분리, DEAE-셀룰로즈 크로마토그래피, 암모늄 설페이트 분별법, 세파크릴 (알릴 덱스트란 및 N,N'-메틸렌 비스아크릴아미드의 교차연결된 공중합체) 크로마토그래피와 같은 겔 여과 매체를 이용한 크로마토그래피, 및 모노-Q (4급 아민기를 통해 음으로 하전된 생분자를 결합시키는 음이온 교환기) 크로마토그래피와 같은 이온 교환 크로마토그래피에 의해 미생물로부터 분리된 효소일 수 있다.
선택적으로, 본 발명의 환원적 아민화 방법은 효소의 원료로서 손상되지 않은 세포 또는 세포 추출물을 사용할 수 있다. 미생물의 사용과 관련하여, 본 발명의 방법은 본원에 기술된 입체 선택적 효소 환원을 촉매할 수 있는 적합한 미생물 물질을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들면, 세포는 손상되지 않은 젖은 세포 또는 동결건조, 분무-건조 또는 열-건조된 세포와 같은 건조된 세포의 형태로, 또는 파괴된 세포 또는 세포 추출물과 같은 처리된 세포 물질의 형태로 사용될 수 있다. 적합한 미생물로는 박테리아, 효모 및 곰팡이속, 예를 들면, 비. 섭틸리스(B. subtilis)와 같은 바실러스종, 스포로사르시나종, 티. 인터메디우스(T. intermedius)와 같은 써모악티노마이세스종 등이 있다.
유전공학적으로 제조된 생물체의 사용이 또한 내포된다. 숙주 세포는 본원에 기술된 촉매 작용을 할 수 있는 1개 이상의 아미노산 디히드로게나제를 발현시키는 유전자 또는 유전자들을 함유하도록 개질된 세포, 예를 들면 에스케리키아 콜리(Escherichia coli), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 등 일 수 있다.
이후에 더욱 상세히 설명되는 바대로, 본 발명의 바람직한 특정한 유전공학적으로 제조된 생물체는 또한 보조 인자 (포르메이트 디히드로게나제와 같은)를 재생시키는 제2 효소를 발현시킨다. 이 제2 효소를 코딩하는 핵산은 내생적이거나 또는 재조합 기술을 통해 유전 공학적으로 세포내 제조될 수 있다.
피치아속의 미생물, 특히피치아 파스토리스, 특히피치아 파스토리스ATCC 74408 및피치아 파스토리스ATCC 74433을 사용하는 것이 특히 바람직하다. 또다른 바람직한 생물체는이. 콜리ATCC 98374이다. 본원에 사용된 용어 "ATCC"는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection, 특허 기탁, 버지니아주 20110-2209, 마나싸스, 유니버시티 블루바드 10801)의 추적 번호 및 언급된미생물의 기탁을 의미한다.피치아 파스토리스ATCC 74408은 부다페스트 조약의 규정에 따라 1997년 3월 26일 ATCC에 기탁되었다.피치아 파스토리스ATCC 74433은 부다페스트 조약의 규정에 따라 1998년 2월 13일 ATCC에 기탁되고,E. coliATCC 98374는 부다페스트 조약의 규정에 따라 1997년 3월 26일 ATCC에 기탁되었다. 본 발명에서 이들 생물체 (미생물)로부터 분리된 효소 또는 세포 추출물을 사용하는 것이 또한 특히 바람직하다.
본 발명의 입체 선택적인 효소 환원 방법은 사용된 미생물의 발효에 이어 순차적으로 수행 (2단계의 발효 및 환원)되거나, 또는 동시에 수행될 수 있다. 즉, 후자의 경우에, 동일 반응계 내 발효 및 환원 (1단계의 발효 및 환원)이 수행될 수 있다. 1단계 방법에서, 미생물은 충분한 성장이 이루어질 때까지 적합한 배지에서 배양될 수 있다. 그 다음 화학식 (II)의 화합물을 미생물 배양액에 첨가하고, 입체 선택적인 효소적 환원은 발효에 이어, 바람직하게는 완전한 변환이 이루어질 때까지 계속될 수 있다.
2단계 방법에서, 미생물은 제1단계에서 바람직한 효소 (즉, 환원적 아민화) 활성이 나타날 때까지 적합한 발효용 배지에서 배양될 수 있다. 이후, 세포는 원심분리에 의해 수확되고 적합한 완충액에서 수확된 세포를 현탁시킴으로써 미생물 세포 현탁액을 제조한다. 트리스-HCl, 포스페이트, 소듐 아세테이트 등과 같은 완충액이 사용될 수 있다. 물이 또한 미생물 세포의 현탁액을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 제2 단계에서, 화학식 (II)의 화합물은 미생물 세포 현탁액과 혼합될 수 있고, 화합물의 입체 선택적인 효소 환원은 이 미생물 세포 현탁액에 의해 촉매될수 있다. 환원은 바람직하게는 모든 또는 거의 모든 화학식 (II)의 화합물이 입체 선택적으로 환원될 때까지 수행된다.
미생물의 배양은 적합한 배지를 사용함으로써 당업자에 의해 이루어질 수 있다. 미생물 배양을 위한 적합한 배지는 미생물 세포의 배양에 필요한 영양분을 공급하는 것을 포함한다. 배양을 위한 전형적인 배지는 필요한 탄소원, 질소원, 및 미량 원소를 포함한다. 유발제가 또한 첨가될 수 있다. 본원에 사용된 "유발제"는 케토기를 함유하는 화합물과 같은, 미생물 세포 내에서 원하는 효소적 환원 아민화 활성의 형성을 증진시키는 임의의 화합물을 포함한다. 화학식 (I)의 화합물이 미생물의 배양 중에 유발제로서 첨가될 수 있다. 유전 공학적으로 제조된 효모 및 박테리아 배양에서는, 메탄올 및 이소프로필 베타 갈락토시드(IPTG)가 각각, 좋은 유발제이다.
탄소원은 말토스, 락토스, 글루코스, 프럭토스, 글리세롤, 소르비톨, 슈크로스, 전분, 만니톨, 프로필렌 글리콜 등과 같은 당; 소듐 포르메이트, 소듐 아세테이트, 소듐 시트레이트 등과 같은 유기산; 소듐 글루타메이트 등과 같은 아미노산; 및 메탄올, 에탄올, 프로판올 등과 같은 알콜을 포함할 수 있다.
질소원은 N-Z 아민 A, 옥수수 침지액, 대두밀, 소고기 추출물, 효모 추출물, 이스트아민, 당밀, 베이커스 효모, 트립톤, 뉴트리소이, 펩톤, 소듐 니트레이트, 암모늄 설페이트 등을 포함할 수 있다.
미량 원소는 포스페이트 및 마그네슘, 망간, 칼슘, 코발트, 니켈, 철, 나트륨 및 칼륨 염들을 포함할 수 있다.
사용된 배지는 1개 이상의 탄소 또는 질소원 또는 다른 영양분을 포함할 수 있다.
써모악티노마이세스종을 위한 바람직한 배지는 하기 성분 (중량%)을 갖는 수성 배지이다:
성분
L-페닐알라닌 0.5 %
NZ 아민 A 2 %
효모 추출물 0.5 %
K2HPO40.2 %
NaH2PO40.1 %
MgSO4H2O 0.02 %
안티폼, 예를 들면, SAG5693 0.02 %
pH 6.5-6.9
E. coli를 위한 바람직한 배지는 하기 성분 (중량%)을 갖는 수성 배지이다:
성분
NZ 아민 A 1 %
이스트아민 2 %
글리세롤 2 %
Na2HPO40.6 %
K2HPO40.3 %
(NH4)2SO40.125 %
프로필렌 글리콜 0.05 %
MgSO47H2O 0.0246 %
카나마이신 0.005 %
이소프로필 β-D-티오갈락토시드 0.00238 %
pH 7.0-7.2
효모를 위한 바람직한 배지는 하기 성분 (중량%)을 갖는 수성 배지이다:
배지 1:
성분
아미노산 없는 효모 질소 염기 1.34 %
펩톤 2.0 %
효모 추출물 1.0 %
글리세롤 1.0 %
메탄올 0.5 %
K2HPO40.282 %
KH2PO41.14 %
바이오틴 4 x 10-5%
안티폼, 즉, A289 0.01 %
pH 6.0
배지 1에서 효모를 배양하는 중에, 메탄올 농도는 요구되는 바와 같이 메탄올 공급에 의해 약 0.5%로 유지되었다.
배지 2:
성분
펩톤 2.0 %
효모 추출물 1.0 %
글루코스 2.0 %
안티폼 A289 0.01 %
pH 6.0
배지의 pH는 바람직하게는 특정한 배지에 의존적으로, 약 6 내지 8로 조정되고, 예를 들면, 약 121℃ 온도에서 30분 동안 멸균되고, 멸균 후 바람직한 pH로 조정된다.
본 발명의 방법은 화학식 (I)의 원하는 화합물을 형성하기에 적합한 조건 하에서 수행된다. 미생물을 배양하는 도중 배지의 pH는 바람직하게는 약 4 내지 10, 더욱 바람직하게는 약 6 내지 8로 유지된다. 입체 선택적인 환원 방법 도중에는, 그것이 효소로 수행되든지 또는 미생물로 수행되든지, pH는 약 7내지 9.5, 바람직하게는 약 8로 유지된다.
온도는 입체 선택적인 환원 방법에 유용한 열 에너지의 척도이고, 이 방법을 위해 이용 가능한 충분한 에너지가 존재하도록 유지되어야 한다. 본 발명의 방법을 위해 적합한 온도 범위는 약 15 내지 약 60oC이다. 바람직한 온도 범위는 약 25 내지 약 45oC이다.
압력은 본 발명을 실시하는 데 중요하다고 알려져 있지 않고 편의상 대기압 정도의 압력이 대체로 사용된다.
미생물을 배양시킬 때, 본 발명의 방법은 바람직하게는 호기 조건 하에서 수행된다. 반응 혼합물의 교반 및 통기는 예를 들면, 1단계 또는 2단계 방법으로 미생물을 배양시키는 중에 교반 플라스크 배양액 또는 발효기 탱크에서 수행될 수 있는 입체 선택적인 환원 공정 및 발효 공정 중에서 이용 가능한 산소량에 영향을 미친다. 50 내지 500 RPM의 교반 범위가 바람직하고, 50 내지 100 RPM이 가장 바람직하다. 분당 배지 용량당 약 0.1 내지 10배수 용량의 통기 (0.1 내지 10 v/v/m)가 바람직하고, 분당 배지 용량당 약 5배수 용량의 통기 (5 v/v/m)가 가장 바람직하다.
환원 공정이 미생물 배양후 제2 단계에서 수행된다면, 산소는 필요하다고 알려져 있지 않고 해로울 수도 있다.
화학식 (II)의 화합물의 완전한 변환은 예를 들면, 약 4 내지 48시간, 바람직하게는 약 12 내지 30시간이 걸릴 수 있고, 이 시간은 본원에 기술된 미생물 또는 효소로 화학식 (II)의 화합물을 처음 처리하는 시간으로부터 측정된다.
본 발명의 입체 선택적인 효소적 환원 공정은 보조 인자를 사용하여 수행된다. 보조 인자는 케토산의 환원을 위한 매개체로 작용한다. 보조 인자의 양은 통상적으로 약 0.05 내지 약 2 mM이고, 바람직하게는 약 0.5 내지 약 1 mM이다. 본 발명에 유용한 보조 인자는 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (NAD), 환원된 NAD (NADH), 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트 (NADP), 및 환원된 NADP (NADPH)이다. NADH가 가장 바람직하다. 분리된 효소가 사용될 때, 보조 인자의 사용이 필요하다. 예를 들면, NADH는 재생되어 재사용될 수 있다. 동일 반응계 내에서 보조 인자를 재생시키는 것이 바람직하다. 바람직한 재상 수단은 포르메이트 디히드로게나제 (FDH), 글루코스 디히드로게나제, 알콜 디히드로게나제 등과 같은 보조 인자를 재생시키는 제2 형태의 효소를 사용하는 것이다. 적합한 수소 공여체는 분자 수소, 글루코스, 에탄올, 또는 포르메이트 (예를 들면, 알칼리 금속 또는 암모늄 포르메이트)를 포함한다. 화학적 환원 (예를 들면, 디티오니트 사용) 또는 비올로겐, 예를 들면 메틸 비올로겐 존재 하에서의 전기 화학적 환원이 또한 사용될 수 있다. 바람직한 실시 양태에서, 반응 중 생성된 NAD는 바람직하게는 FDH를 이용한 포르메이트의 이산화탄소로의 산화에 의해 또는 글루코스 디히드로게나제를 이용한 글루코스의 글루콘산으로의 산화에 의해 NADH로 재순환될 수 있다. 바람직한 실시 양태에서는, 단일 숙주 세포 균주가 PDH 및 FDH 모두의 원천으로서 사용된다. 특히 바람직한 실시 양태에서는, 재조합 또는 유전 공학적으로 제조된 숙주 세포가 아미노산 디히드로게나제, 특히 PDH, 및 FDH 둘다의 원천으로서 사용된다. 본 발명에 사용되기에 바람직한 생물체, 즉,피치아 파스토리스, ATCC 74408은 재조합 PDH를 발현시키기 위해 유전 공학적으로 조작되었을 뿐만 아니라, 내생적 FDH 활성의 수준도 또한 증가된다는 것이 놀랍게도 발견되었다. 본 발명에 사용되기에 바람직한 또다른 바람직한 생물체, 즉,피치아 파스토리스ATCC 74433은 재조합 PDH 및 재조합 FDH 둘다를 발현시키기 위해 유전 공학적으로 조작된다.
유기 액체, 또는 혼화성 또는 불혼화성 (2개상의) 유기/수성 액체 혼합물이 또한 사용될 수 있다 하더라도, 반응 매체로 수성 액체를 사용하는 것이 바람직하다.
화합물 및 반응 매체의 혼합 중량을 기준으로 화학식 (II) 출발 물질의 화합물을 0.1 내지 25 중량% 사용하는 것이 바람직하다. 출발 물질에 대해 사용된 효소 또는 미생물의 양은 본 발명의 입체 선택적인 효소 환원을 촉매하도록 선택된다.
본 발명의 입체 선택적인 환원 공정의 생성물은 단리될 수 있고 원한다면, 추출, 증류, 결정화, 칼럼 크로마토그래피 등과 같은 공지의 방법에 의해 정제될 수 있다.
반응 매체에 남아 있는 화합물로부터 화학식 (I)의 바람직한 화합물을 분리하는 방법은 물을 제거하여 농축하고, 이후 메탄올을 첨가하여 아미노산을 결정화시키는 것이다.
본원에 유용한 바람직한 아미노산 디히드로게나제는 화학식 (II)의 상기 기술된 케톤과의 반응 활성을 갖는 아미노산 디히드로게나제들로부터 선택된다. 이러한 아미노산 디히드로게나제들로는 알라닌 디히디로게나제, 페닐알라닌 디히드로게나제, 류신 디히드로게나제, 글루타메이트 디히드로게나제, 발린 디히드로게나제 등이 있다. 본 발명은 또한 특히 전체 세포 또는 조추출물을 사용할 때처럼, 2개 이상의 아미노산 디히드로게나제를 사용하는 것을 포함한다. 본 발명에 유용한 아미노산 디히드로게나제는 대체로 다양한 식물, 동물, 및 미생물원으로부터 얻는다. 선택적으로, 본 발명에 유용한 효소는 합성적 수단, 즉, 당업자에게 공지된 방법에 의한, 그 성분 아미노산으로부터 폴리펩티드를 화학적으로 합성하여 얻어질 수 있다. 예를 들면, 문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci.,Houghton et al., 82, 5131-5135, 1985]에 기술된 고체상 방법이 사용될 수 있다. 이 효소는 원하는 효소 (내생적 또는 재조합)를 코딩하는 DNA 서열을 발현시키는 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 생성함으로써, 또는 바람직한 효소의 전부 또는 일부를 코딩하는 DNA 서열에 의해 코딩되는 mRNA를 시험관 내 번역시킴으로써 얻어질 수도 있다. 이들 방법에 의한 폴리펩티드 생성 기술은 당업계에 공지되어 있고, 본원에 기술되어 있다. 본원에 유용한 효소의 구체적 예는 소간의 글루타메이트 디히드로게나제, 바실러스 섭틸리스로부터의 알라닌 디히드로게나제, 스포로사르시나종으로부터의 페닐알라닌 디히드로게나제, 바실러스 스페리쿠스(Bacillus sphaericus) ATCC 4525로부터의 류신 디히드로게나제, 써모악티소마이세스 인터메디우스(Thermoactinomyces intermedius) ATCC 33205 (페닐알라닌, 알라닌 및 류신 디히드로게나제의 원료)로부터의 추출물 등을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 바람직한 아미노산 디히드로게나제는 페닐알라닌 디히드로게나제 (PDH)이다.
본 발명의 방법은 암모니아를 필요로 한다. 암모니아는 이것이 아미노산 화합물 (즉, 화학식 (I)의 화합물)의 아미노기를 공급하기 때문에 필요로 된다. 암모니아의 원료는 NH4OH, 우레아와 우레아제, 및 HCOONH4를 포함한다. 암모니아의 양은 대체로 케토산 화합물 (즉, 화학식 (II)의 화합물)의 양과 동량이거나 더 많다.
효소적 환원 아민화 공정의 조건은 사용되는 효소 형태에 따라 대단히 다를 수 있다. 예를 들면, 써모악티노마이세스/포르메이트 디히드로게나제 조합을 위해서는, 약 12 내지 약 48시간, 바람직하게는 약 25시간의 반응 시간 동안 약 35 내지 약 45oC, 바람직하게는 약 40oC의 온도가 대체로 적합하다.
본 발명의 방법은 화학식 (I)의 화합물을 높은 수율로 얻게 한다. 전형적인 수율은 약 80% 이상, 바람직하게는 약 90% 이상, 더욱 바람직하게는 약 95% 이상, 및 가장 바람직하게는 약 99% 이다. 본 발명의 방법은 또한 높은 광학 순도, 즉, 바람직하지 않은 R 에난티오머에 비해 바람직한 S 에난티오머를 생성시킨다. 전형적인 광학 순도는 약 95% 이상, 바람직하게는 약 99%보다 크다.
L-알리신 에틸렌 아세탈과 같은, 본 발명의 환원적 아민화 방법에 의해 생성된 화합물은 본원에 참고로 그 전문이 인용된 미국 특허 제5,508,272호에 개시된 에스테르 유도체로 용이하게 변환될 수 있다. 에스테르 유도체는 미국 특허 제5,508,272호에 개시된 바대로, 심혈관 질병의 치료를 위해, 안지오텐신 전환 효소 (ACE) 및 중성 엔도프로테아제 (NEP) 둘다를 억제시키는 바소펩티다아제 억제제를 제조하기 위한 빌딩 블록 (building blocks)이다. 그러므로, 본 발명은 또한 화학식 (I)의 디옥솔란 아세탈- 함유 화합물을 이들의 상응하는 에스테르 유도체로 변환시키는 임의적 단계를 포함한다. 더욱 구체적으로, 임의적인 부가적 에스테르화 단계는 디옥솔란 아세탈 부분 즉, R2가 하기 구조인 것을 디알콕시 아세탈과 교환시키고, 카르복실산(존재한다면)을 알킬 에스테르로 변환시켜 원하는 화합물인, (S)-2-아미노-6,6-디알콕시헥산산 알킬 에스테르를 얻는 것을 포함한다.
,, 또는
이는 화합물 (I)을 메탄올 또는 메탄올보다 고급 알콜과 같은 적합한 용매중에서 티오닐 클로라이드와 반응시키거나, 또는 화합물 (I)을 메탄올과 같은 적합한 용매중에서 무수 HCl (TMSCl 또는 동등한 수단으로부터 기체로서 얻어짐) 및 디메틸 설파이트와 반응시킴으로써 이루어져, 하기 화학식 (III)의 에스테르 화합물을 형성한다:
상기 식에서, R5는 C1-C18알킬 (바람직하게는 C1-C10알킬, 더욱 바람직하게는 저급 알킬, 및 가장 바람직하게는 메틸)이다.
상기 에스테르화 단계에서, 조건은 중요하지 않고, 예를 들면, 약 8 내지 약 72시간 동안, 바람직하게는 약 6 내지 약 9시간 동안의 반응 시간 동안, 약 0 내지 약 45oC, 바람직하게는 약 35 내지 약 40oC의 온도가 대체로 적합하고, 이 단계가 HCl, 질소 또는 아르곤과 같은 기류에서 일어나는 것이 바람직하다. 이 반응은 완전한 아미노기 또는 아미노염을 생성시킬 것이고, 둘다 로블에 기술된 반응에 사용될 수 있다.
본 발명의 효소적 환원 아민화 방법을 위한 케토 출발 물질을 제조하기 위해, 하기 화학식 (IV)를 갖는 할로알킬 화합물{식 중, n은 1 내지 5 (바람직하게는 2)이고, X는 염소, 브롬 또는 요오드 (바람직하게는 브롬)}이 출발 물질로서 사용된다. 바람직하게는 화학식 (IV)의 브로모 유도체를 마그네슘과 반응시켜 화학식 (IV)의 화합물의 유기 마그네슘 유도체를 형성하고, 이를 이후 낮은 온도에서 THF 중 디에틸 (바람직함) 또는 디메틸 옥살레이트와 같은 알파 디카르보닐 화합물과 반응시켜 화학식 (II)를 갖는 화합물의 에스테르 (메틸 또는 에틸)를 얻는다. 화학식 (II)의 에스테르 유도체는 이후 반응식 1에 도시된 바대로 비누화되어 R1이 수소인 화학식 (II)의 유도체를 생성하거나, 또는 더욱 바람직하게는 반응식 2에 도시된 바대로 비누화되고 R1이 리튬인 화학식 (II)의 유도체로서 분리된다.
n이 2 또는 3인 화학식 (IV)를 갖는 할로 유도체는 HBr을 적합한 출발 화합물 (테트라히드로퓨란 또는 테트라히드로피란)과 반응시키고, 이어서 통상적인 조건을 이용하여 알데히드로 산화시키고 최종적으로 이 할로 알데히드를 적합한 알콜 (메틸, 에틸 또는 프로필) 또는 디올 (에틸렌 글리콜, 1,3-디히드록시 프로판, 1,3-디히드록시-2,2-디메틸 프로판)과 반응시켜 화학식 (IV)를 갖는 화합물을 얻는다. 선택적으로 화학식 (II)의 화합물은 반응식 1 또는 2에 도시된 화학 반응을 이용하여 상업적으로 구입 가능한 적합한 할로 알콜, 알데히드 또는 아세탈로부터 출발하여 제조될 수 있다.
본 발명의 또다른 방법의 예가 하기에 도시된다 (반응식 2).
로블에 의해 미국 특허 제5,508,772호에 기술된 바대로, 본 발명의 방법에 의해 제조된 화합물 (본원에서 화학식 (III), 로블에서 화학식 (XXIII)) 또는 그의 산 부가염, 예를 들면, (S)-2-아미노-6,6-디메톡시헥산산 메틸 에스테르는 하기 화학식 (V)의 N-보호된 아미노산과 커플링되어 하기 화학식 (VI)의 디펩티드를 제조할 수 있다.
상기 식에서, P1은 벤질옥시카보닐 또는 t-부틸옥시카보닐과 같은 아미노 보호기 또는 질소 원자와 함께 프탈이미도와 같은 보호기를 형성하는 기이고, P2는 아세틸 또는 벤조일과 같은 머캅토 보호기이다. 이 커플링 반응은 바람직하게는 벤조트리아졸-1-일옥시트리스(디메틸아미노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트, 에틸-3-(3-디메틸-아미노)프로필 카르보디이미드, 디시클로헥실카르보디이미드, 또는 1H-벤조트리아졸-1-올, 메탄 술포네이트 에스테르와 같은 커플링제의 존재 하에서 수행된다.
P2보호기는 메탄올 중 소듐 메톡사이드로 처리함으로써 또는 메탄올 중 p-톨루엔설폰산으로 처리함으로써 화학식 (VI)의 디펩티드로부터 선택적으로 제거된다. 생성되는 머캅탄 화합물에 이후 바람직하게는 트리플루오로아세트산, p-톨루엔설폰산, 메탄설폰과 같은 강산, 또는 앰벌리스트 (Amberlyst)15과 같은 상업적으로구입 가능한 폴리스티렌 설포네이트 중합체 형태의 이온 교환 수지로 처리함으로써 산 촉매 고리화 반응이 일어난다. 이 고리화 반응은 메틸렌 클로라이드 또는 클로로폼과 같은 비양자성 용매에서 수행되어 하기 화학식 (VII)의 락탐을 제공할 수 있다.
화학식 (VII)의 락탐은 이후 P1(N-보호기)를 제거하기 위해 처리되고 이후 하기 화학식 (VIII)의 아실머캅토알카노일 측쇄와 반응하여 하기 화학식 (IX)의 화합물을 제공한다.
상기 식에서, R6은 메틸 또는 페닐이다.
상기 커플링 반응은 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드, 디시클로헥실카르보디이미드, 벤조트리아졸-1-일옥시트리스-(디메틸아미노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트, 또는 카보닐디이미다졸과 같은 커플링제 존재 하에서, 메틸렌 클로라이드와 같은 유기 용매 중에서 수행될 수 있다. 선택적으로, 화학식 (VIII)의 아실머캅토알칸산은 커플링 전에 산 클로라이드, 혼합된 무수물, 대칭성 무수물, 활성화된 에스테르 등과 같은 활성화된 형태로 변환될 수 있다.
P1(N-보호기)은, 예를 들면, 질소 원자와 함께 P1이 프탈이미도기를 형성할 때는 히드라진 일수화물로 처리함으로써, 또는 P1이 벤질옥시카보닐일 때는 요오도트리메틸실란 또는 탄소상 팔라듐 및 수소로 처리함으로써, 또는 P1이 t-부톡시카보닐일 때는 디옥산 중 염산 또는 다른 강산으로 처리함으로써, 화학식 (VII)의 락탐으로부터 제거될 수 있다.
아실기 R6-C(O)-는 제거되고 메틸 에스테르기는 화학식 (IX)의 화합물로부터카르복실산으로 변환되어 원하는 최종 생성물을 얻는다. 예를 들면, R6가 메틸일 때, 메탄올성 소듐 히드록시드로 처리하고 이후 수성 산으로 처리하면 원하는 화합물을 얻게 된다.
4S-[4a(R*), 7a, 10ab]]-옥타히드로-4-[(2-머캅토-1-옥소-3-페닐프로필)아미노]-5-옥소-7H-피리도[2,1-b][1,3]티아제핀-7-카르복실산은 안지오텐신 전환 효소 및 중성 엔도펩티다아제 억제 활성을 갖는다. 이 화합물 및 그의 제약학적으로 허용 가능한 염은, 로블의 미국 특허 제5,508,272호에 알려진 바대로 고혈압 및 울혈성 심부전과 같은 심혈관 질환 치료에 유용하다. 이 화합물은 사람과 같은 포유류 숙주에게 1일 체중 kg 당 약 0.1 내지 약 100 mg, 바람직하게는 1일 체중 kg 당 약 0.5 내지 약 25 mg이 투여될 수 있다. 이 화합물은 바람직하게는 경구로 투여되지만 비경구 투여 및 국소 투여가 또한 사용될 수 있다. 1일 투약량은 1회에 투여되거나 또는 하루 동안 2 내지 4회로 나누어서 투여될 수도 있다.
본 발명은 또한 포르메이트 디히드로게나제(FDH)를 코딩하는 재조합 또는 내생의 핵산 서열 및 페닐알라닌 디히드로게나제(PDH)를 코딩하는 재조합 핵산 서열을 포함하는 조작된 효모 숙주세포에 관한 것이다. 바람직하게는, 핵산 분자는 DNA분자이고 핵산 서열은 DNA 서열이다. 본문에서 모든 DNA 서열은 좌에서 우로의 배열이 통상적인 5'에서 3'방향으로 나타내어진다. 또한 본 발명은 개질된 서열도 포함하는 것으로 의도된다. 본 명세서에서 "개질"이란 용어는, 이 용어가 뉴클레오티드나 폴리펩티드 서열을 의미하는 경우, 자연에서 발견되는 야생형의 뉴클레오티드나 폴리펩티드 서열과 다른 것을 의미한다.
본 발명의 재조합 숙주세포는, 재조합적 및(또는) 자연적인 (내생의) FDH를 생산할 수 있고, 촉매적으로 활성인 PDH를 발현하기 위해 다른 종으로부터 기원하는 PDH로 형질전환되거나 유전적으로 조작될 수 있는 임의의 미생물일 수 있다. 본 발명의 숙주세포의 예를 들면, 칸디다(Candida) 종, 사카로미세스(Saccharomyces) 종, 세팔로스포리움(Cephalosporium) 종, 푸사리움(Fusarium) 종, 페니실리움(Penicillium) 종, 피치아 파스토리스, 칸디다(Candida) 종, 에스케리키아(Escherichia)종, 슈도모나스(Pseudomonas) 종과 같은 예를 포함한다. 본 발명에서 가장 바람직한 숙주세포는 피치아 종, 특히 피치아 파스토리스이다.
효모 숙주세포를 형질전환시키기 위해 사용되는 PDH 핵산은, 숙주세포내에서 촉매적으로 활성인 PDH의 발현을 가져올 수 있는 임의의 핵산일 수 있다. 예를 들면, PDH를 코딩하는 PDH 핵산 서열의 원천은 바실러스 스페리쿠스(Bacillus sphaericus), 바실러스 바디우스(Bacillus badius), 스포로사르시나 우레아스(Sporosarcina ureas), 바실러스 패사러스(Bacillus faecalis), 코리네박테리움 에쿠이스(Corynebacterium equis), 로도토룰라 글루티니스(Rhodotorula glutinis), 브레비박테리움 종(Brevibacterium sp.), 로도코커스 마리스(Rhodococcus maris)와 같은 로도코커스 종(Rhodococcus sp.) 따위이다. 바람직한 PDH 핵산은 써모악티노미세스 인터메디우스 ATCC 33205로부터 기원하는 PDH 유전자이다. 이는 문헌[Takada, H., 등,J. Biochem., 109, 371-376 (1991)]에 공개된 바이며, 이 공개 전문을 참고문헌으로 본문에 첨부한다.
효모 숙주세포를 형질전환시키기 위해 사용되는 본 발명의 PDH (및, 임의적으로 FDH) 서열은 당업계에서 통상의 기술을 가진자들에게 널리 알려진 다양한 방법을 이용하면 얻을 수 있다. 적어도 세가지의 주된 대안법으로 다음과 같은 것들이 사용될 수 있다:
(1) 게놈 DNA 또는 그 서열을 포함하는 상보 DNA (cDNA)로부터 이중나선 DNA 서열의 분리;
(2) DNA 서열의 화학적 합성; 및
(3) 중합효소 연쇄반응 (PCR)에 의한 DNA 서열의 합성.
첫번째 접근법에서는, 게놈 또는 cDNA 라이브러리를 스크리닝하여 PDH (및, 임의적으로 FDH)의 전부 또는 일부를 코딩하는 DNA 서열을 동정할 수 있다. 예를 들면, PDH (및, 임의적으로 FDH)의 전부 또는 일부를 코딩하는 DNA 서열을 동정하기 위해, 티. 인터메디우스(T. intermedius) 게놈 DNA 라이브러리를 스크리닝할 수 있다. 다양한 방법들이 게놈 DNA나 cDNA 라이브러리를 검색하기 위해 사용될 수 있다.
예를 들면, PDH의 전부나 일부를 코딩하는 표적 게놈 DNA나 cDNA에 존재하는 서열의 복제인 표지된 단일 사슬 DNA 탐침 서열을 이용하여, 단일 사슬 형태로 변성된 게놈 DNA나 cDNA의 클론상에서 수행되는 DNA/DNA 하이브리드법에 적용가능하다.
게놈 DNA나 cDNA 라이브러리는 또한, PDH (및, 임의적으로 FDH)의 전부 또는일부를 코딩하는 게놈 DNA나 cDNA를 면역블롯 기술을 이용하여 스크리닝할 수도 있다.
면역블롯법이나 하이브리드법에 모두 적합한 한 전형적인 검색법에서는, 일반적으로 벡터내에 포함된 게놈 DNA 라이브러리 또는 cDNA 라이브러리를 먼저 아가 평판위에 펴바르고, 그 다음에 그 클론을 나이트로셀룰로오스 막과 같은 여과막으로 옮긴다. 그 다음, PDH (및, 임의적으로 FDH)의 전부 또는 일부를 코딩하는 게놈 DNA나 cDNA를 포함하는 클론을 동정하기 위해, 클론에 DNA 탐침을 혼성화시키거나 또는 항체를 클론에 부착시킬 수 있다.
두번째 접근법에서, PDH (및, 임의적으로 FDH)를 코딩하는 본 발명의 DNA 서열은 화학적으로 합성할 수 있다. 예를 들면, PDH (및, 임의적으로 FDH)를 코딩하는 DNA 서열을 일련의 100 염기 올리고뉴클레오티드로서 합성하고 이를 연속적으로 연결하여(적절한 말단 제한 자리 또는 상보적인 말단 서열에 의해) 올바른 선형 뉴클레오티드 서열을 형성할 수 있다.
세번째 접근법에서, PDH (및, 임의적으로 FDH)를 코딩하는 본 발명의 DNA 서열은 PCR을 이용해 합성할 수 있다. 간략하게 설명하자면, 표적 DNA 서열의 반대 사슬에 혼성화되는 적어도 15 염기 정도의 합성 DNA 올리고뉴클레오티드쌍 (PCR 프라이머)를 이용하여 표적 서열의 중간에 끼인 DNA 부분을 효소적으로 증폭한다. 주형의 열 변성, 프라이머의 어닐링 및 어닐링된 프라이머의 3' 말단의 DNA 중합효소에 의한 연장 과정의 반복은 PCR 프라이머의 5' 말단에 의해 정의되는 절편의 증폭을 가져온다[문헌, White et al., Trends Genet. 5, 185~189 (1989)].
PDH (및, 임의적으로 FDH)를 코딩하는 본 발명에서 유용한 DNA 서열은 또한 다양한 돌연변이를 만들기 위해 개질(즉, 돌연변이)될 수 있다. 이러한 돌연변이는 축퇴성, 즉 돌연변이가 돌연변이된 코돈에 의해 암호화된 아미노산 서열을 변화시키는 경우, 또는 비축퇴성, 즉 돌연변이가 돌연변이된 코돈에 의해 암호화된 아미노산 서열을 변화시키지 않는 경우일 수도 있다. 이러한 개질된 DNA 서열은, 예를 들면, 당업계에서 잘 알려진 방법을 사용하여, 암호화된 폴리펩티드내 하나 이상의 아미노산의 결실, 치환, 삽입, 역위 또는 첨가를 야기하도록 PDH (및, 임의적으로 FDH) DNA 서열의 돌연변이를 통해 제조할 수 있다. 예를 들면, 위치 지향적 돌연변이발생법이 사용될 수도 있다. [Morinaga et al., Bio/Technol. 2, 636~639 (1984); 및 Taylor et al., Nucl. Acids Res. 13, 8749-8764 (1985), Kunkel, Proc, Natl. Acad. Sci. USA 82, 482-492 (1985) 참조]. 게다가 위치 지향적인 돌연변이 발생 킷트를 상업적으로 구입할 수도 있다. 예를 들면, 위치 지향적 돌연변이 발생을 일으키는 킷트는 아머샴사(Arlington Heights, IL)에서 구입가능하다. 게다가 문헌 [Sayers et al., Nucl. Acids Res. 16, 791-802 (1988)]에 기술된 분열, 결실 그리고 중단법도 역시 적용가능하다. 축퇴성 및 비축퇴성 모두 본 발명의 폴리펩티드를 생산 또는 사용하는 데 장점이 있을 것이다. 예를 들면, 이러한 돌연변이는 높은 생산성, 간편한 정제, 또는 부가적인 제한효소 인식 부위를 제공하는 것을 허용한다. 이러한 모든 변형된 DNA 및 폴리펩티드 분자는 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명의 효모 세포는 PDH (및, 임의적으로 FDH)를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 발현 벡터를 사용하여 간단하게 형질전환될 수 있다. 발현 벡터는 바람직하게는, 실질적으로 문헌 [Takada, H., et al,J. Biochem., 109, 371-376 (1991)]에 나타난 바와 같은 PDH 뉴클레오티드 서열을 가지는 DNA 서열중 하나의 전부 또는 일부를 포함한다. 더욱 바람직하게는, PDH (및, 임의적으로 FDH)의 전부 또는 일부를 코딩하는 DNA 서열에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 조절 DNA 서열을 포함하는 발현 벡터이다. 상기 문장에서 "작동가능하게 연결된"이란 말은 조절 DNA 서열이 PDH (및, 임의적으로 FDH)를 코딩하는 DNA 서열의 복제 및(또는) 발현을 지시할 능력이 있다는 것을 의미한다.
본 발명에서 유용한 발현 벡터는 종종 "플라스미드"형태인데, 이는 환형 이중 나선 DNA 고리를 의미하고, 벡터형태로서는 염색체에 결합되지 않는다. 그러나, 본 발명은 동일한 기능을 수행하고 차후 당업계에 알려질 다른 형태의 발현 벡터를 포함하는 것을 의도한다.
본 발명에서 유용한 발현 벡터는 전형적으로, 복제시작점, DNA 서열 앞쪽 (즉, 상류)에 위치한 프로모터(바람직하게는 AOX1과 같은 유도성 프로모터 또는 GAP와 같은 상시 프로모터)와 그에 뒤따르는 PDH (및, 임의적으로 FDH)의 전부 또는 일부를 코딩하는 DNA 서열을 함유한다. PDH (및, 임의적으로 FDH)의 전부 또는 일부를 코딩하는 DNA 서열에는 전사 종결 서열과 잔여 벡터가 뒤따른다. 만일 재조합 FDH 핵산이 사용된다면, 그 FDH DNA는 PDH에서와 동일한 벡터의 일부분이거나 별도의 벡터의 일부분일 것이다. 상기 발현 벡터는 또한 당업계에 알려진 다른 DNA 서열을 포함할 수 있는데, 예를 들면, 발현된 산물에 안정성을 부여하는 안정성 리더 서열, 발현된 산물이 분비되게 하는 분비 리더 서열, 구조 유전자의 조절된 발현(예를 들면, 성장 배지중 영양소 또는 기타 유발체의 존재나 부존재에 의한 조절)을 가능하게 하는 서열, 형질전환된 숙주세포에서 표현형 선택을 가능하게 하는 마커 서열, 플라스미드에 유사분열 안정성을 부여하는 동원체와 같은 안정성 요소, 및 제한 엔도뉴클리아제에 의한 절단 부위를 제공하는 서열이 있다. 사용된 실재 발현 벡터의 특성들은 적용된 숙주세포와 반드시 양립가능성이 있어야 한다. 예를 들면, 진균류나 효모 세포계에 클로닝 될 때에는, 발현 벡터는 진균이나 효모 세포의 게놈에서 단리된 프로모터 (예를 들면,Aspergillus nidulans로부터의 trpC 프로모터,Pichia pastoris로부터의 AOX1 프로모터, 및P. pastoris로부터의 GAP 프로모터 따위)를 포함하여야 한다. 어떤 발현 벡터는 자가 복제 서열 (ARS ; 예를 들면,Fusarium oxysporum, Saccharomyces cerevisiae의 ARS 따위)을 포함할 수 있는데, 이들은 진균이나 효모 숙주내에서 플라스미드의 자기 복제 생산을 촉진한다. 본 발명에서의 효모 발현 벡터는 효모 ARS를 가지지 않는 것이 바람직하며, 그리함으로써 플라스미드가 숙주세포에 들어간 후 숙주 유전자에 삽입된다. 이러한 삽입은 증가된 유전적 안정성 때문에 더 바람직하다. 본 발명에서 기대하는 발현 벡터는, 효모나 진균 세포내에서 문헌 [Takada, H., et al,J. Biochem., 109, 371-376 (1991)]에 개시된 피치아 세포 PDH DNA 서열의 복제, 삽입, 및 바람직하게는 발현을 지시할 수 있는 능력을 최소한 갖는다. 적합한 프로모터로는, 예를 들면, 아스페르질러스 니둘란스(Aspergillus nidulans)로부터의 trpC 프로모터, 에프. 옥시스포룸(F. oxysporum)으로부터의 페니실린 V 아미다제(penicillin Vamidase) 프로모터, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)로부터의 GAP 프로모터 및 피 파스토리스(P. pastoris)로부터의 AOX 프로모터 등이 있다. 적합한 종결 서열로는 예를 들어, 에이. 니둘란스로부터의 trpC 종결서열, 에프 옥시스포룸으로부터의 PVA 종결서열, 피. 파스토리스로부터의 AOX1 종결서열 등이 있다. 또한 발현 벡터는 선택성 마커를 코딩하는 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 선택성 마커로는 바람직하게는 항생제 내성이 있다. 선택성 마커로서 G418 내성이나 제오신(Zeocin) 내성이 편리하게 사용될 수 있다. 이러한 물질 모두는 당업계에 잘 알려져 있고 상업적으로 이용가능하다.
특히 바람직하게는, PDH를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 후술하는 pPDH9k/10, pPDH155K 및 pGAPk-PDH라고 명명된 발현 벡터들, 또는 이들 플라스미드와 동일시되는 특성을 지닌 발현벡터들이다. 또한 선호되는 것은 FDH를 코딩하는 DNA를 포함하는 pGAPZ-FDH라고 명명된 발현벡터이다.
pPDH9K/10 플라스미드를 포함하는 숙주세포 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)균주 SMD1168은 아메리칸 타입 컬처 콜렉션(ATCC) [Manassas, Virginia]에 1997년 3월 26일에 기탁되어 있으며, 부다페스트 조약에 의해 제 74408호로 분양받을 수 있다.
pGAPk-PDH와 pGAPZ-FDH 플라스미드를 포함하는 피치아 파스토리스 균주 GS115는 ATCC에 1998년 2월 13일 기탁되었으며, 부다페스트 조약의 규정하에서 ATCC에서 제 74433호로 분양받을 수 있다.
pPDH155K 플라스미드를 포함하는 에스케리키아 콜리 균주 BL21은 ATCC에1997년 3월 26일 기탁되었으며, 부다페스트 조약의 규정하에서 ATCC에서 제 98374호로 분양받을 수 있다.
원하는 코딩서열 및 조절 서열을 포함하는 적합한 발현 벡터는 당업계에 잘 알려진 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조될 수 잇으며, 이에 대한 것은 문헌 [Sambrook et al. Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor, NY (1998)]에 상당부분 기재되어 있다.
본 발명의 숙주세포는 PDH (및, 임의적으로 FDH)의 전부 또는 일부를 코딩하는 DNA 서열의 복제 및(또는) 발현을 지시할 수 있고, 그 DNA 서열에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 조절 DNA 서열을 함유하는 발현 벡터를 포함하는 것이 바람직히다. 숙주세포는, 예를 들면,세팔로스포리움 아크레모니움(Cephalosporium acremonium), 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum)및페니실리움 크리소지눔(Penicillium chrysogenum), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 칸디다 보이디니(Candida boidinii),및사카로미세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)세포들일 수 있다. 숙주세포로서 특히 바람직한 것은 피치아 파스토리스 균주이다.
발현 벡터는 당업계에서 널리 알려진 다양한 방법을 이용하여 숙주세포내로 도입될 수 있다. 예를 들면, 발현 벡터를 이용한 숙주세포의 형질전환은 폴리에틸렌 글리콜에 의해 매개된 원형질체 형질전환에 의해 달성될 수 있다. 그러나, 발현 벡터를 숙주세포내로 도입시키기 위한 다른 방법, 예를 들면, 전기천공법 (electroporation), 생리스트 주사법(biolistic injection), 또는 원형질 융합 역시 적용가능하다.
일단 발현 벡터가 적절한 숙주세포내로 도입되면, 숙주세포는 많은 양의 필요한 폴리펩티드, 바람직하게는 PDH (및, 임의적으로 FDH)를 포함하는 폴리펩티드 분자를 발현할 수 있게 하는 조건에서 배양될 것이다. 따라서, 본 발명은,
(a) PDH를 암호화하는 재조합 핵산 및, 임의적으로, PDH를 암호화하는 내생적 핵산, 및
(b) 내생적, 재조합, 또는 내생적 및 재조합 모두인 FDH를 암호화하는 핵산
을 함유하는, 페닐알라닌 디히드로게나제(PDH) 및 포르메이트 디히드로게나제(FDH) 모두를 생산할 수 있는 조작된 숙주 세포, 바람직하게는 효모에 관한 것이다.
PDH (및, 임의적으로 FDH)의 전부 또는 일부를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 발현 벡터가 함유된 숙주세포는 다음의 다섯 가지 일반적인 접근법 중에서 한가지 또는 그 이상을 이용해 동정할 수 있다: (a) DNA-DNA 하이브리드법; (b) 마커 유전자 기능의 존재 또는 부존재; (c) 숙주세포내내 mRNA 전사체 생산을 측정함으로써 전사 수준을 평가하는 방법; (d) 유전자 산물의 면역학적으로 검출법; 및 (e) 효소 분석법, 효소 분석법이 동정법중 가장 선호되는 방법이다.
첫번째 접근법에서는, 원하는 효소의 전부 또는 일부를 코딩하는 DNA 서열의 존재는 DNA 서열에 상보적인 탐침을 사용하여 DNA-DNA나 RNA-DNA 하이브리드법에 의해 검출될 수 있다.
두번째 접근법에서는, 재조합 발현 벡터 숙주 시스템은, 특정 마커 유전자의기능(예를 들면, 아세트아미드의 이용, 항생제 내성, 항진균제 내성, 우라실 최초굴성, 등)의 존재 또는 부존재에 기초하여 동정 및 선별이 가능하다. 마커 유전자는 효소를 코딩하는 서열을 조절하는 프로모터와 같은 프로모터 또는 다른 프로모터의 조절하에서, 효소의 전부 또는 일부를 코딩하는 DNA 서열과 동일한 플라스미드내에 존재할 수 있다. 유도에 응답하는 마커 유전자의 발현 또는 선별은 원하는 효소의 전부 또는 일부를 코딩하는 DNA 서열을 운반하는 재조합 발현 벡터 전체가 존재한다는 것을 나타낸다.
세번째 접근법에서는, 효소 mRNA 전사체의 생성이 하이브리드 검색법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들면, 폴리아데닐화된 RNA를 단리하고, 그 RNA 서열에 상보적인 탐침을 사용하여 노던 블롯법 또는 뉴클리아제 보호 검사에 의해 분석할 수 있다. 선택적으로, 숙주세포내 총 핵산을 추출하고 상기 탐침과의 혼성화를 검사할 수도 있다.
네번째 접근법에서는, 원하는 효소의 전부 또는 일부의 발현을 웨스턴 블롯과 같은 면역학적 방법으로 측정할 수 있다.
다섯번째 접근법에서는, 효소의 발현을 공지된 방법을 이용하여 효소 활성을 측정함으로써 평가할 수 있다.
본 발명의 발현 벡터, 플라스미드 또는 DNA 분자의 DNA 서열은 당업계에 알려진 다양한 방법으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467 (1977)]에 기술된 디데옥시 사슬 종결법이나, 문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 560-564 (1977)]에 기술된 맥섬-길버트법이있다.
모든 발현 벡터 및 DNA 조절 서열들이 본 발명의 DNA 서열을 발현하기 위해 동일하게 잘 기능하지는 않을 것이라는 것을 물론 이해해야 한다. 동일 발현계에 대하여 모든 숙주 세포가 동일하게 잘 기능하지도 않을 것이다. 그러나, 당업계의 숙련가라면, 과도한 실험 없이도 본문에 제공된 지침을 이용하여 본 발명의 범위를 벗어나지 않고, 발현 벡터들, DNA 조절 서열들, 그리고 숙주 세포들 중에서 선택할 수 있을 것이다.
만일 재조합 FDH를 발현하도록 조작된 숙주 세포를 사용한다면, FDH를 암호화하는 핵산을 함유하도록 숙주 세포를 형질 전환시키기 위하여 상기 기술된 것과 유사한 과정을 사용 및 적용할 수 있다. FDH 핵산의 적당한 원천은피치아종이다.
본 발명의 PDH 형질전환된 숙주 세포는 부가적으로 FDH를 발현할 수 있는 자연적 또는 내생의 핵산을 함유하는 것이 바람직하다. 임의로, 상기 숙주 세포는 재조합 PDH 핵산 외에도 PDH를 암호화하는 내생의 핵산을 또한 포함할 수 있다. 즉, 발현 벡터를 삽입하고자 선택된 숙주 세포는 이미 FDH를 발현하는 능력을 가지고 있는 것이 바람직하다. 예상 외로, PDH의 발현을 가져올 수 있는 벡터로 피치아 세포를 형질 전환시키는 것은 또한 FDH 발현의 증가를 가져온다는 것을 발견하였다. 본 발명의 효소적 전환 과정에서는 그러한 세포를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명은 나아가 FDH를 발현할 수 있는 재조합 또는 자연적 핵산을 포함하고 PDH를 발현할 수 있는 발현 벡터를 포함하는 조작된 숙주 세포의 배양을 포함하는, PDH 및 FDH의 생산 방법에 관한 것이다. 바람직하게는 상기 발현 벡터는 pPDH9K/10이다.
본문에서 동정된 모든 아미노산 잔기는 자연상태인 L-구조이다. 문헌 [J. Biol. Chem. 243, 3557-3559 (1969)]의 표준 폴리펩티드 명명법을 따라, 아미노산 잔기의 약어를 다음 대응표에 나타내었다.
대응표
기호 아미노산
한글자 세글자
YGFMASILTVPKHQEWRDNC TyrGlyPheMetAlaSerIleLeuThrValProLysHisGlnGluTrpArgAspAsnCys L-티로신L-글리신L-페닐알라닌L-메티오닌L-알라닌L-세린L-이소류신L-류신L-트레오닌L-발린L-프롤린L-리신L-히스티딘L-글루타민L-글루탐산L-트립토판L-아르기닌L-아스파르트산L-아스파라긴L-시스테인
모든 아미노산 서열은 왼쪽에서 오른쪽 배열이 전통적인 아미노-말단에서 카르복시-말단 방향으로 나타내어진다.
본문에서 유용한 핵산이나 아미노산의 대립유전자 변형은 자연적으로 존재하거나, 또는 당업계에서 공지된 방법으로 의도적으로 도입될 수도 있음을 이해할 것이다. 이러한 변화는 전체 서열에서 하나 이상의 아미노산의 상이함, 또는 이러한 서열에서 하나 이상의 아미노산의 결실, 치환, 삽입, 역위 또는 첨가로 나타날 수 있다. 상기 아미노산 치환은 예를 들면, 관여 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및(또는) 양극성의 유사성에 기초하여 이루어질 수 있다. 예를 들어, 음전하를 띤 아미노산은 아스파르트산과 글루탐산을 포함하고; 양전하를 띤 아미노산은 리신과 아르기닌을 포함하며; 유사한 친수성 수치를 갖는 비하전 극성 헤드기 또는 비극성 헤드기를 갖는 아미노산으로는 류신, 이소류신, 발린, 글리신, 알라닌, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 페닐알라닌, 타이로신이 있다. 기타 예상되는 변화로는, 상기 폴리펩티드의 염과 에스테르 및, 예를 들어 메티오닌, N-포밀메티오닌 및 리더 서열과 같은 N-말단 치환체를 갖는 전구체인, 상기 폴리펩티드이 전구체 등이 있다. 모든 그러한 변화는 본 발명의 범위내에 포함된다.
하기 실시예는 본 발명을 설명하지만 한정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 실시예 1-6의 반응은 반응식3에 나타난 바와 같다.
실시예 1
다양한 원천으로부터의 아미노산 디히드로게나제를 이용한 환원적 아민화
pH 8.7에서 최종 부피 1.0 ml에 함유된 용액: 1 M 포르메이트 암모늄 (NH4OH로 pH 8.7로 조정), 0.1 M 5-(1,3 디옥솔란-2-일)-2-옥소-펜탄산, 1 mM NAD, 1밀리그람(mg) 단백질/밀리리터(ml) (베링거 맨하임사 단백질 mg당 0.53 유닛) 칸디다 보이디니(Candida boidinii)로부터 얻은 포르메이트 디히드로게나제 및 표1에 열거된 아미노산 디히드로게나제. 상기 용액을 30℃에서 16시간 동안 배양한 후, 반응액에서 시료를 취해 고속액체크로마토그래피(HPLC)로 분석하였다. 그 결과는 표1에 나타내었다. 각 경우에 거울상 이성질체 초과량은 98%가 넘었다.
<표1>
디히드로게나제 원천 함량 (유닛) 5-(1,3-디옥솔란-2-일-(S)-2-아미노펜탄산 (mM)
글루타메이트알라닌류신페닐알라닌 시그마시그마자체시그마 7635.72212.6 1.0311.7714.0151.71
류신 디히드로게나제는 바실러스 스패리쿠스(Bacillus sphaericus) ATCC 4525로부터 부분 정제하였다. 글루타메이트 디히드로게나제는 소의 간에서 얻었으며; 알라닌 디히드로게나제는 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis)에서 얻었으며; 페닐알라닌 디히드로게나제는 스포로사르시나(Sporosarcina)종에서 얻었다.
5-(1,3-디옥솔란-2-일)-(S)-2-아미노-펜탄산의 광학적 순도 및 함량의 HPLC 정량
시료는 물로 희석하여 약 5 mM 정도의 농도가 되게한 후 끓는 수조내에 1분간 넣어 반응을 중단시키고 단백질을 침전시켰다. 식힌 후에, 시료를 0.2 마이크론 나일론 필터를 통하여 HPLC 바이알로 여과시켰다: 키랄팩(Chiralpak) WH 25 ×0.46cm (다이셀 화학 공업 (주))
이동상: 0.3 mM CuSO4
유속: 1 ml/분 (min)
칼럼 온도: 40℃
검출 : 230 나노미터 (nm)의 DAD기
주입용량 : 20 마이크로리터 (μl)
지체시간: L-에난티오머 28.044분, D-에난시오머 23.842분. 지체시간은 칼럼의 사용에 따라 감소하고 시료의 농도에 따라 변화될 수 있다. D-에난티오머의 검출 가능한 최소 퍼센트는 약 1%다.
실시예2
써모악티노미세스 인터메디우스(Thermoactinomyces intermedius)를 이용한 환원적 아민화
L-페닐알라닌 1%, L-글루탐산 0.1%, 펩톤 1.0%, 효모 추출물 0.5%, K2HPO40.2%, NaCl 0.1% 및 MgSO4·7H2O 0.02%를 함유하는 배지상의 써모악티노미세스 인터메디우스 ATCC33205를 55℃의 15 L 발효기 내에서 성장시켰다. 19시간 후에 세포를 회수한 다음, -12℃에서 동결 저장하였다. 동결된 세포를 pH 7, 50 mM 인산칼륨 완충액 200 ml로 세척하고 16,000 x g에서 10분 동안 원심분리하였다. 1 mM 디티오트레이톨을 함유하는 pH 7의 50 mM 인산칼륨 완충액 40 ml에 세포를 재현탁시켰다. 세포 현탁액을 2분 동안 초음파분쇄한 후 16,000 x g에서 10분 동안 원심분리하였다. 페닐피루베이트의 환원 아민화에 대해 분석한 결과, 상청액은 단백질 1 mg 당 0.43 eksdnldml PDH를 함유하였다.
1 M 암모늄 포르메이트(25.22 g), 5-(1,3-디옥솔란-2-일)-2-옥소-펜탄산(7.527 g), 1 mM NAD(274 mg), 1mM 디티오트레이톨(61.6 mg), 포르메이트 디히드로게나제 40 u(76 mg 단백질) 및 써모악티노미세스 인터메디우스 추출물 40 ml (309 mg 단백질)를 함유하는 pH 8.7 용액 400 ml를 제조하였다. 암모늄 포르메이트를 300 ml의 물에 용해시키고 진한 수산화암모늄으로 pH가 8.7이 되게 한 후, 다른 성분들을 가하고 용액의 양이 400 ml가 되게 하고 다시 진한 수산화암모늄으로 pH를 8.7로 조절 하였다. 용액을 40℃에서 인큐베이션시키고 9시간 및 23시간 후에 별도의 포르메이트 디히드로게나제 분획 20 mg씩을 가하였다. 21시간 후에 HPLC에 의해 측정한 결과, 용액은 80.1 mM의 L-5-(1,3-디옥솔란-2-일)-(S)-2-아미노-펜탄산을 함유하였다. 29시간 후에도 농도는동일하게 유지되었다. 키랄 HPLC에 의한 측정결과, 특정 거울상이성질체의 비율이 98%를 초과하였다.
실시예3
열 건조된 써모악티노미세스 인터메디우스 및 칸디다 보이디니를 이용한 환원 아민화
5-(1,3-디옥솔란-2-일)-2-옥소-펜탄산(10.0 g, 53.14 mmole), 암모늄 포르메이트 (3.509 g, 55.65 mmole) 및 자석 교반 막대를 300 ml 비이커에 가하였다. 물 150 ml 및 진한 수산화암모늄 용액(29.6%) 4.5 ml를 비이커에 가하고 고체가 용해될 때까지 교반하였다. 별도의 수산화 암모늄을 필요량 추가하여 pH를 8로 조절하였다. 디티오트레이톨(36.2 mg, 0.235 mmole) 및 NAD(145.2 mg, 0.212 mmole)를 가하고 교반하여 용해시켰다. 물을 가하여 부피가 200 ml가 되게 한 후, 용액을 250 ml 자켓의 반응기에 부었다. 비이커를 6 ml의 물로 헹구고 헹굼액을 반응기에 가하였다. 반응기는 Neslab RTE-110 배드/서큘레이터를 이용하여 10℃로 유지시켰다. 용액을 Heidolph RZR-2000 교반기를 이용하여 분 당 280회전(280 RPM)으로 교반하였다. 열 건조된 써모악티노미세스 인터메디우스 세포(4.08 g, 333 u 페닐알라닌 디히드로게나제) 및 칸디다 보이디니 세포(1.42 g, 55 u 포름메이트 디히드로게나제)를 교반한 용액에 가하였다. 30분 후에 세포를 교반기로 분산시키는데, 이때 진한 수산화암모늄 용액(약 0.5 ml)을 가하여 약 7.1 인 pH를 다시 8이 되게 하였다. 반응기는 파라필름으로 덮어서 증발을 최소화하였다. 3시간 후에 수산화암모늄을 소량 첨가하여 pH를 8로 조절 하였다. 그 후, 6시간 후에는 pH가 8.1 내지 8.2로, 19시간 후에는 8.5로 증가하였다. 5-(1,3-디옥솔란-2-일)-2-옥소-펜탄산이트가 완전히 5-(1,3-디옥솔란-2-일)-(S)-2-아미노-펜탄산으로 전환된 후(HPLC로 확인 하였음), 현탁액을 소발(Sorvall) GSA 로터(rotor)로 13,000 rpm(27,504 x g)에서 15분 동안 원심분리 하여 세포를 회수하였다. 세포 펠렛을 20 ml의 물에서 유리막대를 사용하여 재현탁시키고, 소발 SS34 로터로 20,000rpm(47,807 x g) 에서 10분간 원심분리하였다. 이러한 세척 과정을 3번 더 반복한 후, 상청액을 첫번째 상청액과 혼합하였다. 반응 종결시, 5-(1,3-디옥솔란-2-일)-(S)-2-옥소-펜탄산의 HPLC 수율은 6.85 g이었다(입력물질인 케토산의 HPLC 순도 91% 에 대해 보정할경우 74.9M%). 특정 거울상이성질체의 비율이 98%를 초과하였다.
실시예4
열 건조된 재조합 E.Coli 및 칸디다 보이디니를 이용한 환원 아민화
5-(1,3-디옥솔란-2-일)-2-옥소-펜탄산(20.0 g,106.28 mmole), 암모늄 포르메이트 (7.018 g, 111.29 mmole) 및 자석 교반 막대를 500 ml 비이커에 가하였다. 물 300 ml 및 진한 수산화암모늄 용액(29.6%) 9 ml를 비이커에 가하고 고체가 용해될 때까지 교반하였다. 별도의 수산화암모늄을 필요량 추가하여 pH를 8로 조절 하였다. 디티오트레이톨(65.6 mg, 0.425 mmole) 및 NAD(282 mg, 0.425 mmole)를 가한 후 교반하여 용해시켰다. 물을 가하여 부피가 400 ml가 되게한 후, 용액을 1 L 자켓의 반응기에 부었다. 비이커를 12 ml의 물로 헹군 후, 헹굼액을 반응기에 가하였다. 반응기는 Neslab RTE-110 배드/서큘레이터를 이용하여 40℃로 유지시켰다. 용액을 Heidolph RZR-2000 교반기를 이용하여 350 RPM으로 교반하고, E.coli BL21(DE3)(pPDH155K)[SC16144] 열 건조 세포(0.360 g, 666 u 페닐알라닌 디히드로게나제) 및 칸디다 보이디니 열건조 세포(3.116g, 110u 포르메이트 디히드로게나제)를 교반한 용액에 가하였다. 5 내지 10분 후에 세포를 교반기로 분산시키는데, 이때 진한 수산화암모늄 용액(약 1.4 ml)을 가하여 약 7.2인 pH를 다시 8이 되게 하였다. 반응기는 파라필름 으로 덮어서 증발을 최소화하였다. 3시간 후에 수산화암모늄을 소량 첨가하여 pH를 8로 조절 하였다. 그 후, 16시간 후에는 pH가 약 8.4로 증가하였다. 5-(1,3-디옥솔란-2-일)-2-옥소-펜탄산이 완전히 5-(1,3-디옥솔란-2-일)-(S)-2-아미노-펜탄산으로 전환되었을때(HPLC로 확인), 상청액을 반응기로부터 회수하여 세포가 분리될 때까지 4℃ 에서 저장하였다. 셀라이트 예비혼합물 및 예비코팅을 갖는 부크너 깔대기(Buchner funnel)에서 여과하여 세포를 제거한 후, 여과액은 한계 분자량 10,000(MW)의 폴리술폰막으로 한외여과하였다.
반응 및 여과가 종결되었을때, 5-(1,3-디옥솔란-2-일)-(S)-2-아미노-펜탄산의 HPLC 수율은 12.5 g 이었다(입력물질인 케토산의 HPLC 순도 88%에 대해 보정할경우 71.0 M%).
실시예5
재조합 피치아(Pichia)를 이용한 환원 아민화
ml 당 100 mg의 세포를 1 mM 디티오트레이톨 및 0.2% 트리톤 X-100을 함유하는 50 mM 인산칼륨 완충액(pH 7.3)에 현탁시키고, 유리 비드를 포함하는 비드 밀을 이용하여 4℃에서 5분 동안 파괴시킴으로써 pPDH9K/10 플라스미드를 함유하는 피치아 파스토리스 균주 SMD 1168(ATCC 액세션 번호 제74408호) 추출물을 제조하였다. 추출물을 10,000 rpm 에서 5분 동안 미소분리하였다. 추출물은 2.44 단위(u)/ml의 포름메이트 디히드로게나제와 15.4 u/ml의 페닐알라닌 디히드로게나제를 함유하였으며, 습윤된 세포의 활성은 24.4 u/g 습윤 세포 포르메이트 디히드로게나제 및 154 u/g 습윤 세포 페닐알라닌 디히드로게나제로서 취해졌다. 5-(1,3-디옥솔란-2-일)-2-옥소-펜탄산(리튬염)(1.0 g, 5.1517 mmole) 및 암모늄포르메이트(389.8 mg, 6.182 mmole)를 20 ml의 물에 용해하고, 디티트레이톨(3.28 mg, 0.0213 mmole)과 NAD(14.1 mg, 0.0206 mmole)를 가하였다. 용액의 pH는 8.16이었다.
1. 피치아 추출물(0.273 u의 포르메이트 디히드로게나제 및 1.723 u 페닐알라닌 디히드로게나제를 함유하는 0.112 ml)을 케토산을 함유하는 용액 1ml에 가한 후, 밀봉된 40℃ 미소분리 튜부에서 25시간 인큐베이션시켰다. 반응 종료시 5-(1,3-디옥솔란-2-일)-(S)-2-아미노-펜탄산의 HPLC 수율은 0.038 g 이었다(입력물질인 케토산의 HPLC 순도 93% 및 Karl Fischer(KF)수(水) 9.4%에 대한 보정의 경우 92.6 M%). 특정 거울상이성질체의 비율이 98%를 초과하였다.
2. 기질을 함유하는 잔류 용액 19 ml를 50ml 엘렌마이어 플라스크 내의 습윤된 피치아 세포(5.23 u의 포르메이트 디히드로게나제 및 32.93 u 페닐알라닌 디히드로게나제를 함유하는 0.214 g)에 넣었다. 현탁액의 pH는 8.04였다. 세포는 -15℃에서 동결저장하였다. 플라스크를 파라필름으로 봉하고 40℃의 회전식 진탕기에서 200 rpm으로 25시간 인큐베이션시켰다. 반응 종료시 5-(1,3-디옥솔란-2-일)-(S)-2-아미노-펜탄산의 HPLC 수율은 0.7506g이었다(입력물질인 케토산의 HPLC 순도 93% 및 KF수 9.4%에 대한 보정의 경우 96.2 M%). 특정 거울상이성질체의 비율이 98%를 초과하였다.
3. 탈이온수(200 ml), 암모늄 포르메이트(7.796 g, 123.63 mmole) 및 5-(1,3-디옥솔란-2-일)-2-옥소-펜탄산 리튬염(20 g, 103.03 mmole)을 40℃로 유지된 500 ml 자켓의 반응기에 가한 후, 250 rpm으로 교반하였다. 고체가 용해된 후에 NAD(66.34 mg, 0.1 mmole)와 열-건조된 피치아(150 u의 포르메이트 디히드로게나제 및 666 u 페닐알라닌 디히드로게나제를 함유하는 1.6406 g)를 가하고, 진한 수산화암모늄으로 pH를 8.0으로 조절 하였다. 7시간 후에 포름산을 가하여 pH를 8.76에서 8로 조절하였다. 10시간 및 23시간 후에 각각 포름산으로 다시 pH를 8로 조절하였다. 25시간 후에 5-(1,3-디옥솔란-2-일)-(S)-2-아미노-펜탄산의 HPLC 수율은 17.16 g이었다(입력물질인 케토산의 순도에 대한 보정시 98.3%). 특정 거울상이성질체의 비율이 98%를 초과하였다. 원심분리에 의해 세포를 회수하고 한외여과에 의해 단백질을 회수하였다.
실시예6
고정된 효소를 이용한 환원 아민화
재조합 E.coli추출물로부터 얻은 페닐알라닌 디히드로게나제를 제조자의 지침에 따라 Eupergit C250L(Rohm GmbH사로부터 입수)상에 고정시키고 칸디다 보이디니로부터 얻은 포르메이트 디히드로게나제를 Eupergit C(Rohm GmbH사로부터 입수)상에 고정시켰다. 반응액은 100ml의 부피에 하기 물질들을 함유하였다: 5-(1,3-디옥솔란-2-일)-2-옥소-펜탄산 리튬염(5.0 g, 25.8 mmole), 암모늄 포르메이트(1.754 g, 27.8 mmole), 디티오트레이톨(16.4 mg, 0.106 mmole), NAD(70.5 mg, 0.103 mmole), Eupergit C250L 상에 고정된 재조합 페닐알라닌 디히드로게나제(4.35 g, 166.5 u), Eupergit C 상에 고정된 Candida boidini 포르메이트 디히드로게나제(7.29 g, 27.5 u). 수산화암모늄과 포름산을 사용하여 pH를 8.0으로 조절 하였고, 온도는 40℃였다. 반응 종결시 80/400 메쉬의 스테인리스 스틸 체를 통하여 반응기로부터 용매를 배출시키고(이때, 고정된 효소는 체에 걸러짐), 새로운 용액을 반응기에 가하였다. 하기 표에 나타난 바와 같이, 6개의 반응에 효소를 사용하였다. 각 반응에 있어서 특정 거울상이성질체의 비율이 98%를 초과하였다.
용도 반응시간(h) 5-(1,3-디옥솔란-2-일)-(S)-2-아미노-펜탄산(g) 입력물질의 순도에 대하여 보정한 수률(%)
1 26 2.76 61.9
2 26 2.70 60.5
3 45 3.73 83.5
4 69 4.37 97.8
5 48 3.03 67.9
6 120 3.83 85.8
실시예7
씨. 보이디니(C.boidinii) 포르메이트 디히드로게나제 및 티. 인터메디우스(T.intermedius) 페닐알라닌 디히드로게나제에 대한 피치아 재조합
탈이온수(10.0 ml), 암모늄 포르메이트(389.8 mg, 6.18 mmole) 및 5-(1,3-디옥솔란-2-일)-2-옥소-펜탄산 리튬염(1.0 g, 5.15 mmole)을 50 ml 엘렌마이어 플라스크에 가한 후 40℃의 회전식 진탕기에서 200 rpm으로 혼합하였다. 고체가 용해된 후, NAD(3.32 mg, 0.005 mmole), T.intermedius 페닐알라닌 디히드로게나제 및 C.boidinii 포름산 디히드로게나제에 대한 이중 구성 재조합 피치아 균주 SC16245의 습윤된 세포(7.24 u의 포름산 디히드로게나제 및 40.9 u 페닐알라닌 디히드로게나제를 함유하는 0.67 g)를 가하였다. 진한 수산화암모늄을 사용하여 pH를 8.0으로 조절 하였다. 플라스크를 파라필름으로 봉하고 40℃의 회전식 진탕기에서, 200 rpm으로 5분 동안 인큐베이션시켰다. 25시간 후에, 5-(1,3-디옥솔란-2-일)-(S)-2-아미노-펜탄산의 HPLC 수율은 0.98 g이었다(입력물질인 케토산의 순도 보정시 100%). 특정 거울상 이성질체의 비율이 98%를 초과하였다.
실시예8
하기에 상세히 기재된 방법을 하용하여 THF로부터 4-(3-브로모프로필)-1,3-디옥솔란 91.5 g(77.9M%)을 제조하였다.
4-(3-브로모프로필)-1,3-디옥솔란의 제조
THF(50 ml)와 디클로로메탄(500 ml)을 질소 투입구, 열전쌍, HBr 살포관 및환기장치가 구비된 1 L의 3-넥 플라스크에 넣었다. 반응 온도를 20-25℃로 유지하면서 HBr 기체(약 63 g)를 용액에 충전하였다. HBr 기체의 충전은 반응이 완결되었다고 판단될 때까지(THF에 대한 GC 면적%가 10% 이하, 실제 3.5면적%) 계속하였다. 이어서, 질소로 반응 혼합물을 퍼지하여 과량의 HBr 기체를 제거한 후, 8w/v%의 NaHCO3(2 x 220 ml)로 세척하여 4-브로모-부탄올의 메틸렌 클로라이드 용액을 얻었다(GC 면적% = 90.5, 외관상 pH = 6.9). 생성된 4-브로모-부탄올 용액과 포타슘 브로마이드 용액(5 g/25 ml)을 교반기, 질소 투입구, 열전쌍, 1L의 압력 균등화 부가 깔대기가 장착된 2L의 3-넥 둥근바닥 플라스크에 가하였다. 교반하면서 반응 플라스크를 -5 ~ 5℃로 냉각시킨 후, 8w/v%의 NaHCO3(81 ml), 2,2,6,6,-테트라메틸-1-피페리디닐옥시 자유 라디칼(0.675 g)을 가하였다. 격렬한 교반과 함께 온도를 -5 ~ 25℃로 유지하면서 약 1시간에 걸쳐 5.25% 소듐 하이포클로라이트 용액(874 ml)을 반응 혼합물에 가하였다. 첨가가 완전히 끝나면, 공정 중 GC 분석에 의해 판단되어지는 바와 같이 반응이 종결되었다. 두 개의 상으로 분리하고, 수성층을 메틸렌 클로라이드(150 ml)로 추출하였다. 수집된 유기층은 산성화된 요오드화칼륨 수용액(10w/v% 염산 125ml 중의 KI 1.19 g), 6.4w/v% 소듐 티오설페이트 용액(125 ml) 및 물(125 ml로 두번)로 세척하였다. 생성된 4-브로모부탄올의 메틸렌 클로라이드 용액(GC AP = 91.5), 에틸렌 글리콜(39.0 g) 및 파라톨루엔술폰산(7.25 g)을 오버헤드 교반기, 질소 투입구, 열전쌍, 응축기가 달린 Dean-Stark 물 분리기 장치가 있는 2 L의 3-목 둥근바닥 플라스크에 충전시켰다.반응 종결시(GC 분석으로 확인; 미반응 4-브로모부탄알이 2면적% 이하) 물을 공비 제거하면서 반응 혼합물을 가열하여 환류시켰다. 20-25℃로 냉각한 후, 10w/v% 탄산칼륨 용액(250 ml) 및 물(250 ml로 두번)로 세척하였다. 생성된 4-(3-브로모프로필)-1,3-디옥솔란의 메틸렌 클로라이드용액을 처음 부피의 반으로 농축한 후, 테트라히드로푸란을 가하였다. 4-(3-브로모프로필)-1,3-디옥솔란 91.5g(77.9M%, GC 면적% = 89.4, 지체시간 7.9 분) 함유하는 생성물 용액 중의 메틸렌 클로라이드가 0.2% 미만 존재할 때까지 농축을 계속하였다.
공정 중(In-process) GC 방법:
기구 : HP 5890 시리즈 Ⅱ 기체 크로마토그래피
주입구 온도 : 200℃
칼럼 : Restek RTx-5; 30m; 0.32mm ID
오븐 프로그램 : 50℃ 에서 2분, 25℃/분으로 275℃까지 승온, 275℃에서 8분
검색 : FID
검출 장치 온도 : 300℃
시료 제조 : 메틸렌 클로라이드로 희석
지체 시간
4-브로모부탄올 6.4분
4-브로모부티르알데히드 5.6분
4-(3-브로모프로필)-1,3-디옥솔란 7.9분
늦게 용출된 BMS-207170중의 불순물 10.8분
4-(3-브로모프로필)-1,3-디옥솔란 -1H-NMR: 300MHz: CDCl3: δ1.8(m, 2H), 2.0(m, 2H), 3.45(tr, 2H), 3.85(m, 2H), 3.95(m, 2H) 및 4.9(tr, 1H).13C-NMR: 75MHz: CDCl3: 26.94, 32.03, 33.46, 64.72, 103.42.
실시예9
하기에 상세히 기재된 방법을 사용하여 4-(3-브로모프로필)-1,3-디옥솔란 50 g으로부터 리튬-5-(1,3-디옥솔란-2-일)-2-옥소-펜타노에이트 34 g을 제조하였다.
리튬-5-(1,3-디옥솔란-2-일)-2-옥소-펜타노에이트의 제조
질소 분위기하에서, 마그네슘(6.55 g) 및 무수 테트라히드로푸란(30 ml)을 깨끗한 500 ml 플라스크에 충전시켰다. 이 현탁액에 4-(3-마그네시오브로모프로필)-1,3-디옥솔란의 테트라히드로푸란 용액(5 ml)을 가한 후, 10-30분 동안 교반하였다. 브로모아세탈(50 g)을 테트라히드로푸란(130 ml)에 용해시켜 4-(3-브로모프로필)-1,3-디옥솔란의 테트라히드로푸란 용액을 제조하였다. 발열(2-7℃)이 관측된 후에, 4-(3-브로모프로필)-1,3-디옥솔란의 테트라히드로푸란 용액(5 ml)을 반응 혼합물에 가하였다. 발열(2-5℃)이 관측된 후에, 남아있는 4-(3-브로모프로필)-1,3-디옥솔란의 테트라히드로푸란 용액을 25-35℃의 온도가 유지된 상태에서 2-4시간에 걸쳐 반응 혼합물에 천천히 첨가하였다. 첨가가 모두 끝난후에, 그리니어 시약이 완전히 형성될 때까지(공정 중 GC 분석으로 판단; 미반응 브로마이드 1% 이하) 반응 혼합물을 교반하였다. 디에틸옥살레이트(29.85 g) 및 테트라히드로푸란(78 ml)을 질소 투입구, 오버헤드 교반기, 극저온의 냉각조를 갖춘 500ml의 3-넥 둥근바닥 플라스크에 가하였다. 생성된 디에틸옥살레이트 용액을 -60 ~ -70℃로 냉각하고, 4-(3-마그네시오브로모프로필)-1,3-디옥솔란의 테트라히드로푸란 용액을 -60 ~ -78℃가 유지된 상태에서 천천히 첨가하였다. GC분석에 의해 커플링 반응이 완전히 종결되었다고 판단될때까지(이어지는 분석에서 NMR에 의한 미반응 디에틸옥살레이트의 변화수준 = 0.5%) 커플링 반응 혼합물을 -60 ~ -78℃ 에서 약 2시간동안 교반하였다. -60 ~ -78℃에서 커플링 반응 혼합물을 냉각되고(0-5℃) 교반된, 메틸 tert-부틸 에테르(100 l)와 12.5w/v% 구연산 수용액의 2-상(2 phase) 혼합물에 재빨리 가하였다. 상을 분리하고 수성층을 메틸 tert-부틸 에테르(100 ml)로 추출하였다. 수집된 유기층을 pH 6.5-7.0의 10w/v% 소듐 디하이드로겐 포스페이트 완충액(100ml)으로 세척하였다. 생성된 메틸-5-(1,3-디옥솔란-2-일)-2-옥소-펜타노에이트의 메틸 tert-부틸 에테르 용액을 0-5℃로 냉각하고 수산화리튬 용액(85 ml, 80 ml의 물 중의 9.90g 수산화리튬)을 5℃ 이하의 온도를 유지하면서 첨가하였다. 공정 중 GC분석에 의해 비누화반응이 완전히 종결되었다고 판단될 때까지(초기 시료에 대한 상대 면적%가 1 이하) 2-상의 반응 혼합물을 0-10℃ 에서 교반하였다. 반응 종결 후 상을 분리하고 유기층을 물(10 ml)로 추출하였다. 수집된 수성층을 15-30℃로 승온시킨 후, 20분 이상에 걸쳐 이소프로판올(800 ml)로 희석하였다. 생성된 결정 슬러리를 15-30℃ 에서 한시간 동안 교반한 후 0-5℃로 냉각하고, 상청액 중의 생성물 농도가 8 M% 미만일 때까지 교반하였다. 리튬-5-(1,3-디옥솔란-2-일)-2-옥소-펜타노에이트를 필터 상에 수집하고 습윤된 케이크를 저온의(0-5℃) 이소프로판올 수용액(1:8, 75 ml)으로 세척하였다. 습윤된 케이크를 40-50℃의 진공상태에서 건조하고, 흰색의 자유유동 결정체로서 리튬-5-(1,3-디옥솔란-2-일)-2-옥소-펜타노에이트(34.0g, 68.0M%, HPLC 지체시간=4.0분, HPLC AP=94%)를 얻었다.
HPLC 방법 : 칼럼; YMC 기준 5 마이크로 입도, 4.6 x 250 mm, 용매; 10:90 아세토니트릴 : 0.01M 암모늄 아세테이트, 유속 = 1ml/m, 검출 = 210nm UV.
분석자료:1H-NMR: 300MHz: D2O: δ1.5-1.6(m, 4H), 2.65(tr, 2H), 3.7-3.9(m, 4H) 및 4.8(tr, 1H).13C-NMR: 75MHz: D2O: δ17.62, 33.39, 39.17, 64.97, 114.26, 171.86 및 206.99.
실시예10
하기에 상세히 기재된 방법을 사용하여, 한계 분자량이 10,000인 필터러 한외 여과한 후 효소를 이용한 환원 아미노 공정으로부터 5-(1,3-디옥솔란-2-일)-(S)-2-아미노-펜탄산을 단리하였다.
5-(1,3-디옥솔란-2-일)-(S)-2-아미노-펜탄산의 단리
옥살산(농도 = 7.74 mM)이 혼합된 (S)-2-아미노-1,3-디옥솔란-2-펜탄산 수용액(16 g/L, 부피 3500 ml)에 질소를 살포하였다. 30w/v% 아세트산(55 ml)를 첨가하여 pH를 8.6에서 6.5로 조절하고, 질소 가스의 살포를 중지하였다. pH를 조절한후, 옥살산의 혼합 수준을 기준으로 중화된 생성물 용액에 1M 염화칼슘 용액(81.4 ml)을 첨가하였다. 생성된 슬러리를 실온에서 20-30분, 60℃ 에서 30-60분 교반하고 50℃의 진공상태에서 900 ml로 농축하였다. 생성된 슬러리를 여과하고, 여과액을 잔류 옥살산에 대해 시험(Sigma kit 591)한 다음, 진공상태에서 350 ml로 더 농축하였다. 메탄올을 교반하면서 농축액에 가한 후, 생성된 혼합물을 55-60℃ 에서 약 1시간 가열하였다. 생성된 결정 슬러리를 1-1.5시간에 걸쳐 1-5℃로 냉각한 후, 이 온도에서 2-4시간 동안 방치하였다. 생성물 결정을 필터로 수집하고, 저온의 메탄올로 세척한 후, LOD가 1% 이하가 될때까지 40-50℃의 진공상태에서 건조시켜 흰색 결정으로서 5-(1,3-디옥솔란-2-일)-(S)-2-아미노-펜탄산(44.7 g, 78.5%의 회수, 표준시약에 대하여 97.7%의 능률, HPLC AP = 98.9%, HPLC 지체시간 = 2.7분, 잔류 R 거울상 이성질체= 보이지 않음)를 얻었다.
HPLC방법: 칼럼; YMC ODS AQ 4 X 50 mm, 용매; 황산구리 5수화물 물중의 782 mg/L, 유속 = 1 ml/m 및 검출 230 nm UV, 지체시간: 2.7분
실시예11
하기에 상세히 기재된 방법을 사용하여 5-(1,3-디옥솔란-2-일)-(S)-2-아미노-펜탄산 20.0 g으로부터 (S)-2-아미노-6,6-디메톡시헥산산 메틸 에스테르 17.4 g을 제조하였다.
(S)-2-아미노-6,6-디메톡시헥산산 메틸 에스테르의 제조
질소하에서 메탄올(240 ml 중의 5-(1,3-디옥솔란-2-일)-(S)-2-아미노-펜탄산(20.0 g) 및 디메틸 설파이트(12.0 g)의 현탁액에 클로로트리메틸 실란(28.0 g)을 가하여 균질한 용액을 얻었다. 29℃까지의 발열이 관측된 후에, 용액을 40-45℃로 가열하고 그 온도에서 8시간, ~22℃에서 72시간 이하 교반하였다. 공정 중 HPLC 분석에 의해 반응이 종결된것을 확인한 다음(~93M%가 생성물로 전환), 생성된 용액을 -5 ~ -10℃로 냉각하였다. -5~0℃의 온도를 유지하면서 32%(또는 4.45 M) 포타슘 메톡사이드 메탄올 용액(70 ml)을 조심스럽게 천천히 교반하면서 가하여 혼합물의 겉보기 PH를 11.7-11.9로 조절 하였다. 생성물 슬러리를 NMR로 분석하여 중화가 종결되었음을 확인하였다(BMS-205787의 알파 양성자의 화학적 변이가 <3.36 ppm). 30℃ 이하의 진공상태에서 묽은 슬러리를 300ml로 농축한 후, 공정 중 GC분석에 의하여 메탄올이 완전히 제거되었다고 판단될때까지(AP 1이하) 에틸 아세테이트를 첨가하여 생성물 슬러리의 용매를 에틸 아세테이트로 교환하였다. 용매 교환이 종결되면 에틸 아세테이트를 가하여 뱃치 부피를 400ml로 조절하고, 생성된 슬러리를 여과하였다. 폴리(아크릴산 공-아크릴아미드) 칼륨염(3.0 내지 3.2 g) 및 물(30 내지 32 ml)을 여과물에 첨가하였다. 혼합물을 ~35분 동안 교반한 후 여과하였다. 공정 중 GC분석에 의하여 에틸렌 글리콜의 양이 0.15당량을 초과한다고 판단되면, 폴리(아크릴산 공-아크릴아미드) 칼륨염 처리를 여과물에 대하여 임의로 반복할 수 있다. 공정 중 HPLC 분석 후, 에틸 아세테이트 용액 형태의 BMS-205787 (17.4 g)을 80.8 M%의 수율로 얻었다.
분석자료: HPLC: Tr = 7.1분(UV 215): Mac-Mod Analytical, Zorbax CN5 μM, 4.6 x 250 mm, 72v/v%(0.02M 암모늄 포스페이트 용액): 28v/v% 아세토니트릴, 1.0 ml/min으로 용출되는 20 μl의 주입 부피. 이동상으로 300 μl를 5 ml로 희석시킴.
실시예12
하기에 상세히 기재된 방법을 사용하여 5-(1,3-디옥솔란-2-일)-(S)-2-아미노-펜탄산 50 g으로부터 (S)-2-아미노-6,6-디메톡시헥산산 메틸 에스테르 옥살산염 (1:1) 62.5 g(78.7M%)을 제조하였다.
(S)-2-아미노-6,6-디메톡시헥산산 메틸 에스테르 옥살산염 (1:1) 의 제조
5-(1,3-디옥솔란-2-일)-(S)-2-아미노-펜탄산(50 g), 메탄올(300 ml) 및 디메틸 설파이트(11.2 ml)를 기계적 교반기, 열전쌍, 가열 맨틀, 응축기, 질소 투입기 및 환기장치가 있는 250 ml의 3-넥 플라스크에 충전시켰다. 클로로트리메틸 실란(83.9 ml)을 생성된 슬러리에 가하고 반응 혼합물을 40-42℃에서 8시간 가열한 후 실온에서 8시간 교반하였다. 2 L의 3-넥 플라스크에 함유된 메탄올(200 ml)에 중탄산칼륨(104.3 g)을 슬러리화한 후, (S)-아미노-6,6-디메톡시헥산산 메틸 에스테르 염산염을 함유하는 반응 혼합물을 pH를 7이상으로 유지하면서 중탄산칼륨 슬러리에 가하여 중화하였다. 하이플로(12.5 g)와 n-부틸 아세테이트(400 ml)를 가하고 30℃ 이하의 온도를 유지하면서 혼합물을 진공상태에서 농축하여 메탄올을 제거하였다. tert-부틸 메틸 에테르(300 ml)를 슬러리에 가하고 -5℃로 냉각한 다음, 여과에 의해 중화염을 회수하고, 여과 케이크를 tert-부틸 메틸 에테르(50 ml)로 세척하였다. 수집된 여과물을 20-25℃로 데우고 ~27℃의 옥살산 이수화물(36.7 g)의 메탄올(73 ml)용액을 1시간에 걸쳐 분획씩 첨가하였다. 생성된 (S)-2-아미노-6,6-디메톡시헥산산 메틸 에스테르 옥살산염(1:1)의 슬러리를 30분 동안 교반하고, tert-부틸 메틸 에테르(800 ml)를 천천히 첨가하여 부가의 생성물을 결정화하였다. 생성물 슬러리를 30분 동안 교반한 후에 0-5℃로 냉각하고 적어도 1시간동안 방치한 다음 여과하였다. 습윤된 케이크를 tert-부틸 메틸 에테르(300 ml로 두번)로 세척하고 40℃를 넘지않는 온도의 진공상태)~200 mmHg)에서 건조하였다. 생성물인 BMS-205787-02(62.5 g)를 흰색 자유 유동성 분말로서 단리하였다(HPLC AP 97.0, 유리 염기 능률 68.3%(vs. 실험실 표준), BMS-205786-01로부터 보정된 수율 78.7M%).
분석자료: HPLC: Tr = 13.5분(UV 205nm): Rockland Technologies Inc., Zorbax CN5 마이크로 M, 4.6 x 250mm (제품번호 880952.705), 85v/v%(0.01M 인산칼륨 용액) : 15v/v% 아세토니트릴, 1.0 mL/min으로 용출되는 주입 부피 10 μl. HPLC 응답은 0.16 내지 1.5 mg/ml의 범위에서 선형인 것으로 밝혀졌다. 표본을 메탄올 또는 이동상으로 희석하였다.
분석자료:1H-NMR: 300MHz: CD3OD: 1.3-1.6(m, 4H), 1.8-2.0(m, 2H), 3.3(s,3H), 4.1(tr, 1H), 4.4(tr, 1H) 및 5.1(br S, 3H).13C-NMR: 75MHz: CD3OD: 21.03, 31.29, 33.06, 53.56, 53.65, 53.89, 105.74, 166.49 및 171.14.
실시예13
하기에 상세히 기재된 방법을 사용하여 5-(1,3-디옥솔란-2-일)-(S)-2-아미노-펜탄산 100 g으로부터 (S)-2-아미노-6,6-디메톡시헥산산 메틸 에스테르 옥살산염 (2:1) 100.3 g을 제조하였다.
(S)-2-아미노-6,6-디메톡시헥산산 메틸 에스테르 옥살산염 (2:1)의 제조
5-(1,3-디옥솔란-2-일)-(S)-2-아미노-펜탄산(100 g), 메탄올(1200 ml) 및 디메틸 설파이트(44.8 ml)를 기계적 교반기, 열전쌍, 가열 맨틀, 응축기, 질소 투입기 및 환기장치가 있는 250 ml의 3-넥 플라스크에 충전시켰다. 클로로트리메틸 실란(168 ml)을 생성된 슬러리에 가하고 반응 혼합물을 40-42℃ 에서 약 8시간 가열한 후 실온에서 8시간 교반하여 (S)-2-아미노-6,6-디메톡시헥산산 메틸 에스테르 염산염 용액(공정 중 분석시 100.9g, 93 M%)을 얻었다. 5 L의 3-넥 플라스크에 함유된 메탄올(400 ml)에서 중탄산칼륨(208.6 g)을 슬러리화시키고, 혼합물의 pH를 6.9 이상으로 유지하면서, (S)-2-아미노-6,6-디메톡시헥산산 메틸 에스테르 염산염을 함유하는 반응 혼합물을 중탄산칼륨 슬러리에 천천히(약 1.5시간에 걸쳐) 첨가하여 중화하였다. 전체 부피를 약 2 L로 유지하면서 진공증류(50 내지 60 mmHg, 30 내지 40 ℃)함으로써 슬러리의 용매를 n-부틸 아세테이트로 대체하였다. 2.25L의 n-부틸 아세테이트를 증류한 후에 증류용기에 메탄올(1.25 L)을 가하고, 현탁액 상청액의 물 함량이 0.05중량% 이하, 메탄올 수준이 5상대면적% 이하가 될 때까지 전체 부피가 2 L를 넘지 않게 하면서 증류를 계속하였다. 헥산(1.5L)을 생성된 슬러리에 가한 후 -5℃로 냉각하였다. 혼합물을 1시간 동안 교반한 후 여과하고, 여과 케이크를 헥산(100 ml로 두번)으로 세척하였다. 생성된 탁한 슬러리를 폴리쉬여과하여(polish filtered) 투명한 여과액을 얻었다. 투명한 여과액을 20-25℃로 데우고 옥살산 이수화물(33.3 g)의 메탄올(1333 ml)용액을 2시간에 걸쳐 천천히 첨가하였다. 생성된 (S)-2-아미노-6,6-디메톡시헥산산 메틸 에스테르 옥살산염 (2:1)의 슬러리를 실온에서 18시간 교반한 후 필터상에 생성물을 수집하였다. 습윤된 생성물 케이크를 아세토니트릴(100 ml로 4번)로 세척하고 45℃ 진공하에서 건조하여 103.2 g(78M%)의 BMS-205787-05(HPLC AP = 100, 유리 염기에 대한 능률 84중량%(vs. 실험실 표준; 이론치는 82 중량%))를 얻었다.
분석자료: HPLC: Tr = 10.0분 (UV 205nm): Rockland Technologies Inc., Zorbax stable bond CN, 5 마이크로 M, 4.6 x 250 mm, 85v/v%(KOH로 pH를 7.5로 조절한 0.01M 포타슘 디하이드로겐 포스페이트 용액) : 15v/v% 아세토니트릴, 1.0 ml/min으로 용출되는 주입 부피 10μl. 시료는 에탄올 또는 이동상으로 희석할 수 있다.
분석 자료 :1H-NMR: 300 MHz: D6DMSO:δ1.2-1.4 (m,2H), 1.4-1.6 (m,2H), 1.6-1.8 (m,2H), 3.2 (s,6H), 3.55 (tr, 1H), 3.7 (s,3H), 4.3(tr,1H) 및 5.9(brs,4H).13C-NMR: 75 MHz; D6DMSO:δ21.00, 31.77, 32.08, 52.04, 52.39, 52.85, 103.75, 165.01 및 173.09.
실시예 14
다음 제조 공정 기재는 110 ｇ의 4-(3-브로모프로필)-1,3-디옥솔란으로부터 (80 M%가 5-(1,3-디옥솔란-2-일)-2-옥소-펜탄산) 60.3ｇ을 제조하는 데 사용된 공정을 상술한다.
5-(1,3-디옥솔란-2-일)-2-옥소-펜탄산의 제조
적정 깔대기, 질소 선, 오버헤드 교반기, 열전대, 및 수조를 갖춘 3-목 둥근 바닥 500 ml 플라스크에 마그네슘 부스러기 (14.13 ｇ)를 채웠다. 질소 공기하에서, 마그네슘 부스러기를 무수 테트라히드로퓨란 (KF=0.0016wt%, 70 mL로 3회)로 세척하였다. 플라스크를 테트라히드로퓨란 (70 mL, KF=0.02wt%)으로 채운 후, 테드라하이드로퓨란 중에 미리 제조된 그리그냐드 시약의 2 M 테트라히드로퓨란 용액 5 mL로 채웠다. 적정 깔때기는 브로모아세탈:클로로아세탈 (110ｇ, 90:10 wt%)의 85:15 순혼합물로 채웠다. 반응 플라스크에 약 0.5 mL 브로모아세탈 혼합물을 첨가한 후에, 온도를 20℃에서 25℃로 올렸다. 반응 온도가 약 30℃을 유지하도록 첨가되는 속도를 조절하였다. 테트라히드로퓨란 (25 mL)으로 첨가 깔때기를 세척하고, 세척액을 반응 플라스크에 부가하였다. ca. 1.5 시간 후에 첨가를 종료하고, 회분이 실온이 될 때까지 방치하였다. 이 때 그리그냐드 시약의 제조과정 GC-분석은 브로모아세탈 90%가 시클로부탄 불순물이 없는 그리그냐드 시약으로 전환된 반면, 클로로아세탈은 반응하지 않았음을 나타냈다.
1 L 3-목 둥근 바닥 플라스크에 질소 선, 오버헤드 교반기, 열전대를 설치하였다. 질소 공기 하에서, 플라스크를 디에틸 옥살레이트 (73.85 ｇ) 및 테트라히드로퓨란 (250 mL)으로 채웠다. 용액을 60℃까지 냉각한 후, 온도를 -55℃이하로 유지하기 위하여 그리그냐드 시약의 액체 부분을 캐뉼러를 통해 냉각된 디에틸 옥살레이트 용액에 첨가하였다. 테트라히드로퓨란(20 mL로 3회)으로 그리그냐드 제조 플라스크를 세척하고, 얻어진 세척액을 캐뉼러를 통해 첨가하였다. 1.5 시간후에 첨가를 종료하였으며, -60℃ 내지 -55℃에서 약 2 시간동안 반응액을 교반하였다. 냉각된 반응 혼합물을 재빨리 NH4Cl (32.1ｇ), 물 (100 mL), 얼음 (200 ｇ) 및 에틸 아세테이트 (300 mL)로 구성된 혼합물에 부었다. 층들을 분리한 후 수용액 층을 에틸 아세테이트로 다시 추출하였다 (300 mL로 2회). 합쳐진 유기층들을 황산 마그네슘 상에서 건조시키고 농축시켜 87 g (79M% 수율)의 5-(1,3-디옥솔란-2-일)-2-옥소-펜탄산, 에틸 에스테르를 진한 용액으로 얻었다.
3 L 3-목 둥근 바닥 플라스크에 오버헤드 교반기, 열전대 및 1.5 N NaOH(460 mL)을 포함한 첨가 깔때기를 설치하였다. 플라스크를 MeOH (700mL)로 채우고, 0℃로 냉각하였다. 온도를 10℃ 미만으로 유지하면서 수산화나트륨 용액을 메탄올에 천천히 첨가하고, 첨가가 끝날 때 얻어진 용액을 0℃로 냉각하였다. 반응 혼합물의 온도가 3℃ 미만으로 유지되는 속도로 적정 깔때기를 통해 5-(1,3-디옥솔란-2-일)-2-옥소-펜탄산, 에틸 에스테르 (350mL)의 메탄올 용액을 반응에 첨가하였다 (첨가 시간 1시간). 반응물을 0 ℃에서 2시간 동안 교반한 다음 2 M 이황산칼륨 (75 mL)을 첨가하여 반응물의 pH가 7.71이 되도록 하였다. 메탄올을 증발시킨 후 불투명 수성 슬러리를 MTBE 로 세척하였다 (500 mL로 3회). 2M 이황산칼륨 (100 mL)을 첨가하여 수성층의 pH을 4.5로 조정한 후에 에틸 아세테이트 (500 mL)로 추출하였다. 2M 이황산칼륨 (50 mL)을 첨가하여 수성층의 pH을다시 2.0으로 조정한 후에, 에틸 아세테이트 (500 mL로 2회)로 추출하였다. 합쳐진 에틸 아세테이트 추출액을 황산 마그네슘 상에서 건조시키고 농축시켜 5-(1,3-디옥솔란-2-일)-2-옥소-펜탄산 (60ｇ,8M% 수율)을 진한 용액으로 얻었다.
(5-(1,3-디옥솔란-2-일)-2-옥소-펜탄산)-1H-NMR: 300 MHz; CDCl3: δ1.75 (brm,4H), 2.95 (tr,2H), 3.85 (m,2H), 3.95 (m,2H), 4.85 (tr, 1H) 및 7.70 (brs,1H).
13C-NMR: 75 MHz; CDCl3:δ17.27, 32.30, 37.19, 64.85, 103.94, 160.19 및 195.38.
하기 반응식 4는 실시예 15 및 16의 반응을 기술한다.
실시예 15
암모늄 포르메이트 (175 ㎎, 2,775 mmoles), 6-6-디메톡시-2-옥소헥산산, 모노리튬 염(50 ㎎, 0.255 mmoles), 물 10㎖, 디티오트레이톨 (1.64 ㎎, 10.6 μmoles), NAD(7.05 ㎎, 10.6 μmoles), 써모악티노미세스 인터메디우스 (Thermoactinomyces intermedius)의 페닐알라닌 디히드로게나제가 클로닝된 열-건조된 대장균 (50㎎, 62.5 유닛), 및 열-건조된 칸디다 보이디니(Candida boidinii) (82.55 ㎎, 2.75 units)를 상기 순서대로 50 ml 엘렌메이어 플라스크에 첨가하였다. pH는 조정없이 8.03이었다. 40℃에서, 200 rpm으로 18 시간 동안 플라스크를 교반하였다. 키랄팩(Chiralpak) WH 컬럼 (Daicel Chemical Industries)을 사용하여 5-(1,3-디옥솔란-2-일)-(S)-2-아미노-펜탄산에서 기술된 것과 동일한 방법으로 산물 (S)-2-아미노-6,6-디메톡시헥산산의 농도를 정량하였다. 거울상 이성질체에 적합한 표준이 없으나, 이 물질은 아마도 S-아미노산일 것이다. 아미노산의 몰 수율은 74.5% 인 것으로 측정되었다 (농도을 측정하기 위해 5-(1,3-디옥솔란-2-일)-S-2-아미노-펜탄산이 HPLC 표준으로 사용되었다). (M+H)+, 192
실시예 16
암모늄 포르메이트 (389.8 ㎎, 6.18 mmoles), 6-6-디메톡시-2-옥소헥산산, 모노리튬 염 (1.000 g, 5.099 mmoles), 물 20ml, 디티오트레이톨 (3.28 ㎎, 21.27μmoles), NAD (14.1 ㎎, 20.57 μmoles), 및 써모악티노미세스 인터메디우스 (Thermoactinomyces intermedius)의 포르메이트 디히드로게나제 5.5 u 및 페닐알라닌 디히드로게나제 34.7 유닛을 포함하는 냉동상태로 보관된 젖은 피치아(Pichia) 세포(0.2255 g)를 상기 순서대로 50 ml 엘렌메이어 플라스크에 첨가하였다. NH4OH을 첨가하여 pH을 7.56 내지 8.0으로 조정하였다. 40℃에서, 200 rpm으로 43 시간 동안 플라스크를 교반하였다. 반응이 끝난 후에, 원심분리하여 세포를 제거하고 상등액을 분획분자량 10,000 MW의 폴리술폰 막 (YM10)으로 한외여과하였다. 키랄팩 WH 컬럼으로 측정된 (S)-2-아미노-6,6-디메톡시 헥산산의 반응 초기에서 세포 및 단백질의 제거 후로 교정된 전체 수율은 108%이었다.
실시예 17
다음 제조 공정 기재는 10ｇ의 4,4-디메톡시-1-브로모부탄으로부터 (25 M %가 6,6-디메톡시-헥산산) 4.33ｇ을 제조하는 데 사용된 공정을 상술한다.
적정 깔대기, 질소 선, 오버헤드 교반기, 열전대, 및 수조를 갖춘 3-목 둥근 바닥 100 mL 플라스크에 마그네슘 부스러기 (1.7ｇ)를 채웠다. 질소 공기하에서, 마그네슘 부스러기를 건조 테트라히드로퓨란 (10 mL)으로 세척하였다. 테트라히드로퓨란 (6 mL, KF=0.02wt%)으로 플라스크를 채운 후, 테드라하이드로퓨란 (4,4-디메톡시-1-마그네시오브로모부탄)중에 미리 제조된 그리그냐드 시약 1mL로 채웠다. 4,4-디메톡시-1-브로모부탄의 THF 용액 (THF 용액 26 mL 중의 10 g)으로 적정 깔때기를 채웠다 . 온도를 28 내지 31℃에서 유지하면서, 용액을 적가하였다. 첨가를 종료한 후, 용액을 30℃에서 1시간 동안 유지하였다.
100 mL 3-목 둥근 바닥 플라스크에 질소 선, 오버헤드 교반기, 열전대를 설치하고, 열전대를 무수 THF 20 mL로 세척하였다. 디에틸옥살레이트 (4.85 g) 및 THF (100 mL)로 플라스크를 채우고, 용액을 -70℃로 냉각하였다. 온도를 -60 내지 -70℃ 사이로 유지하면서, 디에틸옥살레이트 용액에 그리그냐드 시약 (4,4-디메톡시-1-마그네시오브로모부탄)의 THF 용액을 채웠다. 반응 혼합물을 -70℃에서 2 시간 동안 유지하고, 제조과정 GC 분석 (0.5% 반응안한 디에틸옥살레이트)으로 반응이 종료된 시점을 판단하였다. 반응 혼합물을 구연산 용액 (40 mL 물에 용해된 5g 구연산)에 부어 반응을 종료하였다. 반응이 종료된 반응 혼합물을 메틸 삼차 부틸 에테르로 추출하고 (20 mL로 2회), 합쳐진 메틸 삼차 부틸 에테르 추출물을 pH 6.5의 제일염기 인산나트륨 용액 (20 mL 물 중의 2g, 10N 수산화나트륨 용액으로 pH조정)으로 세척하였다. 진한 유기상을 2 ℃로 냉각하고, 온도를 5℃ 이하로 유지하면서 수산화리튬 용액 (15 mL 물 중의 LiOH 1.4 g)을 적가하였다. 제조 공정 GC 분석이 반응이 종결된 것을 나타낼 때까지(유기상 중의 반응안한 에스테르가 0.5% 미만) 반응 혼합물을 5℃에서 30분간 교반하였다. 층들을 분리하였으며, 유기상을 물 (2 mL)로 추출하였다. 이소프로판올 (300 mL)을 진한 수성상에 첨가하고 생성된 슬러리를 회전 진공기상에서 고체로 농축하였다. 고체를 메틸 삼차 부틸 에테르 (300 mL) 및 이소프로판올 (100 mL) 혼합물에 현탁하고, 슬러리를 3 ℃에서 1시간 동안 교반하고 산물을 여과기 상에서 회수하였다. 젖은-케이크 산물을 찬 메틸 삼차 부틸 에테르/이소프로판올 (75 mL, 각각 4:1)로 세척하고 진공 하에서 건조하여 리튬-6,6-디메톡시-2-옥소-헥사노에이트 (4.33g, 4,4-디메톡시-브로모부탄으로부터 25M%)를 얻었다.
분석 자료 :HPLC:Tr=4.4 분 (UV 210nm):YMC-염기, 5 마이크로-M, 4.6X 250nm, 90v/v% (0.05 M 암모늄 아세테이트 용액); 10v/v% 아세토나이트릴, 10 마이크로 L 주사 부피가 1.0mL/분의 속도로 용출).
분석 자료 :1H-NMR: 300 MHz: D2O:δ1.6 (brm,6H), 3.3 (s,6H), 및 4.4 (m, 1H).13C-NMR: 75 MHz; D2O:δ18.78, 32.39, 39.70, 54.34, 105.85 및 207.03.
실시예 18
다음 제조 공정 기재는 10,000 MW 제한 여과기를 통한 한외여과 후의 효소적 환원 아미노화 공정 흐름으로부터 (S)-2-아미노-6,6-디메톡시헥산산을 분리하는 데 사용된 공정을 상술한다.
(S)-2-아미노-6,6-디메톡시헥산산의 단리
옥살산 (농도=5.4mM)이 들어간 (S)-2-아미노-6,6-디메톡시헥산산의 수용액 (농도=26.5g/L, 36mL 부피)에 질소를 살포하였다. 30w/v% 아세트산 (1.2mL)로 용액의 pH을 약 6.5로 조정한 후 질소 살포를 중단하였다. pH을 조정하고, 옥살산 오염 정도에 따라 1M 염화 칼슘 용액 (1.3 mL)을 중화된 산물 용액에 첨가하였다. 생성된 슬러리를 실온에서 20-30분간, 55℃에서 30분간 교반하고 여과하여 칼슘 옥살레이트를 제거하였다. 여과액을 Darco G-60으로 30분간 교반하고 HyFlo을 통해 여과하였다. 여과액을 n-buOH을 이용하여 진공에서 농축하여 공비혼합물적으로 물을 제거하여, 거품상(2.04g)을 얻었다. 거품을 메탄올 (5.1mL)에 용해하고 아세토나이트릴(15mL)과 혼합하였다. 용액에 (S)-2-아미노-6,6-디메톡시헥산산을 뿌리고 얼음 수조에서 냉각하였다. 산물을 여과기상에서 수집하고 젖은-케이크를 50℃에서 4시간 동안 진공하에서 건조하여 (S)-2-아미노-6,6-디메티헥산산을 얻었다 (0.392g, 투입 용액으로부터 35.6M% ), (HPLC 면적률=97.6).
분석 자료 :HPLC:Tr=3.6 분 (UV 230nm):YMC-ODS AQ, 4.6X 50mm, 무수 황산구리 @ 500 mg/L 농도, 10 마이크로 L 주사 부피가 1.0mL/분의 속도로 용출).
분석 자료 :1H-NMR: 300 MHz: D2O:δ1.3-1.5 (m,2H), 1.6-1.75 (m,2H),1.8-2.0 (m,2H), 3.4 (s,6H), 3.75 (tr, 1H) 및 4.6 (tr, 1H).13C-NMR: 75 MHz; D2O:δ19.89, 30.57, 32.05, 53.82, 55.11, 105.07 및 175.05.
실시예 19
FDH 및 PDH의 양자 항시 발현
1. 재조합 균주 피치아 파스토리스 ( Pichia pastoris ) GS115(pGAPZ-FDH)의 제조
pGAPZ는 Invitrogen (Carlsbad, CA)에서 구입한 벡터이다. 상기 벡터는 항상성 글리세르알데하이드 3'-포스페이트 프로모터 조절하에서 외래 유전자가 피치아 파스토리스에서 발현되도록 한다. 칸디다 보이디니로부터의 포르메이트 디히드로게나제 (fdh)는 다음과 같이 pGAPZ에 콜로닝되었다.
클로닝된 칸디다 보이디니의fdh유전자의 DNA 서열을 결정하고 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)을 이용한 상기 유전자의 증폭을 위한 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 제조하는 데 사용하였다. 프라이머들은 (NH2끝)5'-GGAATTCCATATGAAGATCGTTT- TAGTCTTA3'(SEQ.ID.NO.:1) 및 (COOH 끝) 5'-CCTTAAGAATAATAAAGAATAGACAAATGG-3'(SEQ.ID.NO.:2)이었다. 씨. 보이디니의 염색체 DNA를 PCR 반응의 표적으로 사용하였다. PCR 반응으로 예상된 크기 (ca. 1100-염기쌍)의 단일 DNA 절편을 얻었으며, 상기 절편을 분리하고, 정제하고, 제한효소 EcoRI으로 절단하였다. 절단된 PCR 산물을 EcoRI-절단된 pGAPZ DNA와 연결하고,연결체 혼합물로 대장균 TOP 10F' 균주를 전기천공법을 이용하여 형질전환하였다.
형질전환된 세포를 항생제 제오신 (Invitrogen) 25mg/ml을 포함한 LB 한천 배지에서 선별하였다. 18개 콜로니들에서의fdh유전자의 존재를 PCR로 확인하였다: 세 개가 양성인 것으로 나타났다. fdh 유전자를 시퀀싱하여 이 서열이 사카이(Sakai, Y.) 등의 문헌[J. Bacteriology, 179: 4480-4485, 1997]에 의해 공개된 것과 같은 같은 서열임을 확인하였다. 이후의 사용을 위해 플라스미드 pGAPZ-FDH을 포함한 한 개의 콜로니를 선택하였다. TOP 10F' (pGAPZ-FDH)로부터 플라스미드 DNA을 분리하고, 제한효소 AvrII 처리하여 선형화하고, 피치아 파스토리스 GS115에 전기침공하였다. 2g/l 제오신을 포함한 배지에 세포를 깔아 여러 개의 삽입된 pGAPZ-FDH 복사본을 가지는 형질전환체를 선택하였다. 이같은 콜로니들을 여러 개 얻었으며 이들은 pGAPZ만을 가진 세포들 (자체 FDH 유전자를 가진 피치아 파스토리스)의 FDH 활성의 최소 2배의 활성을 가지는 것으로 나타났다. 그 후의 작업을 위해 가장 높은 FDH 비활성을 가지는 균주를 선택하였으며 GS115 (pGAPZ-FDH)로 명명하였다.
2. pGAPk-PDH의 제조
양자 항시 발현 균주의 제조의 다음 공정으로 재조합 페닐알라닌 디히드로게나제 (pdh) 유전자를 GS115 (pGAPZ-FDH)에 도입하였다. 이들 균주는 이미 제오신-내성이 있으므로, 항상성 프로모터를 포함하나 형질 전환체의 다른 선별 방법을 허용하는 플라스미드를 제조하였다. 글리세르알데히드 3'-인산 프로모터 부위를 가지는 pGAPZ의 546-염기쌍 BglII/NotI 절단 단편을 pPIC9k (Invitrogen)의 9000-염기쌍 BamHI/NotI 절편에 클로닝하였다. 이 새로운 플라스미드를 pGAPk라 명명하였다. pGAPk에는 GS115에 존재하는 불완전한 형태를 보완하는 완전한 기능적 HIS4 유전자가 존재하므로 최소 배지에서 선별할 수 있다. 또한 플라스미드에 의해 코드되는 항생제 G418에 대한 내성을 이용하여 복수 삽입체를 선별할 수 있다. pGAPk 유전자 지도를 첨부한다.
3. 재조합 플라스미드 pGAPk-PDH의 제조와 GS115(pGAPZ-FDH)의 형질전환
써모악티노미세스 인터미디어스 페닐알라닌 디히드로게나제 유전자의 공개된 DNA 서열을 이용하여 [Takada, H., et al.,J. of Biochem., 109:371-376, 1991], NH2끝 (5'-CGGAATTCAAGATGCGCGACGTGTTTGAAATG-3') (SEQ.ID.No.:3) 및 COOH 끝 (5'-CGTTCTCGCGTTCCTCCATTGAGCTCGCC-3') (SEQ.ID.No.,:4)에 해당하는 DNA 프라이머들을 합성하였다. 이들을 써모악티노미세스 인터미디어스 염색체 DNA을 표적 DNA로 하는 PCR에 사용하였다. 전기 영동으로 예상 크기 (ca. 1100-염기쌍)의 절편을 확인하였다. DNA을 정제하고 EcoRI 및 XhoI 제한효소로 절단하였다. pGAPk을 EcoRI으로 절단한 다음 XhoI으로 부분절단하였다; 아가로스 젤 전기영동으로 9500-염기쌍을 단리하였다. 두 절편을 연결하고 대장균 DH10B 세포에 전기침공법으로 형질전환하였다. 형질전환체 중pdh유전자의 존재를 콜로니 PCR로 스크린하였다. 이러한 하나의 콜로니를 확인하여 이 플라스미드를 pGAPk-PDH라 명명하였다.
pGAPk-PDH를 AvrII 제한효소를 사용하여 선형화하고 피치아 파스토리스 GS115 (pGAPZ-FDH)에 전기침공하였다. 최소 포도당 한천 플레이트에서 성장하는 능력으로 형질전환체를 선별하였다. 약 10,000 콜로니들에 대해 G418 (4g11)에 대한 내성을 스크린하였다. 내성을 나타내는 여러 개의 콜로니들을 분리하였으며 액체 YPD 배지에서 성장시킨 후, 수집하고 PDH와 FDH 활성을 조사하였다. 양쪽 활성이 모두 존재하였다. 재조합 분리체로부터의 세포 추출물을 이용한 5-(1,3-디옥솔란-2-일)-2-옥소-펜탄산의 5-(1,3-디옥솔란-2-일)-(S)-2-아미노 펜탄산으로의 생전환의 사용 시험은 양성이었다.
실시예 20
rPDH 유도성 발현 시스템
1. 재조합 대장균 BL21(DE3)(pPDH155K)의 rPDH 발현
최종 재조합 벡터 (pPDH155K)의 제조는 두 단계로 이루어졌다: a) 써모악티노미세스 인터미디어스 PDH 유전자를 플라스미드 벡터 pET15b (Novagen, Madison, WI;도1)에 클로닝하여 재조합 벡터 pPDH15b/l을 제조하는 단계; 및, b) 플라스미드 벡터 pPDH15b/l의 엠피실린 내성 마커를 벡터 pET9b (Novagen, Madison, WI.;Fig.2)의 카나마이신 내성 마커로 치환하는 단계. 이 시스템에서 PDH 유전자의 발현은 강력한 T7 프로모터 조절 하에 있다. IPTG (이소프로필 B-D-티오갈락토피라노시드)로 PDH 발현을 유도한다. PDH 단백질의 발현은 세포내이다.
재조합 균주 대장균 BL21(DE3)(pPDH155K)(ATCC 98374)을 다음과 같은 방식으로 제조하였다. 공개된 써모악티노미세스 인터미디어스의 페닐알라닌 디히드로게나제 (PDH) DNA 서열[Takada, et al.,J.of Biochem., 109:371-376,1991]을 이용하여, PDH 단백질의 N-끝 (5'-CATGCCATGGTCGACGTGTTTGAAATGATGG-3') (SEQ.ID.No.:5) 및 C-끝 (5'-CCGCTCGAGTTACCTCCTTGCGCTGTTGC-3') (SEQ.ID.No.:6)에 해당하는 DNA 프라이머을 합성하고 써모악티노미세스 인터미디어스 표적 DNA을 이용한 PCR 반응에 이용하였다. PCR 반응으로 예상 크기의 하나의 단일 DNA 절편을 얻었으며, 이를 분리하고, 정제하고 난 다음 제한효소 NcoI 및 XhoI으로 절단하였다. 절단된 PCR 절편을 NcoI/XhoI으로 절단된 pET15b 플라스미드 벡터에 연결하였으며, 연결 혼합체로 대장균 균주 BL21(DE3)을 전기침공하였다. 단리된 대장균 균주 BL21(DE3)(pPDH15b/l)의 유도시킨 배양액의 세포 추출물을 SDS-PAGE 분석한 결과 정확한 크기의 과발현된 단백질의 존재를 증명하였다. 재조합 세포 추출물을 이용한 5-(1,3-디옥솔란-2-일)-2-옥소-펜탄산의 5-(1,3-디옥솔란-2-일)-(S)-2-아미노- 펜탄산으로의 생전환에의 사용 시험 및 PDH 활성 분석 결과는 모두 양성이었다.
그 후 벡터 pPDH15b/l을 분리하고 제한효소 AlwNI 및 EcoRI으로 절단하였다. 이들 두 효소에 의한 pPDH15b/l의 절단은, PDH 발현 카세트나 플라스미드 복제/유지 기능에 영향을 주지 않고 앰피실린 내성 유전자를 완전히 떨어져 나가게 한다. 이와 마찬가지로, 플라스미드 벡터 pET9b을 동일한 두 제한 효소로 절단하고, 카나마이신 내성 유전자를 포함하는 1.17 kb AlwNI/EcoRI DNA 절편을 분리하고 난 다음, 이를 pPDH15b/l PDH-포함 절편과의 연결 반응에 사용하였다 (상술한 바와 같이). 연결 혼합체를 대장균 균주 BL21 (DE3)의 전기침공에 의한 형질전환에 사용하였다. 카나마이신 내성 형질전환체 [대장균 BL21(DE3)(pPDH155K)]을 단리하고 PCR로 PDH 발현 카세트의 존재를 확인하였다. 이 재조합 균주로부터의 세포 용해물을 이용한 5-(1,3-디옥솔란-2-일)-2-옥소-펜탄산의 5-(1,3-디옥솔란-2-일)-(S)-2-아미노 펜탄산으로의 생전환에의 사용 시험 및 PDH 활성 검사 결과는 모두 양성이었다.
2. 재조합 균주 피치아 파스토리스 SMD1168(pPDH9K/10)에 의한 FDH/rPDH의 발현
5-(1,3-디옥솔란-2-일)-2-옥소-펜탄산의 5-(1,3-디옥솔란-2-일)-(S)-
2-아미노 펜탄산의 생전환은 두 종류의 효소, 즉 페닐알라닌 디히드로게나제 (PDH) 및 포르메이트 디히드로게나제 (FDH)의 작용을 수반한다. 재조합 균주 피치아 파스토리스 SMD1168 (pPDH9K/10)은 피치아 파스토리스의 내부 FDH와 클로닝된 써모악티노미세스 인터미디어스의 PDH 유전자를 이용하여, 단일-세포 FDH/rPDH시스템으로 제조되었다. 최종 재조합 벡터 (pPDH9K)의 제조는 두 단계로 일어난다: a) 써모악티노미세스 인터미디어스pdh유전자를 플라스미드 벡터 pICZ (Invitrogen, San Diego, CA.;Fig.3)에 클로닝하여 플라스미드 벡터 pICZ-PDH을 먼저 제조하고 이어서, b) 벡터 pICZ-PDH에 클로닝된 PDH 유전자를 플라스미드 벡터 pIC9K (Invitrogen, San Diego, CA)에 전달하여 플라스미드 벡터 pPDH9K를 제조하는 단계. 이 시스템에서 PDH 발현은 메탄올에 의해 발현 유도되는 AOX1 프로모터의 조절하에 있다. PDH 단백질의 발현은 세포 내이다.
재조합 균주 피치아 파스토리스 SMD1168(pPDH9K/10)(ATCC 74408)은 다음과 같은 방법으로 단리하였다. 공개된 써모악티노미세스 인터미디어스pdhDNA 서열을 이용하여,pdh유전자의 N-끝 (5'CGGAATTCAAGATGCGCGACGTGTTTGAAATG3')(SEQ.ID.No.;7) 및 C-끝 (5'GGGGTACCCCTCCTTGCGCTGTTGCGGGG3')(SEQ.ID.No.;8)을 합성하고 써모악티노미세스 인터미디어스 표적 DNA을 이용한 PCR 반응에 이용하였다. PCR 반응으로 예상 크기의 하나의 단일 DNA 절편을 얻었으며, 이를 단리하고, 정제하고 난 다음 제한효소 EcoRI 및 KpnI으로 절단하였다. 절단된 PCR 절편을 EcoRI/KpnI으로 절단된 pICZ 플라스미드 벡터에 연결하였으며, 이 연결 혼합체로 피치아 파스토리스 균주 GS115를 전기침공하였다. 피치아 파스토리스 GS115 (pICZ-PDH)로부터의 재조합 단리물의 세포 추출물에서 PDH 활성 분석 결과가 양성이었다.
그 후 플라스미드 pICZ-PDH을 제한효소 PmeI 및 NotI으로 절단하고,pdh유전자 카세트를 포함하는 2.5kb DNA 절편을 분리하고 정제하였다. 이와 마찬가지로, 플라스미드 벡터 pIC9K를 동일한 두 제한효소로 절단 및 정제하였다. 두 절단된 DNA들을 연결하고 전기침공법을 이용하여 이 연결 혼합체를 피치아 파스토리스 SMD1168에 형질전환시켰다. 이어서 이 전기침공에 의한 형질전환체들을 고농도의 항생제 G418 (4mg/ml)에 대한 내성으로 스크린하였으며, 단리물들이 다수의 플라스미드 삽입이 일어난 것으로 나타났다. 높은 G418 내성을 나타내는 8개의 콜로니들에서 메탄올 유도 후의 재조합 PDH 발현을 조사하였다. 하나의 단리물 [피치아 파스토리스 SMD1168 (pPDH9K/10)]가 조사된 다른 형질전환체들에 비해 상당히 높은PDH 활성을 나타내었다. 예상된 대로, 상기 단리물로부터의 세포 추출물에서 FDH 활성도 또한 나타났다. 반응 혼합물에 외부 FDH가 첨가되는 때나 반응 혼합물에 FDH가 첨가되지 않는 때나, 상기 분리체의 세포 추출물을 이용한 5-(1,3-디옥솔란-2-일)-2-옥소-펜탄산의 5-(1,3-디옥솔란-2-일)-(S)-2-아미노 펜탄산으로의 생전환의 사용 시험은 양성이었으며, 이는 본 단일-세포 FDH/rPDH 시스템의 효능을 증명하는 것이다.

Claims (28)

  1. 하기 화학식(II)의 케토 화합물을, 하기 화학식(I) 화합물의 형성에 적합한 조건하에서 암모니아 및 보조 인자 존재 하, 아미노산 디히드로게나제와 접촉시키는 것을 포함하는, 하기 화학식(I)의 알킬아미노산 화합물의 제조 방법
    <화학식 I>
    상기 식에서, R1은 수소, C1-C18알킬 또는 1가 양이온이고,
    R2는 하기 화학식a), b) 또는 c)의 잔기들 중 하나이다
    <화학식 a>
    <화학식 b>
    <화학식 c>
    상기 식에서, 각 R3는 C1-C18알킬이고, R4는 H 또는 R3이다
    <화학식 II>
    상기 식에서, R2및 R1은 상기 정의한 바와 같다.
  2. 제1항에 있어서, R1이 수소인 방법.
  3. 제1항에 있어서, R1이 리튬인 방법.
  4. 제1항에 있어서, R2가인 방법.
  5. 제1항에 있어서, R3이 메틸이거나 또는 R2가 하기 화학식인 방법
    상기 식에서 R4는 H 또는 메틸이다.
  6. 제1항에 있어서, 상기 아미노산 디히드로게나제가 알라닌 디히드로게나제, 페닐알라닌 디히드로게나제, 글루타메이트 디히드로게나제, 류신 디히드로게나제 또는 발린 디히드로게나제인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 아미노산 디히드로게나제가 미생물에 의해 반응기내에서 생성되는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 미생물이 써모악티노미세스종(Thermoactinomyces sp.) 또는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 또는 이 콜리(E. Coli)인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 보조 인자가 NADH인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 보조 인자가 효소에 의해 반응기내에서 재생되는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 재생 효소가 포르메이트 디히드로게나제인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 후속 공정으로서,
    화합물(I)을 하기 화학식(III) 화합물의 형성에 적합한 조건하에서 적합한 용매 중의 티오닐 클로라이드와 반응시키거나, 또는
    화합물(I)을 하기 화학식(III) 화합물의 형성에 적합한 조건하에서 적합한 용매 중의 클로로트리메틸 실란 및 디메틸 설파이트와 반응시키는 추가단계를 갖는 방법
    <화학식 III>
    상기 식에서 R5는 C1-C18알킬이다.
  13. (a) PDH를 암호화하는 재조합 핵산 및, 임의적으로, PDH를 암호화하는 내생적 핵산, 및
    (b) 내생적, 재조합, 또는 내생적 및 재조합 모두인 FDH를 암호화하는 핵산을 함유하는, 페닐알라닌 디히드로게나제(PDH) 및 포르메이트 디히드로게나제(FDH)를 모두 생산할 수 있는 조작된 숙주 세포.
  14. 제13항에 있어서, 포르메이트 디히드로게나제를 발현시킬 수 있는 핵산이 내생적인 조작된 숙주 세포.
  15. 제14항에 있어서, 페닐알라닌 디히드로게나제를 발현시킬 수 있는 핵산이 내생적이 아닌 숙주 세포.
  16. 제13항에 있어서, 피치아종 숙주 세포.
  17. 제13항에 있어서, 피치아 파스토리스 숙주 세포.
  18. 피치아 파스토리스 ATCC 74408.
  19. 피치아 파스토리스 ATCC 74433.
  20. 제13항에 있어서, 내생적 포르메이트 디히드로게나제를 발현시킬 수 있는 칸디다 보이디니(Candida boidinii) ATCC 32195 숙주 세포.
  21. 페닐알라닌 디히드로게나제를 발현시킬 수 있는 재조합 핵산 및 포르메이트 디히드로게나제를 발현시킬 수 있는 내생적 핵산을 포함하는 조작된 박테리아 숙주 세포.
  22. 에스케리키아 콜리(Escherichia coli) ATCC 98374.
  23. 하기 화학식(II)의 화합물
    <화학식 II>
    상기 식에서, R1은 수소, C1-C18알킬 또는 1가 양이온이고,
    R2는 하기 화학식a), b) 또는 c)의 잔기들 중 하나이다
    <화학식 a>
    <화학식 b>
    <화학식 c>
    상기 식에서, 각 R3는 C1-C18알킬이고, R4는 H 또는 R3이다.
  24. 제23항에 있어서, R2가인 화합물.
  25. 제23항에 있어서, R1이 수소, 암모늄, 리튬 또는 칼륨인 화합물.
  26. 제23항에 있어서, R1이 수소, 암모늄, 리튬 또는 칼륨이고, R2가인 화합물.
  27. 제25항에 있어서, R1이 수소인 화합물.
  28. 제25항에 있어서, R1이 리튬인 화합물.
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