JP2003169685A - 改変アリールマロン酸脱炭酸酵素およびそれを用いた製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】望ましい立体選択性を有するアリールマロン酸
脱炭酸酵素（以下、ＡＭＤａｓｅ）を提供することを目
的とする。 【解決手段】アルカリゲネス・ブロンチセプティクス
（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃ
ｕｓ）ＫＵ１２０１（微工研菌寄第１１６７０号）が産
生する野性型ＡＭＤａｓｅの有する立体選択性とは逆の
立体選択性を有することを特徴とする改変ＡＭＤａｓｅ
を用いて、α−アリール−α−メチル−マロン酸誘導体
から光学活性を有するα−アリールプロピオン酸誘導体
を製造する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、立体選択的なアリ
ールマロン酸脱炭酸活性を有する蛋白質の誘導体、特に
野性型酵素とは逆の立体選択性を有する改変体に関する
ものであり、さらには該蛋白質等を用いて高い光学純度
を有するα−アリールプロピオン酸誘導体を生物工学的
に製造する方法等に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】光学活性α−アリールプロピオン酸は強
電磁液晶や医農薬の合成中間体として有用な化合物であ
る。従来二置換マロン酸誘導体を原料に不斉脱炭酸反応
を行って光学活性α−アリールプロピオン酸を高い収率
で得る方法は知られていなかったが、アリールマロン酸
脱炭酸酵素（以下ＡＭＤａｓｅと略記する）の発見によ
りこれが可能になった（特開平５−１７６６７７８号公
報）。その後、この酵素は性質が詳細に解析され（特開
平５−２２７９６３５号公報、特開平５−２８４９８１
号公報）、また本酵素を用いるフッ素含有α−アリール
アルカン酸化合物の合成方法が開示された（特開平５−
２６０９８３号公報）。さらには本酵素の大量生産を可
能にする遺伝子のクローニングがなされ、それと共にア
ミノ酸配列も明らかにされた（特開平５−３２８７９７
６号公報、Ｍｉｙａｍｏｔｏ，Ｋ．ら，Ａｐｐｌ．Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８、２３４
−２３８、１９９２年）。クローニングされた遺伝子を
基に遺伝子工学的な手法を用いて酵素の機能改変を行う
ことが可能であり、すでに１０１番目のシステイン残基
をセリン残基に置換したもの（特開平９−２２４６７５
号公報）が野性型酵素に比べて高い触媒活性を有し、ま
た４５番目のプロリン残基をロイシン残基に置換したも
の（特開平１０−１１４９０７号公報）が野性型酵素に
比べて熱安定性が向上していることなどが明らかになっ
ている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】アルカリゲネス・ブロ
ンチセプティクス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｂｒｏｎ
ｃｈｉｓｅｐｔｉｃｕｓ）ＫＵ１２０１（微工研菌寄第
１１６７０号）が産生するＡＭＤａｓｅは高い触媒活性
と立体選択性を有するが、これを用いることによって得
られるα−アリールプロピオン酸は、非ステロイド系抗
炎症剤、殺虫剤、除草剤などに用いられている化合物群
とは逆の立体配置であることが明らかにされている。こ
のことが本酵素の産業上の利用に大きな障害となってお
り、逆の立体選択性を有する酵素の発見あるいは創製が
強く要望されていた。しかしながら通常の土壌からのス
クリーニングによってはそうした酵素を産生する微生物
が単離されておらず、また本酵素が反応上もアミノ酸配
列上も極めて特異な酵素であるために、合理的な機能改
変の道筋を得ることが困難であった。

【０００４】一般に光学活性な生理活性物質を生物工学
的な手法を用いて生産させるには大きく二通りの方法が
ある。すなわち天然物として生物体に生産させる方法と
生物体の持つ酵素を利用して物質変換させる方法であ
る。現時点においては安価な糖類を原料として光学活性
なα−アリールプロピオン酸を生産するような微生物は
知られていない。後者の方法として最も良く利用されて
いるのはリパーゼ、プロテアーゼ、あるいはアミダーゼ
などの加水分解酵素を利用して立体選択的に加水分解反
応を起こさせる方法である。例えばＣｏｍａｍｏｎａｓ
ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ ＫＰＯ−２７７１４の産生
するアミダーゼを用いてＲの立体配置を有するケトプロ
フェン［２−（３−ベンゾイルフェニル）プロピオン
酸］を合成する例が知られている（Ｙａｍａｍｏｔｏ，
Ｋ．ら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．６２、１５２−１５５、１９９６年）。しかしなが
らこうした加水分解酵素を利用した場合には収率が５０
％未満となり、残った逆の光学異性体を利用しようとす
ると化学的なラセミ化などの処置が必要となる。こうし
たことからプロキラルな化合物から立体特異的に変換す
る酵素が望ましい。ＡＭＤａｓｅはまさにそうした性質
を有する酵素であり、マロン酸誘導体の化学合成が容易
であることから、望ましい立体選択性を有するＡＭＤａ
ｓｅが入手できれば、医農薬原料の合成に広く利用でき
ると期待される。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者等は上記課題に
関し鋭意検討した結果、本発明に到達した。即ち本発明
は、アルカリゲネス・ブロンチセプティクス（Ａｌｃａ
ｌｉｇｅｎｅｓ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃｕｓ）Ｋ
Ｕ１２０１（微工研菌寄第１１６７０号）が産生する野
性型アリールマロン酸脱炭酸酵素の有する立体選択性と
は逆の立体選択性を有することを特徴とする、改変アリ
ールマロン酸脱炭酸酵素である。また本発明は、上述の
改変アリールマロン酸脱炭酸酵素を用いて、α−アリー
ル−α−メチル−マロン酸誘導体から光学活性を有する
α−アリールプロピオン酸誘導体を製造することを特徴
とする、α−アリールプロピオン酸誘導体の製造法であ
る。以下、本発明を更に詳細に説明する。

【０００６】本発明の改変アリールマロン酸脱炭酸酵素
は、アルカリゲネス・ブロンチセプティクス（Ａｌｃａ
ｌｉｇｅｎｅｓ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃｕｓ）Ｋ
Ｕ１２０１（微工研菌寄第１１６７０号）が産生する野
性型アリールマロン酸脱炭酸酵素の有する立体選択性と
は逆の立体選択性を有するものである。このアルカリゲ
ネス・ブロンチセプティクス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ
ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃｕｓ）ＫＵ１２０１（微
工研菌寄第１１６７０号）が産生する野性型アリールマ
ロン酸脱炭酸酵素としては、例えば配列番号１のアミノ
酸配列が暗号化する酵素を挙げることができる。

【０００７】本発明者らは、従来類縁の酵素がなく、機
能改変の手がかりがつかめなかったＡＭＤａｓｅがグル
タミン酸ラセマーゼ、アスパラギン酸ラセマーゼ、ヒダ
ントインラセマーゼ、及びマレイン酸ラセマーゼと類似
した反応機構を有し、またこれらと弱いながらも有意な
相同性を有することを見出した。こうした知見を手がか
りにして触媒活性に必須なシステイン残基の配置を変え
ることにより酵素の立体選択性を反転させることができ
るのではないかという考えに基づき、グルタミン酸ラセ
マーゼの活性中心残基（Ｇｌａｖａｓ，Ｓ．とＴａｎｎ
ｅｒ，Ｍ．Ｅ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４０、６１
９９−６２０４、２００１年）と立体構造（Ｈｗａｎ
ｇ，Ｋ．Ｙ．，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．６、
４２２−４２６、１９９９年）を参考にしてアミノ酸の
置換を行った。

【０００８】すなわち、グルタミン酸ラセマーゼ、アス
パラギン酸ラセマーゼ、ヒダントインラセマーゼ、及び
マレイン酸ラセマーゼと比較した場合、これらの活性中
心残基のひとつと推測されるシステイン残基に相当する
ＡＭＤａｓｅの残基をＧｌｙ７４及びその前後のアミノ
酸残基であると推定した。この領域での相同性は低いた
め一義的に決定することは困難であり、本発明ではＳｅ
ｒ７１からＴｈｒ７５の間のいずれかをシステイン残基
によって置換することが好ましい。その中でＧｌｙ７４
をシステイン残基に改変することが特に好ましい。また
野性型酵素において活性中心残基となっているＣｙｓ１
８８を不活性化するためにこれを他のアミノ酸残基に置
換することが好ましく、特にセリン残基に置換すること
が好ましい。こうして得られた本発明の改変アリールマ
ロン酸脱炭酸酵素は、配列番号１に記載のアミノ酸配列
が暗号化する酵素の立体選択性とは逆の立体選択性を有
し、例えばα−メチル−α−（２−ナフチル）マロン
酸、及びα−メチル−α−（２−チエニル）マロン酸か
ら、それぞれＳ体のα−（２−ナフチル）プロピオン
酸、及びＲ体のα−（２−チエニル）プロピオン酸を生
成した。後者の生成物はＲと表記されるが、これは不斉
炭素から２原子離れた位置に硫黄原子があるためであ
り、両者の絶対配置は同一である。一方野性型酵素を用
いた場合にはどちらの場合もそれぞれＲ体、Ｓ体の化合
物が得られた。

【０００９】本発明の製法において原料として用いられ
るα−アリール−α−メチルマロン酸誘導体の製法には
特に限定はない。例えばα−メチル−α−（２−ナフチ
ル）マロン酸、及びα−メチル−α−（２−チエニル）
マロン酸の製造法には特に限定はなく、マロン酸にメチ
ル基とアリール基を導入することによって得ることもで
きるし、α−アリール酢酸を原料としてエステル化、ア
ルコキシカルボニル化、メチル化、エステル加水分解と
いった手順を通して得ることも、あるいは同じくα−ア
リール酢酸を原料としてエステル化、メチル化、アルコ
キシカルボニル化、エステル加水分解といった手順を通
して得ることもできる。

【００１０】本発明で用いられるＡＭＤａｓｅおよびそ
の改変型変異酵素を調製する方法にも特に限定はなく、
大腸菌、枯草菌、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎ
ｅｓ）属細菌、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ）属細菌、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属酵母、サッカロ
マイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属酵母等を任
意に利用することができる。酵素の利用形態にも特に制
限はなく、これらの微生物の培養液から回収した微生物
菌体をそのまま触媒として用いることもできるし、微生
物菌体を浸透圧ショックや超音波処理、フレンチプレス
処理、あるいはマントン・ゴーリン・ホモジナイザー処
理等の既知の方法で破砕して得た菌体抽出液を触媒とし
て用いることもできる。さらには硫安塩析法、溶媒分画
法、イオン交換や疎水相互作用を利用したカラムクロマ
トグラフィー法等既知の方法で精製した酵素を用いるこ
ともできる。

【００１１】

【実施例】以下、実施例により本発明を更に詳細に説明
するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

【００１２】実施例１ α−（２−チエニル）酢酸メチ
ルエステルの合成 市販のα−（２−チエニル）酢酸（４．２６５４ｇ、
０．０３ｍｏｌ）と濃硫酸数滴をメタノール（５０ｍ
ｌ）に加えて加熱還流下３時間撹拌した。定法により抽
出後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン
／酢酸エチル＝６／１）で精製して目的物（４．６４８
７ｇ、９９％）を無色液体として得た。

【００１３】反応生成物の物性値¹ Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ₃）δ：３．７３
（３Ｈ、ｓ）、３．８５（２Ｈ、ｓ）、６．９５〜７．
２３（３Ｈ、ｍ）。

【００１４】実施例２ α−（２−チエニル）プロピオ
ン酸メチルエステルの合成 ジイソプロピルアミン（２．５３ｍｌ、１．２ｅｑ）／
ＴＨＦ（２０ｍｌ）を１００ｍｌナスフラスコにとり、
温度を−７８℃に保ちながらｎ−ブチルリチウムのヘキ
サン溶液（９．８７ｍｌ、１．２ｅｑ）を滴下してリチ
ウムジイソプロピルアミド（以下ＬＤＡと略記する）を
調製した。滴下終了後３０分間その温度で撹拌した。こ
の溶液にα−（２−チエニル）酢酸メチルエステル
（２．３４ｇ、１５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（２０ｍ
ｌ）を加え、３０分間−７８℃で撹拌した。次に、ヨー
ドメタン（１．４ｍｌ、１．５ｅｑ）を加え、温度を−
７８℃から０℃（氷水浴）へと昇温し、３０分間撹拌し
た。２Ｎ塩酸（１０ｍｌ）を加えて中和した後、定法に
より抽出後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘ
キサン／酢酸エチル＝２９／１）で精製して目的物
（２．１８７６ｇ、８６％）を無色液体として得た。

【００１５】反応生成物の物性値¹ Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ₃）δ：１．５９
（３Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．２Ｈｚ）、３．７１（３Ｈ、
ｓ）、４．０２（１Ｈ、ｑ、Ｊ＝７．１Ｈｚ）、６．９
４（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝３．３Ｈｚ）、７．２０（３Ｈ、
ｔ、Ｊ＝３．２Ｈｚ）。

【００１６】実施例３ α−メチル−α−（２−チエニ
ル）マロン酸ジメチルエステルの合成 ジイソプロピルアミン（１．０５ｍｌ、１．５ｅｑ）／
ＴＨＦ（７ｍｌ）を１００ｍｌナスフラスコにとり、温
度を−７８℃に保ちながらｎ−ブチルリチウムのヘキサ
ン溶液（４．１１ｍｌ、１．５ｅｑ）を滴下してＬＤＡ
を調製した。滴下終了後３０分間その温度で撹拌した。
この溶液にα−（２−チエニル）プロピオン酸メチルエ
ステル（０．８５１２ｇ、５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液
（７ｍｌ）を加え、３０分間−７８℃で撹拌した。次
に、クロロメチルギ酸（０．５８ｍｌ、１．５ｅｑ）を
加え、温度を−７８℃から０℃（氷水浴）へと昇温し、
３０分間撹拌した。２Ｎ塩酸（１０ｍｌ）を加えて中和
した後、定法により抽出後、シリカゲルカラムクロマト
グラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝９／１）で精製し
て目的物（１．１０４９ｇ、９７％）を無色液体として
得た。

【００１７】反応生成物の物性値¹ Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ₃）δ： １．９
４（３Ｈ、ｓ）、３．７８（３Ｈ、ｓ）、６．９６〜
７．３１（３Ｈ、ｍ）。

【００１８】実施例４ α−メチル−α−（２−チエ
ニル）マロン酸の合成 ５０ｍｌナスフラスコにα−メチル−α−（２−チエニ
ル）マロン酸ジメチルエステル（０．９８９５ｇ、４．
３４ｍｍｏｌ）のメタノール溶液（５ｍｌ）を入れ、水
酸化カリウム（３．１８ｇ、１０ｅｑ）水溶液（２０ｍ
ｌ）を加え、氷水浴中で１時間攪拌して、加水分解を行
なった。濃塩酸（１０ｍｌ）を加えた後、定法により抽
出した。減圧下溶媒を留去して得た残留物をヘキサン−
酢酸エチルから再結晶することにより、目的物（０．６
２８２ｇ、７２％）を白色結晶として得た。

【００１９】反応生成物の物性値¹ Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤ₃ＯＤ）δ：１．９０
（３Ｈ、ｓ）、６．９６〜７．４１（３Ｈ、ｍ）。

【００２０】実施例５ α−（２−ナフチル）酢酸メチ
ルエステルの合成 市販のα−（２−ナフチル）酢酸（２．７９３２ｇ、１
５ｍｍｏｌ）と濃硫酸数滴をメタノール（３０ｍｌ）に
加えて加熱還流下３時間撹拌した。定法により抽出後、
シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸
エチル＝４／１）で精製して目的物（２．９９３８ｇ、
ｑｕａｎｔ）を無色液体として得た。

【００２１】反応生成物の物性値¹ Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ₃）δ：３．６８
（３Ｈ、ｓ）、３．８０（２Ｈ、ｓ）、７．４０〜７．
８２（７Ｈ、ｍ）。

【００２２】実施例６ α−（２−ナフチル）プロピオ
ン酸メチルエステルの合成 ジイソプロピルアミン（２．１０ｍｌ、１．５ｅｑ）／
ＴＨＦ（１４ｍｌ）を１００ｍｌナスフラスコにとり、
温度を−７８℃に保ちながらｎ−ブチルリチウムのヘキ
サン溶液（８．２２ｍｌ、１．５ｅｑ）を滴下してＬＤ
Ａを調製した。滴下終了後３０分間その温度で撹拌し
た。この溶液にα−（２−ナフチル）酢酸メチルエステ
ル（２．００２５ｇ、１０ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（１
４ｍｌ）を加え、３０分間−７８℃で撹拌した。次に、
ヨードメタン（０．９３ｍｌ、１．５ｅｑ）を加え、温
度を−７８℃から０℃（氷水浴）へと昇温し、３０分間
撹拌した。２Ｎ塩酸（１０ｍｌ）を加えて中和した後、
定法により抽出後、シリカゲルカラムクロマトグラフィ
ー（ヘキサン／酢酸エチル＝４／１）で精製して目的物
（２．０７８４ｇ、９７％）を無色液体として得た。

【００２３】反応生成物の物性値¹ Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ₃）δ：１．６０
（３Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．３Ｈｚ）、３．６７（３Ｈ、
ｓ）、３．９０（１Ｈ、ｑ、Ｊ＝７．１Ｈｚ） 、７．
４２〜７．８３（７Ｈ、ｍ）。

【００２４】実施例７ α−メチル−α−（２−ナフチ
ル）マロン酸ジメチルエステルの合成 ジイソプロピルアミン（１．４７ｍｌ、１．５ｅｑ）／
ＴＨＦ（１０ｍｌ）を１００ｍｌナスフラスコにとり、
温度を−７８℃に保ちながらｎ−ブチルリチウムのヘキ
サン溶液（５．７６ｍｌ、１．５ｅｑ）を滴下してＬＤ
Ａを調製した。滴下終了後３０分間その温度で撹拌し
た。この溶液にα−（２−ナフチル）プロピオン酸メチ
ルエステル（１．５０００ｇ、７ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶
液（１０ｍｌ）を加え、３０分間−７８℃で撹拌した。
次に、クロロメチルギ酸（０．９０ｍｌ、１．５ｅｑ）
を加え、温度を−７８℃から０℃（氷水浴）へと昇温
し、３０分間撹拌した。２Ｎ塩酸（１０ｍｌ）を加えて
中和した後、定法により抽出後、シリカゲルカラムクロ
マトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝４／１）で精
製して目的物（１．７３０１ｇ、９５％）を無色液体と
して得た。

【００２５】反応生成物の物性値¹ Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ₃）δ：１．９９
（３Ｈ、ｓ）、３．７９（３Ｈ、ｓ）、７．４６〜７．
８３（７Ｈ、ｍ）。

【００２６】実施例８ α−メチル−α−（２−ナフチ
ル）マロン酸の合成 ５０ｍｌナスフラスコにα−メチル−α−（２−ナフチ
ル）マロン酸ジメチルエステル（０．６６９８ｇ、２．
４６ｍｍｏｌ）のメタノール溶液（２０ｍｌ）を入れ、
水酸化カリウム（２．２４ｇ、１０ｅｑ）水溶液（２０
ｍｌ）を加え、氷水浴中で１時間攪拌して、加水分解を
行なった。濃塩酸（１０ｍｌ）を加えた後、定法により
抽出した。減圧下溶媒を留去して得た残留物をヘキサン
−酢酸エチルから再結晶することにより、目的物（０．
３６２９ｇ、６０％）を白色結晶として得た。

【００２７】反応生成物の物性値¹ Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤ₃ＯＤ）δ：１．９７
（３Ｈ、ｓ）、７．４８〜７．９７（７Ｈ、ｍ）。

【００２８】実施例９ 酵素調製 野性型および変異体酵素の調製は以下の手順で行った。
組換え体大腸菌をｐＨ７．０のアンピシリン１５０μｇ
／ｍｌを含むＬＢ培地２０ｍｌに接種し、前培養として
３０℃で１８時間振とう培養を行った。次に、前培養液
１５ｍｌを１．５Ｌの同培地に接種し、３０℃で３時間
培養を行った。この培養液にイソプロピル−β−チオ−
ガラクトピラノシドを０．１ｍＭになるよう添加し、３
０℃で１５時間振とう培養した。培養菌体を遠心分離
（６０００×ｇ、２０分）により集菌した。

【００２９】以下の操作は０．５ｍＭ エチレンジアミ
ン四酢酸及び５ｍＭ β−メルカプトエタノールを緩衝
液に添加して行った。菌体を１００ｍＭ リン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）に懸濁し、フレンチプレス（大岳製作所
製）により破砕した（１５００ｋｇ／ｃｍ²）。得られ
た破砕液を遠心分離（１２０００×ｇ、２０分）し、沈
殿を除くことにより無細胞抽出液を得た。この酵素液に
２％硫酸プロタミン水溶液を酵素液の１％量滴下し、３
０分撹拌した。生じた核酸の沈殿を遠心分離（１２００
０×ｇ、２０分）によって除去した。得られた酵素液に
硫酸アンモニウムを６０％飽和になるように添加し、１
時間撹拌した。遠心分離（１２０００×ｇ、２０分）に
よって得られた沈渣を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝
液（ｐＨ８．０）に溶解し、同じ緩衝液に対して透析を
行った。

【００３０】透析後の酵素液を同じ緩衝液で平衡化した
ＤＥＡＥ−トヨパール（東ソー製）カラムに吸着させ、
同緩衝液で洗浄した後、０ｍＭから５０ｍＭのＮａＣｌ
の直線的濃度勾配で溶出した。ＤＥＡＥ−トヨパールカ
ラムの活性画分を集め、限外ろ過により４０ｍｌに濃縮
した。この画分を２５％硫酸アンモニウム飽和とし、あ
らかじめ２５％飽和の硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化した
Ｂｕｔｙｌ−トヨパール（東ソー製）カラムに吸着させ
た。同緩衝液で洗浄した後、２５％飽和から１５％飽和
の硫酸アンモニウムの直線的濃度勾配で溶出した。Ｂｕ
ｔｙｌ−トヨパールカラムの活性画分を集め、限外ろ過
（Ａｍｉｃｏｎ Ｃｅｌｌ ８２００、Ａｍｉｃｏｎ社
製）により濃縮して精製酵素標品を得た。

【００３１】特に記述がない場合には、酵素活性は以下
の方法にて測定した。すなわち、５０μｌの２００ｍＭ
フェニルマロン酸水溶液（ｐＨ７）、５０μｌの１Ｍ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）及び適当量の酵
素溶液を混合したのち、脱イオン水で５００μｌとして
（フェニルマロン酸の終濃度２０ｍＭ）３５℃で５分間
反応を行った。１Ｎ塩酸１２５μｌを加えて反応を停止
した。生成したフェニル酢酸は高速液体クロマトグラフ
ィーにて分析を行い、あらかじめ作成した検量線を用い
て生成量を算出した。３５℃において１分間に１μｍｏ
ｌのフェニルマロン酸をフェニル酢酸に変換する酵素活
性を１ｕｎｉｔと定義した。

【００３２】実施例１０ 変異導入 Ｃ１８８Ｓ（Ｎ末端から１８８番目のシステイン残基が
セリン残基に置換された変異を意味する。以下同じ。）
の変異が導入された遺伝子は（Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ｍ．
ら，Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．７０、２７
６５−２７６９、１９９７年）に記載されたものを用い
た。

【００３３】野性型遺伝子あるいはＣ１８８Ｓ遺伝子を
出発原料としたＧ７４Ｃの変異導入はプラスミドｐＡＭ
Ｄ１０１（Ｍｉｙａｍｏｔｏ，Ｋ．ら，Ａｐｐｌ．Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８、２３４
−２３８、１９９２年）あるいはＣ１８８Ｓ変異が導入
されたｐＡＭＤ１０１（Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ｍ．ら，Ｂ
ｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．７０、２７６５−
２７６９、１９９７年）を鋳型としたＰＣＲによって行
った。すなわち配列番号２および配列番号３のプライマ
ーセットを用いたＰＣＲと、配列番号４および配列番号
５のプライマーセットを用いたＰＣＲとを別個に行い、
それぞれ得られた約４２０ｂｐおよび約９４０ｂｐのＤ
ＮＡ断片をそれぞれアガロース電気泳動により精製し
た。前者をＨｉｎｄＩＩＩとＡｐａＬＩ、後者をＰｓｔ
ＩとＡｐａＬＩを用いて消化した後に、プラスミドベク
ターｐＵＣ１９のＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｓｔＩ部位にＴ４
ＤＮＡリガーゼを用いて挿入することにより目的とする
組換え体を得た。

【００３４】実施例１１ α−メチル−α−（２−チエ
ニル）マロン酸を基質とした酵素反応 α−メチル−α−（２−チエニル）マロン酸（４５６ｍ
ｇ、２ｍｍｏｌ）を水酸化ナトリウム水溶液に溶解さ
せ、塩酸、水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨを８．
０に合わせた後、蒸留水を加えて１０ｍｌとした。２０
ｍｌ ナスフラスコに基質水溶液１ｍｌ（２００ｍｍｏ
ｌ）と各種酵素溶液１ｍｌを加え、３０℃で１時間撹拌
した。なおＧ７４Ｃ／Ｃ１８８Ｓ二重変異体を用いた場
合のみ反応時間を３時間とした。２Ｎ塩酸水溶液１ｍｌ
を加えて反応を停止させた後、定法により抽出を行なっ
た。減圧下溶媒を留去し、これを分取用薄層カラムクロ
マトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル／酢酸＝７０／
３０／１）により精製してモノカルボン酸を得た。

【００３５】モノカルボン酸をメタノールに溶解した
後、ＴＭＳジアゾメタンを用いてエステル体とし、ＨＰ
ＬＣを用いて光学純度の測定を行なった。ＨＰＬＣは以
下の条件で行った。

【００３６】カラム；Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ ＯＪ（ダイ
セル社製）直径４．６ｍｍ×長さ２５０ｍｍ 溶離液；ヘキサン／２−プロパノール＝５０／１ 流速 ；０．５ｍｌ／ｍｉｎ この条件においてＲ体は保持時間１９．７ｍｉｎ、Ｓ体
は保持時間３２．４分に溶出された。

【００３７】野性型酵素を用いた場合に反応収率はほぼ
１００％で、光学純度が９４％ｅ．ｅ．のＳ体が得られ
た。これに対しＧ７４Ｃ変異体酵素を用いた場合には反
応収率３７％でラセミ体のモノカルボン酸が得られた。
またＧ７４Ｃ／Ｃ１８８Ｓ二重変異体を用いた場合には
反応収率１６％で光学純度が８４％ｅ．ｅ．のＲ体が得
られた。

【００３８】実施例１２ α−メチル−α−（２−ナフ
チル）マロン酸を基質とした酵素反応（１） α−メチル−α−（２−ナフチル）マロン酸（５４４ｍ
ｇ、２ｍｍｏｌ）を水酸化ナトリウム水溶液に溶解さ
せ、塩酸、水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨを８．
０に合わせた後、蒸留水を加えて１０ｍｌとした。２０
ｍｌナスフラスコに基質水溶液１ｍｌ（２００ｍｍｏ
ｌ）と各種酵素溶液１ｍｌを加え、３０℃で撹拌した。
野性型酵素を用いた場合には反応時間を１時間、Ｇ７４
Ｃ変異体およびＧ７４Ｃ／Ｃ１８８Ｓ二重変異体を用い
た場合には反応時間を２時間とした。２Ｎ塩酸水溶液１
ｍｌを加えて反応を停止させた後、定法により抽出を行
なった。減圧下溶媒を留去し、これを分取用薄層カラム
クロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル／酢酸＝５
０／５０／１）により精製してモノカルボン酸を得た。

【００３９】モノカルボン酸をメタノールに溶解した
後、ＴＭＳジアゾメタンを用いてエステル体とし、ＨＰ
ＬＣを用いて光学純度の測定を行なった。ＨＰＬＣは以
下の条件で行った。

【００４０】カラム；Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ ＯＪ（ダイ
セル社製）直径４．６ｍｍ×長さ２５０ｍｍ 溶離液；ヘキサン／２−プロパノール＝１００／１ 流速 ；０．５ｍｌ／ｍｉｎ この条件においてＲ体は保持時間１９．７ｍｉｎ、Ｓ体
は保持時間２１．７分に溶出された。

【００４１】野性型酵素を用いた場合に反応はほぼ１０
０％進行し、光学純度が９２％ｅ．ｅ．のＲ体が得られ
た。これに対しＧ７４Ｃ変異体酵素を用いた場合には反
応収率６４％で光学純度が２％ｅ．ｅ．のＲ体が得られ
た。またＧ７４Ｃ／Ｃ１８８Ｓ二重変異体を用いた場合
には反応収率３７％で光学純度が６７％ｅ．ｅ．のＳ体
が得られた。

【００４２】実施例１３ α−メチル−α−（２−ナフ
チル）マロン酸を基質とした酵素反応（２） α−メチル−α−（２−ナフチル）マロン酸（５４４ｍ
ｇ、２ｍｍｏｌ）を水酸化ナトリウム水溶液に溶解さ
せ、塩酸、水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨを８．
０に合わせた後、蒸留水を加えて１０ｍｌとした。２０
ｍｌ ナスフラスコに基質水溶液１ｍｌ（２００ｍｍｏ
ｌ）と各種酵素溶液１ｍｌを加え、３０℃で１時間撹拌
した。なおＧ７４Ｃ／Ｃ１８８Ｓ二重変異体を用いた場
合のみ反応時間を３時間とした。２Ｎ塩酸水溶液１ｍｌ
を加えて反応を停止させた後、定法により抽出を行なっ
た。減圧下溶媒を留去し、これを分取用薄層カラムクロ
マトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル／酢酸＝５０／
５０／１）により精製してモノカルボン酸を得た。

【００４３】モノカルボン酸をメタノールに溶解した
後、ＴＭＳジアゾメタンを用いてエステル体とし、ＨＰ
ＬＣを用いて光学純度の測定を行なった。ＨＰＬＣは以
下の条件で行った。

【００４４】カラム；Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ ＯＪ（ダイ
セル社製）直径４．６ｍｍ×長さ２５０ｍｍ 溶離液；ヘキサン／２−プロパノール＝１００／１ 流速 ；０．５ｍｌ／ｍｉｎ この条件においてＲ体は保持時間１９．７ｍｉｎ、Ｓ体
は保持時間２１．７分に溶出された。

【００４５】野性型酵素を用いた場合に反応収率は９６
％で、光学純度が９２％ｅ．ｅ．のＲ体が得られた。こ
れに対しＧ７４Ｃ変異体酵素を用いた場合には反応収率
１３％で光学純度が６％ｅ．ｅ．のＲ体が得られた。ま
たＧ７４Ｃ／Ｃ１８８Ｓ二重変異体を用いた場合には反
応収率８％で光学純度が９０％ｅ．ｅ．のＳ体が得られ
た。

【００４６】

【発明の効果】本発明によって、非ステロイド系抗炎症
剤などの有効成分として利用可能な光学活性を有するα
−アリールプロピオン酸誘導体を、対応するアリールマ
ロン酸誘導体の酵素的脱炭酸反応によって得ることがで
きる。この反応はプロキラルな前駆体から不斉誘導する
ものであり、光学分割法に対して有利なプロセスを提供
する。

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110>TOSOH Corporation <120>改変アリールマロン酸脱炭酸酵素およびそれを用いた製造法 <130>PA211-0647 <160>5 <210>1 <211>240 <212>PRT <213>Alcaligenes bronchisepticus <400>1 Met Gln Gln Ala Ser Thr Pro Thr Ile Gly Met Ile Val Pro Pro Ala 1 5 10 15 Ala Gly Leu Val Pro Ala Asp Gly Ala Arg Leu Tyr Pro Asp Leu Pro 20 25 30 Phe Ile Ala Ser Gly Leu Gly Leu Gly Ser Val Thr Pro Glu Gly Tyr 35 40 45 Asp Ala Val Ile Glu Ser Val Val Asp His Ala Arg Arg Leu Gln Lys 50 55 60 Gln Gly Ala Ala Val Val Ser Leu Met Gly Thr Ser Leu Ser Phe Tyr 65 70 75 80 Arg Gly Ala Ala Phe Asn Ala Ala Leu Thr Val Ala Met Arg Glu Ala 85 90 95 Thr Gly Leu Pro Cys Thr Thr Met Ser Thr Ala Val Leu Asn Gly Leu 100 105 110 Arg Ala Leu Gly Val Arg Arg Val Ala Leu Ala Thr Ala Tyr Ile Asp 115 120 125 Asp Val Asn Glu Arg Leu Ala Ala Phe Leu Ala Glu Glu Ser Leu Val 130 135 140 Pro Thr Gly Cys Arg Ser Leu Gly Ile Thr Gly Val Glu Ala Met Ala 145 150 155 160 Arg Val Asp Thr Ala Thr Leu Val Asp Leu Cys Val Arg Ala Phe Glu 165 170 175 Ala Ala Pro Asp Ser Asp Gly Ile Leu Leu Ser Cys Gly Gly Leu Leu 180 185 190 Thr Leu Asp Ala Ile Pro Glu Val Glu Arg Arg Leu Gly Val Pro Val 195 200 205 Val Ser Ser Ser Pro Ala Gly Phe Trp Asp Ala Val Arg Leu Ala Gly 210 215 220 Gly Gly Ala Lys Ala Arg Pro Gly Tyr Gly Arg Leu Phe Asp Glu Ser 225 230 235 240 <210>2 <211>18 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>2 caggaaacag ctatgacc 18 <210>3 <211>30 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>3 gctgagcgag gtgcacatca gcgaaaccac 30 <210>4 <211>18 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>4 gtaaaacgac ggccagtg 18 <210>5 <211>30 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>5 gtt tcg ctg atg tgc acc tcg ctc agc ttc 30

フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B024 AA03 BA07 CA04 DA06 EA04 GA11 4B050 CC04 DD02 FF04E FF05E FF09E LL05 4B064 AD05 CA21 CB30 CE09

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】アルカリゲネス・ブロンチセプティクス
   （Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉ
   ｃｕｓ）ＫＵ１２０１（微工研菌寄第１１６７０号）が
   産生する野性型アリールマロン酸脱炭酸酵素の有する立
   体選択性とは逆の立体選択性を有することを特徴とす
   る、改変アリールマロン酸脱炭酸酵素。
2. 【請求項２】アルカリゲネス・ブロンチセプティクス
   （Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉ
   ｃｕｓ）ＫＵ１２０１（微工研菌寄第１１６７０号）が
   産生する野性型アリールマロン酸脱炭酸酵素が、配列番
   号１のアミノ酸配列が暗号化する酵素であることを特徴
   とする、請求項１に記載の改変アリールマロン酸脱炭酸
   酵素。
3. 【請求項３】配列番号１のアミノ酸配列の７１番目から
   ７５番目のアミノ酸残基のうちいずれかをシステイン残
   基によって置換し、かつ１８８番目のシステイン残基を
   他のアミノ酸残基によって置換することを特徴とする、
   請求項２に記載の改変アリールマロン酸脱炭酸酵素。
4. 【請求項４】配列番号１のアミノ酸配列の７４番目のグ
   リシン残基をシステイン残基によって置換し、かつ１８
   ８番目のシステイン残基をセリン残基によって置換する
   ことを特徴とする、請求項２または３に記載の改変アリ
   ールマロン酸脱炭酸酵素。
5. 【請求項５】請求項１〜４いずれかに記載の改変アリー
   ルマロン酸脱炭酸酵素を用いて、α−アリール−α−メ
   チル−マロン酸誘導体から光学活性を有するα−アリー
   ルプロピオン酸誘導体を製造することを特徴とする、α
   −アリールプロピオン酸誘導体の製造法。
6. 【請求項６】α位の立体配置がＳであるα−ナフチルプ
   ロピオン酸誘導体を製造することを特徴とする、請求項
   ５に記載の製造法。
7. 【請求項７】α位の立体配置がＲであるα−（２−チエ
   ニル）プロピオン酸誘導体を製造することを特徴とす
   る、請求項５に記載の製造法。