CN109943618A

CN109943618A - 一种重组脂肪酶在拆分(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯中的应用

Info

Publication number: CN109943618A
Application number: CN201910283500.3A
Authority: CN
Inventors: 郑建永; 吴鹏; 汪钊; 章银军; 张梦婕
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2019-04-10
Filing date: 2019-04-10
Publication date: 2019-06-28
Anticipated expiration: 2039-04-10
Also published as: CN109943618B

Abstract

本发明提供了一种重组脂肪酶在拆分(R,S)‑α‑乙基‑2‑氧‑1‑吡咯烷乙酸甲酯中的应用，所述重组脂肪酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明重组脂肪酶基因可与表达载体连接构建得到含该基因的胞内表达重组质粒，再转化至大肠杆菌中，获得重组脂肪酶基因大肠杆菌。该重组大肠杆菌经发酵培养后冻干获得重组脂肪酶粗酶粉；该重组脂肪酶具有催化拆分(R,S)‑α‑乙基‑2‑氧‑1‑吡咯烷乙酸甲酯的能力，可制备左乙拉西坦中间体高光学纯(S)‑α‑乙基‑2‑氧‑1‑吡咯烷乙酸。与传统化学法拆分相比，该生物拆分法具有操作条件简单，拆分效率和产物光学纯度高等优点。

Description

一种重组脂肪酶在拆分(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯中的应用

(一)技术领域

本发明属于生物催化技术领域，涉及一种脂肪酶立体选择性催化水解拆分(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯对映体制备左乙拉西坦中间体高光学纯度(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸的应用，可以大大提高手性中间体的制备效率。

(二)背景技术

左乙拉西坦(Levetiracetam，LEV)化学名称为(S)-α-乙基-2-氧合-1-乙酰胺吡咯烷，是一种乙酰吡咯烷类化合物的新型抗癫痫药物。该药治疗指数很高，药动学理想，口服吸收快且安全，生物利用度可达100％，是一种高效、毒副作用小的广谱抗癫痫药，具有极高的开发价值。目前左乙拉西坦的生产主要通过化学法制备，但该方法存在着收率低、成本高、步骤繁多、产物光学纯度较低等问题。随着生物工程技术的不断发展，利用酶的高度立体和区域选择性对外消旋体的进行生物拆分，从而得到光学纯的手性化合物已经逐渐成为手性药物制备的重要途径。α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯是LEV合成的关键中间体，利用微生物脂肪酶选择性拆分(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯，再以光学纯中间体制备LEV，不仅可以简化制备工艺，而且大大提高了产物纯度。

脂肪酶(Lipase,EC 3.1.1.3)全称为三酰基甘油酰基水解酶(Triacyl-glycerolacylhydrolase)，是目前研究与工业化应用最多的一类水解酶。脂肪酶能催化酯水解、酯合成、醇解、酸解、酯酯交换和氨解反应。脂肪酶广泛存在于自然界的各种生物体，特别是在微生物和动植物组织中。动物脂肪酶主要存在于胰脏等器官组织，比如猪肝酯酶和猪胰脂肪酶，但由于动物脂肪酶活性较低、酶提取纯化成本较高和原料来源有限等因素，限制了其在工业中的应用。微生物脂肪酶来源丰富，种类繁多，不受季节气候等因素的影响，微生物生长产酶周期较短，而且具有耐有机溶剂、底物专一性强、催化选择性高和催化活性高等特点，因而微生物来源的脂肪酶有较高的工业化应用价值。目前市场上大部分商品化脂肪酶都通过细菌、真菌和酵母等微生物培养发酵获得。丹麦Novo Nordisk公司、日本Amano公司和美国Genencor公司等主要酶制造商开发了多种的商品化酶制剂。这些酶制剂公司利用分子改造技术对微生物脂肪酶进行改造，提高酶活力、稳定性和立体选择性等酶学性质，以满足不同工业领域应用的需求。因而构建脂肪酶基因工程菌从而大量生产重组脂肪酶具有十分重要意义。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种立体选择性脂肪酶在生物法拆分(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯中的应用，解决了现有方法存在着收率低、成本高、步骤繁多、产物光学纯度较低等问题。(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯是LEV合成的关键中间体，利用微生物脂肪酶选择性高效拆分(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯，高光学纯度制备(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸，该手性羧酸经酰胺化后即可制得LEV，不仅可以简化制备工艺，而且大大提高了产物纯度。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种重组脂肪酶在拆分(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯中的应用(如图1所示)，所述重组脂肪酶氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码基因序列为SEQID NO.2所示，脂肪酶基因源自米曲霉WZ007(Aspergillus oryzaeWZ007)，该菌保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，430072，保藏编号：CCTCC No:M 206105，保藏日期：2006年10月8日，已在先前申请专利(中国专利CN 101186938)中提交了相关菌种保藏信息并披露了其遗传资源来源。本发明在此申请的基础上，进行目标脂肪酶和基因的挖掘。具体的应用方法为：以含重组脂肪酶编码基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体冻干菌粉为催化剂，以(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯为底物，以pH 7.0缓冲液为反应介质，在20-45℃、600-1000rpm条件下进行拆分反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得高光学纯(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸。所述催化剂用量以缓冲液体积计为5-10g/L(优选10g/L)，所述底物终浓度以缓冲液体积计为1％-10％(优选2％)。

进一步，优选反应时间为5-60min，更优选反应条件为35℃，1000rpm反应10min。

进一步，所述缓冲液为pH 7.0，0.2mM的Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲溶液。

进一步，所述催化剂按如下方法制备：将含重组脂肪酶编码基因的工程菌(优选大肠杆菌BL21)接种在LB培养基中，37℃培养OD₆₀₀至0.4-0.6，加IPTG至终浓度0.02mM，30℃培养10-12h，菌液8000rpm，4℃离心10min，收集菌体，再用PBS缓冲液洗涤菌体2次，8000rpm，4℃离心10min，收集菌体，冻干(冻干条件：冷阱温度-85℃，冻干室温度-20℃，真空度6.0Pa，48h)，得到脂肪酶冻干粉，即为催化剂；LB培养基组成：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl5g/L，溶剂为去离子水，pH值自然。

进一步，本发明所述反应液分离提化的方法为：反应结束后，将反应液离心，取上清液，用2mol/L的NaOH溶液调pH至8.0，加入与总体积等量的乙酸乙酯充分振荡，除去上层有机相，取下层水相，用4mol/L的盐酸调pH至2.0；再加入与水相等体积的乙酸乙酯充分振荡，弃水层，在45℃下减压蒸馏至无液体流出，得到产物(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸。

本发明提供一种立体选择性脂肪酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：

MSSQIPRPALNPELAHVHQALPKIGMSTKEELESYRQFLGSSFSLEDAIRGREDMLSYEERDIPGPAGPMRATIFRPKNQTRRIEDRPGVLCLHGSGLVSGNRFVGVIGMLDWVEPLSAILVTAEYRLAPEHPQPAALEDSYAALQWMNNHSTELGFNPHKLVVCGGSAGGNLAAGVTILARDRSGPKICAQVLMYPLLDDSNQGHSVQQFGDLAPWTGSNTIDALRYALGENHEHADIYTVPSRATNLHSLPPTFIDVGEADAFRDEDVSYAANLWKSGVSTELHVWPGCWHGFDAFVPDAPISLQAGAVRLTWLKKVLENS

由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的多肽的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该多肽的片段或多肽变体与前述氨基酸序列同源性在90％以上、且具有相同的酶活性，均属于本发明保护范围之列。具体的，所述改变可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；其中，对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。

本发明所述蛋白的片段、衍生物或类似物是指基本上保持本发明所述的蛋白酶相同的生物学功能或活性的蛋白，可以是下列情形：(Ⅰ)一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基(优选的是保守氨基酸残基)取代，并且取代的氨基酸可以是也可以不是由遗传密码子编码的；(Ⅱ)一个或多个氨基酸残基上的某个基团被其它基团取代；(Ⅲ)成熟蛋白与另一种化合物(比如延长蛋白半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合；(Ⅳ)附加的氨基酸序列融合进成熟的蛋白而形成的蛋白序列(如用来纯化此蛋白的序列或蛋白原序列)。

所述蛋白可以是重组蛋白、天然蛋白或合成蛋白，可以是纯天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如：细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的蛋白可以是糖基化的。本发明的蛋白还可以包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还涉及所述立体选择性脂肪酶的编码基因，具体的，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：

ATGTCTTCTCAAATTCCGCGACCTGCGCTCAATCCAGAGCTTGCTCACGTGCATCAGGCCCTCCCCAAGATTGGGATGAGCACCAAGGAAGAGCTCGAATCTTACCGTCAATTTTTAGGATCGTCCTTCTCGCTGGAGGATGCGATCCGAGGCAGAGAGGATATGCTCTCTTACGAAGAACGAGACATCCCAGGGCCAGCCGGACCGATGAGGGCCACGATTTTTCGTCCAAAGAACCAGACTCGGCGAATAGAAGACAGACCGGGAGTTCTGTGCTTGCATGGCAGTGGGCTGGTCAGTGGGAATCGCTTTGTGGGAGTCATTGGCATGTTGGATTGGGTCGAGCCCCTCAGTGCTATCCTTGTAACTGCCGAATACCGCCTCGCTCCTGAGCATCCCCAGCCCGCAGCGCTAGAGGACAGTTATGCAGCACTCCAGTGGATGAACAATCACTCGACAGAACTCGGATTCAACCCGCACAAATTAGTTGTATGTGGTGGCTCGGCAGGCGGGAATCTCGCCGCCGGGGTTACGATACTTGCCCGCGACCGATCAGGACCTAAAATCTGCGCTCAAGTACTGATGTATCCGTTACTCGATGATAGTAATCAGGGGCATTCTGTACAGCAATTTGGTGACCTTGCTCCGTGGACCGGGTCGAACACTATCGATGCCTTGAGATACGCACTTGGCGAGAATCACGAGCATGCTGACATATATACCGTTCCCTCGCGCGCTACGAATCTCCACAGCTTGCCACCCACATTTATTGACGTCGGTGAGGCGGACGCATTCCGTGATGAAGATGTGTCTTATGCTGCGAACTTGTGGAAGTCTGGTGTATCCACTGAGTTGCACGTATGGCCTGGTTGCTGGCATGGCTTCGATGCGTTTGTGCCAGATGCGCCTATTAGTCTGCAGGCGGGGGCTGTTCGTCTGACTTGGCTCAAAAAAGTGCTTGAAAACTCCTAA

由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQ ID NO.2所示多核苷酸的变体，只要其与该多核苷酸具有70％以上同源性、且具有相同的功能，均属于本发明保护范围之列。所述多核苷酸的变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列。此多核苷酸的变体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体，包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的氨基酸的功能。

另外，可与SEQ ID NO：2所示多核苷酸序列杂交的多核苷酸(至少具有50％同源性，优选具有70％同源性)，也在本发明保护范围之列，特别是在严格条件下可与本发明所述核苷酸序列杂交的多核苷酸。所述“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加用变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清，0.1％Ficoll，42℃；或(3)仅在两条序列之间的同源性至少在95％以上，更好是97％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的蛋白与SEQ ID NO：1所示的蛋白有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及含有所述编码基因的重组载体，以及利用所述重组载体转化得到的重组基因工程菌。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种重组脂肪酶及编码基因；该脂肪酶基因可与表达载体连接构建得到含该基因的胞内表达重组质粒，再转化至大肠杆菌菌株中，获得重组大肠杆菌，利用重组脂肪酶为生物催化剂催化拆分(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯，可制备高光学纯度(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸，对映体过量值>99％和转化率达到49.2％，产物(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸的质量收率达到96.8％。本发明生物催化的手性合成反应具有条件温和、效率高，高度的化学选择性、区域选择性以及对映体选择性等优点，而且生物催化过程具有无毒、无污染和能耗低等特点，是一种环境友好的合成方法。

(四)附图说明

图1为重组脂肪酶对映选择性水解拆分(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯的反应式；

图2为(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯标样液相图；

图3为实施例3中脂肪酶催化水解拆分(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯反应的液相图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此，本领域的普通技术人员根据这些实施方式所做出的方法上的变换均包含在本发明的保护范围内。

实施例1米曲霉WZ007发酵，cDNA制备，脂肪酶基因克隆和工程菌构建

1、米曲霉WZ007发酵条件：斜面培养基(g/L)：去皮马铃薯200，蔗糖20，琼脂20，溶剂为去离子水，pH自然。发酵培养基(g/L)：蛋白胨20，橄榄油1％(V/V)，KH₂PO₄ 1，MgSO₄0.5，NaCl 0.5，溶剂为去离子水，pH 7.0。

将米曲霉WZ007(Aspergillus oryzaeWZ007)接种至斜面培养基，30℃培养6-8d，获得斜面菌种。米曲霉WZ007保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，430072，保藏编号：CCTCC No:M 206105，保藏日期：2006年10月8日，已在专利申请CN101186938A中公开。

取斜面菌种接种至含100mL发酵培养基的500mL摇瓶中，在温度30℃，转速200rpm的恒温摇床培养12h，制成种子液。将1L种子液倒入到含18L发酵培养基的30L发酵罐进行发酵培养，其中温度和转速分别控制在30℃和200rpm，发酵培养48h收集湿菌体。

2、米曲霉WZ007cDNA制备：取1g上述米曲霉湿菌体，使用全式金公司的TransZolUp Plus RNA Kit试剂盒提取mRNA，再使用TOYOBO公司的ReverTra Ace qPCR RT Kit，高效率地合成适用于Realtime PCR的cDNA模板。

3、米曲霉脂肪酶基因的克隆：根据NCBI查得的米曲霉基因组XM_002374217.1碱基序列的基础上，设计上游引物为

5'-CCATGGGCATGTCTTCTCAAATTCCGCGACC-3'和下游引物为5'-CTCGAGTTAGGAGTTTTCAAGCACTTTTTTGAG-3'，以cDNA为模板，进行PCR，得到核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示的基因片段，测序验证正确。SEQ ID NO.2所示基因片段的编码蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。

4、大肠杆菌工程菌的构建：将该SEQ ID NO.2所示的基因片段连接至载体pET-28b(+)，转化至大肠杆菌Rosetta感受态，获得含脂肪酶基因的大肠杆菌工程菌(标记为工程菌M1)。

实施例2工程菌M1的发酵培养

将实施例1获得的工程菌M1接种在LB培养基中，37℃培养OD₆₀₀至0.5(大概培养2h)，加IPTG至终浓度0.02mM，30℃培养10-12h。300mL菌液8000rpm，4℃离心10min，收集菌体，再用PBS缓冲液洗涤菌体2次，8000rpm，10min收集菌体。将收集的湿菌体使用冻干机进行冻干处理48h(冻干条件：冷阱温度-85℃，冻干室温度-20℃，真空度6.0Pa)，得到重组脂肪酶冻干粉，记为脂肪酶M1，放于4℃冰箱保存。LB培养基组成：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 5g/L，溶剂为去离子水，pH自然。

实施例3酶催化拆分(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯的反应

称取0.01g实施例2方法制备的脂肪酶M1于2mL EP管中，加入1mL PB(pH 7.0、0.2mM)作为反应溶剂，然后加入20μL底物(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯，以不加菌体为空白对照，置于35℃，1000rpm恒温混匀仪中反应10min。反应结束后，反应液经200μL(4mM)HCl酸化，再加入800μL乙酸乙酯，涡旋振荡器振荡2min，充分萃取，离心(1200rpm，3min)，得到有机相(乙酸乙酯层)。取200μL乙酸乙酯层减压浓缩至无液体流出，加入1mL流动相进行溶解。液相色谱检测菌体的立体选择性及酶催化水解活性，得到产物的对映体过量值>99％和转化率达到49.2％。

具体液相分析检测条件：采用Agilent 1200高效液相色谱仪；色谱柱：CHIRALPAKAS-H柱(250×4.6mm×5um)；检测波长：210nm；流动相：正己烷/异丙醇/三氟乙酸＝80：20：0.2(V/V/V)；流速：0.8mL/min；柱温：30℃；

进样量：20μL。如图1的HPLC的结果所示，(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯和(R)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯的保留时间分别为29.946min和36.005min。

实施例4不同脂肪酶水解拆分(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯的效果比较

在pH 7.0，0.2mM的Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲溶液1mL中，加入终浓度10g/L的不同脂肪酶(实施例2制备的脂肪酶M1、Novozym 435、Lipozyme TL IM、Lipozyme RM IM、AmanoLipase PS IM)，20μL (R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯，于恒温混匀仪35℃，1000rpm条件下反应10min，取反应液按实施例3方法检测(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸的对映体过量值和转化率，结果见表1所示。在35℃反应10min后，脂肪酶435对(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯的两种构型能进行一定程度水解，但对底物两种构型没有对映体选择性，而TL IM、RM IM、PS IM对底物没有水解活性。当脂肪酶粗酶粉催化反应时，产物(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸的ee值>99％，转化率为49.2％，液相色谱图3所示。

表1不同脂肪酶催化(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯的拆分效果比较

实施例5反应时间对酶动力学水解拆分(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯的影响

在pH 7.0，0.2mM的Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲溶液1mL中，加入终浓度10g/L的实施例2制备的脂肪酶M1，20μL(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯，于恒温混匀仪35℃，1000rpm条件下反应不同时间(5min～60min)，取反应液按实施例3方法检测(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸的对映体过量值和转化率，结果见表2所示。

结果表明，反应10min后，产物(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸的对映体过量值已达到最高，对映体过量值>99％，转化率为49.2％，当反应时间大于10min，产物(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸的转化率增大，对映体过量值在减小。

表2反应时间对酶催化反应反应的影响

实施例6反应温度对酶动力学水解拆分(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯的影响

在pH 7.0，0.2mM的Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲溶液1mL中，加入终浓度10g/L的实施例2制备的脂肪酶M1，20μL(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯，于恒温混匀仪不同温度(20-45℃)，1000rpm条件下反应相同时间10min，取反应液按实施例3方法检测(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸的对映体过量值和转化率，结果见表3所示

结果说明，在反应温度为35℃时，(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸的对映体过量值最高，其ee值>99％。当反应温度高于35℃或者低于35℃时，(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸的对映体过量值都会下降，说明温度对脂肪酶M1的光学选择性具有很大的影响。

表3反应温度对反应的影响

实施例7产物(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸的分离提纯

在50mL圆底烧瓶中加入20mL pH 7.0，0.2mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲溶液，称取0.1g实施例2制备的脂肪酶M1，再加入底物(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯终浓度以缓冲液体积计为2％，用50mM NaOH进行流加滴定反应，控制反应pH维持在7.0，在磁力搅拌器35℃，600rpm条件下反应3h。反应结束后得到的反应液离心，取上清液，加入与总体积等量的乙酸乙酯充分振荡，除去上层有机相，取下层水相，用4mol/L的盐酸调pH至2.0；再加入与水相等体积的乙酸乙酯充分振荡，弃水层，在45℃下减压蒸馏至无馏出物，得到产物(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸，其eep>99％，质量收率达到96.8％。

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 一种重组脂肪酶在拆分(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 323

<212> PRT

<213> 米曲霉(Aspergillus oryzae)

<400> 1

Met Ser Ser Gln Ile Pro Arg Pro Ala Leu Asn Pro Glu Leu Ala His

1 5 10 15

Val His Gln Ala Leu Pro Lys Ile Gly Met Ser Thr Lys Glu Glu Leu

20 25 30

Glu Ser Tyr Arg Gln Phe Leu Gly Ser Ser Phe Ser Leu Glu Asp Ala

35 40 45

Ile Arg Gly Arg Glu Asp Met Leu Ser Tyr Glu Glu Arg Asp Ile Pro

50 55 60

Gly Pro Ala Gly Pro Met Arg Ala Thr Ile Phe Arg Pro Lys Asn Gln

65 70 75 80

Thr Arg Arg Ile Glu Asp Arg Pro Gly Val Leu Cys Leu His Gly Ser

85 90 95

Gly Leu Val Ser Gly Asn Arg Phe Val Gly Val Ile Gly Met Leu Asp

100 105 110

Trp Val Glu Pro Leu Ser Ala Ile Leu Val Thr Ala Glu Tyr Arg Leu

115 120 125

Ala Pro Glu His Pro Gln Pro Ala Ala Leu Glu Asp Ser Tyr Ala Ala

130 135 140

Leu Gln Trp Met Asn Asn His Ser Thr Glu Leu Gly Phe Asn Pro His

145 150 155 160

Lys Leu Val Val Cys Gly Gly Ser Ala Gly Gly Asn Leu Ala Ala Gly

165 170 175

Val Thr Ile Leu Ala Arg Asp Arg Ser Gly Pro Lys Ile Cys Ala Gln

180 185 190

Val Leu Met Tyr Pro Leu Leu Asp Asp Ser Asn Gln Gly His Ser Val

195 200 205

Gln Gln Phe Gly Asp Leu Ala Pro Trp Thr Gly Ser Asn Thr Ile Asp

210 215 220

Ala Leu Arg Tyr Ala Leu Gly Glu Asn His Glu His Ala Asp Ile Tyr

225 230 235 240

Thr Val Pro Ser Arg Ala Thr Asn Leu His Ser Leu Pro Pro Thr Phe

245 250 255

Ile Asp Val Gly Glu Ala Asp Ala Phe Arg Asp Glu Asp Val Ser Tyr

260 265 270

Ala Ala Asn Leu Trp Lys Ser Gly Val Ser Thr Glu Leu His Val Trp

275 280 285

Pro Gly Cys Trp His Gly Phe Asp Ala Phe Val Pro Asp Ala Pro Ile

290 295 300

Ser Leu Gln Ala Gly Ala Val Arg Leu Thr Trp Leu Lys Lys Val Leu

305 310 315 320

Glu Asn Ser

<210> 2

<211> 972

<212> DNA

<213> 米曲霉(Aspergillus oryzae)

<400> 2

atgtcttctc aaattccgcg acctgcgctc aatccagagc ttgctcacgt gcatcaggcc 60

ctccccaaga ttgggatgag caccaaggaa gagctcgaat cttaccgtca atttttagga 120

tcgtccttct cgctggagga tgcgatccga ggcagagagg atatgctctc ttacgaagaa 180

cgagacatcc cagggccagc cggaccgatg agggccacga tttttcgtcc aaagaaccag 240

actcggcgaa tagaagacag accgggagtt ctgtgcttgc atggcagtgg gctggtcagt 300

gggaatcgct ttgtgggagt cattggcatg ttggattggg tcgagcccct cagtgctatc 360

cttgtaactg ccgaataccg cctcgctcct gagcatcccc agcccgcagc gctagaggac 420

agttatgcag cactccagtg gatgaacaat cactcgacag aactcggatt caacccgcac 480

aaattagttg tatgtggtgg ctcggcaggc gggaatctcg ccgccggggt tacgatactt 540

gcccgcgacc gatcaggacc taaaatctgc gctcaagtac tgatgtatcc gttactcgat 600

gatagtaatc aggggcattc tgtacagcaa tttggtgacc ttgctccgtg gaccgggtcg 660

aacactatcg atgccttgag atacgcactt ggcgagaatc acgagcatgc tgacatatat 720

accgttccct cgcgcgctac gaatctccac agcttgccac ccacatttat tgacgtcggt 780

gaggcggacg cattccgtga tgaagatgtg tcttatgctg cgaacttgtg gaagtctggt 840

gtatccactg agttgcacgt atggcctggt tgctggcatg gcttcgatgc gtttgtgcca 900

gatgcgccta ttagtctgca ggcgggggct gttcgtctga cttggctcaa aaaagtgctt 960

gaaaactcct aa 972

Claims

1.一种重组脂肪酶在拆分(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯中的应用，其特征在于所述重组脂肪酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述重组脂肪酶的编码基因核苷酸序列为SEQID NO.2所示。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述应用的方法为：以含重组脂肪酶编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体冻干粉为催化剂，以(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯为底物，以pH7.0缓冲液为反应介质，在20-45℃、600-1000rpm条件下进行拆分反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述催化剂用量以缓冲液体积计为5-10g/L，所述底物终浓度以缓冲液体积计为1％-10％。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于反应时间为5-120min。

6.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述反应条件为35℃、1000rpm反应10min。

7.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述缓冲液为pH7.0，0.2mM的Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲溶液。

8.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述催化剂按如下方法制备：将含重组脂肪酶编码基因的工程菌接种在LB培养基中，37℃培养OD₆₀₀至0.4-0.6，加IPTG至终浓度0.02mM，30℃培养10-12h，菌液8000rpm，4℃离心10min，收集菌体，再用PBS缓冲液洗涤菌体2次，8000rpm，4℃离心10min，收集菌体，冻干，得到重组脂肪酶冻干粉，即为催化剂。

9.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述反应液分离纯化的方法为：反应结束后，将反应液离心，取上清液，用2mol/L的NaOH溶液调pH至8.0，加入与总体积等量的乙酸乙酯充分振荡，除去上层有机相，取下层水相，用4mol/L的盐酸调pH至2.0；再加入与水相等体积的乙酸乙酯充分振荡，弃水层，在45℃下减压蒸馏至无馏出物，得到产物(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸。