CN111378640A - 制备右旋酰胺酮洛芬的方法 - Google Patents

制备右旋酰胺酮洛芬的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111378640A
CN111378640A CN202010171563.2A CN202010171563A CN111378640A CN 111378640 A CN111378640 A CN 111378640A CN 202010171563 A CN202010171563 A CN 202010171563A CN 111378640 A CN111378640 A CN 111378640A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nitrile hydratase
leu
glu
val
ala
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010171563.2A
Other languages
English (en)
Inventor
林洁
王小龙
何玉兰
张枝
叶燕全
韦德活
张嘉杰
屈代鑫
胡盛本
麦倩婷
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yichang Dongyangguang Biochemical Pharmaceutical Co ltd
Original Assignee
Dongguan Dongyangguang Biosynthetics Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dongguan Dongyangguang Biosynthetics Co ltd filed Critical Dongguan Dongyangguang Biosynthetics Co ltd
Priority to CN202010171563.2A priority Critical patent/CN111378640A/zh
Publication of CN111378640A publication Critical patent/CN111378640A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
    • C12Y402/01—Hydro-lyases (4.2.1)
    • C12Y402/01084—Nitrile hydratase (4.2.1.84)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提出了一种制备右旋酰胺酮洛芬的方法。该方法包括使氰基酮洛芬在腈水合酶的催化下进行酰胺化反应，以便获得右旋酰胺酮洛芬，所述腈水合酶来源于Rhodococcus。发明人发现，来源于Rhodococcus的腈水合酶对右旋氰基酮洛芬的特异性识别能力更强，使用来源于Rhodococcus的腈水合酶制备右旋酰胺酮洛芬，可大大提高右旋酰胺酮洛芬的转化率，提高右旋酰胺酮洛芬的ee值。

Description

制备右旋酰胺酮洛芬的方法
技术领域
本发明涉及生物工程领域，具体地，本发明涉及制备右旋酰胺酮洛芬的方法。
背景技术
酮洛芬是2-芳基丙酸类非甾体抗炎药(NSAIDs)，此类药物均具有一个手性中心，只有右旋体才具有抗炎抗风湿和镇痛作用，左旋体几乎没有药理活性且毒副作用大。
目前，市售(S)-(+)－酮洛芬主要合成方法有传统的化学合成法、手性拆分以及生物酶合成法。
化学合成法主要是不对称合成可通过6步反应，由烯丙醇通过sharpless环氧化制备得到(2S，3S)环氧化合物，再加入手性位移试剂，经过对映体选择性氢解后生成二醇，在RuO4/NaIO4的催化下，最终得到右旋酮洛芬，ee值达到98％这种方法的产率和对映体选择性较为理想，但是均需要用到传统的化学催化剂以促使反应快速进行，而大部分催化剂毒性较高、易燃且会造成环境污染，还有可能引入有害的副产物。
另有手性拆分方法，有专利(专利01，CN101928214A)采用国内廉价易得的(-)-葡辛胺作为拆分剂拆分(RS)-酮洛芬，按一定比例混合后升温回流后降温结晶，对酮洛芬利用率达70％。目前也有采用高分子印迹聚合物、色谱法对酮洛芬对映体进行拆分。也有研究利用微生物酶法进行酮洛芬拆分。也有研究利用紫外诱变得到的微生物菌株在一定条件下进行发酵，利用菌体拆分(RS)-酮洛芬。也有研究利用诺维信脂肪酶435催化酮洛芬酯拆分，该研究中，大肠杆菌表达来自于古细菌的嗜热酯酶，利用菌体催化酮洛芬乙酯反应生成右旋酮洛芬。然而，利用酯酶的缺点在于拆分率和产物ee值都不理想，底物浓度偏低问题也难以解决。
生物酶合成法可以一定程度是解决底物浓度和产物ee值偏低的问题。目前已有利用腈水合酶和酰胺酶双酶体系制备光学纯酮洛芬的报道。但现有技术的转化率或光学纯度均较低，仍达不到生产要求。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本申请的发明人对腈水合酶进行了筛选，发现在特定菌中的腈水合酶对右旋氰基酮洛芬的特异性识别能力强，右旋酰胺酮洛芬的转化率和ee值高。
在本发明的第一方面，本发明提出了一种用于右旋酮洛芬的合成的酶组合。根据本发明的实施例，所述组合包括：腈水合酶和酰胺酶，所述腈水合酶来源于Rhodococcus。发明人发现，来源于Rhodococcus的腈水合酶对右旋氰基酮洛芬的特异性识别能力更强，使用来源于Rhodococcus的腈水合酶和酰胺酶的双酶体系制备右旋酮洛芬，可大大提高右旋酰胺酮洛芬的转化率，提高右旋酰胺酮洛芬和右旋酮洛芬的ee值。
根据本发明的实施例，上述酶组合还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本年发明的实施例，所述腈水合酶具有SEQ ID NO:1～3所示的氨基酸序列。
MDGVHDLAGVQGFGKVPHTVNADIGPTFHAEWEHLPYSLMFAGVAELGAFSVDEVRYVVERMEPRHYMMTPYYERYVIGVAALMVEKGILTQEELESLAGGPFPLSRPSESEGRPARIDTTTFEVGQRVRVRDEYVPGHIRMPAYCRGRVGTIAHRTTERWPFPDAIGHGRNDAGEEPTYHVTFAAEELFGSDTDGGSVVVDLFEGYLEPAA(SEQ IDNO:1)。
MSVTIDHTTENAAPAQAPVSDRAWALFRALDGKGLVPDGYVEGWKKTFEEDFSPRRGAELVARAWTDPDFRQLLLTDGTAAVAQYGYLGPQGEYIVAVEDTPTLKNVIVCSLCSCTAWPILGLPPTWYKSFEYRARVVREPRKVLSEMGTEIASDVEIRVYDTTAETRYMVLPQRPAGTEGWSQEQLQEIVTKDCLIGVAVPQVPTV(SEQ ID NO:2)。
MVDTRLPVTVLSGFLGAGKTTLLNEILRNREGRRVAVIVNDMSEINIDSAEVEREISLSRSEEKLVEMTNGCICCTLREDLLSEISALAADGRFDYLLIESSGISEPLPVAETFTFIDTDGHALADVARLDTMVTVVDGNSFLRDYTAGGRVEADAPEDERDIADLLVDQIEFADVILVSKADLVSQQHLVELTAVLRSLNATAAIVPMTLGRIPLDTILDTGLFSLEKAAQAPGWLQELQGERTPETEEYGIGSVVYRERAPFHPQRLHDFLSSKWTNGKLLRAKGYYWNAGRFTEIGSISQAGHLIRHGYVGRWWKFLPRDEWPADDYRRDGILDKWEEPVGDCRQELVFIGQAIDPSRLHRELDACLLTTAEIELGPDVWTTWSDPLGIGYTDQTV(SEQ ID NO:3)。
其中，SEQ ID NO:1表示来源于Rhodococcus的腈水合酶的α亚基(αsubunit)的氨基酸序列，SEQ ID NO:2表示来源于Rhodococcus的腈水合酶的β亚基(βsubunit)的氨基酸序列，SEQ ID NO:3表示来源于Rhodococcus的腈水合酶的副蛋白(accessory protein)的氨基酸序列。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种制备右旋酰胺酮洛芬的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括使氰基酮洛芬在腈水合酶的催化下进行酰胺化反应，以便获得右旋酰胺酮洛芬，所述腈水合酶来源于Rhodococcus。
发明人发现，来源于Rhodococcus的腈水合酶对右旋氰基酮洛芬的特异性识别能力更强，使用来源于Rhodococcus的腈水合酶制备右旋酰胺酮洛芬，可大大提高右旋酰胺酮洛芬的转化率和ee值。
根据本发明的实施例，上述制备右旋酰胺酮洛芬的方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述腈水合酶具有SEQ ID NO:1～3所示的氨基酸序列。
根据本发明的实施例，所述腈水合酶是以腈水合酶发酵菌体的形式提供的。
根据本发明的具体实施例，所述腈水合酶发酵菌体是通过如下方式获得的：将转化有质粒的大肠杆菌菌体进行活化处理，所述质粒中携带表达腈水合酶的核酸序列；将活化处理后菌液进行基础发酵培养，以便获得OD600为30～35的基础发酵培养菌液；将所述基础发酵培养菌液进行诱导培养，所述诱导培养是在IPTG和FeCl2存在的条件下进行的，所述诱导培养的时间为14～16h。
根据本发明的实施例，所述氰基酮洛芬与腈水合酶发酵菌体的质量比为1：(2～4),如1：2，1：3，1：4。
根据本发明的实施例，进一步包括将所述腈水合酶发酵菌体进行干燥处理，以便获得菌体干粉。
根据本发明的实施例，所述氰基酮洛芬与腈水合酶发酵菌体干粉的质量比为(1～3)：1，如1：1，2：1，3：1。进而催化反应效率进一步提高。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种制备右旋酮洛芬的方法。根据本发明的实施例，依据前面所述的方法获得右旋酰胺酮洛芬；使所述右旋酰胺酮洛芬在酰胺酶的催化下进行脱氨基反应，以便获得右旋酮洛芬。
根据本发明实施例的上述制备右旋酮洛芬的方法可表示如下：
Figure BDA0002409363450000031
来源于Rhodococcus的腈水合酶对右旋氰基酮洛芬的特异性识别能力更强，使用来源于Rhodococcus的腈水合酶制备右旋酮洛芬，可大大提高右旋酰胺酮洛芬的转化率，提高右旋酮洛芬的ee值。
附图说明
图1是根据本发明实施例的蛋白诱导表达的凝胶电泳图；
图2是根据本发明实施例5的腈水合酶NH1菌体催化合成右旋酰胺酮洛芬产物样品的HPLC检测结果；以及
图3是根据本发明实施例6的腈水合酶NH1喷干酶粉催化合成右旋酰胺酮洛芬产物样品的HPLC检测结果。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
本发明在大肠杆菌中表达腈水合酶NH1，利用大肠杆菌菌体进行酶催化反应，其中：
腈水合酶NH1氨基酸序列来源于Rhodococcus。
下面将更加详细地描述本发明的实施例。
实施例1腈水合酶NH1大肠杆菌表达菌株构建
根据Rhodococcus腈水合酶NH1氨基酸序列，其中，α亚基(αsubunit)的氨基酸序列如SEQ ID NO:1表示，β亚基(βsubunit)的氨基酸序列SEQ ID NO:2表示，副蛋白(accessoryprotein)的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。在每一个亚基前加入RBS位点。基因克隆在pET28a的NcoI和HindIII位点，核酸序列根据大肠杆菌密码子进行优化，优化后的核酸序列如下所示，并交由通用生物系统(安徽)有限公司进行合成。
ATGGATGGTGTTCATGATCTGGCAGGTGTTCAGGGTTTTGGTAAAGTTCCGCATACCGTTAATGCAGATATTGGTCCGACCTTTCATGCAGAATGGGAACATCTGCCGTATAGCCTGATGTTTGCAGGTGTTGCAGAACTGGGTGCATTTAGCGTTGATGAAGTTCGTTATGTTGTTGAACGTATGGAACCGCGTCATTATATGATGACCCCGTATTATGAACGTTATGTTATTGGTGTTGCAGCACTGATGGTTGAAAAAGGTATTCTGACCCAGGAAGAACTGGAAAGCCTGGCAGGTGGTCCGTTTCCGCTGAGCCGTCCGAGCGAAAGCGAAGGTCGTCCGGCACGTATTGATACCACCACCTTTGAAGTTGGTCAGCGTGTTCGTGTTCGTGATGAATATGTTCCGGGTCATATTCGTATGCCGGCATATTGTCGTGGTCGTGTTGGTACCATTGCACATCGTACCACCGAACGTTGGCCGTTTCCGGATGCAATTGGTCATGGTCGTAATGATGCAGGTGAAGAACCGACCTATCATGTTACCTTTGCAGCAGAAGAACTGTTTGGTAGCGATACCGATGGTGGTAGCGTTGTTGTTGATCTGTTTGAAGGTTATCTGGAACCGGCAGCATGAAAGGAGATATAGATATGAGCGTTACCATTGATCATACCACCGAAAATGCAGCACCGGCACAGGCACCGGTTAGCGATCGTGCATGGGCACTGTTTCGTGCACTGGATGGTAAAGGTCTGGTTCCGGATGGTTATGTTGAAGGTTGGAAAAAGACCTTTGAAGAAGATTTTAGCCCGCGTCGTGGTGCAGAACTGGTTGCACGTGCATGGACCGATCCGGATTTTCGTCAGCTGCTGCTGACCGATGGTACCGCAGCAGTTGCACAGTATGGTTATCTGGGTCCGCAGGGTGAATATATTGTTGCAGTTGAAGATACCCCGACCCTGAAAAATGTTATTGTTTGTAGCCTGTGTAGCTGTACCGCATGGCCGATTCTGGGTCTGCCGCCGACCTGGTATAAAAGTTTTGAATATCGTGCACGTGTTGTTCGTGAACCGCGTAAAGTTCTGAGCGAAATGGGTACCGAAATTGCAAGCGATGTTGAAATTCGTGTTTATGATACCACCGCAGAAACCCGTTATATGGTTCTGCCGCAGCGTCCGGCAGGTACCGAAGGTTGGAGCCAGGAACAGCTGCAGGAAATTGTTACCAAAGATTGTCTGATTGGTGTTGCAGTTCCGCAGGTTCCGACCGTTTGAAAGGAGTACTAGATATGGTTGATACCCGTCTGCCGGTTACCGTTCTGAGCGGTTTTCTGGGTGCAGGTAAAACCACCCTGCTGAATGAAATTCTGCGTAATCGTGAAGGTCGTCGTGTTGCAGTTATTGTTAATGATATGAGCGAAATTAATATTGATAGCGCCGAAGTTGAACGTGAAATTAGCCTGAGCCGTAGCGAAGAAAAACTGGTTGAAATGACCAATGGTTGTATTTGTTGTACCCTGCGTGAAGATTTACTGAGCGAAATTAGCGCACTGGCAGCAGATGGTCGTTTTGATTATCTGCTGATTGAAAGCAGCGGTATTAGCGAACCGCTGCCGGTTGCAGAAACCTTTACCTTTATTGATACCGATGGTCATGCACTGGCAGATGTTGCACGTCTGGATACAATGGTTACCGTTGTTGATGGTAATAGCTTTCTGCGTGATTATACCGCAGGTGGTCGTGTTGAAGCAGATGCACCGGAAGATGAACGTGATATTGCAGATTTACTGGTTGATCAGATTGAATTTGCAGATGTTATTCTGGTTAGCAAAGCAGATTTAGTTAGCCAGCAGCATCTGGTTGAACTGACCGCAGTTCTGCGTAGCCTGAATGCAACCGCAGCAATTGTTCCGATGACCCTGGGTCGTATTCCGCTGGATACCATTCTGGATACCGGTCTGTTTAGCCTGGAAAAAGCAGCACAGGCACCGGGTTGGCTGCAGGAACTGCAGGGTGAACGTACCCCGGAAACCGAAGAATATGGTATTGGTAGCGTTGTTTATCGTGAACGTGCACCGTTTCATCCGCAGCGTCTGCATGATTTTCTGAGCAGCAAATGGACCAATGGTAAACTGCTGCGTGCAAAAGGTTATTATTGGAATGCAGGTCGTTTTACCGAAATTGGTAGCATTAGCCAGGCAGGTCATCTGATTCGTCATGGTTATGTTGGTCGTTGGTGGAAATTTCTGCCGCGTGATGAATGGCCGGCAGATGATTATCGTCGTGATGGTATTCTGGATAAATGGGAAGAACCGGTTGGTGATTGTCGTCAGGAACTGGTTTTTATTGGTCAGGCAATTGATCCGAGCCGTCTGCATCGTGAACTGGATGCATGTCTGCTGACCACCGCAGAAATTGAACTGGGTCCGGATGTTTGGACCACCTGGAGCGATCCGCTGGGTATTGGTTATACCGATCAGACCGTTTGA(SEQ IDNO：4)。
SEQ ID NO:4所示核酸序列导入大肠杆菌中，可在大肠杆菌中表达SEQ ID NO:1～3所示的腈水合酶NH1的α亚基、β亚基以及副蛋白。
合成得到的质粒干粉分别加入50μl蒸馏水溶解，取1μl转化BL21(DE3)感受态细胞，转化液涂布LB+Kan平板(10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L氯化钠，50μg/mL卡那霉素，15g/L琼脂粉)，37℃过夜培养。
实施例2腈水合酶NH1的摇瓶诱导表达
分别挑取转化平板上的单菌落至5mL LB+Kan液体培养基(10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L氯化钠，50μg/mL卡那霉素)，37℃250rpm/min条件下过夜培养，约12h。
取过夜活化好的菌液，2mL转接至新鲜的200mL LB+Kan液体培养基，37℃ 250rpm/min条件下培养直至OD达到0.5-0.8。
取培养好的NH1菌液，加入终浓度为1mM的IPTG以及终浓度为1mM的FeCl2，30℃250rpm/min条件下培养5h。
诱导结束后，收集全部菌液在8000prm/min、4摄氏度条件下离心收集菌体。取适当菌体进行超声波破壁处理，10000rpm/min、4℃离心10min，取上清液检测蛋白表达情况。
蛋白诱导情况见图1。
实施例3腈水合酶NH1的50L罐上发酵
取实施例2中过夜活化好的菌液，1mL转接至新鲜的1000mL LB+Kan液体培养基，37℃ 250rpm/min条件下培养约10h后接种50L发酵罐(发酵培养基：一水葡萄糖121g，酵母浸粉500g，酵母蛋白胨250g，NaCl100g，Na2HPO4 25g，MgSO4.7H2O 20g，KH2PO4 100g，(NH4)2SO450g，一水柠檬酸55g，NaOH 75g，GPE消泡剂25mL。118℃灭菌30min，消后体积25L)。
基础培养阶段：控制培养温度37.0℃，通气量1:1vvm，通过搅拌和通气调节发酵液溶氧水平高于50％，罐压40～70Kpa。
补葡萄糖阶段：发酵液pH值反弹至7.15时开始补加葡萄糖溶液，初始补糖速率6.6g/L.h，每0.5h提升0.7g/L.h，葡萄糖补加速率提升至10.0g/L.h，维持此速率补加至诱导阶段。补葡萄糖阶段培养温度34.0℃，通气量1:1.3vvm，通过搅拌和通气调节发酵液溶氧水平高于30％。
诱导阶段：发酵液OD600值在30～35时，开始进行诱导，诱导时一次性打入终浓度1mMIPTG溶液和终浓度1mM FeCl2溶液。诱导前降低培养温度至30℃，诱导后葡萄糖补加速率3.3～3.6g/L.h，发酵液溶氧水平20％～50％。维持该速率直至发酵结束，诱导约15h。发酵结束后离心发酵液收集菌体，菌体置于-20℃保存。
实施例4腈水合酶NH1的酶粉制备
喷干酶粉的制备：利用实施例3中获得的腈水合酶NH1发酵液，量取500mL发酵液，于喷雾干燥箱(设置参数为进口温度170℃、出口温度80℃、进料流量700mL/h)中进行喷干，获得腈水合酶NH1喷干酶粉。喷干酶粉置于4℃保存。
冻干酶粉的制备：利用实施例3中获得的腈水合酶NH1发酵液，量取500mL发酵液样品离心，将菌体用生理盐水洗涤菌体后移去多余生理盐水，加入5％蔗糖溶液作保护剂。重悬菌体并置于冷冻舱里的隔板上，在超低温冰箱(－70℃)中预冷12h。随后在冷冻干燥机中冷冻干燥48h即得冻干酶粉。冻干酶粉置于4℃保存。
实施例5腈水合酶NH1菌体催化合成右旋酰胺酮洛芬
取实施例3中18g腈水合酶NH1菌体均匀分散到100mL 0.1M pH＝7.0磷酸钠缓冲液中，30℃下温浴10min，再将6g氰基酮洛芬底物溶于10mL乙酸乙酯滴加入反应瓶，保温反应。反应24h取样2mL，加4mL二氯甲烷萃取，取萃取相50uL，干燥，HPLC检测各组分含量。
样品处理：采用乙腈溶解，配制成1mg/ml。
检测条件：采用HPLC正相，色谱柱(Welch Topsil 5u C18 100A，4.6×150mm)，检测波长：250nm，柱温：25℃，进样量5μl,流动相：磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钾68.0g，加水溶解并稀释至1000ml，用磷酸调节pH值至3.5±0.1)-乙睛-水(2：43：55)，洗脱条件：等度洗脱，运行时间：25min。
e.e＝(右旋KPA含量-左旋KPA含量)/(右旋KPA含量+左旋KPA含量)
转化率＝右旋KPA含量/初始KPN含量
KPN为底物氰基酮洛芬，KPA为产物酰胺酮洛芬。
结果如图2所示，产物右旋KPA的e.e值为98.6％，转化率为48.4％。
实施例6腈水合酶NH1喷干酶粉催化合成右旋酰胺酮洛芬
取实施例4中3g腈水合酶NH1喷干酶粉均匀分散到100mL 0.1M pH＝7.0磷酸钠缓冲液中，30℃下温浴10min，再将6g氰基酮洛芬底物溶于10mL乙酸乙酯滴加入反应瓶，保温反应。反应20h取样2mL，加4mL二氯甲烷萃取，取萃取相50uL，干燥，HPLC检测各组分含量。样品处理以及检测方法同实施例5。样品处理以及检测方法同实施例5。
HPLC图见附图3，产物右旋KPA的e.e值为98.5％，转化率为48.5％。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
SEQUENCE LISTING
<110> 东莞市东阳光生物合成药有限公司
<120> 制备右旋酰胺酮洛芬的方法
<130> PIDC4190300
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 212
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 来源于Rhodococcus的腈水合酶的α亚基（α subunit）的氨基酸序列
<400> 1
Met Asp Gly Val His Asp Leu Ala Gly Val Gln Gly Phe Gly Lys Val
1 5 10 15
Pro His Thr Val Asn Ala Asp Ile Gly Pro Thr Phe His Ala Glu Trp
20 25 30
Glu His Leu Pro Tyr Ser Leu Met Phe Ala Gly Val Ala Glu Leu Gly
35 40 45
Ala Phe Ser Val Asp Glu Val Arg Tyr Val Val Glu Arg Met Glu Pro
50 55 60
Arg His Tyr Met Met Thr Pro Tyr Tyr Glu Arg Tyr Val Ile Gly Val
65 70 75 80
Ala Ala Leu Met Val Glu Lys Gly Ile Leu Thr Gln Glu Glu Leu Glu
85 90 95
Ser Leu Ala Gly Gly Pro Phe Pro Leu Ser Arg Pro Ser Glu Ser Glu
100 105 110
Gly Arg Pro Ala Arg Ile Asp Thr Thr Thr Phe Glu Val Gly Gln Arg
115 120 125
Val Arg Val Arg Asp Glu Tyr Val Pro Gly His Ile Arg Met Pro Ala
130 135 140
Tyr Cys Arg Gly Arg Val Gly Thr Ile Ala His Arg Thr Thr Glu Arg
145 150 155 160
Trp Pro Phe Pro Asp Ala Ile Gly His Gly Arg Asn Asp Ala Gly Glu
165 170 175
Glu Pro Thr Tyr His Val Thr Phe Ala Ala Glu Glu Leu Phe Gly Ser
180 185 190
Asp Thr Asp Gly Gly Ser Val Val Val Asp Leu Phe Glu Gly Tyr Leu
195 200 205
Glu Pro Ala Ala
210
<210> 2
<211> 207
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 来源于Rhodococcus的腈水合酶的β亚基（? subunit）的氨基酸序列
<400> 2
Met Ser Val Thr Ile Asp His Thr Thr Glu Asn Ala Ala Pro Ala Gln
1 5 10 15
Ala Pro Val Ser Asp Arg Ala Trp Ala Leu Phe Arg Ala Leu Asp Gly
20 25 30
Lys Gly Leu Val Pro Asp Gly Tyr Val Glu Gly Trp Lys Lys Thr Phe
35 40 45
Glu Glu Asp Phe Ser Pro Arg Arg Gly Ala Glu Leu Val Ala Arg Ala
50 55 60
Trp Thr Asp Pro Asp Phe Arg Gln Leu Leu Leu Thr Asp Gly Thr Ala
65 70 75 80
Ala Val Ala Gln Tyr Gly Tyr Leu Gly Pro Gln Gly Glu Tyr Ile Val
85 90 95
Ala Val Glu Asp Thr Pro Thr Leu Lys Asn Val Ile Val Cys Ser Leu
100 105 110
Cys Ser Cys Thr Ala Trp Pro Ile Leu Gly Leu Pro Pro Thr Trp Tyr
115 120 125
Lys Ser Phe Glu Tyr Arg Ala Arg Val Val Arg Glu Pro Arg Lys Val
130 135 140
Leu Ser Glu Met Gly Thr Glu Ile Ala Ser Asp Val Glu Ile Arg Val
145 150 155 160
Tyr Asp Thr Thr Ala Glu Thr Arg Tyr Met Val Leu Pro Gln Arg Pro
165 170 175
Ala Gly Thr Glu Gly Trp Ser Gln Glu Gln Leu Gln Glu Ile Val Thr
180 185 190
Lys Asp Cys Leu Ile Gly Val Ala Val Pro Gln Val Pro Thr Val
195 200 205
<210> 3
<211> 399
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 来源于Rhodococcus的腈水合酶的副蛋白（accessory
protein）的氨基酸序列
<400> 3
Met Val Asp Thr Arg Leu Pro Val Thr Val Leu Ser Gly Phe Leu Gly
1 5 10 15
Ala Gly Lys Thr Thr Leu Leu Asn Glu Ile Leu Arg Asn Arg Glu Gly
20 25 30
Arg Arg Val Ala Val Ile Val Asn Asp Met Ser Glu Ile Asn Ile Asp
35 40 45
Ser Ala Glu Val Glu Arg Glu Ile Ser Leu Ser Arg Ser Glu Glu Lys
50 55 60
Leu Val Glu Met Thr Asn Gly Cys Ile Cys Cys Thr Leu Arg Glu Asp
65 70 75 80
Leu Leu Ser Glu Ile Ser Ala Leu Ala Ala Asp Gly Arg Phe Asp Tyr
85 90 95
Leu Leu Ile Glu Ser Ser Gly Ile Ser Glu Pro Leu Pro Val Ala Glu
100 105 110
Thr Phe Thr Phe Ile Asp Thr Asp Gly His Ala Leu Ala Asp Val Ala
115 120 125
Arg Leu Asp Thr Met Val Thr Val Val Asp Gly Asn Ser Phe Leu Arg
130 135 140
Asp Tyr Thr Ala Gly Gly Arg Val Glu Ala Asp Ala Pro Glu Asp Glu
145 150 155 160
Arg Asp Ile Ala Asp Leu Leu Val Asp Gln Ile Glu Phe Ala Asp Val
165 170 175
Ile Leu Val Ser Lys Ala Asp Leu Val Ser Gln Gln His Leu Val Glu
180 185 190
Leu Thr Ala Val Leu Arg Ser Leu Asn Ala Thr Ala Ala Ile Val Pro
195 200 205
Met Thr Leu Gly Arg Ile Pro Leu Asp Thr Ile Leu Asp Thr Gly Leu
210 215 220
Phe Ser Leu Glu Lys Ala Ala Gln Ala Pro Gly Trp Leu Gln Glu Leu
225 230 235 240
Gln Gly Glu Arg Thr Pro Glu Thr Glu Glu Tyr Gly Ile Gly Ser Val
245 250 255
Val Tyr Arg Glu Arg Ala Pro Phe His Pro Gln Arg Leu His Asp Phe
260 265 270
Leu Ser Ser Lys Trp Thr Asn Gly Lys Leu Leu Arg Ala Lys Gly Tyr
275 280 285
Tyr Trp Asn Ala Gly Arg Phe Thr Glu Ile Gly Ser Ile Ser Gln Ala
290 295 300
Gly His Leu Ile Arg His Gly Tyr Val Gly Arg Trp Trp Lys Phe Leu
305 310 315 320
Pro Arg Asp Glu Trp Pro Ala Asp Asp Tyr Arg Arg Asp Gly Ile Leu
325 330 335
Asp Lys Trp Glu Glu Pro Val Gly Asp Cys Arg Gln Glu Leu Val Phe
340 345 350
Ile Gly Gln Ala Ile Asp Pro Ser Arg Leu His Arg Glu Leu Asp Ala
355 360 365
Cys Leu Leu Thr Thr Ala Glu Ile Glu Leu Gly Pro Asp Val Trp Thr
370 375 380
Thr Trp Ser Asp Pro Leu Gly Ile Gly Tyr Thr Asp Gln Thr Val
385 390 395
<210> 4
<211> 2491
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 可在大肠杆菌中表达SEQ ID
NO:1~3所示的腈水合酶NH1的α亚基、β亚基以及副蛋白的核酸的核苷酸序
列
<400> 4
atggatggtg ttcatgatct ggcaggtgtt cagggttttg gtaaagttcc gcataccgtt 60
aatgcagata ttggtccgac ctttcatgca gaatgggaac atctgccgta tagcctgatg 120
tttgcaggtg ttgcagaact gggtgcattt agcgttgatg aagttcgtta tgttgttgaa 180
cgtatggaac cgcgtcatta tatgatgacc ccgtattatg aacgttatgt tattggtgtt 240
gcagcactga tggttgaaaa aggtattctg acccaggaag aactggaaag cctggcaggt 300
ggtccgtttc cgctgagccg tccgagcgaa agcgaaggtc gtccggcacg tattgatacc 360
accacctttg aagttggtca gcgtgttcgt gttcgtgatg aatatgttcc gggtcatatt 420
cgtatgccgg catattgtcg tggtcgtgtt ggtaccattg cacatcgtac caccgaacgt 480
tggccgtttc cggatgcaat tggtcatggt cgtaatgatg caggtgaaga accgacctat 540
catgttacct ttgcagcaga agaactgttt ggtagcgata ccgatggtgg tagcgttgtt 600
gttgatctgt ttgaaggtta tctggaaccg gcagcatgaa aggagatata gatatgagcg 660
ttaccattga tcataccacc gaaaatgcag caccggcaca ggcaccggtt agcgatcgtg 720
catgggcact gtttcgtgca ctggatggta aaggtctggt tccggatggt tatgttgaag 780
gttggaaaaa gacctttgaa gaagatttta gcccgcgtcg tggtgcagaa ctggttgcac 840
gtgcatggac cgatccggat tttcgtcagc tgctgctgac cgatggtacc gcagcagttg 900
cacagtatgg ttatctgggt ccgcagggtg aatatattgt tgcagttgaa gataccccga 960
ccctgaaaaa tgttattgtt tgtagcctgt gtagctgtac cgcatggccg attctgggtc 1020
tgccgccgac ctggtataaa agttttgaat atcgtgcacg tgttgttcgt gaaccgcgta 1080
aagttctgag cgaaatgggt accgaaattg caagcgatgt tgaaattcgt gtttatgata 1140
ccaccgcaga aacccgttat atggttctgc cgcagcgtcc ggcaggtacc gaaggttgga 1200
gccaggaaca gctgcaggaa attgttacca aagattgtct gattggtgtt gcagttccgc 1260
aggttccgac cgtttgaaag gagtactaga tatggttgat acccgtctgc cggttaccgt 1320
tctgagcggt tttctgggtg caggtaaaac caccctgctg aatgaaattc tgcgtaatcg 1380
tgaaggtcgt cgtgttgcag ttattgttaa tgatatgagc gaaattaata ttgatagcgc 1440
cgaagttgaa cgtgaaatta gcctgagccg tagcgaagaa aaactggttg aaatgaccaa 1500
tggttgtatt tgttgtaccc tgcgtgaaga tttactgagc gaaattagcg cactggcagc 1560
agatggtcgt tttgattatc tgctgattga aagcagcggt attagcgaac cgctgccggt 1620
tgcagaaacc tttaccttta ttgataccga tggtcatgca ctggcagatg ttgcacgtct 1680
ggatacaatg gttaccgttg ttgatggtaa tagctttctg cgtgattata ccgcaggtgg 1740
tcgtgttgaa gcagatgcac cggaagatga acgtgatatt gcagatttac tggttgatca 1800
gattgaattt gcagatgtta ttctggttag caaagcagat ttagttagcc agcagcatct 1860
ggttgaactg accgcagttc tgcgtagcct gaatgcaacc gcagcaattg ttccgatgac 1920
cctgggtcgt attccgctgg ataccattct ggataccggt ctgtttagcc tggaaaaagc 1980
agcacaggca ccgggttggc tgcaggaact gcagggtgaa cgtaccccgg aaaccgaaga 2040
atatggtatt ggtagcgttg tttatcgtga acgtgcaccg tttcatccgc agcgtctgca 2100
tgattttctg agcagcaaat ggaccaatgg taaactgctg cgtgcaaaag gttattattg 2160
gaatgcaggt cgttttaccg aaattggtag cattagccag gcaggtcatc tgattcgtca 2220
tggttatgtt ggtcgttggt ggaaatttct gccgcgtgat gaatggccgg cagatgatta 2280
tcgtcgtgat ggtattctgg ataaatggga agaaccggtt ggtgattgtc gtcaggaact 2340
ggtttttatt ggtcaggcaa ttgatccgag ccgtctgcat cgtgaactgg atgcatgtct 2400
gctgaccacc gcagaaattg aactgggtcc ggatgtttgg accacctgga gcgatccgct 2460
gggtattggt tataccgatc agaccgtttg a 2491

Claims (9)

1.一种用于右旋酮洛芬的合成的酶组合，其特征在于，包括：腈水合酶和酰胺酶，所述腈水合酶来源于Rhodococcus。
2.根据权利要求1所述的酶组合，其特征在于，所述腈水合酶具有SEQ ID NO:1～3所示的氨基酸序列。
3.一种制备右旋酰胺酮洛芬的方法，其特征在于，使氰基酮洛芬在腈水合酶的催化下进行酰胺化反应，以便获得右旋酰胺酮洛芬，所述腈水合酶来源于Rhodococcus。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述腈水合酶具有SEQ ID NO:1～3所示的氨基酸序列。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述腈水合酶是以腈水合酶发酵菌体的形式提供的。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述腈水合酶发酵菌体是通过如下方式获得的：
将转化有质粒的大肠杆菌菌体进行活化处理，所述质粒中携带表达腈水合酶的核酸序列；
将活化处理后菌液进行基础发酵培养，以便获得OD600为30～35的基础发酵培养菌液；
将所述基础发酵培养菌液进行诱导培养，所述诱导培养是在IPTG和FeCl2存在的条件下进行的，所述诱导培养的时间为14～16h。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述氰基酮洛芬与腈水合酶发酵菌体的质量比为1：(2～4)。
8.根据权利要请求6所述的方法，其特征在于，进一步包括将所述腈水合酶发酵菌体进行干燥处理，以便获得菌体干粉；
优选地，所述氰基酮洛芬与腈水合酶发酵菌体喷干粉的质量比为(1～3)：1。
9.一种制备右旋酮洛芬的方法，其特征在于，依据权利要求3～8任一项所述的方法制备右旋酰胺酮洛芬；
使所述右旋酰胺酮洛芬在酰胺酶的催化下进行脱氨基反应，以便获得右旋酮洛芬。
CN202010171563.2A 2020-03-12 2020-03-12 制备右旋酰胺酮洛芬的方法 Pending CN111378640A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010171563.2A CN111378640A (zh) 2020-03-12 2020-03-12 制备右旋酰胺酮洛芬的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010171563.2A CN111378640A (zh) 2020-03-12 2020-03-12 制备右旋酰胺酮洛芬的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111378640A true CN111378640A (zh) 2020-07-07

Family

ID=71221615

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010171563.2A Pending CN111378640A (zh) 2020-03-12 2020-03-12 制备右旋酰胺酮洛芬的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111378640A (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5654180A (en) * 1991-03-04 1997-08-05 Nitto Chemical Co. Ltd. Hybrid plasmid vectors, recombinant plasmids containing genes encoding nitrile degrading enzymes, transformants containing the recombinant plasmids and methods of producing amides and acids using the transformants
CN1340101A (zh) * 1999-10-26 2002-03-13 昭和电工株式会社 新型红球菌属细菌、源自于红球菌属细菌的腈水解酶基因、腈水合酶基因和酰胺酶基因,以及利用它们生产羧酸的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5654180A (en) * 1991-03-04 1997-08-05 Nitto Chemical Co. Ltd. Hybrid plasmid vectors, recombinant plasmids containing genes encoding nitrile degrading enzymes, transformants containing the recombinant plasmids and methods of producing amides and acids using the transformants
CN1340101A (zh) * 1999-10-26 2002-03-13 昭和电工株式会社 新型红球菌属细菌、源自于红球菌属细菌的腈水解酶基因、腈水合酶基因和酰胺酶基因,以及利用它们生产羧酸的方法

Non-Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALAN WILLIAM BUNCH: "Biotransformation of nitriles by rhodococci", 《ANTONIE VAN LEEUWENHOEK》 *
CH. REISINGER ET AL.: "Enzymatic hydrolysis of cyanohydrins with recombinant nitrile hydratase and amidase from Rhodococcus erythropolis", 《BIOTECHNOLOGY LETTERS》 *
IRENA PREPECHALOVA ET AL.: "Purification and characterization of the enantioselective nitrile hydratase from Rhodococcus equi A4", 《APPL MICROBIOL BIOTECHNOL》 *
LUDMILA MARTINKOVA ET AL.: "ENANTIOSELECTIVITY OF THE NITRILE HYDRATASE FROM RHODOCOCCUSEQUI A4 TOWARDS SUBSTITUTED (R,S)-2-ARYLPROPIONITRILES", 《BIOTECHNOLOGY LETTERS》 *
M. M. TAUBER ET AL.: "Nitrile Hydratase and Amidase from Rhodococcus rhodochrous Hydrolyze Acrylic Fibers and Granular Polyacrylonitriles", 《APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY》 *
NORMAN LAYH ET AL.: "ENANTIOSELECTIVE HYDROLYSIS OF KETOPROFEN AMIDE BY RHODOCOCCUS SP. C3II AND RHODOCOCCUS ERYTHROPOLIS MP 50", 《BIOTECHNOLOGY LETTERS》 *
SEKINE,M. ET AL.: "nitrile hydratase activator [Rhodococcus erythropolis PR4]，GenBank: BAH36634.1", 《GENBANK》 *
YINGQIANG SHEN ET AL.: "Stereoselective nitrile hydratase", 《AFRICAN JOURNAL OF MICROBIOLOGY RESEARCH》 *
余越春: "腈水合酶在大肠杆菌中的表达及合成机理研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 基础科学辑》 *
胡琦蔚等: "生物催化法制备手性酮基布洛芬的研究进展", 《发酵科技通讯》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106957850B (zh) 一株产磷脂酶d的基因工程菌及其构建方法与应用
CN109628544B (zh) 一种脂肪酶在拆分n-乙酰-dl-甲硫氨酸甲酯中的应用
CN106754846A (zh) 一种具核梭杆菌酪氨酸酚裂解酶突变体、基因、载体、工程菌及其应用
CN113462666B (zh) 羰基还原酶突变体及其应用
CN115927224A (zh) 一种羰基还原酶突变体及其应用
CN106591258B (zh) 一种脂肪酶基因、载体、工程菌及其应用
CN108410831B (zh) 酮酸还原酶、基因、工程菌及在合成手性芳香2-羟酸中的应用
CN109652470B (zh) 一种脂肪酶在拆分(r,s)-扁桃酸甲酯中的应用
KR20090015626A (ko) 재조합 미생물을 이용한 광학활성（ｓ）-3-하이드록시부탄산 및（ｓ）-3-하이드록시부티레이트 에스테르의 제조방법
CN110358751B (zh) 一种重组脂肪酶突变体、编码基因、重组工程菌及应用
US11667939B2 (en) Method for producing methacrylyl-CoA
CN111334495B (zh) 制备右旋酰胺酮洛芬的方法
CN103131659A (zh) 一种耐有机溶剂脂肪酶、其编码基因、产生菌株及应用
CN112143725B (zh) 一种重组酯酶、编码基因、工程菌及在拆分甲霜灵中的应用
CN111378640A (zh) 制备右旋酰胺酮洛芬的方法
CN109943618B (zh) 一种重组脂肪酶在拆分(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯中的应用
CN103865940A (zh) 一种l-异亮氨酸羟化酶基因及其基因工程菌与应用
CN111363736A (zh) 制备右旋酮洛芬的方法
CN111378637A (zh) 制备右旋酮洛芬的方法
CN114134133A (zh) 比活和热稳定性提高的腈水合酶变体及其应用
CN111057735B (zh) 一种解淀粉芽孢杆菌酯酶在拆分N-BOC-DL-α-氨基丁酸甲酯中的应用
CN110066835B (zh) 一种脂肪酶在拆分外消旋2-溴代异戊酸乙酯中的应用
CN111057736B (zh) 一种脂肪酶在拆分boc-dl-脯氨酸甲酯中的应用
CN109402188A (zh) 一种来自短小芽孢杆菌的ω-转氨酶及在生物胺化中的应用
CN114134132A (zh) 比活提高的酰胺酶变体及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20210622

Address after: 443300 No.62 Binjiang Road, Lucheng, Yidu, Yichang, Hubei Province

Applicant after: Yichang dongyangguang Biochemical Pharmaceutical Co.,Ltd.

Address before: 523871 room 114, building 3, No.368, middle Zhen'an Road, Chang'an Town, Dongguan City, Guangdong Province

Applicant before: Dongguan dongyangguang biosynthetics Co.,Ltd.

RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20200707