CN111363736A - 制备右旋酮洛芬的方法 - Google Patents

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叶燕全
杨志雄
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Abstract

本发明提出了一种制备右旋酮洛芬的方法。该方法包括使酰胺酮洛芬在酰胺酶的催化下进行脱氨基反应，以便获得右旋酮洛芬，所述酰胺酶来源于Klebsiella。发明人发现，来源于Klebsiella的酰胺酶对右旋酰胺酮洛芬的特异性识别能力更强，使用来源于Klebsiella的酰胺酶制备右旋酮洛芬，可大大提高右旋酮洛芬的ee值。

Description

制备右旋酮洛芬的方法
技术领域
本发明涉及生物工程领域，具体地，本发明涉及制备右旋酮洛芬的方法。
背景技术
酮洛芬是2-芳基丙酸类非甾体抗炎药(NSAIDs)，此类药物均具有一个手性中心，只有右旋体才具有抗炎抗风湿和镇痛作用，左旋体几乎没有药理活性且毒副作用大。
目前，市售(S)-(+)－酮洛芬主要合成方法有传统的化学合成法、手性拆分以及生物酶合成法。
化学合成法主要是不对称合成可通过6步反应，由烯丙醇通过sharpless环氧化制备得到(2S，3S)环氧化合物，再加入手性位移试剂，经过对映体选择性氢解后生成二醇，在RuO4/NaIO4的催化下，最终得到右旋酮洛芬，ee值达到98％这种方法的产率和对映体选择性较为理想，但是均需要用到传统的化学催化剂以促使反应快速进行，而大部分催化剂毒性较高、易燃且会造成环境污染，还有可能引入有害的副产物。
另有手性拆分方法，有专利(专利01，CN101928214A)采用国内廉价易得的(-)-葡辛胺作为拆分剂拆分(RS)-酮洛芬，按一定比例混合后升温回流后降温结晶，对酮洛芬利用率达70％。目前也有采用高分子印迹聚合物、色谱法对酮洛芬对映体进行拆分。也有研究利用微生物酶法进行酮洛芬拆分。也有研究利用紫外诱变得到的微生物菌株在一定条件下进行发酵，利用菌体拆分(RS)-酮洛芬。也有研究利用诺维信脂肪酶435催化酮洛芬酯拆分，该研究中，大肠杆菌表达来自于古细菌的嗜热酯酶，利用菌体催化酮洛芬乙酯反应生成右旋酮洛芬。然而，利用酯酶的缺点在于拆分率和产物ee值都不理想，底物浓度偏低问题也难以解决。
生物酶合成法可以一定程度是解决底物浓度和产物ee值偏低的问题。目前已有利用腈水合酶和酰胺酶双酶体系制备光学纯酮洛芬的报道。但现有技术的转化率或光学纯度均较低，仍达不到生产要求。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本申请的发明人对酰胺酶进行了筛选，发现在特定菌中的酰胺酶对右旋酰胺酮洛芬的特异性识别能力强，右旋酮洛芬的转化率和ee值高。
在本发明的第一方面，本发明提出了一种用于右旋酮洛芬的合成的酶组合。根据本发明的实施例，所述组合包括：腈水合酶和酰胺酶，所述酰胺酶来源于Klebsiella。发明人发现，来源于Klebsiella的酰胺酶对右旋酰胺酮洛芬的特异性识别能力更强，使用腈水合酶和来源于Klebsiella的酰胺酶的双酶体系制备右旋酮洛芬，可大大提高右旋酮洛芬的转化率和ee值。
根据本发明的实施例，上述酶组合还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本年发明的实施例，所述酰胺酶具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
MAIQRPTAEQLQELASRLHISLTTAQAEEYLAVMQANFDAYDLIDSLPDDIPEVRYPRAAGYRPTGEDNPLNAWYYKTEVKGAATGALAGRTIALKDNVSLAGVPMMNGASTLEGFVPSCDATVATRLLDAGATILGKATCEHFCLSGGSHTSDPAPVHNPHRHGYSSGGSSSGSAALVAAGEVDMAIGCDQGGSIRIPSAFCGTYGMKPTHGLVPYTGIMPIEATIDHAGPITANVRDNALMLETIAGSDGLDPRQYAPVVESYTAALGKGVRGLKIGILTEGFQLPNMDPQVETKVRDAIARLQALGAIVSEISVPEHNLAGALWSPIGCEGLTAQMMHGNGMGFNWEGQYDVSLLDKHAQWRDSADALSPSLKVCMFVGQYGLERYNGRYYARAQNIARRARAGYDRALSDFDLLVMPTVPVLAQPIPDPDCSITEYISRAFEMIGNTAAQDITGHPAMSIPCGMVDGLPVGMMLVGRHYAENTLYQAAAAFEACGDWRTF(SEQ ID NO:1)。
SEQ ID NO:1表示来源于Klebsiella的酰胺酶的氨基酸序列。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种制备右旋酮洛芬的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括使酰胺酮洛芬在酰胺酶的催化下进行脱氨基反应，以便获得右旋酮洛芬，所述酰胺酶来源于Klebsiella。
根据本发明实施例的上述制备右旋酮洛芬的方法可表示如下：
Figure BDA0002409359690000021
发明人发现，来源于Klebsiella的酰胺酶对右旋酰胺酮洛芬的特异性识别能力更强，使用来源于Klebsiella的酰胺酶制备右旋酮洛芬，可大大提高右旋酮洛芬的ee值。
根据本发明的实施例，上述制备右旋酮洛芬的方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述酰胺酶具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
根据本发明的实施例，所述酰胺酶是以酰胺酶发酵菌体的形式提供的。
根据本发明的具体实施例，所述酰胺酶发酵菌体是通过如下方式获得的：将转化有质粒的大肠杆菌菌体进行活化处理，所述质粒中携带表达酰胺酶的核酸序列；将活化处理后菌液进行基础发酵培养，以便获得OD600为30～35的基础发酵培养菌液；将所述基础发酵培养菌液进行诱导培养，所述诱导培养是在IPTG存在的条件下进行的，所述诱导培养的时间为14～16h。
根据本发明的实施例，所述酰胺酮洛芬与酰胺酶发酵菌体的质量比为(0.5～3)：1，如2：1，1：1，2.5：1，3：1。
根据本发明的实施例，进一步包括将所述酰胺酶发酵菌体进行干燥处理，以便获得菌体干粉。
根据本发明的实施例，所述酰胺酮洛芬与酰胺酶发酵菌体干粉的质量比为(2～6)：1，如2：1，2.5：1，3：1，4：1，5：1，6：1。进而催化反应效率进一步提高。
根据本发明的实施例，所述酰胺酮洛芬是通过使氰基酮洛芬在腈水合酶的催化下进行酰胺化反应获得的。
附图说明
图1是根据本发明实施例的蛋白诱导表达的凝胶电泳图；
图2是根据本发明实施例5的酰胺酶AMD02菌体催化合成右旋酮洛芬产物样品的HPLC检测结果；以及
图3是根据本发明实施例6的酰胺酶AMD02干粉催化合成右旋酮洛芬产物样品的HPLC检测结果。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
本发明在大肠杆菌中表达酰胺酶AMD02，利用大肠杆菌菌体进行酶催化反应，其中：
酰胺酶AMD02氨基酸序列来源于Klebsiella。
利用酰胺酶催化右旋酮洛芬合成的途径为：
Figure BDA0002409359690000031
下面将更加详细地描述本发明的实施例。
实施例1酰胺酶AMD02大肠杆菌表达菌株构建
根据Klebsiella酰胺酶AMD02氨基酸序列，序列如SEQ ID NO:2所示。基因克隆在pET28a的NcoI和HindIII位点，核酸序列根据大肠杆菌密码子进行优化，优化后的核酸序列如下所示，并交由通用生物系统(安徽)有限公司进行合成。
ATGGCAATTCAGCGTCCGACCGCAGAACAGCTGCAGGAACTGGCAAGCCGTCTGCATATTAGCCTGACCACCGCACAGGCGGAAGAATATCTGGCTGTGATGCAGGCTAATTTTGATGCATATGATCTGATTGATAGTCTGCCGGATGATATTCCGGAAGTGCGCTATCCGCGTGCAGCAGGTTATCGTCCGACCGGCGAAGATAATCCGCTGAATGCATGGTATTATAAAACCGAAGTGAAAGGTGCAGCTACCGGTGCACTGGCTGGCCGCACCATTGCCCTGAAAGATAATGTTTCTCTGGCCGGCGTGCCGATGATGAATGGCGCCAGTACCCTGGAAGGCTTTGTTCCGAGTTGCGATGCGACCGTTGCAACCCGTCTGCTGGATGCCGGCGCCACCATTCTGGGTAAAGCGACCTGCGAACATTTTTGCCTGAGCGGTGGTTCTCATACCTCAGATCCGGCCCCGGTTCATAATCCGCATCGCCACGGTTATTCTAGCGGCGGCAGTTCATCTGGTAGTGCGGCACTGGTGGCTGCAGGTGAAGTGGATATGGCGATTGGCTGTGATCAGGGCGGCAGCATTCGCATTCCGTCTGCGTTTTGCGGTACCTATGGCATGAAACCGACCCACGGTCTGGTTCCGTATACCGGCATTATGCCGATTGAAGCTACCATTGATCATGCTGGCCCGATTACCGCGAATGTTCGTGATAATGCTCTGATGCTGGAAACCATTGCAGGTTCTGATGGTCTGGACCCTCGCCAGTATGCGCCGGTTGTGGAATCATATACCGCAGCGCTGGGCAAAGGTGTTCGCGGTCTGAAAATTGGTATTCTGACCGAAGGTTTTCAGCTGCCGAATATGGACCCTCAGGTGGAAACCAAAGTTCGTGATGCGATTGCCCGTCTGCAGGCACTGGGCGCGATTGTTTCTGAAATTTCTGTTCCGGAACATAATCTGGCTGGTGCACTGTGGTCACCGATTGGCTGTGAAGGCCTGACCGCCCAGATGATGCATGGTAATGGCATGGGCTTTAATTGGGAAGGCCAGTATGATGTTTCACTGCTGGATAAACATGCCCAGTGGCGTGATTCAGCAGATGCACTGAGTCCGTCACTGAAAGTGTGTATGTTTGTTGGCCAGTATGGTCTGGAACGCTATAATGGCCGTTATTATGCTCGTGCACAGAATATTGCGCGTCGTGCTCGTGCAGGCTATGATCGCGCTCTGAGTGATTTTGATCTGCTGGTGATGCCGACCGTGCCGGTGCTGGCTCAGCCGATTCCGGACCCTGATTGCTCTATTACCGAATATATTAGTCGCGCTTTTGAAATGATTGGTAATACCGCTGCGCAGGATATTACCGGCCATCCGGCCATGTCAATTCCGTGCGGTATGGTGGATGGCCTGCCGGTGGGTATGATGCTGGTTGGTCGCCATTATGCCGAAAATACCCTGTATCAGGCGGCCGCGGCCTTTGAAGCGTGTGGTGATTGGCGCACCTTTTAA(SEQ ID NO：2)。
SEQ ID NO:2所示核酸序列导入大肠杆菌中，可在大肠杆菌中表达Klebsiella酰胺酶AMD02。
合成得到的质粒干粉分别加入50μl蒸馏水溶解，取1μl转化BL21(DE3)感受态细胞，转化液涂布LB+Kan平板(10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L氯化钠，50μg/mL卡那霉素，15g/L琼脂粉)，37℃过夜培养。
实施例2酰胺酶AMD02的摇瓶诱导表达
分别挑取转化平板上的单菌落至5mL LB+Kan液体培养基(10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L氯化钠，50μg/mL卡那霉素)，37℃250rpm/min条件下过夜培养，约12h。
取过夜活化好的菌液，500μl转接至新鲜的50mL LB+Kan液体培养基，37℃250rpm/min条件下培养直至OD达到0.5-0.8。
取培养好的AMD02菌液，加入终浓度为1mM的IPTG，30℃250rpm/min条件下培养5h。
诱导结束后，收集全部菌液在8000prm/min、4摄氏度条件下离心收集菌体。取适当菌体破壁检测蛋白表达情况。
蛋白诱导情况见图1。
实施例3酰胺酶AMD02的50L罐上发酵
取实施例2中过夜活化好的菌液，1mL转接至新鲜的1000mL LB+Kan液体培养基，37℃250rpm/min条件下培养约10h后接种50L发酵罐(发酵培养基：一水葡萄糖121g，酵母浸粉500g，酵母蛋白胨250g，NaCl100g，Na2HPO4 25g，MgSO4.7H2O 20g，KH2PO4 100g，(NH4)2SO450g，一水柠檬酸55g，NaOH 75g，GPE消泡剂25mL。118℃灭菌30min，消后体积25L)。
基础培养阶段：控制培养温度37.0℃，通气量1:1vvm，通过搅拌和通气调节发酵液溶氧水平高于50％，罐压40～70Kpa。
补葡萄糖阶段：发酵液pH值反弹至7.15时开始补加葡萄糖溶液，初始补糖速率6.6g/L.h，每0.5h提升0.7g/L.h，葡萄糖补加速率提升至10.0g/L.h，维持此速率补加至诱导阶段。补葡萄糖阶段培养温度34.0℃，通气量1:1.3vvm，通过搅拌和通气调节发酵液溶氧水平高于30％。
诱导阶段：发酵液OD600值在30～35时，开始进行诱导，诱导时一次性打入终浓度1mM IPTG溶液。诱导前降低培养温度至30℃，诱导后葡萄糖补加速率3.3～3.6g/L.h，发酵液溶氧水平20％～50％。维持该速率直至发酵结束，诱导约15h。发酵结束后离心发酵液收集菌体，菌体置于-20℃保存。
实施例4酰胺酶AMD02的酶粉制备
喷干酶粉的制备：利用实施例3中获得的酰胺酶AMD02发酵液，量取500mL发酵液，于喷雾干燥箱(设置参数为进口温度170℃、出口温度80℃、进料流量700mL/h)中进行喷干，获得酰胺酶酶粉喷干酶粉。喷干酶粉置于4℃保存。
冻干酶粉的制备：利用实施例3中获得的酰胺酶AMD02发酵液，量取500mL发酵液样品离心，将菌体用生理盐水洗涤菌体后移去多余生理盐水，加入5％蔗糖溶液作保护剂。重悬菌体并置于冷冻舱里的隔板上，在超低温冰箱(－70℃)中预冷12h。随后在冷冻干燥机中冷冻干燥48h即得冻干酶粉。冻干酶粉置于4℃保存。
实施例5酰胺酶AMD02菌体催化合成右旋酮洛芬
取实施例3获得的4g酰胺酶AMD02菌体，用100mL 0.1M pH＝7.5磷酸钠缓冲液重悬，30℃下温浴10min，再将4g酰胺酮洛芬溶于10mL甲苯流加入反应瓶，保温反应。反应108h。加入6mL 2M盐酸终止反应和20mL二氯甲烷萃取，取萃取相200μL干燥。HPLC检测各组分含量。
样品处理：采用乙腈溶解,配制成1mg/ml。
检测条件：采用HPLC正相，色谱柱(Welch Topsil 5u C18 100A，4.6×150mm)，检测波长：250nm，柱温：25℃，进样量5ul,流动相：磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钾68.0g，加水溶解并稀释至1000ml，用磷酸调节pH值至3.5±0.1)-乙睛-水(2：43：55)，洗脱条件：等度洗脱，运行时间：25min。
e.e＝(右旋KP含量-左旋KP含量)/(右旋KP含量+左旋KP含量)。
转化率＝右旋KP含量/初始KPA含量。
KPA为底物酰胺酮洛芬,KP为产物酮洛芬。
HPLC检测图谱如图2所示，产物右旋KP的e.e值为100％，转化率50.89％。
实施例6酰胺酶AMD02酶粉催化合成右旋酮洛芬
取实施例4获得的0.8g酰胺酶AMD02喷干酶粉，用100mL 0.1M pH＝7.5磷酸钠缓冲液重悬，30℃下温浴10min，再将4g酰胺酮洛芬溶于10mL甲苯流加入反应瓶，保温反应。反应10h。加入6mL 2M盐酸终止反应和20mL二氯甲烷萃取，取萃取相200uL干燥。HPLC检测各组分含量，样品处理及检测方法同实施例5。
HPLC检测图谱如图3所示，，产物右旋KP的e.e值为100％，转化率50.85％。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
SEQUENCE LISTING
<110> 东莞市东阳光生物合成药有限公司
<120> 制备右旋酮洛芬的方法
<130> PIDC4190302
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 504
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 来源于Klebsiella的酰胺酶的氨基酸序列
<400> 1
Met Ala Ile Gln Arg Pro Thr Ala Glu Gln Leu Gln Glu Leu Ala Ser
1 5 10 15
Arg Leu His Ile Ser Leu Thr Thr Ala Gln Ala Glu Glu Tyr Leu Ala
20 25 30
Val Met Gln Ala Asn Phe Asp Ala Tyr Asp Leu Ile Asp Ser Leu Pro
35 40 45
Asp Asp Ile Pro Glu Val Arg Tyr Pro Arg Ala Ala Gly Tyr Arg Pro
50 55 60
Thr Gly Glu Asp Asn Pro Leu Asn Ala Trp Tyr Tyr Lys Thr Glu Val
65 70 75 80
Lys Gly Ala Ala Thr Gly Ala Leu Ala Gly Arg Thr Ile Ala Leu Lys
85 90 95
Asp Asn Val Ser Leu Ala Gly Val Pro Met Met Asn Gly Ala Ser Thr
100 105 110
Leu Glu Gly Phe Val Pro Ser Cys Asp Ala Thr Val Ala Thr Arg Leu
115 120 125
Leu Asp Ala Gly Ala Thr Ile Leu Gly Lys Ala Thr Cys Glu His Phe
130 135 140
Cys Leu Ser Gly Gly Ser His Thr Ser Asp Pro Ala Pro Val His Asn
145 150 155 160
Pro His Arg His Gly Tyr Ser Ser Gly Gly Ser Ser Ser Gly Ser Ala
165 170 175
Ala Leu Val Ala Ala Gly Glu Val Asp Met Ala Ile Gly Cys Asp Gln
180 185 190
Gly Gly Ser Ile Arg Ile Pro Ser Ala Phe Cys Gly Thr Tyr Gly Met
195 200 205
Lys Pro Thr His Gly Leu Val Pro Tyr Thr Gly Ile Met Pro Ile Glu
210 215 220
Ala Thr Ile Asp His Ala Gly Pro Ile Thr Ala Asn Val Arg Asp Asn
225 230 235 240
Ala Leu Met Leu Glu Thr Ile Ala Gly Ser Asp Gly Leu Asp Pro Arg
245 250 255
Gln Tyr Ala Pro Val Val Glu Ser Tyr Thr Ala Ala Leu Gly Lys Gly
260 265 270
Val Arg Gly Leu Lys Ile Gly Ile Leu Thr Glu Gly Phe Gln Leu Pro
275 280 285
Asn Met Asp Pro Gln Val Glu Thr Lys Val Arg Asp Ala Ile Ala Arg
290 295 300
Leu Gln Ala Leu Gly Ala Ile Val Ser Glu Ile Ser Val Pro Glu His
305 310 315 320
Asn Leu Ala Gly Ala Leu Trp Ser Pro Ile Gly Cys Glu Gly Leu Thr
325 330 335
Ala Gln Met Met His Gly Asn Gly Met Gly Phe Asn Trp Glu Gly Gln
340 345 350
Tyr Asp Val Ser Leu Leu Asp Lys His Ala Gln Trp Arg Asp Ser Ala
355 360 365
Asp Ala Leu Ser Pro Ser Leu Lys Val Cys Met Phe Val Gly Gln Tyr
370 375 380
Gly Leu Glu Arg Tyr Asn Gly Arg Tyr Tyr Ala Arg Ala Gln Asn Ile
385 390 395 400
Ala Arg Arg Ala Arg Ala Gly Tyr Asp Arg Ala Leu Ser Asp Phe Asp
405 410 415
Leu Leu Val Met Pro Thr Val Pro Val Leu Ala Gln Pro Ile Pro Asp
420 425 430
Pro Asp Cys Ser Ile Thr Glu Tyr Ile Ser Arg Ala Phe Glu Met Ile
435 440 445
Gly Asn Thr Ala Ala Gln Asp Ile Thr Gly His Pro Ala Met Ser Ile
450 455 460
Pro Cys Gly Met Val Asp Gly Leu Pro Val Gly Met Met Leu Val Gly
465 470 475 480
Arg His Tyr Ala Glu Asn Thr Leu Tyr Gln Ala Ala Ala Ala Phe Glu
485 490 495
Ala Cys Gly Asp Trp Arg Thr Phe
500
<210> 2
<211> 1515
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 可在大肠杆菌中表达Klebsiella酰胺酶AMD02的核酸的核苷酸序列
<400> 2
atggcaattc agcgtccgac cgcagaacag ctgcaggaac tggcaagccg tctgcatatt 60
agcctgacca ccgcacaggc ggaagaatat ctggctgtga tgcaggctaa ttttgatgca 120
tatgatctga ttgatagtct gccggatgat attccggaag tgcgctatcc gcgtgcagca 180
ggttatcgtc cgaccggcga agataatccg ctgaatgcat ggtattataa aaccgaagtg 240
aaaggtgcag ctaccggtgc actggctggc cgcaccattg ccctgaaaga taatgtttct 300
ctggccggcg tgccgatgat gaatggcgcc agtaccctgg aaggctttgt tccgagttgc 360
gatgcgaccg ttgcaacccg tctgctggat gccggcgcca ccattctggg taaagcgacc 420
tgcgaacatt tttgcctgag cggtggttct catacctcag atccggcccc ggttcataat 480
ccgcatcgcc acggttattc tagcggcggc agttcatctg gtagtgcggc actggtggct 540
gcaggtgaag tggatatggc gattggctgt gatcagggcg gcagcattcg cattccgtct 600
gcgttttgcg gtacctatgg catgaaaccg acccacggtc tggttccgta taccggcatt 660
atgccgattg aagctaccat tgatcatgct ggcccgatta ccgcgaatgt tcgtgataat 720
gctctgatgc tggaaaccat tgcaggttct gatggtctgg accctcgcca gtatgcgccg 780
gttgtggaat catataccgc agcgctgggc aaaggtgttc gcggtctgaa aattggtatt 840
ctgaccgaag gttttcagct gccgaatatg gaccctcagg tggaaaccaa agttcgtgat 900
gcgattgccc gtctgcaggc actgggcgcg attgtttctg aaatttctgt tccggaacat 960
aatctggctg gtgcactgtg gtcaccgatt ggctgtgaag gcctgaccgc ccagatgatg 1020
catggtaatg gcatgggctt taattgggaa ggccagtatg atgtttcact gctggataaa 1080
catgcccagt ggcgtgattc agcagatgca ctgagtccgt cactgaaagt gtgtatgttt 1140
gttggccagt atggtctgga acgctataat ggccgttatt atgctcgtgc acagaatatt 1200
gcgcgtcgtg ctcgtgcagg ctatgatcgc gctctgagtg attttgatct gctggtgatg 1260
ccgaccgtgc cggtgctggc tcagccgatt ccggaccctg attgctctat taccgaatat 1320
attagtcgcg cttttgaaat gattggtaat accgctgcgc aggatattac cggccatccg 1380
gccatgtcaa ttccgtgcgg tatggtggat ggcctgccgg tgggtatgat gctggttggt 1440
cgccattatg ccgaaaatac cctgtatcag gcggccgcgg cctttgaagc gtgtggtgat 1500
tggcgcacct tttaa 1515

Claims (9)

1.一种用于右旋酮洛芬的合成的酶组合，其特征在于，包括：腈水合酶和酰胺酶，所述酰胺酶来源于Klebsiella。
2.根据权利要求1所述的酶组合，其特征在于，所述酰胺酶具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
3.一种制备右旋酮洛芬的方法，其特征在于，使酰胺酮洛芬在酰胺酶的催化下进行脱氨基反应，以便获得右旋酮洛芬，所述酰胺酶来源于Klebsiella。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述酰胺酶具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述酰胺酶是以酰胺酶发酵菌体的形式提供的。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述酰胺酶发酵菌体是通过如下方式获得的：
将转化有质粒的大肠杆菌菌体进行活化处理，所述质粒中携带表达酰胺酶的核酸序列；
将活化处理后菌液进行基础发酵培养，以便获得OD600为30～35的基础发酵培养菌液；
将所述基础发酵培养菌液进行诱导培养，所述诱导培养是在IPTG存在的条件下进行的，所述诱导培养的时间为14～16h。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述酰胺酮洛芬与酰胺酶发酵菌体的质量比为(0.5～3)：1。
8.根据权利要请求6所述的方法，其特征在于，进一步包括将酰胺酶发酵菌体进行干燥处理，以便获得菌体干粉；
优选的，所述酰胺酮洛芬与酰胺酶发酵菌体干粉的质量比为(2～6)：1。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酰胺酮洛芬是通过使氰基酮洛芬在腈水合酶的催化下进行酰胺化反应获得的。
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