JP2002520065A

JP2002520065A - ケトンの立体選択的還元的アミノ化

Info

Publication number: JP2002520065A
Application number: JP2000560276A
Authority: JP
Inventors: メアリー・ジョー・ドノバン; スティーブン・ゴールドバーグ; ロナルド・エル・ハンソン; ポール・エイ・ジャス; ウェン−セン・リ; ラメシュ・エヌ・ペイテル; キース・ラミグ; ラズロ・ジェイ・サーカ; ジョン・ジェイ・ベニット
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 1998-07-15
Filing date: 1999-07-07
Publication date: 2002-07-09
Also published as: AU755530B2; HUP0105062A2; CA2337230A1; US6140088A; IL140898A0; HUP0105062A3; WO2000004179A1; EP1097236A4; AU4973599A; TWI226372B; EP1097236A1; KR20010071908A

Abstract

(57)【要約】ある種のケトカルボン酸誘導体を立体選択的に酵素的変換して対応のアルキルアミノ酸化合物を製造する方法を記載する。本発明はまた、フェニルアラニンデヒドロゲナーゼを発現しうる組換え核酸を含有する遺伝子操作した酵母宿主細胞、並びにフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ酵素を発現しうる組換え核酸およびギ酸デヒドロゲナーゼ酵素を発現しうる核酸を含有する遺伝子操作した宿主細胞にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（技術分野）本発明は、立体選択的な酵素的還元的アミノ化プロセスに関する。

【０００２】（背景技術）米国特許第５,５０８,２７２号のRoblは、式：

【化１５】（式中、Ａは式：

【化１６】である）で示される化合物を中性エンドペプチダーゼおよびアンジオテンシン変
換酵素阻害活性を有するものとして開示している。これら化合物のなかには、[
４Ｓ−[４α(Ｒ^＊),７α,１０αβ]]−オクタヒドロ−４−[(２−メルカプト−
１−オキソ−３−フェニルプロピル)アミノ]−５−オキソ−７Ｈ−ピリド[２,１
−ｂ][１,３]チアゼピン−７−カルボン酸が含まれ、これは現在、臨床評価を受
けている段階である。

【０００３】 Roblは、この化合物のアミノラクタム部分、すなわち式：

【化１７】で示される中間体が、(Ｓ)−２−アミノ−６,６−ジメトキシヘキサン酸メチル
エステルなどのアルキルエステル化合物を式：

【化１８】（式中、Ｐ_１はアミノ保護基であり、Ｐ_２は硫黄保護基である）で示されるＮ−
保護アミノ酸とカップリングさせて式：

【化１９】で示されるジペプチドを得ることにより調製できることを開示している。Ｐ_２保
護基を除去した後、酸触媒環化ついでＰ_１保護基を除去すると、[４Ｓ−(４α,
７α,１０αβ)]−オクタヒドロ−４−アミノ−５−オキソ−７Ｈ−ピリド[２,
１−ｂ][１,３]チアゼピン−７−カルボン酸メチルエステルが得られる。

【０００４】 Roblは、Ｎ−保護Ｌ−ε−ヒドロキシノルロイシンをそのメチルエステルに変
換し、対応のアルデヒド、たとえば式：

【化２０】で示されるものに酸化し、ついで強い酸触媒の存在下でオルトギ酸トリメチルと
反応させ、ついでＰ_３保護基を除去することにより、(Ｓ)−２−アミノ−６,６
−ジメトキシヘキサン酸メチルエステルなどの(Ｓ)−２−アミノ−６,６−ジア
ルコキシヘキサン酸アルキルエステルを調製することを開示している。

【０００５】（発明の開示）本発明は、ある種のケトカルボン酸誘導体を立体選択的に酵素的変換して対応
のアルキルアミノ酸化合物を生成する方法を提供する。本発明の酵素的方法によ
って調製したアミノ化合物は、Ｎ−(トリフルオロアセチル)−Ｌ−ホモシステイ
ン,(１→１')−ジスルフィドなどの化合物を用いて対応の(Ｓ)−２−アミノ−６
,６−ジアルコキシヘキサン酸アルキルエステルまたはそのような化合物の安定
な塩、たとえばリン酸塩、シュウ酸塩または二塩に都合よく変換することができ
る。

【０００６】さらに詳しくは、本発明は、式（式Ｉ）：

【化２１】（式中、Ｒ^１は水素または一価カチオンまたはＣ_１−Ｃ_１８アルキル（好ましく
はＣ_１−Ｃ_１０アルキル、さらに好ましくは低級アルキル）、Ｒ^２は式：

【化２２】で示される残基、式：

【化２３】（式中、各Ｒ^３はＣ_１−Ｃ_１８アルキル（好ましくはＣ_１−Ｃ_１０アルキル、さ
らに好ましくは低級アルキル））で示される残基、または式：

【化２４】（式中、各Ｒ^４はＨまたはＲ^３）で示される残基）で示されるアルキルアミノ酸
化合物の製造方法に関し、該方法は、式（式II）：

【化２５】（式中、Ｒ^２は前記と同じ、Ｒ^１は前記と同じ）で示されるアルキルケト化合物
をアンモニアおよび補因子の存在下、式Ｉの化合物の生成に適した条件下でアミ
ノ酸デヒドロゲナーゼに接触させることを含む。

【０００７】本発明はまた、フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ酵素を発現しうる組換え核
酸およびギ酸デヒドロゲナーゼ酵素を発現しうる内生または組換え核酸を含む遺
伝子操作した酵母宿主細胞に関する。

【０００８】（発明の詳細な記載）上記式において、一価カチオンは、たとえばリチウム、カリウム、ナトリウム
、アンモニウムなどであってよい。Ｒ^１は水素、アンモニウム、リチウムまたは
カリウムであるのが好ましく、Ｒ^２は式：

【化２６】で示されるジオキソラン残基であるのが好ましい。Ｒ^３は低級アルキル、とりわ
けメチルであるのが好ましい。

【０００９】本発明の最も好ましい還元的アミノ化法は、還元的アミノ化による５−(１,３
−ジオキソラン−２−イル)−２−オキソ−ペンタン酸の５−(１,３−ジオキソ
ラン−２−イル)−２Ｓ−アミノ−ペンタン酸（Ｌ−アリシンエチレンアセター
ル）への変換であり、これは以下のように表される。

【化２７】（式中、Ｒ^１は水素またはリチウム）。

【００１０】本明細書において単独または他の基の一部として使用する「アルキル」なる語
は、任意に置換された（しかしながら、置換されないのが好ましい）、好ましく
は主鎖中に１〜１０個の炭素を有する直鎖および分枝鎖飽和炭化水素基を意味す
る。置換されていないそのような基の例としては、メチル、エチル、プロピル、
イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、イ
ソヘキシル、ヘプチル、４,４−ジメチルペンチル、オクチル、２,２,４−トリ
メチルペンチル、ノニル、デシルなどが挙げられる。アルキル基は本発明におい
て使用するのに適した化合物を提供する適当な置換基で置換されていてよい。ア
ルキル基の置換基の例としては、１またはそれ以上、好ましくは３またはそれ以
下の塩素基、臭素基、またはヨード基が挙げられる。本明細書において使用する「低級アルキル」なる語は、１〜３個の炭素原子を
有するアルキル基を意味する。

【００１１】本発明の還元的アミノ化法は、鏡像異性体特異的な結果が得られるという利点
を有する。本発明の方法は、好ましい鏡像異性体と好ましくない鏡像異性体との
ラセミ混合物よりも（Ｓ）鏡像異性体を主として生成する。特定の態様のさらな
る利点としては、たとえば、多工程の化学合成と比較して単一工程での鏡像異性
体特異的還元が挙げられる。また、とりわけ約４０℃にて周囲圧で還元を触媒し
た場合に、ケトン化合物から対応アミン化合物の所望の鏡像異性体への高変換、
および該アミン化合物の高鏡像異性体純度が得られる。

【００１２】酵素的な変換法に関し、Ｒ^１がＬｉなどの一価カチオンである場合は、単離手
順は一般にｐＨの低下を含み、これはカチオンをＨに変換する。本発明において使用するアミノ酸デヒドロゲナーゼは、本明細書に記載する立
体選択的な酵素的還元的アミノ化を触媒しうるものであればいかなるアミノ酸デ
ヒドロゲナーゼであってもよい。酵素源としての酵素的または微生物的材料は、
遊離の形態かまたは物理的吸着や包括などにより支持体上に固定化して使用して
よい。

【００１３】適当な酵素は、その由来または純度に係りなく、アミノ酸デヒドロゲナーゼと
称される酵素である。使用する酵素は、たとえば、菌体浮遊液をホモジナイズし
、ついで分解し、遠心分離し、ＤＥＡＥ−セルロースクロマトグラフィーにかけ
、硫酸アンモニウム分画し、セファクリル（アリルデキストランとＮ,Ｎ'−メチ
レンビスアクリルアミドとの架橋コポリマー）クロマトグラフィーなどのゲル濾
過媒体を用いたクロマトグラフィーにかけ、ついでモノＱ（第四級アミン基によ
り負に荷電した生体分子を結合する陰イオン交換体）クロマトグラフィーなどの
イオン交換クロマトグラフィーにかけることにより単離した酵素であってよい。

【００１４】別の態様として、本発明の還元的アミノ化法は酵素源として完全な菌体または
菌体抽出物を用いてよい。微生物の使用に関しては、本発明の方法は、本明細書
に記載する立体選択的な酵素的還元を触媒しうる適当な微生物材料を用いて行う
ことができる。たとえば、菌体は、完全な湿潤菌体または凍結乾燥した菌体、噴
霧乾燥した菌体もしくは加熱乾燥した菌体などの乾燥菌体の形態、または破砕し
た菌体もしくは菌体抽出物などのような処理した菌体材料の形態で用いてよい。
適当な微生物としては、細菌、酵母および真菌の種、たとえば、Bacillus種、た
とえばB. subtilis、Sporosarcina種、Thermoactinomyces種、たとえばT. inter
mediusなどが挙げられる。

【００１５】遺伝的に操作した微生物の使用もまた包含される。宿主細胞は、本明細書に記
載する触媒をなし得る１またはそれ以上のアミノ酸デヒドロゲナーゼを発現する
単一もしくは複数の遺伝子を含むように修飾した菌体、たとえば、Escherichia
coli、Pichia pastorisなどであってよい。以下にさらに詳細に説明するように、本発明のある種の好ましい遺伝子操作し
た微生物はまた、補因子（ギ酸デヒドロゲナーゼなど）を再生する第二の酵素を
も発現する。この第二の酵素をコードする核酸は、内生のものであるか、または
組換え法により菌体中に遺伝子操作したもののいずれであってもよい。

【００１６】 Pichia属、とりわけPichia pastoris種、特にPichia pastoris ＡＴＣＣ７４
４０８およびPichia pastoris ＡＴＣＣ７４４３３株の微生物を用いるのが特に
好ましい。他の好ましい微生物は、E. coliＡＴＣＣ９８３７４である。本明細
書において使用する「ＡＴＣＣ」なる語は、本明細書において言及する微生物の
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（特許寄託（Patent Depositor
y）、バージニア２０１１０−２２０９、マナサス、ユニバーシティー・ブール
バード、１０８０１番）寄託の受託番号をいう。Pichia pastoris ＡＴＣＣ７４
４０８は、ブダペスト条約の規定の下、ＡＴＣＣに１９９７年３月２６日に寄託
してある。Pichia pastoris ＡＴＣＣ７４４３３は、ブダペスト条約の規定の下
、ＡＴＣＣに１９９８年２月１３日に寄託してあり、E. coli ＡＴＣＣ９８３７
４は、ブダペスト条約の規定の下、ＡＴＣＣに１９９７年３月２６日に寄託して
ある。本発明において菌体抽出物またはこれら微生物から単離した酵素を用いる
のもまた特に好ましい。

【００１７】本発明の立体選択的な酵素的還元法は、使用した微生物の発酵後に行うことも
できるし（２工程の発酵および還元）、または微生物の発酵と同時に行うことも
でき、後者の場合はその場での（in situ）発酵および還元（単一工程の発酵お
よび還元）による。単一工程法では、微生物の充分な増殖が達成されるまで微生
物を適当な培地で増殖させる。ついで、式IIの化合物を微生物の培養液に加え、
好ましくは完全な変換が得られるまで発酵とともに立体選択的な酵素的還元を継
続させる。

【００１８】２工程法では、微生物を第一の工程において適当な培地で所望の酵素（すなわ
ち、還元的アミノ化）活性が示されるまで増殖して発酵させる。引き続き、菌体
を遠心分離により回収し、回収した菌体を適当な緩衝液に浮遊させることにより
微生物菌体の浮遊液を調製する。トリス−ＨＣｌ、リン酸、酢酸ナトリウムなど
の緩衝液を用いることができる。微生物菌体の浮遊液を調製するのに水を用いる
こともできる。第二の工程において、式IIの化合物を微生物菌体の浮遊液と混合
し、微生物菌体の浮遊液により触媒して該化合物の立体選択的な酵素的還元を行
う。還元は、すべてまたは殆どすべての式IIの化合物が立体選択的に還元される
まで行うのが好ましい。

【００１９】微生物の増殖は、適当な培地を用いることにより当業者によって行うことがで
きる。微生物の増殖に適した培地としては、微生物菌体の増殖に必要な栄養素を
提供するものが挙げられる。増殖のための典型的な培地は、必要な炭素源、窒素
源、および微量元素を含む。インデューサーを加えてもよい。本明細書において
使用する「インデューサー」なる語は、微生物菌体内での所望の酵素的還元的ア
ミノ化活性の生成を促進する化合物、たとえばケト基を含有する化合物などを包
含する。式Ｉの化合物を微生物の増殖の際にインデューサーとして加えてよい。
遺伝的に操作した酵母および細菌培養液については、メタノールおよびイソプロ
ピルベータガラクトシド（ＩＰＴＧ）がそれぞれ良好なインデューサーである。

【００２０】炭素源としては、マルトース、乳糖、グルコース、フルクトース、グリセロー
ル、ソルビトール、ショ糖、デンプン、マンニトール、プロピレングリコールな
どの糖類；ギ酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムなどの有機酸
；グルタミン酸ナトリウムなどのアミノ酸；メタノール、エタノール、プロパノ
ールなどのアルコールが挙げられる。

【００２１】窒素源としては、Ｎ−ＺアミンＡ、コーンスティープリッカー（corn steep l
iquor）、ソイビーンミール（soy bean meal）、牛肉エキス、酵母エキス、イー
スタミン（yeastamine）、糖蜜、パン酵母、トリプトン、ニュートリソイ（nutr
isoy）、ペプトン、亜硝酸ナトリウム、硫酸アンモニウムなどが挙げられる。微量元素としては、リン酸、およびマグネシウム、マンガン、カルシウム、コ
バルト、ニッケル、鉄、ナトリウムおよびカリウム塩が挙げられる。使用する培地は、１を超える炭素源または窒素源または他の栄養素を含んでい
てよい。

【００２２】 Thermoactinomyces種に好ましい培地は、以下の成分（重量％）を有する水性
培地である。成分Ｌ−フェニルアラニン０.５％ＮＺアミンＡ２％酵母エキス０.５％Ｋ_２ＨＰＯ_４０.２％ＮａＨ_２ＰＯ_４０.１％ＭｇＳＯ_４・Ｈ_２Ｏ０.０２％界面活性剤（antifoam）０.０２％（たとえばＳＡＧ５６９３）ｐＨ６.５−６.９

【００２３】 E. coliに好ましい培地は、以下の成分（重量％）を有する水性培地である。成分ＮＺアミンＡ１％イースタミン２％グリセロール２％Ｎａ_２ＨＰＯ_４０.６％Ｋ_２ＨＰＯ_４０.３％ (ＮＨ_４)_２ＳＯ_４０.１２５％プロピレングリコール０.０５％ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ０.０２４６％カナマイシン０.００５％イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド０.００２３８％ｐＨ７.０−７.２

【００２４】酵母に好ましい培地は、以下の成分（重量％）を有する水性培地である。培地１：成分アミノ酸不含の酵母窒素ベース１.３４％ペプトン２.０％酵母エキス１.０％グリセロール１.０％メタノール０.５％Ｋ_２ＨＰＯ_４０.２８２％ＫＨ_２ＰＯ_４１.１４％ビオチン４×１０^−５％界面活性剤０.０１％（すなわちＡ２８９）ｐＨ６.０培地１で酵母を増殖するに際しては、必要に応じてメタノールを供給すること
によりメタノール濃度を約０.５％に保持した。

【００２５】培地２：成分ペプトン２.０％酵母エキス１.０％グルコース２.０％界面活性剤Ａ２８９０.０１％ｐＨ６.０培地のｐＨを、特定の培地（たとえば、１２１℃の温度で３０分間滅菌したも
の）に依存して約６〜８に調節し、ついで滅菌後に所望のｐＨに調節するのが好
ましい。

【００２６】本発明の方法は、式Ｉの化合物を生成するのに適した条件下で行う。培地のｐ
Ｈは、微生物の増殖に際して好ましくは約４〜１０、さらに好ましくは約６〜８
に保持する。立体選択的な還元法に際しては、酵素を用いるにせよ微生物を用い
るにせよｐＨを約７〜９.５、好ましくは約８に保持する。

【００２７】温度は立体選択的な還元法に利用できる熱エネルギーの基準であり、この方法
に充分なエネルギーが利用できることを保証すべく維持しなければならない。本
発明の方法に適した温度範囲は、約１５℃〜約６０℃である。好ましい温度は約
２５℃〜約４０℃である。圧力については本発明を行うに際して重要であるか否かは判明しておらず、便
宜上、大気圧を典型的に用いる。

【００２８】微生物を増殖させる場合は、本発明の方法は好気的条件下で行うのが好ましい
。反応混合物の攪拌および通気は、発酵プロセスおよび立体選択的な還元プロセ
スの際に利用できる酸素の量に影響を及ぼし、単一工程または２工程プロセスで
の微生物の増殖の際にたとえば振盪フラスコ培養または発酵タンクで行うことが
できる。５０〜５００ＲＰＭの範囲の攪拌が好ましく、５０〜１００ＲＰＭが最
も好ましい。１分間当たり、培地１容量当たりに約０.１〜１０容量の空気の通
気（０.１〜１０ｖ／ｖ／分）が好ましく、１分間当たり、培地１容量当たりに
約５容量の空気の通気（５ｖ／ｖ／分）が最も好ましい。

【００２９】還元プロセスを微生物の増殖後の第二の段階で行う場合は、酸素が必要か否か
は判明しておらず、有害であるかもしれない。式IIの化合物の完全な変換には、式IIの化合物を本明細書に記載する酵素また
は微生物で最初に処理した時点から測定して、たとえば約４〜４８時間、好まし
くは約１２〜３０時間を要する。

【００３０】本発明の立体選択的な酵素的還元法は、補因子を用いて行う。補因子は、ケト
酸の還元のためのメディエーター（mediator）として働く。補因子の量は、通常
、約０.０５〜約２ｍＭ、好ましくは約０.５〜約１ｍＭである。本発明において
有用な補因子は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、還元型Ｎ
ＡＤ（ＮＡＤＨ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）
、および還元型ＮＡＤＰ（ＮＡＤＰＨ）である。最も好ましいのはＮＡＤＨであ
る。補因子の使用は単離酵素を用いる場合に必要である。たとえば、ＮＡＤＨは
再生され、再利用される。補因子をその場で（in situ）再生するのが好ましい
。再生のための好ましい手段は、補因子を再生する第二のタイプの酵素、たとえ
ば、ギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）、グルコースデヒドロゲナーゼ、アルコー
ルデヒドロゲナーゼなどである。適当な水素ドナーとしては、分子状水素、グル
コース、エタノールまたはギ酸塩（たとえば、ギ酸のアルカリ金属塩またはアン
モニウム塩）が挙げられる。

【００３１】化学的な還元（たとえば、亜ジチオン酸の使用）またはビオロゲン、たとえば
メチルビオロゲンの存在下での電気化学的な還元もまた用いることができる。好
ましい態様において、反応に際して産生されたＮＡＤは、ＦＤＨを用いたギ酸の
二酸化炭素への酸化により、またはグルコースデヒドロゲナーゼを用いたグルコ
ースのグルコン酸への酸化により、ＮＡＤＨに再利用されるのが好ましい。好ま
しい態様において、単一の宿主細胞株をＰＤＨおよびＦＤＨの両者の源として用
いる。特に好ましい態様において、組換えまたは遺伝子操作した宿主細胞を、ア
ミノ酸デヒドロゲナーゼ、とりわけＰＤＨの源として、およびＦＤＨの源として
用いる。予期しないことに、本発明に使用するのに好ましい微生物、すなわちPi
chia pastoris、ＡＴＣＣ７４４０８は、組換えＰＤＨを発現すべく遺伝子操作
されているのみならず、内生のＦＤＨ活性レベルもまた増大していることが見出
された。本発明に使用するのに適した他の微生物、すなわちPichia pastoris Ａ
ＴＣＣ７４４３３は、組換えＰＤＨおよび組換えＦＤＨの両者を発現すべく遺伝
子操作されている。

【００３２】有機液、または混和性のまたは非混和性の（２相）有機／水性液混合物も用い
ることができるが、水性液を反応媒体として用いるのが好ましい。式IIの出発物質化合物および反応媒体の合計重量に基づいて０.１〜２５重量
％の式IIの化合物を用いるのが好ましい。出発物質に対して使用する酵素または
微生物の量は、本発明の立体選択的な酵素的還元の触媒が可能となるように選択
する。

【００３３】本発明の立体選択的な還元プロセスの生成物は、所望なら抽出、蒸留、結晶化
、カラムクロマトグラフィーなどの知られた方法により単離および精製すること
ができる。反応媒体の残留化合物から式Ｉの所望の化合物を分離するのに好ましい方法は
、水分を除去して濃縮し、ついでメタノールを加えてアミノ酸を析出することで
ある。

【００３４】本発明において有用な好ましいアミノ酸デヒドロゲナーゼは、上記式IIのケト
ンに対して活性のアミノ酸デヒドロゲナーゼから選択する。そのようなアミノ酸
デヒドロゲナーゼとしては、アラニンデヒドロゲナーゼ、フェニルアラニンデヒ
ドロゲナーゼ、ロイシンデヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、バ
リンデヒドロゲナーゼなどが挙げられる。本発明はまた、とりわけ全菌体または
粗製の抽出物を用いる場合には、２またはそれ以上のアミノ酸デヒドロゲナーゼ
の使用をも包含する。本発明において有用なアミノ酸デヒドロゲナーゼは、典型
的に様々な植物、動物、および微生物由来のものである。あるいは、本発明にお
いて有用な酵素は、当業者に知られた方法による合成手段、すなわちその成分ア
ミノ酸からのポリペプチドの化学的合成により得ることもできる。たとえば、Ho
ughtonらのProc.Natl.Acad.Sci.82,5131-5135(1985)に記載された固相法を用い
ることができる。これら酵素は、所望の酵素（内生のまたは組換えの酵素）をコ
ードするＤＮＡ配列を発現する原核または真核宿主細胞での産生により、または
所望の酵素の全体または一部をコードするＤＮＡ配列によりコードされるｍＲＮ
Ａのインビトロ翻訳により、得ることができる。これら手段によるポリペプチド
製造の技術は当該技術分野で知られており、本明細書に記載してある。本発明に
おいて有用な酵素の特定の例示としては、これらに限られるものではないが、ウ
シ肝臓グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、Bacillus subtilisからのアラニンデヒ
ドロゲナーゼ、Sporosarcina種からのフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ、Baci
llus sphaericus ＡＴＣＣ４５２２からのロイシンデヒドロゲナーゼ、Thermoac
tinomyces intermedius ＡＴＣＣ３３２０５からの抽出物（フェニルアラニンデ
ヒドロゲナーゼ、アラニンデヒドロゲナーゼおよびロイシンデヒドロゲナーゼの
源）などが挙げられる。

【００３５】本発明の方法はアンモニアを必要とする。アンモニアが必要なのは、それがア
ミノ酸化合物（すなわち、式Ｉの化合物）のためのアミノ基を供給するからであ
る。アンモニア源としては、ＮＨ_４ＯＨ、尿素とウレアーゼ、およびＨＣＯＯＮ
Ｈ_４が挙げられる。アンモニアの量は、典型的にケト酸化合物（すなわち、式II
の化合物）の量と等モルかまたはそれ以上である。

【００３６】酵素的還元的アミノ化プロセスの条件は、使用した酵素の種類により大きく変
わりうる。たとえば、Thermoactinomyces／ギ酸デヒドロゲナーゼの組合せの場
合は、約３５℃〜約４５℃、好ましくは約４０℃の温度で、約１２〜約４８時間
、好ましくは約２５時間の反応時間が典型的に適している。

【００３７】本発明の方法は、高収率の式Ｉの化合物という結果となる。典型的な収率は約
８０％よりも大きく、好ましくは約９０％よりも大きく、さらに好ましくは約９
５％よりも大きく、最も好ましくは約９９％よりも大きい。本発明の方法はまた
、優れた光学純度、すなわち、所望でない（Ｒ）鏡像異性体に比べて所望の（Ｓ
）鏡像異性体の産生という結果となる。典型的な光学純度は、約９５％よりも高
く、好ましくは約９９％よりも高い。

【００３８】本発明の還元的アミノ化プロセスにより製造された化合物（たとえば、Ｌ−ア
リシンエチレンアセタール）は、米国特許第５,５０８,２７２号（その全体を参
照のため本明細書中に引用する）に開示されているエステル誘導体に容易に変換
することができる。このエステル誘導体は、米国特許第５,５０８,２７２号に開
示されているように、心血管疾患の治療のためのアンジオテンシン変換酵素（Ａ
ＣＥ）および中性エンドプロテアーゼ（ＮＥＰ）の両者を阻害するバソペプチダ
ーゼインヒビターを調製するための構築材料である。それゆえ、本発明はまた、
式Ｉのジオキソランアセタール含有化合物を対応エステル誘導体に変換する任意
の工程をも包含する。さらに詳しくは、この任意のエステル化の追加工程は、ジ
オキソランアセタール残基、すなわち、Ｒ^２が式：

【化２８】で示される残基（もし存在するなら）、または式：

【化２９】で示される残基（もし存在するなら）、または式：

【化３０】で示される残基であるものをジアルコキシアセタールと交換し、ついでカルボン
酸（もし存在するなら）をアルキルエステルに変換して所望の化合物、（Ｓ）−
２−アミノ−６,６−ジアルコキシヘキサン酸アルキルエステルとすることを含
む。このことは、化合物Ｉをメタノールまたは高級アルコールなどの適当な溶媒
中で塩化チオニルと反応させるか、または化合物Ｉをメタノールなどの適当な溶
媒中で無水ＨＣｌ（気体としてまたはＴＭＳＣｌからまたは相当の手段により得
たもの）および亜硫酸ジメチルと反応させて、式（式III）：

【化３１】（式中、各Ｒ^５はＣ_１−Ｃ_１８アルキル（好ましくはＣ_１−Ｃ_１０アルキル、さ
らに好ましくは低級アルキル、最も好ましくはメチル））で示されるエステル化
合物を生成することにより行うことができる。

【００３９】上記エステル化工程において、条件が重要であるか否かは判明しておらず、た
とえば、約０〜約４５℃、好ましくは約３５〜約４０℃の温度で、約８〜約７２
時間、好ましくは約６〜約９時間の反応時間が一般に適当である。この工程は、
ＨＣｌ、窒素またはアルゴンなどの雰囲気で行うのが好ましい。この反応の結果
は、完全なアミノ基かまたはアミノ塩のいずれかとなり、そのいずれもRoblに記
載の反応に用いることができる。

【００４０】本発明の酵素的還元的アミノ化プロセスのためのケト出発物質を調製するため
、式（式ＩＶ）を有するハロアルキル化合物（式中、ｎは０〜５（好ましくは２
）、ＸはＣｌ、ＢｒまたはＩ（好ましくはＢｒ））を出発物質として用いる。好
ましくは式ＩＶのブロモ誘導体をマグネシウムと反応させて式ＩＶの化合物のオ
ルガノマグネシウム誘導体を生成させ、ついで該誘導体をテトラヒドロフラン（
ＴＨＦ）中、低温にてシュウ酸ジエチル（好ましい）またはシュウ酸ジメチルな
どのアルファジカルボニル化合物と反応させて式IIを有する化合物のエステル（
メチルまたはエチル）を得る。ついで、式IIのエステル誘導体をスキーム１に示
すように鹸化してＲ^１＝Ｈである式IIの誘導体を得るか、またはさらに好ましく
はスキーム２に示すように鹸化してＲ^１＝Ｌｉである式IIの誘導体として単離す
る。

【化３２】

【００４１】式ＩＶにおいてｎが２または３であるハロ誘導体は、ＨＢｒを適当な出発物質
（テトラヒドロフランまたはテトラヒドロピラン）と反応させ、標準条件を用い
て酸化してアルデヒドとし、最後にハロアルデヒドを適当なアルコール（メチル
、エチルまたはプロピル）またはジオール（エチレングリコール、１,３−ジヒ
ドロキシプロパン、１,３−ジヒドロキシ−２,２−ジメチルプロパン）と反応さ
せて式ＩＶの化合物を得ることにより調製することができる。別法として、式II
の化合物はまた、スキーム１または２に示す化学を用いて適当な市販のハロアル
コール、アルデヒドまたはアセタールから出発して調製できる。

【００４２】スキーム１

【化３３】

【００４３】本発明の他の製造法の例を以下（スキーム２）に示す。スキーム２

【化３４】

【００４４】 Roblの米国特許第５,５０８,２７２号に記載されているように、本発明の方法
により製造された化合物（本発明の式IIIの化合物またはRoblの式ＸＸIIIの化合
物）またはその酸付加塩、たとえば（Ｓ）−２−アミノ−６,６−ジメトキシヘ
キサン酸メチルエステルは、式（式Ｖ）：

【化３５】で示されるＮ−保護アミノ酸とカップリングさせて式（式ＶＩ）：

【化３６】（式中、Ｐ_１はベンジルオキシカルボニルやｔ−ブチルオキシカルボニルなどの
アミノ保護基またはフタルイミドなどのようなＮ−原子といっしょになって保護
基を形成する基、Ｐ_２はアセチルやベンゾイルなどのメルカプト保護基）で示さ
れるジペプチドを得ることができる。このカップリング反応は、ベンゾトリアゾ
ール−１−イルオキシトリス(ジメチルアミノ)ホスホニウムヘキサフルオロホス
フェート、エチル−３−(３−ジメチルアミノ)プロピルカルボジイミド、ジシク
ロヘキシルカルボジイミド、または１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−オール、メ
タンスルホン酸エステルなどのカップリング試薬の存在下で行うのが好ましい。

【００４５】Ｐ_２保護基は、メタノール中のナトリウムメトキシドで処理するかまたはメタ
ノール中のｐ−トルエンスルホン酸で処理することにより式ＶＩのジペプチドか
ら選択的に除去する。ついで、得られたメルカプタン化合物を、好ましくはトリ
フルオロ酢酸、ｐ−トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸などの強酸、または
Amberlyst15^Rなどの市販のポリスチレンスルホネートポリマー型のイオン交換樹
脂で処理することにより酸触媒環化反応に供する。この環化反応は、塩化メチレ
ンやクロロホルムなどの非プロトン溶媒中で行うことができ、式（式ＶII）：

【化３７】で示されるラクタムを得る。

【００４６】ついで、式ＶIIのラクタムを処理してＰ_１のＮ−保護基を除去し、ついで式（
式ＶIII）：

【化３８】（式中、Ｒ_６はメチルまたはフェニル）で示されるアシルメルカプトアルカノイ
ル側鎖と反応させて式（式ＩＸ）：

【化３９】で示される化合物を得る。

【００４７】このカップリング反応は、塩化メチレンなどの有機溶媒中、１−エチル−３−
(３−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド、ジシクロヘキシルカルボジイミ
ド、またはカルボニルジイミダゾールなどのカップリング試薬の存在下で行うこ
とができる。別法として、カップリングする前に式ＶIIIのアシルメルカプトア
ルカン酸を酸クロライド、混合酸無水物、対照酸無水物、活性エステルなどの活
性形に変換することができる。

【００４８】式ＶIIのラクタムからのＰ_１Ｎ−保護基の除去は、たとえば、Ｐ_１がＮ−原
子といっしょになってフタルイミド基を形成している場合にはヒドラジン一水和
物で処理することにより、またはＰ_１がベンジルオキシカルボニルである場合に
はヨードトリメチルシランまたはパラジウム／炭素および水素で処理することに
より、またはＰ_１がｔ−ブトキシカルボニルである場合にはジオキサンの塩酸ま
たは他の強酸で処理することにより行うことができる。式ＩＸの化合物からアシル基Ｒ_６−Ｃ(Ｏ)−を除去し、メチルエステル基をカ
ルボン酸に変換して所望の最終生成物が得られる。たとえば、Ｒ_６がメチルであ
る場合は、メタノール中のナトリウムヒドロキシドで処理し、ついで酸水溶液で
処理すれば所望の化合物が得られる。

【００４９】４Ｓ−[４ａ(Ｒ^＊),７ａ,１０ａｂ]]−オクタヒドロ−４−[(２−メルカプト
−１−オキソ−３−フェニルプロピル)アミノ]−５−オキソ−７Ｈ−ピリド[２,
１−ｂ][１,３]チアゼピン−７−カルボン酸は、アンジオテンシン変換酵素およ
び中性エンドペプチダーゼ阻害活性を有する。この化合物および薬理学的に許容
しうるその塩は、Roblの米国特許第５,５０８,２７２号に記載されているように
高血圧や欝血性心不全などの心血管疾患の治療に有用である。この化合物は、ヒ
トなどの哺乳動物宿主に１日当たり、体重１ｋｇ当たり約０.１ｍｇ〜約１００
ｍｇ、好ましくは１日当たり、体重１ｋｇ当たり約０.５ｍｇ〜約２５ｍｇにて
投与することができる。この化合物は経口で投与するのが好ましいが、非経口経
路および局所経路も採用することができる。１日の投与量は、単回にて投与でき
るし、または１日のうちの２〜４回に分けて投与することもできる。

【００５０】本発明はまた、ギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）をコードする組換えまたは内
生核酸配列およびフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）をコードする組
換えまたは内生核酸配列を含む遺伝子操作した酵母宿主細胞にも関する。好まし
くは、核酸分子はＤＮＡ分子であり、核酸配列はＤＮＡ配列である。本明細書に
おいてＤＮＡ配列はすべて左から右の方向が通常の５'から３'方向であるような
式により表示してある。本発明が修飾した配列を包含することもまた考えられる
。本明細書において使用するに際して「修飾した」なる語は、ヌクレオチド配列
またはポリペプチド配列に言及する場合に天然に見出される野生型の配列とは異
なるヌクレオチド配列またはポリペプチド配列を意味する。

【００５１】本発明の組換え宿主細胞は、組換えおよび／または天然の（内生の）ＦＤＨを
産生することができ、他の種からのＰＤＨで形質転換または遺伝子操作して触媒
活性のあるＰＤＨを発現することのできるあらゆる微生物であってよい。本発明
の宿主細胞の例としては、たとえば、Candida種、Saccharomyces種、Cephalospo
rium種、Fusarium種、Penicillium種、Pichia pastoris、Candida種、Escherich
ia種およびPseudomonas種が挙げられる。本発明の最も好ましい宿主細胞は、Pic
hia種、とりわけPichia pastorisである。

【００５２】酵母宿主細胞を形質転換するのに用いるＰＤＨ核酸は、宿主細胞で触媒活性の
あるＰＤＨを発現する結果となりうるあらゆる核酸であってよい。たとえば、Ｐ
ＤＨ源をコードするＰＤＨ核酸配列は、Bacillus sphaericus、Bacillus badius
、Sporosarcina ureae、Bacillus faecalis、Corynebacterium equis、Rhodotor
ula glutinis、Brevibacterium種、Rhodococcus種、たとえばRhodococcus maris
などであってよい。好ましいＰＤＨ核酸は、Takada, H.ら、J.Biochem.,109,371
-376(1991)（その開示全体を参照のため本明細書中に引用する）に開示されてい
るようにThermoactinomyces intermedius ＡＴＣＣ３３２０５からのＰＤＨ遺伝
子である。

【００５３】酵母宿主細胞を形質転換するのに用いる本発明のＰＤＨ（および任意にＦＤＨ
）配列は、当業者によく知られた種々の方法を用いて得ることができる。少なく
とも３つの択一的な主たる方法を用いることができる：（１）当該配列を含むゲノムＤＮＡまたは相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）からの二本
鎖ＤＮＡ配列の単離；（２）当該ＤＮＡ配列の化学的合成；および（３）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による当該ＤＮＡ配列の合成。

【００５４】第一のアプローチでは、ＰＤＨ（および任意にＦＤＨ）の全部または一部をコ
ードするＤＮＡ配列を同定するためにゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブ
ラリーをスクリーニングすることができる。たとえば、ＰＤＨ（および任意にＦ
ＤＨ）の全部または一部をコードするＤＮＡ配列を同定するためにT. intermedi
usのゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることができる。種々の方法
を用いてゲノムＤＮＡライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニン
グすることができる。

【００５５】たとえば、ＰＤＨの全部または一部をコードする標的ゲノムＤＮＡまたはｃＤ
ＮＡ中に存在する配列と二本鎖を形成する標識一本鎖ＤＮＡプローブ配列を、ゲ
ノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ（一本鎖の形態に変性しておいたもの）のクローニン
グコピーに対して行うＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーション法に用いることが
できる。ゲノムＤＮＡライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーはまた、イムノブロッ
ティング法を用いてＰＤＨ（および任意にＦＤＨ）の全部または一部をコードす
るゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡをスクリーニングするために用いることができる
。

【００５６】イムノブロッティング法かまたはハイブリダイゼーション法に適した一つの典
型的なスクリーニング法では、ゲノムＤＮＡ（通常、ベクター中に含まれる）ま
たはｃＤＮＡライブラリーをまず寒天プレート上に広げ、ついでクローンをフィ
ルターメンブレン、たとえばニトロセルロースメンブレンに移す。ついで、クロ
ーンにＤＮＡプローブをハイブリダイズさせるかまたは抗体を結合させてＰＤＨ
（および任意にＦＤＨ）の全部または一部をコードするゲノムＤＮＡまたはｃＤ
ＮＡを含むクローンを同定することができる。

【００５７】第二のアプローチでは、ＰＤＨ（および任意にＦＤＨ）をコードする本発明の
ＤＮＡ配列を化学的に合成することができる。たとえば、ＰＤＨ（および任意に
ＦＤＨ）をコードするＤＮＡ配列を一連の１００塩基オリゴヌクレオチドとして
合成することができ、これはヌクレオチドの正しい線状配列を形成するように連
続的にライゲート（適当な末端制限部位または相補的な末端配列により）するこ
とができる。

【００５８】第三のアプローチでは、ＰＤＨ（および任意にＦＤＨ）をコードする本発明の
ＤＮＡ配列をＰＣＲを用いて合成することができる。簡単に説明すると、標的Ｄ
ＮＡ配列の反対鎖にハイブリダイズする長さが少なくとも１５ヌクレオチドの合
成ＤＮＡオリゴヌクレオチドのペア（ＰＣＲプライマー）を用い、標的配列上の
ＤＮＡの挟まれた領域を酵素的に増幅させる。鋳型の熱変性、プライマーのアニ
ーリング、およびＤＮＡポリメラーゼを用いたアニールしたプライマーの３'末
端の伸長のサイクルを繰り返すと、ＰＣＲプライマーの５'末端によって定めら
れるセグメントの増幅という結果となる。Whiteら、Trends Genet.5,185-189(19
89)を参照。

【００５９】ＰＤＨ（および任意にＦＤＨ）をコードする本発明において有用なＤＮＡ配列
はまた修飾して（すなわち、変異させて）種々の変異体を調製することができる
。そのような変異は、縮重している、すなわち変異が変異コドンによってコード
されるアミノ酸配列を変化させるものであるか、または縮重していない、すなわ
ち変異が変異コドンによってコードされるアミノ酸配列を変化させないもののい
ずれであってもよい。これら修飾ＤＮＡ配列は、当該技術分野で知られた種々の
方法を用い、たとえば、コードされるポリペプチド中の１またはそれ以上のアミ
ノ酸の欠失、置換、挿入、逆位または付加という結果となるようにＰＤＨ（およ
び任意にＦＤＨ）ＤＮＡ配列を変異させることにより調製できる。たとえば、Mo
rinagaら、Bio/Technol.2,636-639(1984)、Taylorら、Nucl. Acids Res.13,8749
-8764(1985)およびKunkel, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82,482-492(1985)に記載さ
れた部位特異的突然変異誘発法を用いることができる。さらに、部位特異的突然
変異誘発に使用するキットは市場の業者から購入することができる。たとえば、
部位特異的突然変異誘発のためのキットはAmersham Corp.（アーリントン・ハイ
ツ、イリノイ）から購入できる。さらに、Sayersら、Nucl. Acids Res.16,791-8
02(1988)に記載されているような破砕法、欠失法および先端切断（truncation）
法も用いることができる。本発明のポリペプチドを製造または使用するに際して
縮重変異および非縮重変異のいずれも有利である。たとえば、これら変異は、高
レベルの産生、容易な精製を可能とし、あるいはさらなる制限エンドヌクレアー
ゼ認識部位を提供する。そのような修飾したＤＮＡおよびポリペプチド分子はす
べて本発明の範囲に包含される。

【００６０】本発明の酵母宿主細胞は、ＰＤＨ（および任意にＦＤＨ）をコードするＤＮＡ
配列を含む発現ベクターを用いて都合よく形質転換することができる。発現ベク
ターは、実質的にTakada, H.ら、J.Biochem.,109,371-376(1991)に示されるよう
なＰＤＨヌクレオチド配列を有するＤＮＡ配列の一つの全部または一部を含んで
いるのが好ましい。さらに好ましいのは、ＰＤＨ（および任意にＦＤＨ）の全部
または一部をコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結された１またはそれ以上の
調節ＤＮＡ配列を含む発現ベクターである。この文脈において用いる「作動可能
に連結した」とは、調節ＤＮＡ配列がＰＤＨ（および任意にＦＤＨ）をコードす
るＤＮＡ配列の複製および／または発現を指令しうることを意味する。

【００６１】本発明において有用な発現ベクターはまた、しばしば「プラスミド」の形態で
あり、これはそのプラスミドの形態では染色体に結合していない環状二本鎖ＤＮ
Ａループをいう。しかしながら、本発明は、同等の機能を有しその後当該技術分
野において知られるようになる他の形態の発現ベクターをも包含することを意図
するものである。

【００６２】本発明において有用な発現ベクターは、典型的に複製起点、ＤＮＡ配列の前（
すなわち、その上流）に位置するプロモーター（好ましくはＡＯＸ１などの誘導
性プロモーターまたはＧＡＰなどの構成的プロモーター）、ついでＰＤＨ（およ
び任意にＦＤＨ）の全部または一部をコードするＤＮＡ配列を含む。ＰＤＨ（お
よび任意にＦＤＨ）の全部または一部をコードするＤＮＡ配列の次には転写停止
配列および残りのベクターが続く。組換えＦＤＨ核酸を用いる場合は、ＦＤＨ
ＤＮＡはＰＤＨと同じベクターの一部であるかまたは別のベクターの一部であっ
てよい。発現ベクターはまた、当該技術分野で知られた他のＤＮＡ配列、たとえ
ば、発現産物に安定性を付与する安定性リーダー配列、発現産物を分泌させる分
泌リーダー配列、調節すべき（たとえば、増殖培地中の栄養素または他のインデ
ューサーの存在または不在によって）構造遺伝子の発現を可能とする配列、形質
転換した宿主細胞の表現型選択を可能とするマーカー配列、プラスミドに有糸分
裂安定性を付与する中心体などの安定性要素、および制限エンドヌクレアーゼに
より開裂部位を提供する配列を含んでいてよい。

【００６３】実際の発現ベクターの特性は、使用すべき宿主細胞と両立するものでなければ
ならない。たとえば、真菌または酵母細胞系でクローニングする場合は、発現ベ
クターは真菌または酵母細胞のゲノムから単離したプロモーター（たとえば、As
pergillus nidulansからのｔｒｐＣプロモーター、Pichia pastorisからのＡＯ
Ｘ１プロモーター、およびP. pastorisからのＧＡＰプロモーター）を含んでい
なければならない。ある種の発現ベクターは、自己複製配列（ＡＲＳ；たとえば
、Fusarium oxysporum、Saccharomyces cerevisiaeなどからのＡＲＳ）を含んで
いてもよく、これは真菌または酵母宿主での自己複製プラスミドのインビボ産生
を促進する。本発明の酵母発現ベクターは酵母ＡＲＳ配列を有しておらず、それ
ゆえプラスミドが宿主細胞に入ったときに宿主染色体中に組み込まれるのが好ま
しい。そのような組み込みは、遺伝的な安定性が増大するので好ましい。本発明
に包含される発現ベクターは、少なくとも、酵母または真菌細胞中での複製およ
び組み込みを指令することができるものであり、好ましくは、Takada, H.ら、J.
Biochem.,109,371-376(1991)に開示されているＰＤＨＤＮＡ配列をPichia細胞
中で発現しうるものである。

【００６４】適当なプロモーターとしては、たとえば、Aspergillus nidulansからのｔｒｐ
Ｃプロモーター、F. oxysporumからのペニシリンＶアミダーゼプロモーター、Pi
chia pastorisからのＧＡＰプロモーター、およびP. pastorisからのＡＯＸプロ
モーターが挙げられる。適当な停止配列としては、たとえば、A. nidulansから
のｔｒｐＣターミネーター、F. oxysporumからのＰＶＡターミネーター、および
P. pastorisからのＡＯＸ１ターミネーターが挙げられる。発現ベクターはまた
、選択マーカーをコードする配列を含んでいるのが好ましい。選択マーカーは抗
生物質耐性であるのが好ましい。選択マーカーとしてはＧ４１８耐性またはZeoc
in耐性を都合よく用いることができる。これら材料はすべて当該技術分野で知ら
れており、市販されている。

【００６５】特に好ましいのは以下に記載するｐＰＤＨ９ｋ／１０、ｐＰＤＨ１５５Ｋ、お
よびｐＧＡＰｋ−ＰＤＨと称する発現ベクター（ＰＤＨをコードするＤＮＡ配列
を含む）、またはこれらプラスミドの同定特性を有する発現ベクターである。ま
た、ＦＤＨをコードするＤＮＡ配列を含むｐＧＡＰＺ−ＦＤＨと称する発現ベク
ターも好ましい。

【００６６】プラスミドｐＰＤＨ９ｋ／１０を含む宿主細胞Pichia pastoris株ＳＭＤ１１
６８は、ブダペスト条約下、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（
「ＡＴＣＣ」）（マナサス、バージニア）に１９９７年３月２６日に寄託してあ
り、ＡＴＣＣ受託番号７４４０８を付与されている。プラスミドｐＧＡＰｋ−ＰＤＨおよびｐＧＡＰＺ−ＦＤＨを含む宿主細胞Pich
ia pastoris株ＧＳ１１５は、ブダペスト条約の規定下、ＡＴＣＣに１９９８年
２月１３日に寄託してあり、ＡＴＣＣ受託番号７４４３３を付与されている。

【００６７】プラスミドｐＰＤＨ１５５Ｋを含む宿主細胞Escherichia coli株ＢＬ２１は、
ブダペスト条約の規定下、ＡＴＣＣに１９９７年３月２６日に寄託してあり、Ａ
ＴＣＣ受託番号９８３７４を付与されている。所望のコード配列および調節配列を含む適当な発現ベクターは、当該技術分野
で知られた標準組換えＤＮＡ法を用いて構築することができ、該方法の多くはSa
mbrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第２版、コールド・スプ
リングス・ハーバー・ラボラトリー、コールド・スプリングス・ハーバー、ニュ
ーヨーク（１９８９）に記載されている。

【００６８】本発明の宿主細胞は、ＰＤＨの全部または一部をコードするＤＮＡ配列の複製
および／または発現を指令することができ該ＤＮＡ配列に作動可能に連結した１
またはそれ以上の調節ＤＮＡ配列を含有する発現ベクターを含むのが好ましい。
宿主細胞は、たとえば、Cephalosporium acremonium、Fusarium oxysporumおよ
びPenicillium chrysogenum、Pichia pastoris、Candida boidinii、およびSacc
haromyces cerevisiae細胞であってよい。宿主細胞として特に好ましいのはPich
ia pastoris株である。

【００６９】発現ベクターは当該技術分野で知られた様々な方法により宿主細胞中に導入す
ることができる。たとえば、発現ベクターによる宿主細胞の形質転換は、ポリエ
チレングリコールによるプロトプラスト形質転換法によって行うことができる。
しかしながら、宿主細胞中に発現ベクターを導入するための他の方法、たとえば
、エレクトロポレーション、バイオリスティックインジェクション（biolistic
injection）、またはプロトプラスト融合も用いることができる。

【００７０】発現ベクターが適当な宿主細胞中に導入されたら、所望のポリペプチド、好ま
しい場合はＰＤＨ（および任意にＦＤＨ）を含むポリペプチド分子の大量の発現
を可能とする条件下で宿主細胞を培養する。それゆえ、本発明は、フェニルアラ
ニンデヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）およびギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）の両者
を産生することのできる遺伝子操作した宿主細胞、好ましくは酵母に関し、その
際、該宿主細胞は、（ａ）ＰＤＨをコードする組換え核酸、および任意にＰＤＨをコードする内生の
核酸、および（ｂ）ＦＤＨをコードする核酸であって、内生のものであるか、組換えのもので
あるか、または内生および組換えの両者であるものを含む。

【００７１】ＰＤＨ（および任意にＦＤＨ）の全部または一部をコードするＤＮＡ配列を含
有する発現ベクターを含む宿主細胞の同定は、以下の５つの一般的なアプローチ
の１またはそれ以上により行うことができる：（ａ）ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダ
イゼーション；（ｂ）マーカー遺伝子機能の存在または不在；（ｃ）宿主細胞中
でのｍＲＮＡ転写物の産生により測定される転写レベルの評価；（ｄ）遺伝子産
物の免疫学的な検出；および（ｅ）酵素アッセイ（酵素アッセイが好ましい同定
法である）。

【００７２】第一のアプローチでは、所望の酵素の全部または一部をコードするＤＮＡ配列
の存在を、該ＤＮＡ配列に相補的なプローブを用いたＤＮＡ−ＤＮＡまたはＲＮ
Ａ−ＤＮＡハイブリダイゼーションにより検出することができる。第二のアプローチでは、組換え発現ベクター宿主系をある種のマーカー遺伝子
機能（たとえば、アセトアミドの利用性、抗生物質に対する耐性、抗真菌剤に対
する耐性、ウラシル原栄養性など）の存在または不在に基づいて同定および選択
することができる。マーカー遺伝子は、酵素コード配列を制御するのに用いたも
のと同じまたは異なるプロモーターの制御下に酵素の全部または一部をコードす
るＤＮＡ配列と同じプラスミド中に配置することができる。誘導または選択に応
答したマーカー遺伝子の発現は、所望の酵素の全部または一部をコードするＤＮ
Ａ配列を含む全組換え発現ベクターの存在を指示する。

【００７３】第三のアプローチでは、酵素ｍＲＮＡ転写物の産生をハイブリダイゼーション
アッセイにより評価することができる。たとえば、ポリアデニル化ＲＮＡを、該
ＲＮＡ配列に相補的なプローブを用いたノーザンブロッティングまたはヌクレア
ーゼ保護アッセイにより単離および分析することができる。別法として、宿主細
胞の全核酸を抽出し、そのようなプローブに対するハイブリダイゼーションにつ
いてアッセイすることができる。第四のアプローチでは、所望の酵素の全部または一部の発現を、たとえばウエ
スタンブロッティングにより免疫学的にアッセイすることができる。第五のアプローチでは、酵素の発現を公知の方法により酵素活性をアッセイし
て測定することができる。

【００７４】本発明の発現ベクター、プラスミドまたはＤＮＡ分子のＤＮＡ配列の決定は、
当該技術分野で知られた種々の方法により行うことができる。たとえば、Sanger
ら、Proc. Natl. Acad. Sic. USA 74,5463-5467(1977)に記載されたジデオキシ
チェインターミネーション法、またはProc. Natl. Acad. Sic. USA 74,560-564(
1977)に記載されたマクサム−ギルバート法。

【００７５】もちろん、発現ベクターおよびＤＮＡ調節配列のすべてが本発明のＤＮＡ配列
を発現するために同等にうまく機能するものではないであろうことが理解されね
ばらない。また、同じ発現ベクターですべての宿主細胞が同等にうまく機能する
ものではないであろう。しかしながら、当業者であれば、本明細書に開示した案
内に従い、不当な実験を行うことなく、また本発明の範囲から逸脱することなく
、発現ベクター、ＤＮＡ調節配列、および宿主細胞を選択することができるであ
ろう。組換えＦＤＨを発現すべく遺伝子操作した宿主細胞を用いるのであれば、上記
と同様の手順を用い、適合させて宿主細胞を形質転換してＦＤＨをコードする核
酸を含ませることができる。ＦＤＨ核酸の適当な源はPichia種である。

【００７６】本発明によるＰＤＨ形質転換した宿主細胞はまた、ＦＤＨを発現しうる天然ま
たは内生の核酸をも含むのが好ましい。任意に、宿主細胞はまた、組換えＰＤＨ
核酸に加えてＰＤＨをコードする内生の核酸をも含んでいてよい。それゆえ、発
現ベクターを挿入すべく選択した宿主細胞はＦＤＨ発現能を既に有しているのが
好ましい。予期しないことに、ＰＤＨの発現を指令しうる発現ベクターによるPi
chia細胞の形質転換はＦＤＨ発現の増大という結果となることが見出された。そ
のような細胞を本発明の酵素的変換プロセスに使用するのが好ましい。

【００７７】本発明はさらに、ＦＤＨを発現しうる組換えまたは内生の核酸およびＰＤＨを
発現しうる発現ベクターを含有する遺伝子操作した宿主細胞を培養することを含
む、ＰＤＨまたはＦＤＨの製造方法に関する。該発現ベクターは好ましくはｐＤ
Ｈ９Ｋ／１０である。

【００７８】本明細書において同定するアミノ酸残基はすべて天然のＬ−立体配置である。
標準的なポリペプチド命名法、J. Biol. Chem.243,3557-3559(1969)に従うため
、アミノ酸残基の略語を下記対応表に示す。対応表符号アミノ酸１文字３文字ＹＴｙｒＬ−チロシンＧＧｌｙＬ−グリシンＦＰｈｅＬ−フェニルアラニンＭＭｅｔＬ−メチオニンＡＡｌａＬ−アラニンＳＳｅｒＬ−セリンＩＩｌｅＬ−イソロイシンＬＬｅｕＬ−ロイシンＴＴｈｒＬ−トレオニンＶＶａｌＬ−バリンＰＰｒｏＬ−プロリンＫＬｙｓＬ−リジンＨＨｉｓＬ−ヒスチジンＱＧｌｎＬ−グルタミンＥＧｌｕＬ−グルタミン酸ＷＴｒｐＬ−トリプトファンＲＡｒｇＬ−アルギニンＤＡｓｐＬ−アスパラギン酸ＮＡｓｎＬ−アスパラギンＣＣｙｓＬ−システイン本明細書においてアミノ酸配列はすべて、左から右の方向が通常のアミノ末端
からカルボキシ末端であるような式により表示してある。

【００７９】本発明において有用な核酸配列およびアミノ酸配列の対立遺伝子変異体が天然
に存在し、または当該技術分野で知られた方法を用いて意図的に導入しうること
が理解されるであろう。これら変異体は、全体の配列中の１またはそれ以上のア
ミノ酸の相違、または該配列中の１またはそれ以上のアミノ酸の欠失、置換、挿
入、逆位または付加によって示される。そのようなアミノ酸の置換は、たとえば
、関与するアミノ酸残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性および／または
両親媒特性の類似性に基づいて行うことができる。たとえば、負に荷電したアミ
ノ酸にはアスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれ、正に荷電したアミノ酸に
はリジンおよびアルギニンが含まれ、類似の親水価を有する非荷電の極性末端（
head）基または非極性末端基を有するアミノ酸には以下のものが含まれる：ロイ
シン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン
、セリン、トレオニン、フェニルアラニン、チロシン。他に考えられる変異体と
しては、上記ポリペプチドの塩およびエステル、並びに上記ポリペプチドの前駆
体、たとえばＮ−末端置換基（メチオニン、Ｎ−ホルミルメチオニンおよびリー
ダー配列）を有する前駆体が挙げられる。そのような変異体はすべて本発明の範
囲に包含される。

【００８０】以下の実施例は本発明を説明するものであるが、本発明を限定することを意図
するものではない。実施例１〜６の反応をスキーム３に示す。スキーム３

【化４０】

【００８１】実施例１種々の入手源からのアミノ酸デヒドロゲナーゼを用いた還元的アミノ化最終容量１.０ｍｌ（ｐＨ８.７）の溶液は以下のものを含んでいた：１Ｍギ酸
アンモニウム（ＮＨ_４ＯＨでｐＨ８.７に調整したもの）、０.１Ｍ５−(１,３
−ジオキソラン−２−イル）−２−オキソペンタン酸、１ｍＭＮＡＤ、１ｍｇ
タンパク質／ｍｌ（Boehringer Mannheimからの０.５３単位／ｍｇタンパク質）
のCandida boidiniiからのギ酸デヒドロゲナーゼ、および表１に示すアミノ酸デ
ヒドロゲナーゼ。溶液を３０℃で１６時間インキュベートし、ついで高速液体ク
ロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析のために試料を反応液から取り出した。その
結果を表１に示す。鏡像異性体の過剰は各場合に９８％以上であった。

【００８２】表１デヒドロゲナーゼ入手源量５−(１,３−ジオキソラン−２−イル) −(Ｓ)−２−アミノペンタン酸
単位ｍＭグルタミン酸 Sigma ７６１.０３アラニン Sigma ３５.７１１.７７ロイシン実験室内２２１４.０１フェニルアラニン Sigma １２.６５１.７１ロイシンデヒドロゲナーゼは、Bacillus sphaericus ＡＴＣＣ４５２５から部
分的に精製した。グルタミン酸デヒドロゲナーゼはウシ肝臓からのものであった
。アラニンデヒドロゲナーゼはBacillus subtilisからのものであった。フェニ
ルアラニンデヒドロゲナーゼはSporosarcina種からのものであった。

【００８３】５−(１,３−ジオキソラン−２−イル)−(Ｓ)−２−アミノペンタン酸の光学純
度および量のＨＰＬＣアッセイ試料を水で約５ｍＭの濃度に希釈し、沸騰水浴中に１分間入れて反応を停止さ
せ、タンパク質を沈殿させた。冷却後、試料を０.２ミクロンのナイロンフィル
ターでＨＰＬＣバイアル中へ濾過した。カラム：Chiralpak WH ２５×０.４６ｃｍ（Daicel Chemical Industries, Ltd.
）移動相：０.３ｍＭＣｕＳＯ_４流速：１ｍｌ／分カラム温度：４０℃ 検出：２３０ナノメーター（ｎｍ）に設定したＤＡＤ注入容量：２０マイクロリットル（μｌ）保持時間：Ｌ−鏡像異性体２８.０４４分、Ｄ−鏡像異性体２３.８４２分。保持
時間はカラムの使用につれて低下するので試料の濃度に応じて変えることができ
る。検出できるＤ−鏡像異性体の最小パーセントは約１％である。

【００８４】実施例２ Thermoactinomyces intermediusからの抽出物を用いた還元的アミノ化 Thermoactinomyces intermedius ＡＴＣＣ３３２０５を、５５℃の１５Ｌ発酵
槽中、１.０％Ｌ−フェニルアラニン、０.１％Ｌ−グルタミン酸、１.０％ペプ
トン、０.５％酵母エキス、０.２％Ｋ_２ＨＰＯ_４、０.１％ＮａＣｌおよび０.０
２％ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏを含有する培地上で増殖させた。接種１９時間後に菌
体を回収し、−１２℃で凍結保存した。凍結した菌体ペースト（８.０ｇ）を２
００ｍｌの５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）で洗浄し、１６０００×ｇ
にて１０分間遠心分離にかけた。菌体を１ｍＭジチオトレイトールを含有する４
０ｍｌの５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）中に再浮遊させた。この菌体
浮遊液を２分間超音波処理し、ついで１６０００×ｇにて１０分間遠心分離にか
けた。上澄み液はフェニルピルビン酸の還元的アミノ化についてアッセイしたと
きに０.４３単位ＰＤＨ／ｍｇタンパク質を含んでいた。

【００８５】１Ｍギ酸アンモニウム（２５.２２ｇ）、０.１Ｍ５−(１,３−ジオキソラン
−２−イル)−２−オキソペンタン酸（７.５２７ｇ）、１ｍＭＮＡＤ（２７４
ｍｇ）、１ｍＭジチオトレイトール（６１.６ｍｇ）、４０Ｕ（７６ｍｇタンパ
ク質）のギ酸デヒドロゲナーゼ、および４０ｍｌ（３０９ｍｇタンパク質）のTh
ermoactinomyces intermedius抽出物を含有するｐＨ８.７の溶液（４００ｍｌ）
を調製した。ギ酸アンモニウムを３００ｍｌの水に溶解し、濃水酸化アンモニウ
ムを用いてｐＨ８.７とし、ついで他の成分を加え、溶液を４００ｍｌとし、再
び濃水酸化アンモニウムを用いてｐＨ８.７に調節した。この溶液を４０℃にて
インキュベートした。さらに２０ｍｇのギ酸デヒドロゲナーゼを９時間および２
３時間にて加えた。２１時間後、溶液はＨＰＬＣ分析による測定で８０.１ｍＭ
のＬ−５−(１,３−ジオキソラン−２−イル)−(Ｓ)−２−アミノペンタン酸を
含んでいた。この濃度は２９時間後もそのままであった。キラルＨＰＬＣによる
測定で鏡像異性体の過剰は９８％以上であった。

【００８６】実施例３熱乾燥Thermoactinomyces intermediusおよび熱乾燥Candida boidiniiを用いた
還元的アミノ化５−(１,３−ジオキソラン−２−イル)−２−オキソペンタン酸（１０.０ｇ、
５３.１４ミリモル）、ギ酸アンモニウム（３.５０９ｇ、５５.６５ミリモル）
およびマグネチック攪拌棒を３００ｍｌ容ビーカーに加えた。このビーカーに１
５０ｍｌの水および４.５ｍｌの濃水酸化アンモニウム溶液（２９.６％）を加え
、固形分が溶解するまで攪拌した。必要に応じて水酸化アンモニウムをさらに加
えてｐＨを８に調節した。ジチオトレイトール（３６.２ｍｇ、０.２３５ミリモ
ル）およびＮＡＤ（１４５.２ｍｇ、０.２１２ミリモル）を加え、攪拌して溶解
させた。水を加えて容積を２００ｍｌとし、溶液を２５０ｍｌ容のジャケットで
被覆した（jacketed）反応容器に注いだ。ビーカーを６ｍｌの水ですすぎ、すす
いだ水を反応容器に加えた。反応容器をNeslab RTE-110バス／サーキュレーター
で４０℃に保持した。溶液をHeidolph RZR-2000スターラーで１分間あたり２８
０回転（ＲＰＭ）で攪拌した。

【００８７】この攪拌溶液に、Thermoactinomyces intermediusの熱乾燥菌体（４.０８ｇ、
３３３Ｕフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ）およびCandida boidiniiの熱乾燥
菌体（１.４２ｇ、５５Ｕギ酸デヒドロゲナーゼ）を加えた。３０分後、菌体は
スターラーにより分散された。この時点で濃水酸化アンモニウム溶液（約０.５
ｍｌ）を加えてｐＨを約７.１からｐＨ８に戻した。蒸発を最小限に抑えるため
、反応容器をパラフィルムで覆い続けた。３時間後、ｐＨを８.０に調節するた
めに少量の水酸化アンモニウムを添加する必要があった。その後、６時間後には
ｐＨは８.１〜８.２に上昇し、１９時間後には約８.５まで上昇した。ＨＰＬＣ
により５−(１,３−ジオキソラン−２−イル)−２−オキソペンタン酸の５−(１
,３−ジオキソラン−２−イル)−(Ｓ)−２−アミノペンタン酸への変換が完了し
たと判断されたら、浮遊液をSorvall GSAローターで１３,０００ｒｐｍにて１５
分間（２７,５０４×ｇ）遠心分離にかけることにより菌体を除去した。菌体の
ペレットをガラス棒を用いて２０ｍｌの水中に再浮遊させ、Sorvall SS34ロータ
ーで２０,０００ｒｐｍにて１０分間（４７,８０７×ｇ）遠心分離にかけた。こ
の洗浄工程を３回繰返し、上澄み液を最初の上澄み液とともにコンバインした。
反応の終点でのＨＰＬＣ収量は６.８５ｇの５−(１,３−ジオキソラン−２−イ
ル)−(Ｓ)−２−アミノペンタン酸であった（投入したケト酸の９１％ＨＰＬＣ
純度に対して補正して７４.９Ｍ％）。鏡像異性体の過剰は９８％以上であった
。

【００８８】実施例４熱乾燥した組換えE. coliおよび熱乾燥Candida boidiniiを用いた還元的アミノ
化５−(１,３−ジオキソラン−２−イル)−２−オキソペンタン酸（２０.０ｇ、
１０６.２８ミリモル）、ギ酸アンモニウム（７.０１８ｇ、１１１.２９ミリモ
ル）およびマグネチック攪拌棒を５００ｍｌ容ビーカーに加えた。このビーカー
に３００ｍｌの水および９ｍｌの濃水酸化アンモニウム溶液（２９.６％）を加
え、固形分が溶解するまで攪拌した。必要に応じて水酸化アンモニウムをさらに
加えてｐＨを８に調節した。ジチオトレイトール（６５.６ｍｇ、０.４２５ミリ
モル）およびＮＡＤ（２８２ｍｇ、０.４２５ミリモル）を加え、攪拌して溶解
させた。水を加えて容積を４００ｍｌとし、溶液を１リットル（Ｌ）容のジャケ
ットで被覆した反応容器に注いだ。ビーカーを１２ｍｌの水ですすぎ、すすいだ
水を反応容器に加えた。反応容器をNeslab RTE-110バス／サーキュレーターで４
０℃に保持した。溶液をHeidolph RZR-2000スターラーで３５０ＲＰＭにて攪拌
した。

【００８９】この攪拌溶液に、E. coli BL21(DE3)(ｐＰＤＨ１５５Ｋ)[ＳＣ１６１４４]の
熱乾燥菌体（０.３６０ｇ、６６６Ｕフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ）およ
びCandida boidiniiの熱乾燥菌体（３.１１６ｇ、１１０Ｕギ酸デヒドロゲナー
ゼ）を加えた。５〜１０分後、菌体はスターラーにより分散された。この時点で
濃水酸化アンモニウム溶液（約１.４ｍｌ）を加えてｐＨを約７.２からｐＨ８に
戻した。蒸発を最小限に抑えるため、反応容器をパラフィルムで覆い続けた。３
時間後、ｐＨを８.０に調節するために少量の水酸化アンモニウムを添加する必
要があった。その後、１６時間後にｐＨは約８.４に上昇した。ＨＰＬＣにより
測定されるように、５−(１,３−ジオキソラン−２−イル)−２−オキソペンタ
ン酸の５−(１,３−ジオキソラン−２−イル)−(Ｓ)−２−アミノペンタン酸へ
の変換が完了したら、浮遊液を反応容器から取り出し、菌体を除去するまで４℃
で貯蔵した。菌体を、セライト混合物およびプレコートの助けを借りてブフナー
漏斗で濾過することにより除去した。ついで、濾液を１０,０００分子量（ＭＷ
）のカットオフのポリスルホンメンブレンを用いて限外濾過した。反応の終点で
のＨＰＬＣ収量は１２.５ｇの５−(１,３−ジオキソラン−２−イル)−(Ｓ)−２
−アミノペンタン酸であった（投入したケト酸の８８％ＨＰＬＣ純度に対して補
正して７１.０Ｍ％）。

【００９０】実施例５組換えPichiaを用いた還元的アミノ化プラスミドｐＰＤＨ９Ｋ１０を含有するPichia pastoris株ＳＭＤ１１６８（
ＡＴＣＣ受託番号７４４０８）の抽出物を、１ｍＭのジチオトレイトールおよび
０.２％のトリトンＸ−１００を含有する５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ
７.３）中に１ｍｌ当たり１００ｍｇの菌体を浮遊させ、ついでガラスビーズ含
有ビーズミルで４℃にて５分間破砕することにより調製した。この抽出物を１０
０００ｒｐｍにて５分間、マイクロ遠心分離した。この抽出物には２.４４単離
（Ｕ）／ｍｌのギ酸デヒドロゲナーゼおよび１５.４Ｕ／ｍｌのフェニルアラニ
ンデヒドロゲナーゼを含んでおり、湿菌体の活性は２４.４Ｕ／ｇの湿菌体ギ酸
デヒドロゲナーゼおよび１５４Ｕ／ｇの湿菌体フェニルアラニンデヒドロゲナー
ゼであった。５−(１,３−ジオキソラン−２−イル)−２−オキソペンタン酸（
Ｌｉ塩）（１.０ｇ、５.１５１７ミリモル）およびギ酸アンモニウム（３８９.
８ｍｇ、６.１８２ミリモル）を２０ｍｌの水中に溶解した。ジチオトレイトー
ル（３.２８ｍｇ、０.０２１３ミリモル）およびＮＡＤ（１４.１ｍｇ、０.０２
０６ミリモル）を加えた。この溶液のｐＨは８.１６であった。

【００９１】（ａ）Pichia抽出物（０.１１２ｍｌ；０.２７３Ｕのギ酸デヒドロゲナーゼおよ
び１.７２３Ｕのフェニルアラニンデヒドロゲナーゼを含有）を、ケト酸を含有
する溶液（１ｍｌ）に加え、蓋をしたマイクロ遠心管中で４０℃にて２５時間イ
ンキュベートした。反応の終点でのＨＰＬＣ収量は０.０３８ｇの５−(１,３−
ジオキソラン−２−イル)−(Ｓ)−２−アミノペンタン酸であった（投入したケ
ト酸の９３％ＨＰＬＣ純度および９.４％のカールフィッシャー（ＫＦ）水に対
して補正して９２.６Ｍ％）。鏡像異性体の過剰は９８％以上であった。

【００９２】（ｂ）基質を含有する溶液の残りの１９ｍｌを５０ｍｌ容のエーレンマイヤーフ
ラスコ中でPichia湿菌体（０.２１４ｇ；５.２３Ｕのギ酸デヒドロゲナーゼおよ
び３２.９３Ｕのフェニルアラニンデヒドロゲナーゼを含有）に加えた。浮遊液
のｐＨは８.０４であった。菌体を−１５℃で凍結保存した。フラスコをパラフ
ィルムで蓋をし、ロータリーシェーカー上、４０℃、２００ｒｐｍにて２５時間
インキュベートした。反応の終点でのＨＰＬＣ収量は０.７５０６ｇの５−(１,
３−ジオキソラン−２−イル)−(Ｓ)−２−アミノペンタン酸であった（投入し
たケト酸の９３％ＨＰＬＣ純度および９.４％のＫＦ水に対して補正して９６.２
Ｍ％）。鏡像異性体の過剰は９８％以上であった。

【００９３】（ｃ）脱イオン水（２００ｍｌ）、ギ酸アンモニウム（７.７９６ｇ、１２３.６
３ミリモル）、および５−(１,３−ジオキソラン−２−イル)−２−オキソペン
タン酸リチウム塩（２０ｇ、１０３.０３ミリモル）を、４０℃に保持し５００
ｍｌ容のジャケットで被覆した反応容器に加え、２５０ＲＰＭにて攪拌した。固
形分が溶解した後、ＮＡＤ（６６.３４ｍｇ、０.１ミリモル）、および熱乾燥Pi
chia（１.６４０６ｇ；６６６単位のギ酸デヒドロゲナーゼおよび１５０単位の
フェニルアラニンデヒドロゲナーゼを含有）を加えた。ｐＨを濃ＮＨ_４ＯＨで８
.０に調節した。７時間後、ギ酸（９９％）を加えることによりｐＨを８.７６か
ら８に調節した。１０時間および２３時間後に再びｐＨをギ酸で８に調節した。
２５時間後、５−(１,３−ジオキソラン−２−イル)−(Ｓ)−２−アミノペンタ
ン酸の収量は１７.１６ｇ（９８.３％）であった（投入したケト酸の純度に対し
て補正）。鏡像異性体の過剰は９８％以上であった。菌体を遠心分離により除去
し、タンパク質を限外濾過により取り出した。

【００９４】実施例６固定化酵素を用いた還元的アミノ化製造業者の指示に従い、組換えE. coli抽出物からのフェニルアラニンデヒド
ロゲナーゼをEupergit C250L（Rohm GmbHから入手）上に固定化し、Candida boi
dinii抽出物からのギ酸デヒドロゲナーゼをEupergit C（Rohm GmbHから入手）上
に固定化した。反応液は１００ｍｌの容量中に以下のものを含んでいた：５−(
１,３−ジオキソラン−２−イル)−２−オキソペンタン酸リチウム塩（５.０ｇ
、２５.８ミリモル）、ギ酸アンモニウム（１.７５４ｇ、２７.８ミリモル）、
ジチオトレイトール（１６.４ｍｇ、０.１０６ミリモル）、ＮＡＤ（７０.５ｍ
ｇ、０.１０３ミリモル）、Eupergit C250L上に固定化した組換えフェニルアラ
ニンデヒドロゲナーゼ（４.３５ｇ、１６６.５単位）、およびEupergit Cに固定
化したCandida boidiniiギ酸デヒドロゲナーゼ（７.２９ｇ、２７.５単位）。ｐ
ＨをＮＨ_４ＯＨおよびギ酸で８.０に調節し、温度は４０℃であった。各反応の
終点で溶液をステンレス鋼のふるい（８０／４００メッシュ）を通して排出して
固定化酵素を保持させ、ついで新鮮な溶液を反応容器に加えた。酵素は下記表に
示すように６つの反応で使用した。鏡像異性体の過剰は各反応について９８％以
上であった。

【００９５】使用反応時間５−(１,３−ジオキソラン投入量の純度に対 −２−イル)−(Ｓ)−２− して補正した収率アミノペンタン酸時間ｇ％１２６２.７６６１.９２２６２.７０６０.５３４５３.７３８３.５４６９４.３７９７.８５４８３.０３６７.９６１２０３.８３８５.８

【００９６】実施例７ C. boidiniiギ酸デヒドロゲナーゼおよびT. intermediusフェニルアラニンデヒ
ドロゲナーゼのためのPichia組換え体脱イオン水（１０.０ｍｌ）、ギ酸アンモニウム（３８９.８ｍｇ、６.１８ミ
リモル）、および５−(１,３−ジオキソラン−２−イル)−２−オキソペンタン
酸リチウム塩（１.０ｇ、５.１５ミリモル）を、５０ｍｌ容のエーレンマイヤー
フラスコに加え、ロータリーシェーカー上で４０℃、２００ｒｐｍにて混合した
。固形分が溶解した後、ＮＡＤ（３.３２ｍｇ、０.００５ミリモル）、並びにT.
intermediusのフェニルアラニンデヒドロゲナーゼおよびC. boidiniiギ酸デヒ
ドロゲナーゼについてのPichia株ＳＣ１６２４５の二重構成的組換え体（０.６
７ｇ；４０.９単位のフェニルアラニンデヒドロゲナーゼおよび７.２４単位のギ
酸デヒドロゲナーゼを含有）を加えた。ｐＨを濃ＮＨ_４ＯＨで８.０に調節した
。フラスコをパラフィルムで蓋をし、ロータリーシェーカー上、４０℃、２００
ｒｐｍにてインキュベートした。２５時間後、５−(１,３−ジオキソラン−２−
イル)−(Ｓ)−２−アミノペンタン酸の収量は０.９８ｇ（１００％）であった（
投入したケト酸の純度に対して補正）。鏡像異性体の過剰は９８％以上であった
。

【００９７】実施例８以下の方法に関する記載は、ＴＨＦから９１.５ｇ（７７.９Ｍ％）の４−(３
−ブロモプロピル)−１,３−ジオキソランを調製するのに用いた手順の詳細であ
る。４−(３−ブロモプロピル)−１,３−ジオキソランＴＨＦ（５０ｍＬ）およびジクロロメタン（５００ｍＬ）を、窒素導入口、熱
電対、ＨＢｒ噴霧管（sparge tube）および気体通気孔を備えた１Ｌ容の３つ首
フラスコに加えた。反応温度を２０〜２５℃に保持しながら、ＨＢｒガス（〜６
３ｇ）を溶液に通気した。ＨＢｒガスの添加は、反応が完了したと判断されるま
で（ＴＨＦのＧＣ面積（Area）％が＜１０％、実際には３.５％）続けた。

【００９８】ついで、反応混合物に窒素ガスを通気して過剰のＨＢｒガスを除去し、８ｗ／
ｖ％の重炭酸ナトリウム（２×２２０ｍＬ）で洗浄して４−ブロモブタノール（
ＧＣ面積％＝９０.５、みかけのｐＨ＝６.９）の塩化メチレン溶液を得た。得ら
れた４−ブロモブタノールの溶液および臭化カリウム溶液（２５ｍＬ中に５ｇ）
を、オーバーヘッドスターラー、窒素導入口、熱電対および１Ｌ圧均等添加漏斗
（pressure equalizing addition funnel）を備えた２Ｌ容の３つ首丸底フラス
コに加えた。攪拌しながら、反応フラスコの内容物を−５〜＋５℃に冷却した。
反応フラスコに８ｗ／ｖ％重炭酸ナトリウム溶液（８１ｍＬ）および２,２,６,
６−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシフリーラジカル（０.６７５ｇ）を
加えた。激しく攪拌しながら、滴定した次亜塩素酸ナトリウムの５.２５％溶液
（８７４ｍＬ）を温度を−５〜＋２５℃の範囲に保持しながら〜１時間かけて反
応混合物に加えた。添加完了後、製造過程のＧＣ分析により判断されるように（
＜３ＲｅｌＡ％４−ブロモブタノール）反応が完了した。

【００９９】相を分離させ、水性相を塩化メチレン（１５０ｍＬ）で抽出した。コンバイン
した有機層を酸性のヨウ化カリウム水溶液（１２５ｍＬの１０ｗ／ｖ％ＨＣｌ中
の１.１９ｇのヨウ化カリウム）、６.４ｗ／ｖ％チオ硫酸ナトリウム溶液（１２
５ｍＬ）および水（２×１２５ｍＬ）で洗浄した。得られた４−ブロモブタノー
ル（ＧＣＡＰ＝９１.５）の塩化メチレン溶液、エチレングリコール（３９.０
ｇ）およびパラトルエンスルホン酸（７.２５ｇ）を、オーバーヘッドスターラ
ー、窒素導入口、熱電対および冷却器付きディーンスターク水分離器を備えた２
Ｌ容の３つ首丸底フラスコに充填した。ＧＣ分析により判断されるように反応が
完了するまで（＜２面積％未反応の４−ブロモブタノール）、水を共沸除去し
ながら反応混合物を加熱還流した。２０〜２５℃に冷却した後、反応混合物を１
０ｗ／ｖ％炭酸カリウム溶液（２５０ｍＬ）および水（２×２５０ｍＬ）で洗浄
した。得られた４−(３−ブロモプロピル)−１,３−ジオキソランの塩化メチレ
ン溶液を最初の容量の半分に濃縮し、テトラヒドロフランを加えた。濃縮は、４
−(３−ブロモプロピル)−１,３−ジオキソラン（９１.５ｇ）を含有する生成物
溶液中に０.２％未満の塩化メチレンが存在するようになるまで続けた（７７.９
Ｍ％、ＧＣ面積％＝８９.４、保持時間７.９分）。

【０１００】製造過程のＧＣ法：装置：ＨＰ５８９０シリーズIIガスクロマトグラフ注入温度：２００℃ カラム：Restek RTx-5；３０ｍ；０.３２ｍｍＩＤオーブンプログラム：２分＠５０℃、２５℃／分にて２７５℃まで上昇勾配、８
分＠２７５℃ 検出：ＦＩＤ検出温度：３００℃ 試料の調製：塩化メチレンで希釈保持時間：４−ブロモブタノール６.４分４−ブロモブチルアルデヒド５.６分４−(３−ブロモプロピル)−１,３−ジオキソラン７.９分 BMS-207170中の後期溶出不純物１０.８分

【０１０１】４−(３−ブロモプロピル)−１,３−ジオキソラン

【０１０２】実施例９以下の方法に関する記載は、５０ｇの４−(３−ブロモプロピル)−１,３−ジ
オキソランから３４ｇ（６８Ｍ％）の５−(１,３−ジオキソラン−２−イル)−
２−オキソペンタン酸リチウムを調製するのに用いた手順の詳細である。５−(１,３−ジオキソラン−２−イル)−２−オキソペンタン酸リチウムの調製窒素雰囲気下、マグネシウム（６.５５ｇ）および乾燥テトラヒドロフラン（
３０ｍＬ）を清浄な乾燥した５００ｍＬ容３つ首フラスコに充填した。この懸濁
液に４−(３−マグネシオブロモプロピル)−１,３−ジオキソランのテトラヒド
ロフラン溶液（５ｍＬ）を加え、混合物を１０〜３０分間攪拌した。４−(３−
ブロモプロピル)−１,３−ジオキソランのテトラヒドロフラン溶液の調製は、ブ
ロモアセタール（５０ｇ）をテトラヒドロフラン（１３０ｍＬ）に溶解すること
により行った。発熱（２〜７℃）を観察した後、反応混合物に４−(３−ブロモ
プロピル)−１,３−ジオキソラン（５ｍＬ）を加えた。発熱（２〜５℃）を観察
した後、温度を２５〜３５℃の範囲に保持しながら反応混合物に残りの４−(３
−ブロモプロピル)−１,３−ジオキソランのテトラヒドロフラン溶液を２〜４時
間かけてゆっくりと加えた。添加完了後、製造過程のＧＣアッセイにより判断さ
れるようにグリニャール試薬の生成が完了するまで（未反応の臭化物が＜１％）
反応混合物を攪拌した。

【０１０３】シュウ酸ジエチル（２９.８５ｇ）およびテトラヒドロフラン（７８ｍＬ）を
、窒素導入口、オーバーヘッドスターラーおよび極低温冷却浴を備えた清浄な乾
燥した５００ｍＬ容３つ首丸底フラスコに加えた。得られたシュウ酸ジエチルの
溶液を−６０〜−７８℃に冷却し、温度を−６０〜−７８℃の範囲に保持しなが
ら４−(３−マグネシオブロモプロピル)−１,３−ジオキソランのテトラヒドロ
フラン溶液をゆっくりと加えた。製造過程のＧＣ分析によりカップリング反応が
完了したと判断されるまで（未反応のシュウ酸ジエチルレベルは連続的なアッセ
イにおいてＮＭＴ０.５％変化する）、カップリング反応混合物を−６０〜−７
８℃で約２時間攪拌した。−６０〜−７８℃のカップリング反応混合物を、冷却
し攪拌したメチルｔ−ブチルエーテル（１００ｍＬ）と１２.５ｗ／ｖ％水性ク
エン酸との２相混合物に速やかに加えた。相を分離し、水性層をメチルｔ−ブチ
ルエーテル（１００ｍＬ）で抽出した。コンバインした有機層をｐＨ６.５〜７.
０の１０ｗ／ｖ％リン酸二水素ナトリウム緩衝液（１００ｍＬ）で洗浄した。

【０１０４】得られた５−(１,３−ジオキソラン−２−イル)−２−オキソペンタン酸メチ
ルのメチルｔ−ブチルエーテル溶液を０〜５℃に冷却し、温度を＜５℃に保持し
ながらリチウムヒドロキシド溶液（８５ｍＬ、８０ｍＬの水中の９.９０ｇのリ
チウムヒドロキシド一水和物）を加えた。この２相反応混合物を、製造過程のＧ
Ｃ分析により鹸化が完了したと判断されるまで（Ｔ＝０の試料と比較して＜１の
相対面積％）０〜１０℃で攪拌した。反応完了後、相を分離し、有機層を水（１
０ｍＬ）で抽出した。コンバインした水性相を１５〜３０℃に温め、イソプロパ
ノール（８００ｍＬ）で２０分未満かけて希釈した。得られた結晶性のスラリー
を１５〜３０℃で約１時間攪拌し、ついで０〜５℃に冷却し、上澄み液中の生成
物の濃度が８Ｍ％未満となるまで攪拌した。５−(１,３−ジオキソラン−２−イ
ル)−２−オキソペンタン酸リチウムをフィルター上で回収し、この湿ケーキを
冷（０〜５℃）水性イソプロパノール（１：８、７５ｍＬ）で洗浄した。湿ケー
キを４０〜５０℃で真空乾燥させて５−(１,３−ジオキソラン−２−イル)−２
−オキソペンタン酸リチウムを白色の自由流動性結晶（３４.０ｇ、６８.０Ｍ％
、ＨＰＬＣ保持時間＝４.０分、ＨＰＬＣＡＰ＝９４％）として得た。ＨＰＬＣ法：カラム；ＹＭＣ基本（basic）５ミクロン粒径、４.６×２５０ｍｍ
、溶媒；１０：９０アセトニトリル：０.０１Ｍ酢酸アンモニウム、流速＝１ｍ
Ｌ／分、および検出はＵＶ＠２１０ｎｍ。

【０１０５】実施例１０以下の方法に関する記載は、１０,０００ＭＷ限界のフィルターで限外濾過し
た後に酵素的還元的アミノ化法から５−(１,３−ジオキソラン−２−イル)−(Ｓ
)−２−アミノペンタン酸を単離するのに用いた手順の詳細である。５−(１,３−ジオキソラン−２−イル)−(Ｓ)−２−アミノペンタン酸の単離（Ｓ）−ａ−アミノ−１,３−ジオキソラン−２−ペンタン酸の水溶液（濃度
＝１６ｇ／Ｌ、３５００ｍＬ容量）（シュウ酸（濃度＝７.７４ｍＭ）が混入）
に窒素ガスを通気した。３０ｗ／ｖ％酢酸（５５ｍＬ）を加えることにより溶液
のｐＨを８.６から６.５に調節し、窒素ガスの噴霧を止めた。ｐＨ調節後、中和
した生成物溶液に１Ｍ塩化カルシウム溶液（８１.４ｍＬ）をシュウ酸の混入レ
ベルに基づいて加えた。得られたスラリーを室温で２０〜３０分間、６０℃で３
０〜６０分間攪拌し、〜５０℃で９００ｍＬまで真空濃縮した。得られたスラリ
ーを濾過し、濾液を残留シュウ酸について試験し（シグマキット５９１）、さら
に３５０ｍＬまで真空濃縮した。攪拌しながら濃縮物にメタノール（１４００ｍ
Ｌ）を加え、得られた混合物を５５〜６０℃で約１時間加熱した。得られた結晶
性のスラリーを１〜１.５時間かけて１〜５℃に冷却し、この温度で２〜４時間
保持した。生成物の結晶をフィルター上で回収し、冷メタノールで洗浄し、つい
でＬＯＤが１％未満となるまで４０〜５０℃で真空乾燥させて５−(１,３−ジオ
キソラン−２−イル)−(Ｓ)−２−アミノペンタン酸（４４.７ｇ、７８.５％回
収、標準と比べて９７.７％効力、ＨＰＬＣＡＰ＝９８.９％、ＨＰＬＣ保持時
間＝２.７分、残留（Ｒ）鏡像異性体＝明らかならず（not evident））を白色結
晶として得た。ＨＰＬＣ法：カラム；ＹＭＣＯＤＳＡＱ４×５０ｍｍ、溶媒；硫酸銅五水和物
、水中に７８２ｍｇ／Ｌ、流速＝１ｍＬ／分、および検出はＵＶ＠２３０ｎｍ、
保持時間＝２.７分。

【０１０６】実施例１１以下の方法に関する記載は、２０.０ｇの５−(１,３−ジオキソラン−２−イ
ル)−(Ｓ)−２−アミノペンタン酸から１７.４ｇ（８０.８Ｍ％）の（Ｓ）−２
−アミノ−６,６−ジメトキシヘキサン酸メチルエステルを調製するのに用いた
手順の詳細である。（Ｓ）−２−アミノ−６,６−ジメトキシヘキサン酸メチルエステルの調製窒素雰囲気下、メタノール（２４０ｍＬ）中の５−(１,３−ジオキソラン−２
−イル)−(Ｓ)−２−アミノペンタン酸（２０.０ｇ）および亜硫酸ジメチル（１
２.０ｇ）のスラリーにクロロトリメチルシラン（２８.０ｇ）を加えて均一な溶
液を得た。２９℃まで発熱するのを観察した後、溶液を４０〜４５℃に加熱し、
この温度で８時間、ついで〜２２℃で７２時間まで攪拌した。製造過程のＨＰＬ
Ｃ分析は反応が完了したことを示し（生成物への〜９３Ｍ％の変換）、得られた
溶液を−５〜−１０℃に冷却した。攪拌しながら、３２％（または４.４５Ｍ）
のカリウムメトキシドのメタノール溶液（７０ｍＬ）を温度を−５〜０℃の範囲
に保持しながらゆっくりと注意深く加えることにより混合物のみかけのｐＨを１
１.７〜１１.９に調節した。生成物のスラリーの分析（ＮＭＲ）は、中和が完了
したことを示していた（ＢＭＳ−２０５７８７のアルファプロトンのケミカルシ
フトは＜３.３６ｐｐｍであった）。

【０１０７】まず、薄いスラリーを真空下、＜３０℃で３００ｍＬ容量まで濃縮し、ついで
製造過程のＧＣ分析により判断されるように（＜１ＡＰ）メタノールの除去が完
了するまで酢酸エチルを加えることにより、生成物のスラリーの溶媒を酢酸エチ
ルで置換した。溶媒の置換が完了したらバッチ容量を酢酸エチルで〜４００ｍＬ
に調節し、得られたスラリーを濾過した。ポリ(アクリル酸コアクリルアミド)、
カリウム塩（３.０〜３.２ｇ）および水（３０〜３２ｍＬ）を濾液に加えた。こ
の混合物を〜３５分間攪拌し、濾過した。もしもエチレングリコールの量が製造
過程のＧＣ分析により判断されるように０.１５当量を超える場合には、ポリ(ア
クリル酸コアクリルアミド)、カリウム塩処理を濾液に対して任意に繰り返すこ
とができる。製造過程のＨＰＬＣ分析の後、（Ｓ）−２−アミノ−６,６−ジメ
トキシヘキサン酸メチルエステル（１７.４ｇ）を酢酸エチル溶液として８０.８
Ｍ％収率で得た。分析データ：ＨＰＬＣ：Ｔｒ＝７.１分（ＵＶ２１５）：Mac-Mod Analytical, Z
orbax CN ５μＭ、４.６×２５０ｍｍ、７２ｖ／ｖ％（０.０２Ｍリン酸アンモ
ニウム溶液）：２８ｖ／ｖ％アセトニトリル、２０μｌ注入容量、１.０ｍＬ／
分にて溶出。３００μｌ〜５ｍＬを移動相で希釈。

【０１０８】実施例１２以下の方法に関する記載は、５０ｇの５−(１,３−ジオキソラン−２−イル)
−(Ｓ)−２−アミノペンタン酸から６２.５ｇ（７８.７Ｍ％）の（Ｓ）−２−ア
ミノ−６,６−ジメトキシヘキサン酸メチルエステルシュウ酸塩（１：１）を調
製するのに用いた手順の詳細である。（Ｓ）−２−アミノ−６,６−ジメトキシヘキサン酸メチルエステルシュウ酸塩
（１：１）の調製メカニカルアジテーター、熱電対、加熱マントル、冷却器、窒素導入口および
通気孔を備えた２５０ｍＬ容の３つ首フラスコに、５−(１,３−ジオキソラン−
２−イル)−(Ｓ)−２−アミノペンタン酸（５０ｇ）、メタノール（３００ｍＬ
）および亜硫酸ジメチル（１１.２ｍＬ）を充填した。得られたスラリーにクロ
ロトリメチルシラン（８３.９ｍＬ）を加え、反応混合物を４０〜４２℃で約８
時間加熱し、ついで周囲温度で８時間攪拌した。重炭酸カリウム（１０４.３ｇ
）を２Ｌ容の３つ首フラスコに入れたメタノール（２００ｍＬ）中でスラリー化
し、（Ｓ）−２−アミノ−６,６−ジメトキシヘキサン酸メチルエステルの塩酸
塩を含有する反応混合物を重炭酸カリウムのスラリーに加え、混合物のｐＨを７
以上に保持することにより中和した。ハイフロー（１２.５ｇ）および酢酸ｎ−
ブチル（４００ｍＬ）を加え、混合物の温度を３０℃以下に保持しながら混合物
を真空（７６〜１８０ｍｍＨｇ）濃縮してメタノールを除去した。

【０１０９】このスラリーにｔ−ブチルメチルエーテル（３００ｍＬ）を加え、−５℃に冷
却した後、中和後の塩を濾去し、濾過ケーキをｔ−ブチルメチルエーテル（５０
ｍＬ）で洗浄した。コンバインした濾液を２０〜２５℃に温め、シュウ酸二水和
物（３６.７ｇ）の温（〜２７℃）メタノール（７３ｍＬ）溶液を約１時間かけ
て少しずつ加えた。得られた（Ｓ）−２−アミノ−６,６−ジメトキシヘキサン
酸メチルエステルシュウ酸塩（１：１）のスラリーを３０分間攪拌し、ｔ−ブチ
ルメチルエーテル（８００ｍＬ）をゆっくりと加えて生成物をさらに析出させた
。生成物のスラリーを３０分間攪拌した後、０〜５℃に冷却し、少なくとも１時
間保持し、ついで濾過した。湿ケーキをｔ−ブチルメチルエーテル（２×３００
ｍＬ）で洗浄し、真空下（〜２００ｍｍＨｇ）、４０℃以下の温度で乾燥させた
。生成物の（Ｓ）−２−アミノ−６,６−ジメトキシヘキサン酸メチルエステル
シュウ酸塩（１：１）（６２.５ｇ）（９７.０のＨＰＬＣＡＰおよび６８.３％
の遊離塩基効力（実験室標準に対して）を有する）を白色の自由流動性の粉末と
して、（Ｓ）−２−アミノ−６,６−ジメトキシヘキサン酸メチルエステルから
補正して７８.７Ｍ％補正収率で得た。

【０１１０】分析データ：ＨＰＬＣ：Ｔｒ＝１３.５分（ＵＶ２０５ｎｍ）：Rockland Techno
logies Inc., Zorbax CN ５μＭ、４.６×２５０ｍｍ（製品＃８８０９５２.７
０５）、８５ｖ／ｖ％（０.０１Ｍリン酸カリウム溶液）：１５ｖ／ｖ％アセト
ニトリル、１０μｌ注入容量、１.０ｍＬ／分にて溶出。ＨＰＬＣ応答は０.１６
〜１.５ｍｇ／ｍＬの範囲では線形であることがわかった。試料はメタノールま
たは移動相で希釈してよい。

【０１１１】実施例１３以下の方法に関する記載は、１００ｇの５−(１,３−ジオキソラン−２−イル
)−(Ｓ)−２−アミノペンタン酸から１００.３ｇ（７８Ｍ％、補正）の（Ｓ）−
２−アミノ−６,６−ジメトキシヘキサン酸メチルエステルシュウ酸塩（２：１
）を調製するのに用いた手順の詳細である。（Ｓ）−２−アミノ−６,６−ジメトキシヘキサン酸メチルエステルシュウ酸塩
（２：１）の調製メカニカルアジテーター、熱電対、加熱マントル、冷却器、窒素導入口および
通気孔を備えた２５０ｍＬ容の３つ首フラスコに、５−(１,３−ジオキソラン−
２−イル)−(Ｓ)−２−アミノペンタン酸（１００ｇ）、メタノール（１２００
ｍＬ）および亜硫酸ジメチル（４４.８ｍＬ）を充填した。得られたスラリーに
クロロトリメチルシラン（１６８ｍＬ）を加え、反応混合物を４０〜４２℃で約
８時間加熱し、ついで周囲温度で８時間攪拌して（Ｓ）−２−アミノ−６,６−
ジメトキシヘキサン酸メチルエステルの塩酸塩（製造過程の定量１００.９ｇ、
９３Ｍ％）の溶液を得た。重炭酸カリウム（２０８.６ｇ）を５Ｌ容の３つ首フ
ラスコに入れたメタノール（４００ｍＬ）中でスラリー化し、（Ｓ）−２−アミ
ノ−６,６−ジメトキシヘキサン酸メチルエステルの塩酸塩を含有する反応混合
物を重炭酸カリウムのスラリーに加え（１.５時間かけて）、混合物のｐＨを６.
９以上に保持することにより中和した。得られたスラリーの溶媒を、ポット容量
を約２Ｌに保持した真空蒸留（５０〜６０ｍｍＨｇおよび３０〜４０℃）により
酢酸ｎ−ブチルで置換した。２.２５Ｌの酢酸ｎ−ブチルを蒸留した後、蒸留容
器にメタノール（１.２５Ｌ）を加え、ポット容量をＮＬＴ２Ｌに保持しながら
、スラリー上澄み液の水分含量が＜０.０５重量％でメタノールレベルが＜５相
対面積％となるまで蒸留を継続した。

【０１１２】得られたスラリーにヘキサン（１.５Ｌ）を加え、ついで−５℃に冷却した。
この混合物を１時間攪拌した後、濾過し、濾過ケーキをヘキサン（２×１００ｍ
Ｌ）で洗浄した。得られた濁った濾液をポリッシュ（polish）濾過して透明な濾
液を得た。この透明な濾液を２０〜２５℃に温め、シュウ酸二水和物（３３.３
ｇ）のメタノール（１３３３ｍＬ）溶液を約２時間かけてゆっくりと加えた。得
られた（Ｓ）−２−アミノ−６,６−ジメトキシヘキサン酸メチルエステルシュ
ウ酸塩（２：１）のスラリーを周囲温度で１８時間攪拌し、ついで生成物を濾過
により回収した。生成物の湿ケーキをアセトニトリル（４×１００ｍＬ）で洗浄
し、真空下、４５℃で乾燥させて１０３.２ｇ（７８Ｍ％）の（Ｓ）−２−アミ
ノ−６,６−ジメトキシヘキサン酸メチルエステルシュウ酸塩（２：１）（８４
重量％の遊離塩基効力（理論的な実験室標準（＝８２重量％）に対して）および
１００のＨＰＬＣＡＰを有する）を得た。

【０１１３】分析データ：ＨＰＬＣ：Ｔｒ＝１０.０分（ＵＶ２０５ｎｍ）：Rockland Techno
logies Inc., Zorbax stable bond CN、５μＭ、４.６×２５０ｍｍ、８５ｖ／
ｖ％（０.０１Ｍリン酸二水素カリウム溶液、ＫＯＨでｐＨ７.５に調整）：１５
ｖ／ｖ％アセトニトリル、１０μｌ注入容量、１.０ｍＬ／分にて溶出。試料は
メタノールまたは移動相で希釈してよい。

【０１１４】実施例１４４−（３−ブロモプロピル）−１,３−ジオキソラン（１１０ｇ）から５−（
１,３−ジオキソラン−２−イル）−２−オキソ−ペンタン酸（６０．３ｇ、８
０モル％）を調製するのに用いた手順を以下に詳述する。５−（１,３−ジオキソラン−２−イル）−２−オキソ−ペンタン酸の調製

【化４１】滴下ロート、窒素ライン、オーバーヘッドマグネチックスターラー、熱電対お
よび水浴を備えた５００ｍｌの３つ首丸底フラスコに、マグネシウム削片(１４
．１３ｇ）を入れる。窒素雰囲気下、無水テトラヒドロフラン（ＫＦ＝０．００
１６重量％、３×７０ｍｌ）でマグネシウム削片を濯ぐ。フラスコにテトラヒド
ロフラン（７０ｍｌ、ＫＦ＝０．０２重量％）、次いで、予め調製したグリニャ
ール試薬のおよそ２Ｍのテトラヒドロフラン溶液５ｍｌを加える。滴下ロートに
、ブロモアセタール：クロロアセタール（８５：１５）の希釈しない混合物（１
１０ｇ、９０：１０重量％）を加える。反応フラスコにブロモアセタール混合物
約０．５ｍｌを加えた後、温度を２０℃から２５℃に上げる。反応温度が約３０
℃に維持されるように添加速度を調節する。添加ロートをテトラヒドロフラン(
２５ｍｌ）で濯ぎ、濯ぎ液を反応フラスコに加える。約１．５時間後に添加が完
了し、該バッチを室温まで放冷する。プロセス中のこの時点で、グリニャール試
薬のＧＣ分析により、ブロモアセタールの９０％がシクロブタン不純物を含まな
いグリニャール試薬に変換されたことがわかる。

【０１１５】１リットルの３つ首丸底フラスコは、窒素ライン、オーバーヘッドスターラー
および熱電対を備えている。窒素雰囲気下、フラスコに蓚酸ジエチル(７３．８
５ｇ）およびテトラヒドロフラン(２５０ｍｌ）を入れる。溶液を−６０℃に冷
却し、グリニャール試薬の溶液をカニューレにて冷却した蓚酸ジエチルに加え、
温度を−５５℃に維持する。グリニャール調製物のフラスコをテトラヒドロフラ
ン(３×２０ｍｌ）を洗浄し、得られる洗液をカニューレにて加える。約１．５
時間後に添加が完了し、反応物を−６０℃〜−５５℃にて約２時間攪拌する。冷
反応混合物を、ＮＨ_４Ｃｌ(３２．１ｇ）、水(１００ｍｌ）および酢酸エチル(
３００ｍｌ）からなる混合物に急速に加える。層を分離し、水層を再度酢酸エチ
ル(２×３００ｍｌ）で抽出する。有機層を合わせ、乾燥(硫酸マグネシウム)し
、濃縮して、５−（１,３−ジオキソラン−２−イル）−２−オキソ−ペンタン
酸エチルエステル（８７ｇ、収率７９Ｍ％）を濃厚な液体で得る。

【０１１６】１リットルの３つ首丸底フラスコは、オーバーヘッドスターラー、熱電対およ
び１．５ＮのＮａＯＨ(４６０ｍｌ）を含む添加ロートを備えている。フラスコ
にＭｅＯＨ(７００ｍｌ）を入れ、０℃に冷却する。温度を１０℃以下に維持し
ながらメタノールにＮａＯＨ溶液をゆっくりと加え、添加完了後、得られる溶液
を０℃に冷却する。滴下ロートを介して、反応混合物の温度を３℃以下に維持す
るような速度で、５−（１,３−ジオキソラン−２−イル）−２−オキソ−ペン
タン酸エチルエステル(３５０ｍｌ）のメタノール溶液を反応物に加える（添加
時間１時間）。反応物を０℃で２時間攪拌し、２Ｍの重硫酸カリウム(７５ｍｌ
）を添加することによって反応物のｐＨを７．７１に調節する。メタノールを蒸
発し、濁った水性スラリーををＭＴＢＥ(３×５００ｍｌ）で洗浄する。２Ｍの
重硫酸カリウム(１００ｍｌ）を添加することによって水層のｐＨを４．５に調
節し、酢酸エチル(５００ｍｌ）で抽出する。２Ｍの重硫酸カリウム(５０ｍｌ）
を添加することによって水層のｐＨをさらに２．０に調節し、酢酸エチル(２×
５００ｍｌ）で抽出する。酢酸エチル抽出物を合わせ、乾燥（硫酸マグネシウム
）し、濃縮して、５−（１,３−ジオキソラン−２−イル）−２−オキソ−ペン
タン酸（６０ｇ、収率８０Ｍ％）を濃厚な液体で得る。（５−（１,３−ジオキソラン−２−イル）−２−オキソ−ペンタン酸）^１Ｈ
−ＮＭＲ：３００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ_３：δ１．７５（ｂｒｍ,４Ｈ）、２．９５
（ｔｒ，２Ｈ）、３．８５（ｍ，２Ｈ）、３．９５（ｍ，２Ｈ）、４．８５（ｔ
ｒ，１Ｈ）および７．７０（ｂｒｓ，１Ｈ）。^１３Ｃ−ＮＭＲ：７５ＭＨｚ；
ＣＤＣｌ_３：δ１７．２７、３２．３０、３７．１９、６４．８５、１０３．９
４、１６０．１９および１９５．３８。

【０１１７】反応工程式４にて、実施例１５および１６における反応を示す。反応工程式４

【化４２】

【０１１８】実施例１５５０ｍｌのエルレンマイヤーフラスコに、ギ酸アンモニウム(１７５ｍｇ、２
．７７５ミリモル）、６，６−ジメトキシ−２−オキソへキサン酸モノリチウム
塩(５０ｍｇ、０．２２５ミリモル）、水(１０ｍｌ）、ジチオスレイトール(１
．６４ｍｇ、１０．６マイクロモル）、ＮＡＤ(７．０５ｍｇ、１０．３マイク
ロモル）、サーモアクチノマイセス・インテルメジウス（Thermoactinomyces in
termedius）からフェニルアラニンデヒドロゲナーゼをクローニングされた熱乾
燥大腸菌（５０ｍｇ、６２．５ユニット）および熱乾燥カンジダ・ボイジニイ（
Candida boidinii）（８２．５５ｍｇ、２．７５ユニット）をこの順番で加える
。調節なしのｐＨは８．０３である。フラスコを４０℃、２００ｒｐｍで１８時
間震とうする。キラルパクＷＨカラム（ダニエル・ケミカル・インダストリーズ
）を用いて、５−（１,３−ジオキソラン−２−イル）−（Ｓ）−２−アミノ−
ペンタン酸で記載したのと同じ方法によって、生成物（Ｓ）−２−アミノ−６，
６−ジメトキシヘキサン酸の濃度を評価する。アミノ酸のモル収率は７４．５％
である。ＨＰＬＣ標準として、５−（１,３−ジオキソラン−２−イル）−（Ｓ
）−２−アミノ−ペンタン酸を用いて、濃度を評価する。ＭＳ：（Ｍ＋Ｈ）^＋，
１９２。

【０１１９】実施例１６５０ｍｌのエルレンマイヤーフラスコに、ギ酸アンモニウム(３８９．８ｍｇ
、６．１８ミリモル）、６，６−ジメトキシ−２−オキソへキサン酸モノリチウ
ム塩(１．０００ｇ、５．０９９ミリモル）、水(２０ｍｌ）、ジチオスレイトー
ル(３．２８ｍｇ、２１．２７マイクロモル）、ＮＡＤ(１４．１ｍｇ、２０．５
７マイクロモル）、凍結保存したピシア（Pichia）ウエット細胞（サーモアクチ
ノマイセス・インテルメジウス由来の５．５ｕのギ酸デヒドロゲナーゼおよび３
４．７ユニットのフェニルアラニンデヒドロゲナーゼを含む０．２２５５ｇ）を
この順番で加える。ＮＨ_４ＯＨにて７．５６〜８．０にｐＨを調節する。フラス
コを４０℃、２００ｒｐｍにて４３時間震とうする。反応後、遠心分離によって
細胞を除去し、次いで、１００００ＭＷのカットオフポリスルホン膜（ＹＭ１０
）を用いて上清を限外濾過する。細胞およびタンパク質を除去した後にキラルパ
クＷＨカラムを用いて評価した（Ｓ）−２−アミノ−６，６−ジメトキシオキソ
へキサン酸の補正された全収率は１０８％である。

【０１２０】実施例１７４，４−ジメトキシ−１−ブロモブタン（１０ｇ）から６，６−ジメトキシ−
２−オキソヘキサン酸（４．３３ｇ、２５モル％）を調製するのに用いた手順を
以下に詳述する。滴下ロート、窒素ライン、オーバーヘッドスターラー、熱電対および水浴を備
えた１００ｍｌの３つ首丸底フラスコに、マグネシウム削片(１．７ｇ）を入れ
る。窒素雰囲気下、無水テトラヒドロフラン（１０ｍｌ）でマグネシウム削片を
濯ぐ。フラスコにテトラヒドロフラン（６ｍｌ、ＫＦ＝０．０２重量％）、次い
で、予め調製したグリニャール試薬（４，４−ジメトキシ−１−マグネシオブロ
モブタン）のテトラヒドロフラン溶液１ｍｌを加える。滴下ロートに、４，４−
ジメトキシ−１−ブロモブタンのＴＨＦ溶液（１０ｇ、ＴＨＦ２６ｍｌ中）を加
える。温度を２８〜３１℃に維持しながら溶液を滴下する。添加完了後、溶液を
３０℃で１時間保持する。

【０１２１】窒素ライン、オーバーヘッドスターラーおよび熱電対を備えた１００ｍｌの３
つ首丸底フラスコを２０ｍｌの無水ＴＨＦで濯ぐ。ジエチルオキサレート(４．
８５ｇ）およびＴＨＦ(１０ｍｌ）をフラスコに入れ、溶液を−７０まで冷却す
る。温度を−６０〜−７０℃に維持しながら、ジエチルオキサレート溶液にグリ
ニャール試薬（４，４−ジメトキシ−１−マグネシオブロモブタン）のＴＨＦ溶
液を入れる。インプロセスＧＣ分析（未反応ジエチルオキサレート：０．５％）
によって反応の完了を判定した後、反応混合物を−７０℃で２時間保持する。反
応混合物混合物にクエン酸溶液（水４０ｍｌに５ｇのクエン酸を溶解）を加えて
反応を停止する。反応停止した反応混合物をメチル第３ブチルエーテル(２×２
０ｍｌ）で抽出し、メチル第３ブチルエーテル抽出物を合わせ、ｐＨ６．５の一
塩基性リン酸ナトリウムの溶液（水２０ｍｌ中２ｇ、１０Ｎ水酸化ナトリウム溶
液でｐＨを調節）で洗浄する。濃厚な有機相を２℃に冷却し、温度を５℃以下に
維持しながら水酸化リチウム溶液（水１５ｍｌ中、ＬｉＯＨ１．４ｇ）を滴下す
る。インプロセスＧＣ分析が反応の完了を示すまで（有機相中、未反応エステル
：＜０．５％）、反応混合物を５℃にて３０分間攪拌する。相を分離し、有機相
を水(２ｍｌ）で抽出する。濃厚な水相にイソプロパノール(３００ｍｌ）を加え
、得られるスラリーを回転蒸発器にて濃縮して固体を得る。固体をメチル第３ブ
チルエーテル(３００ｍｌ）とイソプロパノール(１００ｍｌ）の混合物に懸濁し
、スラリーを３℃にて１時間攪拌し、濾過により生成物を集める。生成物のウエ
ットケーキを冷メチル第３ブチルエーテル／イソプロパノール(７５ｍｌ、４：
１）で洗浄し、減圧乾燥して、６，６−ジメトキシ−２−オキソヘキサン酸リチ
ウム（４．３３ｇ、４，４−ジメトキシ−１−ブロモブタンからの収率２５モル
％）を得る。分析データ：ＨＰＬＣ：Ｔｒ＝４．４分（ＵＶ２１０ｎｍ）：ＹＭＣ−basic
、５μＭ、４．６×２５０ｍｍ、９０ｖ／ｖ％（０．０５Ｍ酢酸アンモニウム溶
液）：１０ｖ／ｖ％アセトニトリル、１０μＬを注入、溶離速度１．０ｍｌ／分
。分析データ：^１Ｈ−ＮＭＲ：３００ＭＨｚ；Ｄ_２Ｏ：δ１．６（ｂｒｍ,６Ｈ
）、３．３（ｓ，６Ｈ）および４．４（ｍ，１Ｈ）。^１３Ｃ−ＮＭＲ：７５ＭＨ
ｚ；Ｄ_２Ｏ：δ１８．７８、３２．３９、３９．７０、５４．３４、１０５．８
５および２０７．０３。

【０１２２】実施例１８１００００ＭＷ限外濾紙を通す限外濾過を行った後、酵素還元的アミノ化プロ
セスを行って、（Ｓ）−２−アミノ−６，６−ジメトキシヘキサン酸を単離する
のに用いた手順を以下に詳述する。（Ｓ）−２−アミノ−６，６−ジメトキシヘキサン酸の単離蓚酸（濃度＝５．４ｍＭ）で汚染された（Ｓ）−２−アミノ−６，６−ジメト
キシヘキサン酸（濃度＝２６．５ｇ／Ｌ、体積３５ｍｌ）の水溶液を窒素でスパ
ージする。３０ｗ／ｖ％酢酸(１．２ｍｌ）を加えて溶液のｐＨを約６．５に調
節し、窒素によるスパージングを停止する。ｐＨを調節した後、蓚酸による汚染
の程度に応じて中和された生成物溶液に１Ｍ塩化カルシウム溶液(１．３ｍｌ）
を加える。得られるスラリーを室温にて２０〜３０分間、５５℃にて３０分間攪
拌し、蓚酸カルシウムを濾去する。濾液をDarco Ｇ−６０で３０分間攪拌し、Hy
Floにて濾過する。ｎ−ＢｕＯＨを用いて濾液から水分を共沸除去して減圧濃縮
し、泡状物(２．０４ｇ）を得る。泡状物をメタノール(５．１ｍｌ）に溶解し、
アセトニトリル(１５ｍｌ）と混合する。溶液に（Ｓ）−２−アミノ−６，６−
ジメトキシヘキサン酸の種晶を入れ、氷浴で４時間冷却する。濾過して生成物を
集め、ウエットケーキを５０℃で４時間減圧乾燥して、（Ｓ）−２−アミノ−６
，６−ジメトキシヘキサン酸（０．３９２ｇ、インプット溶液からの収率３５．
６モル％、ＨＰＬＣエリア％＝９７．６）を得る。分析データ：ＨＰＬＣ：Ｔｒ＝３．６分（ＵＶ２３０ｎｍ）：ＹＭＣ−ＯＤＳ
ＡＱ、４．６×５０ｍｍ、無水硫酸銅＠５００ｍｇ／Ｌ濃度、１０μＬを注入
、溶離速度１．０ｍｌ／分。分析データ：^１Ｈ−ＮＭＲ：３００ＭＨｚ；Ｄ_２Ｏ：δ１．３−１．５（ｍ,
２Ｈ）、１．６−１．７５（ｍ,２Ｈ）、３．４（ｓ，６Ｈ）、３．７５（ｔｒ
，１Ｈ）および４．６（ｔｒ，１Ｈ）。^１３Ｃ−ＮＭＲ：７５ＭＨｚ；Ｄ_２Ｏ：
δ１９．８９、３０．５７、３２．０５、５３．８２、５５．１１、１０５．０
７および１７５．０５。

【０１２３】実施例１９ＦＤＨおよびＰＤＨのデュアル構成性発現１．組換え菌株ピシア・パストリスＧＳ１１５（ｐＧＡＰＺ−ＦＤＨ）の構築ｐＧＡＰＺは、インビトロゲン社（カールスバド、カナダ）から入手できるベ
クターである。ｐＧＡＰＺは、構成性グリセルアルデヒド３'−リン酸プロモー
ターの制御下にピシア・パストリスにおいて外来性遺伝子を発現させる。カンジ
ダ・ボイジニイ由来のギ酸デヒドロゲナーゼ（ｆｄｈ）遺伝子はｐＧＡＰＺ内へ
以下のようにクローニングされる。クローニングされたカンジダ・ボイジニイｆｄｈ遺伝子のＤＮＡ配列を決定し
、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を用いる増幅のためのオリゴヌクレオチドプラ
イマーに対して用いる。プライマーは、（ＮＨ_２末端）５'−ＧＧＡＡＴＴＣＣ
ＡＴＡＴＧＡＡＧＡＴＣＧＴＴＴＴＡＧＴＣＴＴＡ'３'（配列番号１）および（
ＣＯＯＨ末端）５'−ＣＣＴＴＡＡＧＡＡＴＡＡＴＡＡＡＧＡＡＴＡＧＡＣＡＡ
ＡＴＧＧ−３'（配列番号２）である。カンジダ・ボイジニイ染色体ＤＮＡをＰ
ＣＲ反応の標的として用いる。ＰＣＲ反応により、予定の大きさ（およそ１１０
０塩基対）の一本鎖ＤＮＡフラグメントが得られ、これを単離、精製し、制限エ
ンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩで切断する。切断したＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩ処理
ｐＧＡＰＺＤＮＡにライゲートし、ライゲーション混合物を電気穿孔により、
Ｅ．coli菌株ＴＯＰ１０Ｆ'を形質転換する。２５ｍｇ／ｍｌの抗生物質ゼオシ
ン（Zeocin）（インビトロゲン）を含むＬＢ寒天培地で形質転換した細胞を選択
する。ＰＣＲにより、ｆｄｈ遺伝子の存在について１８個のコロニーをテストす
る；３個が陽性である。ｆｄｈ遺伝子の配列決定を行い、Sakai，YらのJ.of Bac
teriology、１７９、ｐ４４８０−４４８５（１９９７）に記載されているもの
と同じであることを決定する。プラスミドｐＧＡＰＺ―ＦＤＨを含む１つのコロ
ニーを選び、続いての実験に用いる。ＴＯＰ１０Ｆ'（ｐＧＡＰＺ―ＦＤＨ）か
らプラスミドＤＮＡを単離し、制限エンドヌクレアーゼＡｖｒＩＩで直線化し、
電気穿孔にてピシア・パストリスＧＳ１１５を形質転換する。２ｇ／リットルゼ
オシンを含む培地へ細胞を拡散させることによってｐＧＡＰＺ―ＦＤＨの組込ま
れたコピーを多く含む形質転換細胞を選択する。このようなコロニーが数個得ら
れ、ｐＧＡＰＺのみを含む細胞の少なくとも２倍のＦＤＨ活性をもつことがわか
る（ピシア・パストリスはそれ自身のＦＤＨ遺伝子を含む）。続いての実験のた
めに、高いＦＤＨ活性を示す単離体を選び、ＧＳ１１５（ｐＧＡＰＺ−ＦＤＨ）
と称する。

【０１２４】２．ｐＧＡＰｋ−ＰＤＨの構築デュアル構成性発現菌株の構築における次の段階は、組換えフェニルアラニン
デヒドロゲナーゼ（ｐｄｈ）遺伝子をＧＳ１１５（ｐＧＡＰＺ−ＦＤＨ）に導入
することである。この菌株は、すでにゼオシン耐性があるので、構成性プロモー
ターを含むが、形質転換細胞に対して別の選択方法を可能にするプラスミドが作
成される。グリセルアルデヒド３'−リン酸プロモーター領域を含むｐＧＡＰＺ
の５４６塩基対のＢｇｌＩＩＩ／ＮｏｔＩ制限フラグメントを、ｐＰＩＣ９ｋ（
インビトロゲン）の９０００塩基対のＢｇｌＩＩＩ／ＮｏｔＩフラグメント内に
クローニングする。新しいプラスミドをｐＧＡＰｋと称する。ｐＧＡＰｋは、Ｇ
Ｓ１１５に存在する不完全バージョンを補う機能性ＨＩＳ４遺伝子の存在により
、最小量の培地での形質転換細胞の選択を可能にする。抗生物質Ｇ４１８に対す
る耐性を用いて、多くの組込み体を選択することができ、プラスミドによってコ
ードされる。ｐＧＡＰｋのマップを添付する。

【０１２５】３．組換えプラスミドｐＧＡＰｋ−ＰＤＨの構築およびＧＳ１１５（ｐＧＡＰｋ
−ＦＤＨ）の形質転換サーモアクチノマイセス・インテルメジウスフェニルアラニンデヒドロゲナー
ゼ遺伝子の公表された遺伝子配列（Takada,Hら、J.of Biochem.、１０９、ｐ３
７１−３７６（１９９１））を用い、ＮＨ_２（５'−ＣＧＧＡＡＴＴＣＡＡＧＡ
ＴＧＣＧＣＧＡＣＧＴＧＴＴＴＧＡＡＡＴＧ−３'）（配列番号３）およびＣＯ
ＯＨ（５'−ＣＧＴＴＣＴＣＧＣＧＴＴＣＣＴＣＣＡＴＴＧＡＧＣＴＣＧＣＣ−
３'）（配列番号４）末端に対応するＤＮＡプライマーを合成する。それらを用
い、サーモアクチノマイセス・インテルメジウス染色体ＤＮＡを標的ＤＮＡとし
てＰＣＲを行う。寒天ゲル電気泳動後、予定の大きさのフラグメント（およそ１
１００塩基対）が見られる。ＤＮＡを精製し、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲ
ＩとＸｈｏＩで切断する。ＥｃｏＲＩでｐＧＡＰｋを切断し、次いでＸｈｏＩで
部分的に切断する；寒天ゲル電気泳動後、９５００塩基対のフラグメントが単離
される。２つのフラグメントを一緒にライゲートし、Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ１０Ｂを
形質転換する。ＰＣＲにより、ｐｄｈ遺伝子の存在について形質転換細胞をスク
リーニングする。このようなコロニーを同定し、プラスミドをｐＧＡＰｋ−ＰＤ
Ｈと称する。制限酵素ＡｖｒＩＩを用いてｐＧＡＰｋ−ＰＤＨを直線化し、電気穿孔により
ピシア・パストリスＧＳ１１５（ｐＧＡＰｋ−ＦＤＨ）を形質転換する。Ｇ４１
８（４ｇ１１）に対する耐性について、およそ１００００個のコロニーをスクリ
ーニングする。数個の耐性コロニーを単離し、液体ＹＰＤ培地で成長させ、次い
で採取し、ＰＤＨおよびＦＤＨ活性をアッセイする。両方の活性が存在する。５
−（１,３−ジオキサラン−２−イル）−２−オキソ−ペンタン酸から５−（１,
３−ジオキサラン−２−イル）−（Ｓ）−２−アミノペンタン酸への生物変換を
評価するための使用試験は、組換え単離体からの細胞抽出物を用いて陽性である
。

【０１２６】実施例２０ｐＰＤＨ誘発性発現系１．組換え菌株Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＰＤＨ１５５Ｋ）によるｒ
ＰＤＨの発現最終組換えベクター（ｐＰＤＨ１５５Ｋ）の構築は２段階である：ａ）組換え
ベクターｐＰＤＨ１５ｂ／１を作成するための、プラスミドベクターｐＥＴ１５
ｂ（ノヴァゲン、マジソン、ＷＩ；図１）へのサーモアクチノマイセス・インテ
ルメジウスＰＤＨ遺伝子のクローニング；およびｂ）ベクターｐＥＴ９ｂ（ノヴ
ァゲンマジソン、ＷＩ；図２）のカナマイシン耐性マーカーによるプラスミドベ
クターｐＰＤＨ１５ｂ／１のアンピシリン耐性マーカーの交換。この発現系にお
けるＰＤＨ遺伝子の発現は、強力なＴ７プロモーターの制御下にある。ＰＤＨ発
現の誘発は、ＩＰＴＧ（イソプロピルＢ−Ｄ−チオガラクトピラノシド）による
。ＰＤＨタンパク質の発現は、細胞内である。

【０１２７】組換え菌株Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＰＤＨ１５５Ｋ）（ＡＴＣＣ
９８３７４）を次の方法で構築する。サーモアクチノマイセス・インテルメジウ
スフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子の公表された遺伝子配列（Takada,H
ら、J.of Biochem.、１０９、ｐ３７１−３７６（１９９１））を用い、ＰＤＨ
タンパク質のＮ−（５'ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＴＣＧＡＣＧＴＧＴＴＴＧＡＡＡ
ＴＧＡＴＧＧ３'）（配列番号５）およびＣ−（５'ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＴＴＡＣ
ＣＴＣＣＴＴＧＣＧＣＴＧＴＴＧＣ３'）（配列番号６）末端に対応するＤＮＡ
プライマーを合成し、サーモアクチノマイセス・インテルメジウス標的ＤＮＡを
用いるＰＣＲ反応に使用する。ＰＣＲ反応により、予定の大きさの一本鎖ＤＮＡ
フラグメントが得られ、これを単離し、精製し、次いで、制限酵素ＮｃｏＩおよ
びＸｈｏＩで切断する。切断されたＰＣＲフラグメントをＮｃｏＩ／ＸｈｏＩ切
断ｐＥＴ１５ｂプラスミドベクターとライゲートし、電気穿孔により、ライゲー
ション混合物でＥ．coli菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換する。単離されたＥ
．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＰＤＨ１５ｂ／１）の誘発培養物由来の細胞
抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から、正しい大きさの過剰発現タンパク質の存在
がわかる。ＰＤＨ活性アッセイならびに５−（１,３−ジオキサラン−２−イル
）−２−オキソ−ペンタン酸から５−（１,３−ジオキサラン−２−イル）−（
Ｓ）−２−アミノペンタン酸への生物変換を評価するための使用試験は、組換え
細胞抽出物を用いて陽性である。

【０１２８】次いで、ベクターｐＰＤＨ１５ｂ／１を単離し、制限酵素ＡｌｗおよびＥｃｏ
ＲＩで切断する。これら２つの酵素によるｐＰＤＨ１５ｂ／１の切断は、ＰＤＨ
発現カセットまたはプラスミド複製／維持機能に影響を及ぼすことなく、アンピ
シリン耐性遺伝子を完全に欠落させる。同様に、プラスミドベクターｐＥＴ９ｂ
を同じ２つの制限酵素で切断し、カナマイシン耐性遺伝子を含む１．１７ｋｂの
ＡｌｗＮＩ／ＥｃｏＲＩＤＮＡフラグメントを単離し、次いでｐＰＤＨ１５ｂ
／１ＰＤＨ含有フラグメント（上記）とのライゲーション反応に用いる。ライ
ゲーション混合物を用いて、電気穿孔により、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＢＬ２１（ＤＥ
３）を形質転換する。カナマイシン耐性形質転換細胞（Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２（Ｄ
Ｅ３）（ｐＰＤＨ１５５Ｋ））を単離し、ＰＣＲによってＰＤＨ発現カセットの
存在を証明する。ＰＤＨ活性ならびに組換え菌株細胞溶解液を用いる５−（１,
３−ジオキサラン−２−イル）−２−オキソ−ペンタン酸から５−（１,３−ジ
オキサラン−２−イル）−（Ｓ）−２−アミノペンタン酸への生物変換を評価す
るための使用試験は、陽性である。

【０１２９】２．組換え菌株ピシア・パストリスＳＭＤ１１６８（ｐＰＤＨ９Ｋ／１０）によ
るＦＤＨ／ｒＰＤＨの発現５−（１,３−ジオキサラン−２−イル）−２−オキソ−ペンタン酸から５−
（１,３−ジオキサラン−２−イル）−（Ｓ）−２−アミノペンタン酸への生物
変換には、フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）およびギ酸デヒドロゲ
ナーゼ（ＦＤＨ）という２つの酵素が関与する。組換え菌株ピシア・パストリス
ＳＭＤ１１６８（ｐＰＤＨ９Ｋ／１０）は、ピシア・パストリスの内因性ＦＤＨ
とサーモアクチノマイセス・インテルメジウスのクローニングされたＰＤＨ遺伝
子を用いる１細胞ＦＤＨ／ｒＰＤＨ系として構築される。最終組換えベクター（
ｐＰＤＨ９Ｋ）の構築は、２つの段階からなる：ａ）まず、サーモアクチノマイ
セス・インテルメジウスｐｄｈ遺伝子をプラスミドベクターｐＩＣＺ（インビト
ロゲン、サンディエゴ、カリフォルニア；図３）内へクローニングすることによ
り、プラスミドベクターｐＩＣＺ−ＰＤＨを構築し；次いで、ｂ）ベクターｐＩ
ＣＺ−ＰＤＨ内でクローニングされたＰＤＨ遺伝子をプラスミドＲベクターｐＩ
Ｃ９Ｋ（インビトロゲン、サンディエゴ、カリフォルニア）内へ移すことによっ
て、プラスミドベクターｐＰＤＨ９Ｋを構築する。この発現系におけるＰＤＨは
、メタノールによって発現を誘発されるＡＯＸ１の制御下にある。

【０１３０】組換え菌株ピシア・パストリスＳＭＤ１１６８（ｐＰＤＨ９Ｋ／１０）（ＡＴ
ＣＣ７４４０８）を以下の方法で単離する。サーモアクチノマイセス・インテル
メジウスｐｄｈの公表されたＤＮＡ配列を用い、ｐｄｈ遺伝子のＮ−（５'ＣＧ
ＧＡＡＴＴＣＡＡＧＡＴＧＣＧＣＧＡＣＧＴＧＴＴＴＧＡＡＡＴＧ３'）（配列
番号７）およびＣ−（５'ＧＧＧＧＴＡＣＣＣＣＴＣＣＴＴＧＣＧＣＴＧＴＴＧ
ＣＧＧＧＧ３'）（配列番号８）末端に対応するＤＮＡプライマーを合成し、サ
ーモアクチノマイセス・インテルメジウス標的ＤＮＡを用いるＰＣＲ反応に使用
する。ＰＣＲ反応により、予定の大きさの一本鎖ＤＮＡフラグメントが得られ、
これを単離し、精製し、次いで、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで切断する
。切断されたＰＣＲフラグメントをＥｃｏＲＩ／ＫｐｎＩ切断プラスミドベクタ
ーｐＩＣＺとライゲートし、電気穿孔により、ライゲーション混合物でピシア・
パストリス菌株ＧＳ１１５を形質転換する。組換え単離ピシア・パストリスＧＳ
１１５（ｐＩＣＺ−ＰＤＨ）由来の細胞抽出物におけるＰＤＨ活性の分析は、陽
性である。

【０１３１】次いで、プラスミドｐＩＣＺ−ＰＤＨを制限酵素ＰｍｅＩおよびＮｏｔＩで切
断し、次いで、ｐｄｈカセットを含む２．５ｋｂのＤＮＡフラグメントを単離し
、精製する。同様に、プラスミドベクターｐＩＣ９Ｋを同じ２つの制限酵素で切
断し、精製する。２つの切断ＤＮＡをライゲートし、電気穿孔により、ライゲー
ション混合物でピシア・パストリス菌株ＳＭＤ１１６８を形質転換する。高レベ
ルの抗生物質Ｇ４１８（４ｍｇ／ｍｌ）に対する耐性について、この電気穿孔に
より得られる形質転換細胞をスクリーニングすると、多くのプラスミド組込みイ
ベントを含む単離体が存在することがわかる。メタノール誘発後、８個の高Ｇ４
１８耐性コロニーを組換えＰＤＨ発現について試験する。１つの単離体[ピシア
・パストリスＳＭＤ１１６８（ｐＰＤＨ９Ｋ／１０）]は、他の試験した形質転
換細胞と比べて、有意に高いレベルのＰＤＨ活性があることを実証する。ＦＤＨ
活性は、予測されるように、この単離体からの細胞抽出物において著しい。この
単離体からの細胞抽出物を用いる５−（１,３−ジオキサラン−２−イル）−２
−オキソ−ペンタン酸から５−（１,３−ジオキサラン−２−イル）−（Ｓ）−
２−アミノペンタン酸への生物変換を評価するための使用試験は、陽性であり、
反応混合物に外来性ＦＤＨを加える場合または反応混合物にＦＤＨを加えない場
合のどちらの場合においても、この１細胞ＦＤＨ／ｒＰＤＨ系の有効性が実証さ
れる。

【図面の簡単な説明】

【図１】プラスミドｐＥＴ−１５ｂを示す。配列の番号付けはｐＢＲ３２
２の慣例による。配列の目印としては、４５３−４６９のＴ７プロモーター；４
５２のＴ７転写開始部位；３６２−３８０のＨｉｓタグコード配列；２１３−２
５９のＴ７ターミネーター；３８８２のｐＢＲ３２２起点；および４６４３−５
５００のｂｌａコード配列が挙げられる。

【図２】プラスミドｐＥＴ−９ｂを示す。

【図３】プラスミドｐＰＩＣＺＡ,Ｂ,Ｃを示す。特徴としては、１−９４
２の５'ＡＯＸ１プロモーター領域；８２４のＡＯＸ１ｍＲＮＡの５'末端；８
５５−８７５の５'ＡＯＸ１プライミング部位；９３２−１０１１のマルチプル
クローニングサイト；１０１２−１０４４のｍｙｃエピトープタグ；１０５７−
１０７７のポリヒスチジンタグ；１１６０−１１８０の３'ＡＯＸプライミング
部位；１２５１のｍＲＮＡの３'末端；１０７８−１４１９のＡＯＸ１転写停止
領域；１４２０−１８３１のＴＥＦ１プロモーター含有フラグメント；１８３２
−１８９９のＥＭ７プロモーター；１９００−２２７４のＳｈｂｌｅＯＲＦ；
２２７５−２５９２のＣＹＣ１転写停止領域；２６０３−３２７６のＣｏｌＥ１
起点。

【図４】プラスミドｐＰＩＣ９ｋを示す。特徴としては、１−９４８の５
'ＡＯＸ１プロモーターフラグメント；８５５−８７５のＡＯＸ１プライマー部
位；９４９−１２１８のα因子分泌シグナル；１１５２−１１７２のα因子プラ
イマー部位；１１９２−１２４１のマルチプルクローニングサイト；１３２７−
１３４７の３'ＡＯＸ１プライマー部位；１２５３−１５８６の３'ＡＯＸ１転写
停止領域；４５１４−１９８０のＨＩＳ４ＯＲＦ；５７４３−４９２８のカナ
マイシン耐性遺伝子；６１２２−６８７９の３'ＡＯＸ１フラグメント；７９６
１−７２８８のＣｏｌＥ１開始点；８９６６−８１０６のアンピシリン耐性遺伝
子。

【図５】プラスミドｐＧＡＰＺＡ,Ｂ,Ｃを示す。特徴としては、１−４８
３のＧＡＰプロモーター領域；４５５−４７６のｐＧＡＰフォアウォードプライ
ミング部位；４８４−５６３のマルチプルクローニングサイト；５６４−５９３
のｍｙｃエピトープタグ；６０９−６２６のポリヒスチジンタグ；７１１−７３
１の３'ＡＯＸ１プライミング部位；６３０−９７０のＡＯＸ１転写停止領域；
９７１−１３８１のＴＥＦ１プロモーター含有フラグメント；１３８２−１４４
９のＥＭ７プロモーター；１４５０−１８２４のＳｈｂｌｅＯＲＦ；１８２５
−２１４２のＣＹＣ１転写停止領域；２１５３−２８２６のＣｏｌＥ１開始点。

【図６】プラスミドｐＧＡＰｋを示す。プラスミドｐＧＡＰｋは、ｐＰＩ
Ｃ９ｋの８９８０塩基対（ｂｐ）のＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩ断片中にクローニング
したＧＡＰプロモーターおよびマルチプルクローニングサイトを含有するｐＧＡ
ＰＺからの５４６ｂｐのＢｇｌＩＩ／ＮｏｔＩ断片を有する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｐ 13/00 Ｃ１２Ｒ 1:01）Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 13/00 (Ｃ１２Ｐ 13/00 Ｃ１２Ｒ 1:84）Ｃ１２Ｒ 1:84） (Ｃ１２Ｎ 1/19 (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:84) Ｃ１２Ｒ 1:84) (Ｃ１２Ｐ 17/04 (Ｃ１２Ｐ 17/04 Ｃ１２Ｒ 1:01) Ｃ１２Ｒ 1:01) (Ｃ１２Ｐ 17/04 (Ｃ１２Ｐ 17/04 Ｃ１２Ｒ 1:84) Ｃ１２Ｒ 1:84) (Ｃ１２Ｐ 17/06 (Ｃ１２Ｐ 17/06 Ｃ１２Ｒ 1:01) Ｃ１２Ｒ 1:01) (Ｃ１２Ｐ 17/06 (Ｃ１２Ｐ 17/06 Ｃ１２Ｒ 1:84) Ｃ１２Ｒ 1:84) Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者スティーブン・ゴールドバーグアメリカ合衆国07933ニュージャージー州ジレット、サンライズ・ドライブ100番 (72)発明者ロナルド・エル・ハンソンアメリカ合衆国07950ニュージャージー州モリス・プレインズ、ホワイトウッド・ドライブ54番 (72)発明者ポール・エイ・ジャスアメリカ合衆国08527ニュージャージー州ジャクソン、イースト・プレザント・グローブ・ロード315番 (72)発明者ウェン−セン・リアメリカ合衆国07733ニュージャージー州ホームデル、ディアボーン・ドライブ14番 (72)発明者ラメシュ・エヌ・ペイテルアメリカ合衆国08807ニュージャージー州ブリッジウォーター、キャボット・ヒル・ロード572番 (72)発明者キース・ラミグアメリカ合衆国07050ニュージャージー州オレンジ、ローン・リッジ・ロード389番 (72)発明者ラズロ・ジェイ・サーカアメリカ合衆国08816ニュージャージー州イースト・ブランズウィック、ウェリントン・ロード５番 (72)発明者ジョン・ジェイ・ベニットアメリカ合衆国08902ニュージャージー州ノース・ブランズウィック、ドーズ・ロード260番Ｆターム(参考） 4B024 BA08 BA71 CA04 DA05 DA06 DA12 EA04 GA11 4B064 AE03 CA02 CA03 CA06 CA21 CB16 CC03 CC24 CD15 DA16 4B065 AA01X AA26X AA73X AA77X AB01 BA02 CA17 CA28

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】式：【化１】（式中、Ｒ^１は水素またはＣ_１−Ｃ_１８アルキルまたは一価カチオン、Ｒ^２は式
：【化２】で示される残基、式：【化３】（式中、各Ｒ^３はＣ_１−Ｃ_１８アルキル）で示される残基、または式：【化４】（式中、各Ｒ^４はＨまたはＲ^３）で示される残基）で示されるアルキルアミノ酸
化合物の製造方法であって、式（式II）：【化５】（式中、Ｒ^２は前記と同じ、Ｒ^１は前記と同じ）で示されるケト化合物をアンモ
ニアおよび補因子の存在下、式Ｉの化合物の生成に適した条件下でアミノ酸デヒ
ドロゲナーゼに接触させることを含む、方法。
【請求項２】Ｒ^１が水素である請求項１に記載の方法。
【請求項３】Ｒ^１がリチウムである請求項１に記載の方法。
【請求項４】Ｒ^２が式：【化６】で示される残基である請求項１に記載の方法。
【請求項５】Ｒ^３がメチルであるか、またはＲ^２が式：【化７】（式中、Ｒ^４はＨまたはメチル）で示される残基である、請求項１に記載の方法
。
【請求項６】該アミノ酸デヒドロゲナーゼが、アラニンデヒドロゲナーゼ
、フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、ロイシ
ンデヒドロゲナーゼ、またはバリンデヒドロゲナーゼである、請求項１に記載の
方法。
【請求項７】該アミノ酸デヒドロゲナーゼが微生物によりその場で産生さ
れる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】該微生物がThermoactinomyces種またはPichia pastorisまた
はE. coliである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】該補因子がＮＡＤＨである請求項１に記載の方法。
【請求項１０】該補因子が酵素によりその場で生成される請求項９に記載
の方法。
【請求項１１】再生酵素がギ酸デヒドロゲナーゼである請求項１０に記載
の方法。
【請求項１２】式：【化８】で示される化合物の生成に適した条件下、適当な溶媒中で化合物Ｉを塩化チオニ
ルと反応させる工程をさらに含むか、または式IIIで示される化合物の生成に適
した条件下、適当な溶媒中で化合物Ｉをクロロトリメチルシランおよび亜硫酸ジ
メチルと反応させる工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）およびギ酸
デヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）の両者を産生しうる遺伝子操作した酵母宿主細胞で
あって、（ａ）ＰＤＨをコードする組換え核酸、および任意にＰＤＨをコードする内生の
核酸、および（ｂ）ＦＤＨをコードする核酸であって、内生のものであるか、組換えのもので
あるか、または内生および組換えの両者であるものを含むことを特徴とする遺伝子操作した酵母宿主細胞。
【請求項１４】ギ酸デヒドロゲナーゼを発現しうる核酸が内生のものであ
る、請求項１３に記載の遺伝子操作した宿主細胞。
【請求項１５】フェニルアラニンデヒドロゲナーゼを発現しうる核酸が内
生のものでない、請求項１４に記載の遺伝子操作した宿主細胞。
【請求項１６】 Pichia種である請求項１３に記載の宿主細胞。
【請求項１７】 Pichia pastorisである請求項１３に記載の宿主細胞。
【請求項１８】 Pichia pastoris ＡＴＣＣ７４４０８。
【請求項１９】 Pichia pastoris ＡＴＣＣ７４４３３。
【請求項２０】内生のギ酸デヒドロゲナーゼを発現しうるCandida boidin
ii ＡＴＣＣ３２１９５である、請求項１３に記載の宿主細胞。
【請求項２１】フェニルアラニンデヒドロゲナーゼを発現しうる組換え核
酸およびギ酸デヒドロゲナーゼを発現しうる内生の核酸を含む、遺伝子操作した
細菌宿主細胞。
【請求項２２】 Escherichia coli ＡＴＣＣ９８３７４。
【請求項２３】式：【化９】（式中、Ｒ^１は水素、Ｃ_１−Ｃ_１８アルキル、または一価カチオン、Ｒ^２は式：【化１０】で示される残基、式：【化１１】（式中、各Ｒ^３はＣ_１−Ｃ_１８アルキル）で示される残基、または式：【化１２】（式中、各Ｒ^４はＨまたはＲ^３）で示される残基）で示される化合物。
【請求項２４】Ｒ^２が式：【化１３】で示される残基である、請求項２３に記載の化合物。
【請求項２５】Ｒ^１が水素、アンモニウム、リチウムまたはカリウムであ
る、請求項２３に記載の化合物。
【請求項２６】Ｒ^１が水素、アンモニウム、リチウムまたはカリウムであ
り、Ｒ^２が式：【化１４】で示される残基である、請求項２３に記載の化合物。
【請求項２７】Ｒ^１が水素である請求項２５に記載の化合物。
【請求項２８】Ｒ^１がリチウムである請求項２５に記載の化合物。