JP2003339387A - 新規カルボニル還元酵素及びこれをコードする遺伝子、ならびにこれらを利用した光学活性アルコールの製造方法 - Google Patents
新規カルボニル還元酵素及びこれをコードする遺伝子、ならびにこれらを利用した光学活性アルコールの製造方法Info
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- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
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- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 医薬、農薬等の中間体原料として産業上有用
な化合物である光学活性アルコール類の製造方法を提供
する。 【解決手段】 オガタエア(Ogataea)属微生物由来の新
規カルボニル還元酵素とそれをコードするＤＮＡを提供
する。このカルボニル還元酵素を用いてケトンを還元
し、光学活性アルコール、特に（Ｅ）−７−［２−シク
ロプロピル−４−（４−フルオロフェニル）−キノリン
−３−イル］−３，５−ジヒドロキシ−ヘプト−６−エ
ン酸エステル類を生産することが出来る。本発明による
カルボニル還元酵素は、活性と立体選択性に優れる。
な化合物である光学活性アルコール類の製造方法を提供
する。 【解決手段】 オガタエア(Ogataea)属微生物由来の新
規カルボニル還元酵素とそれをコードするＤＮＡを提供
する。このカルボニル還元酵素を用いてケトンを還元
し、光学活性アルコール、特に（Ｅ）−７−［２−シク
ロプロピル−４−（４−フルオロフェニル）−キノリン
−３−イル］−３，５−ジヒドロキシ−ヘプト−６−エ
ン酸エステル類を生産することが出来る。本発明による
カルボニル還元酵素は、活性と立体選択性に優れる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、カルボニル基含有
化合物を還元して、医薬、農薬等の中間体原料として産
業上有用な化合物である光学活性アルコール類に変換す
る活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドをコード
するＤＮＡ、該ＤＮＡをベクターに組み込んで得られる
組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡを保有する形質転換
体に関し、さらに該形質転換体、該形質転換体培養物ま
たは該形質転換体処理物を用いた光学活性アルコール類
の製造方法に関する。
化合物を還元して、医薬、農薬等の中間体原料として産
業上有用な化合物である光学活性アルコール類に変換す
る活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドをコード
するＤＮＡ、該ＤＮＡをベクターに組み込んで得られる
組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡを保有する形質転換
体に関し、さらに該形質転換体、該形質転換体培養物ま
たは該形質転換体処理物を用いた光学活性アルコール類
の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】（Ｅ）−７−［２−シクロプロピル−４
−（４−フルオロフェニル）−キノリン−３−イル］−
３，５−ジヒドロキシ−ヘプト−６−エン酸エステル類
を化学的に製造する方法としては、例えば、特許文献１
に以下に示す製造ルートが知られている。
−（４−フルオロフェニル）−キノリン−３−イル］−
３，５−ジヒドロキシ−ヘプト−６−エン酸エステル類
を化学的に製造する方法としては、例えば、特許文献１
に以下に示す製造ルートが知られている。
【０００３】
【化７】
【０００４】また、特許文献２には、光学活性なシッフ
塩基を用いて製造する方法も報告されている。またさら
に、特許文献３には、（Ｒ）−３−tert-ブチルジメチ
ルシリルオキシ−６−ジメトキシホスフィニル−５−オ
キソヘキサン酸メチルエステルを用いて極低温にて製造
する方法も報告されている。一方、より安価にまた副生
産物の少ない方法として、微生物の菌体及び／または該
菌体処理物を用いて、カルボニル基を有する化合物から
立体選択的に還元し、光学活性なアルコール体を生成す
る方法を上記化合物の製造に応用する方法が考えられる
が、カルボニル基の側鎖にキノリン骨格を有する化合物
を用いる方法として、非特許文献１には、以下に示す反
応をミクロバクテリウム キャンポクエマドエンシス
（Microbacterium campoquemadoensis）MB5614株を用い
て行えることが記載されている。
塩基を用いて製造する方法も報告されている。またさら
に、特許文献３には、（Ｒ）−３−tert-ブチルジメチ
ルシリルオキシ−６−ジメトキシホスフィニル−５−オ
キソヘキサン酸メチルエステルを用いて極低温にて製造
する方法も報告されている。一方、より安価にまた副生
産物の少ない方法として、微生物の菌体及び／または該
菌体処理物を用いて、カルボニル基を有する化合物から
立体選択的に還元し、光学活性なアルコール体を生成す
る方法を上記化合物の製造に応用する方法が考えられる
が、カルボニル基の側鎖にキノリン骨格を有する化合物
を用いる方法として、非特許文献１には、以下に示す反
応をミクロバクテリウム キャンポクエマドエンシス
（Microbacterium campoquemadoensis）MB5614株を用い
て行えることが記載されている。
【０００５】
【化８】
【０００６】また、非特許文献２には、以下に示す反応
をパン酵母を用いて行えることが記載されている。
をパン酵母を用いて行えることが記載されている。
【０００７】
【化９】
【０００８】しかしながら、（Ｅ）−７−［２−シクロ
プロピル−４−（４−フルオロフェニル）−キノリン−
３−イル］−３，５−ジオキソヘプト−６−エン酸エス
テル類のように、カルボニル基のα位にオレフィンが存
在する上に、カルボニル基が連続して存在する化合物に
ついては、微生物を用いて立体選択的に還元できるとい
う例は知られていなかった。
プロピル−４−（４−フルオロフェニル）−キノリン−
３−イル］−３，５−ジオキソヘプト−６−エン酸エス
テル類のように、カルボニル基のα位にオレフィンが存
在する上に、カルボニル基が連続して存在する化合物に
ついては、微生物を用いて立体選択的に還元できるとい
う例は知られていなかった。
【０００９】
【非特許文献１】Appl microbiol Biotechnol(1998)49:
ｐ.709-717
ｐ.709-717
【非特許文献２】Bioorg Med Chem Lett, vol8, p1403-
(1998)
(1998)
【特許文献１】特開平１−２７９８６６号公報
【特許文献２】特開平８−９２２１７号公報
【特許文献３】特開平８−１２７５８５号公報
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】従って、（３Ｒ，５
Ｓ）−（Ｅ）−７−［２−シクロプロピル−４−（４−
フルオロフェニル）−キノリン−３−イル］−３，５−
ジヒドロキシヘプト−６−エン酸エステル類を工業的に
安価に製造できる新規な製造方法を開発することが望ま
れていた。
Ｓ）−（Ｅ）−７−［２−シクロプロピル−４−（４−
フルオロフェニル）−キノリン−３−イル］−３，５−
ジヒドロキシヘプト−６−エン酸エステル類を工業的に
安価に製造できる新規な製造方法を開発することが望ま
れていた。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために、（３Ｒ，５Ｓ）−（Ｅ）−７−［２
−シクロプロピル−４−（４−フルオロフェニル）−キ
ノリン−３−イル］−３，５−ジヒドロキシヘプト−６
−エン酸エステル類の製造方法について鋭意検討した結
果、原料となるカルボニル基含有化合物の還元反応を触
媒する新規酵素を単離し、組換え菌を用いて発現させた
該酵素を、原料となるカルボニル基含有化合物に作用さ
せることにより、高い光学純度かつ高濃度で目的物を得
ることができることを見い出し、本発明を完成するに至
った。
を解決するために、（３Ｒ，５Ｓ）−（Ｅ）−７−［２
−シクロプロピル−４−（４−フルオロフェニル）−キ
ノリン−３−イル］−３，５−ジヒドロキシヘプト−６
−エン酸エステル類の製造方法について鋭意検討した結
果、原料となるカルボニル基含有化合物の還元反応を触
媒する新規酵素を単離し、組換え菌を用いて発現させた
該酵素を、原料となるカルボニル基含有化合物に作用さ
せることにより、高い光学純度かつ高濃度で目的物を得
ることができることを見い出し、本発明を完成するに至
った。
【００１２】すなわち、本発明の要旨は、
（１） 下記（Ａ）または（Ｂ）の何れかのアミノ酸配
列を有するポリペプチド。 （Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列。 （Ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１か
ら複数個のアミノ酸が欠失、付加または置換されている
アミノ酸配列であって、カルボニル還元酵素活性を有す
るポリペプチドのアミノ酸配列。； （２） 下記（ａ）から（ｅ）の何れかの塩基配列を有
するＤＮＡ。 （ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペ
プチドをコードする塩基配列。 （ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１か
ら複数個のアミノ酸が欠失、付加または置換されている
アミノ酸配列からなるポリペプチドであって、カルボニ
ル還元酵素活性を有するポリペプチドをコードする塩基
配列。 （ｃ）配列番号２に記載の塩基配列。 （ｄ）配列番号２に記載の塩基配列において、１から複
数個の塩基が欠失、付加または置換されている塩基配列
であって、カルボニル還元酵素活性を有するポリペプチ
ドをコードする塩基配列。 （ｅ）配列番号２に記載の塩基配列もしくはその相補配
列またはそれらの一部とストリンジェントな条件下でハ
イブリダイズする塩基配列であって、カルボニル還元酵
素活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列。； （３） （２）に記載のＤＮＡをベクターに組み込んで
得られる組換え体ＤＮＡ。； （４） （３）に記載の組換え体ＤＮＡを保有する形質
転換体。； （５） （２）に記載のＤＮＡを染色体ＤＮＡに組み込
んで得られる形質転換体。； （６）（４）または（５）に記載の形質転換体細胞、該
形質転換体細胞培養物、該形質転換体細胞処理物からな
る群より選ばれるいずれかを用いてカルボニル基含有化
合物を不斉還元することを特徴とする光学活性アルコー
ルの製造方法。；及び （７）カルボニル基含有化合物が、下記式（II’）
列を有するポリペプチド。 （Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列。 （Ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１か
ら複数個のアミノ酸が欠失、付加または置換されている
アミノ酸配列であって、カルボニル還元酵素活性を有す
るポリペプチドのアミノ酸配列。； （２） 下記（ａ）から（ｅ）の何れかの塩基配列を有
するＤＮＡ。 （ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペ
プチドをコードする塩基配列。 （ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１か
ら複数個のアミノ酸が欠失、付加または置換されている
アミノ酸配列からなるポリペプチドであって、カルボニ
ル還元酵素活性を有するポリペプチドをコードする塩基
配列。 （ｃ）配列番号２に記載の塩基配列。 （ｄ）配列番号２に記載の塩基配列において、１から複
数個の塩基が欠失、付加または置換されている塩基配列
であって、カルボニル還元酵素活性を有するポリペプチ
ドをコードする塩基配列。 （ｅ）配列番号２に記載の塩基配列もしくはその相補配
列またはそれらの一部とストリンジェントな条件下でハ
イブリダイズする塩基配列であって、カルボニル還元酵
素活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列。； （３） （２）に記載のＤＮＡをベクターに組み込んで
得られる組換え体ＤＮＡ。； （４） （３）に記載の組換え体ＤＮＡを保有する形質
転換体。； （５） （２）に記載のＤＮＡを染色体ＤＮＡに組み込
んで得られる形質転換体。； （６）（４）または（５）に記載の形質転換体細胞、該
形質転換体細胞培養物、該形質転換体細胞処理物からな
る群より選ばれるいずれかを用いてカルボニル基含有化
合物を不斉還元することを特徴とする光学活性アルコー
ルの製造方法。；及び （７）カルボニル基含有化合物が、下記式（II’）
【００１３】
【化１０】
【００１４】（式中、Ｒは水素原子、アルキル基または
アリール基を示す）及び下記式（III’）
アリール基を示す）及び下記式（III’）
【００１５】
【化１１】
【００１６】（式中、Ｒは前記と同義である）で表され
る光学活性体であることを特徴とする（６）に記載の製
造方法に存する。以下に、本発明を詳細に説明する。
る光学活性体であることを特徴とする（６）に記載の製
造方法に存する。以下に、本発明を詳細に説明する。
【００１７】
【発明の実施の形態】本発明のポリペプチドは、配列番
号１に記載のアミノ酸配列を有するもの、又はそのホモ
ログであってカルボニル還元酵素活性を有するものであ
る。本明細書において、カルボニル還元酵素活性とは、
カルボニル基含有化合物中のカルボニル基を不斉還元し
て光学活性なアルコール類とする活性をいう。このよう
な活性は、カルボニル基含有化合物を基質として含有
し、さらにＮＡＤＰＨを補酵素として含有する反応系に
おいて、酵素として、目的のポリペプチド、形質転換体
細胞、形質転換体細胞培養物または形質転換体細胞処理
物を作用させてＮＡＤＰＨ減少初速度を測定することに
より測定することができる。
号１に記載のアミノ酸配列を有するもの、又はそのホモ
ログであってカルボニル還元酵素活性を有するものであ
る。本明細書において、カルボニル還元酵素活性とは、
カルボニル基含有化合物中のカルボニル基を不斉還元し
て光学活性なアルコール類とする活性をいう。このよう
な活性は、カルボニル基含有化合物を基質として含有
し、さらにＮＡＤＰＨを補酵素として含有する反応系に
おいて、酵素として、目的のポリペプチド、形質転換体
細胞、形質転換体細胞培養物または形質転換体細胞処理
物を作用させてＮＡＤＰＨ減少初速度を測定することに
より測定することができる。
【００１８】本発明のポリペプチドは、本発明によって
そのアミノ酸配列および該アミノ酸配列をコードする塩
基配列が明らかになったので、後述するように本発明の
ポリペプチドのアミノ酸配列の一部又は全部をコードす
る塩基配列を元にして作製したプローブを用いて、カル
ボニル基の還元活性を有する任意の微生物から還元酵素
をコードするＤＮＡを単離した後、それを元に通常の遺
伝子工学的手法を用いて得ることができる。また、本発
明を完成するにあたってなされたように、カルボニル基
の還元活性を有する微生物、すなわち、カルボニル還元
酵素をコードするＤＮＡを有する微生物、例えば、オガ
タエア属酵母の培養物より精製することも出来る。
そのアミノ酸配列および該アミノ酸配列をコードする塩
基配列が明らかになったので、後述するように本発明の
ポリペプチドのアミノ酸配列の一部又は全部をコードす
る塩基配列を元にして作製したプローブを用いて、カル
ボニル基の還元活性を有する任意の微生物から還元酵素
をコードするＤＮＡを単離した後、それを元に通常の遺
伝子工学的手法を用いて得ることができる。また、本発
明を完成するにあたってなされたように、カルボニル基
の還元活性を有する微生物、すなわち、カルボニル還元
酵素をコードするＤＮＡを有する微生物、例えば、オガ
タエア属酵母の培養物より精製することも出来る。
【００１９】オガタエア属酵母としては、例えば、オガ
タエア・ミヌタ（Ogataea minuta）が特に本発明のカル
ボニル還元酵素の産生能に優れ、この酵母は、例えばＩ
ＦＯ１４７３株として財団法人発酵研究所より入手する
事が出来る。微生物の培養物からの本発明のポリペプチ
ドの取得方法としては、通常の酵素の精製方法を用いる
ことができ、例えば、以下の方法で行うことができる。
上記微生物をＹＭ培地等の真菌の培養に用いられる一般
的な培地で培養することで十分に増殖させた後に回収
し、ＤＴＴ（Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）等の還元
剤や、フェニルメタンスルホニルフルオリド（ｐｈｅｎ
ｙｌｍｅｔｈａｎｓｕｌｆｏｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉｄ
ｅ；ＰＭＳＦ）の様なプロテアーゼ阻害剤を加えた緩衝
液中で破砕して無細胞抽出液とする。無細胞抽出液か
ら、タンパク質の溶解度による分画（有機溶媒による沈
殿や硫安などによる塩析など）や、陽イオン交換、陰イ
オン交換、ゲル濾過、疎水クロマトグラフィー、キレー
ト、色素、抗体等を用いたアフィニティークロマトグラ
フィー等を適宜組み合わせることにより精製することが
出来る。例えば、ＤＥＡＥセファロースを用いた陰イオ
ン交換クロマトグラフィー、オクチルセファロースを用
いた疎水クロマトグラフィー、Ｑ−セファロースを用い
た陰イオン交換クロマトグラフィー、スーパーデックス
２００を用いたゲル濾過等を経て電気泳動的にほぼ単一
バンドまで精製することが出来る。
タエア・ミヌタ（Ogataea minuta）が特に本発明のカル
ボニル還元酵素の産生能に優れ、この酵母は、例えばＩ
ＦＯ１４７３株として財団法人発酵研究所より入手する
事が出来る。微生物の培養物からの本発明のポリペプチ
ドの取得方法としては、通常の酵素の精製方法を用いる
ことができ、例えば、以下の方法で行うことができる。
上記微生物をＹＭ培地等の真菌の培養に用いられる一般
的な培地で培養することで十分に増殖させた後に回収
し、ＤＴＴ（Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）等の還元
剤や、フェニルメタンスルホニルフルオリド（ｐｈｅｎ
ｙｌｍｅｔｈａｎｓｕｌｆｏｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉｄ
ｅ；ＰＭＳＦ）の様なプロテアーゼ阻害剤を加えた緩衝
液中で破砕して無細胞抽出液とする。無細胞抽出液か
ら、タンパク質の溶解度による分画（有機溶媒による沈
殿や硫安などによる塩析など）や、陽イオン交換、陰イ
オン交換、ゲル濾過、疎水クロマトグラフィー、キレー
ト、色素、抗体等を用いたアフィニティークロマトグラ
フィー等を適宜組み合わせることにより精製することが
出来る。例えば、ＤＥＡＥセファロースを用いた陰イオ
ン交換クロマトグラフィー、オクチルセファロースを用
いた疎水クロマトグラフィー、Ｑ−セファロースを用い
た陰イオン交換クロマトグラフィー、スーパーデックス
２００を用いたゲル濾過等を経て電気泳動的にほぼ単一
バンドまで精製することが出来る。
【００２０】このように精製されたオガタエア・ミヌタ
（Ogataea minuta）に由来する本発明のポリペプチド
は、典型的には以下の性状を備えたものである。 （１）至適ｐＨ ５．０〜６．０ （２）分子量 ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動（以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと省略）による分子量測
定で約２７，０００Ｄａである。さらにこの酵素は以下
の性状で特徴付ける事が出来る。 （３）安定ｐＨ範囲 ｐＨ５．５〜６．５ の範囲で比較的安定である （４）作用適温の範囲 至適温度は６０〜７０℃である。 （５）温度安定性 ４０℃まで比較的安定である。 （６）阻害 本酵素は水銀（Ｉ）イオン、鉛（ＩＩ）イオンにより阻
害を受ける。上記の方法で単離された本発明のポリペプ
チドは、単なるカルボニル基含有化合物だけでなく、ジ
カルボニル化合物も不斉還元する能力を有する優れた酵
素である。
（Ogataea minuta）に由来する本発明のポリペプチド
は、典型的には以下の性状を備えたものである。 （１）至適ｐＨ ５．０〜６．０ （２）分子量 ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動（以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと省略）による分子量測
定で約２７，０００Ｄａである。さらにこの酵素は以下
の性状で特徴付ける事が出来る。 （３）安定ｐＨ範囲 ｐＨ５．５〜６．５ の範囲で比較的安定である （４）作用適温の範囲 至適温度は６０〜７０℃である。 （５）温度安定性 ４０℃まで比較的安定である。 （６）阻害 本酵素は水銀（Ｉ）イオン、鉛（ＩＩ）イオンにより阻
害を受ける。上記の方法で単離された本発明のポリペプ
チドは、単なるカルボニル基含有化合物だけでなく、ジ
カルボニル化合物も不斉還元する能力を有する優れた酵
素である。
【００２１】本発明のポリペプチドのホモログとは、カ
ルボニル還元酵素活性を害さない範囲内において配列番
号１に記載のアミノ酸配列に１から複数個のアミノ酸が
欠失、付加または置換されたアミノ酸配列を有するもの
である。ここで複数個とは、具体的には２０個以下、好
ましくは１０個以下、より好ましくは５個以下である。
また、本発明のポリペプチドのホモログとは、配列番号
１に示されるアミノ酸配列と少なくとも５０%、好まし
くは少なくとも６０%または７０%、より好ましくは８０
%以上のホモロジーを有するアミノ酸配列を有するポリ
ペプチドをいう。
ルボニル還元酵素活性を害さない範囲内において配列番
号１に記載のアミノ酸配列に１から複数個のアミノ酸が
欠失、付加または置換されたアミノ酸配列を有するもの
である。ここで複数個とは、具体的には２０個以下、好
ましくは１０個以下、より好ましくは５個以下である。
また、本発明のポリペプチドのホモログとは、配列番号
１に示されるアミノ酸配列と少なくとも５０%、好まし
くは少なくとも６０%または７０%、より好ましくは８０
%以上のホモロジーを有するアミノ酸配列を有するポリ
ペプチドをいう。
【００２２】ちなみに上記ポリペプチドのホモロジー検
索は、例えば、DNA Databank of JAPAN(DDBJ)を対象
に、FASTA programやBLAST programなどを用いて行う
ことができる。配列番号１に記載のアミノ酸配列を用い
てDDBJを対象にBLAST programを用いてホモロジー検索
を行った結果、既知のタンパク質の中でもっとも高いホ
モロジーを示したのは、シゾサッカロミセス・ポンベ
（Schizosaccharomyces pombe）のprobable short chai
n dehydrogenase（T41540）の３７．４%であった。
索は、例えば、DNA Databank of JAPAN(DDBJ)を対象
に、FASTA programやBLAST programなどを用いて行う
ことができる。配列番号１に記載のアミノ酸配列を用い
てDDBJを対象にBLAST programを用いてホモロジー検索
を行った結果、既知のタンパク質の中でもっとも高いホ
モロジーを示したのは、シゾサッカロミセス・ポンベ
（Schizosaccharomyces pombe）のprobable short chai
n dehydrogenase（T41540）の３７．４%であった。
【００２３】また、本発明のＤＮＡは、上記ポリペプチ
ドをコードするＤＮＡまたはそのホモログであって、カ
ルボニル還元酵素活性を有するポリペプチドをコードす
るＤＮＡである。上記ポリペプチドをコードするＤＮＡ
としては、具体的には配列番号２に記載の塩基配列を含
むものが挙げられる。
ドをコードするＤＮＡまたはそのホモログであって、カ
ルボニル還元酵素活性を有するポリペプチドをコードす
るＤＮＡである。上記ポリペプチドをコードするＤＮＡ
としては、具体的には配列番号２に記載の塩基配列を含
むものが挙げられる。
【００２４】本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ
は、例えば、以下のような方法によって単離することが
できる。まず、本発明のポリペプチドを上記の方法等に
て精製後、Ｎ末端アミノ酸配列を解析し、さらに、リジ
ルエンドペプチダーゼ、Ｖ８プロテアーゼなどの酵素に
より切断後、逆相液体クロマトグラフィーなどによりペ
プチド断片を精製後、プロテインシーケンサーによりア
ミノ酸配列を解析することにより複数のアミノ酸配列を
決める。
は、例えば、以下のような方法によって単離することが
できる。まず、本発明のポリペプチドを上記の方法等に
て精製後、Ｎ末端アミノ酸配列を解析し、さらに、リジ
ルエンドペプチダーゼ、Ｖ８プロテアーゼなどの酵素に
より切断後、逆相液体クロマトグラフィーなどによりペ
プチド断片を精製後、プロテインシーケンサーによりア
ミノ酸配列を解析することにより複数のアミノ酸配列を
決める。
【００２５】決定したアミノ酸配列を元にＰＣＲ用のプ
ライマーを設計し、カルボニル還元酵素生産微生物株の
染色体ＤＮＡもしくは、ｃＤＮＡライブラリーを鋳型と
し、アミノ酸配列から設計したＰＣＲプライマーを用い
てＰＣＲを行うことにより本発明のＤＮＡの一部を得る
ことができる。さらに、得られたＤＮＡ断片をプローブ
として、カルボニル還元酵素生産微生物株の染色体ＤＮ
Ａの制限酵素消化物をファージ、プラスミドなどに導入
し、大腸菌を形質転換して得られたライブラリーやｃＤ
ＮＡライブラリーを利用して、コロニーハイブリダイゼ
ーション、プラークハイブリダイゼーションなどによ
り、本発明のＤＮＡを得ることができる。また、ＰＣＲ
により得られたＤＮＡ断片の塩基配列を解析し、得られ
た配列から、既知のＤＮＡの外側に伸長させるためのＰ
ＣＲプライマーを設計し、カルボニル還元酵素生産微生
物株の染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で消化後、自己環
化反応によりＤＮＡを鋳型として逆ＰＣＲを行うことに
より（Genetics 120, 621-623 (1988)）、また、ＲＡＣ
Ｅ法（Rapid Amplification of cDNA End、「ＰＣＲ実
験マニュアル」p25-33, ＨＢＪ出版局）などにより本発
明のＤＮＡを得ることも可能である。
ライマーを設計し、カルボニル還元酵素生産微生物株の
染色体ＤＮＡもしくは、ｃＤＮＡライブラリーを鋳型と
し、アミノ酸配列から設計したＰＣＲプライマーを用い
てＰＣＲを行うことにより本発明のＤＮＡの一部を得る
ことができる。さらに、得られたＤＮＡ断片をプローブ
として、カルボニル還元酵素生産微生物株の染色体ＤＮ
Ａの制限酵素消化物をファージ、プラスミドなどに導入
し、大腸菌を形質転換して得られたライブラリーやｃＤ
ＮＡライブラリーを利用して、コロニーハイブリダイゼ
ーション、プラークハイブリダイゼーションなどによ
り、本発明のＤＮＡを得ることができる。また、ＰＣＲ
により得られたＤＮＡ断片の塩基配列を解析し、得られ
た配列から、既知のＤＮＡの外側に伸長させるためのＰ
ＣＲプライマーを設計し、カルボニル還元酵素生産微生
物株の染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で消化後、自己環
化反応によりＤＮＡを鋳型として逆ＰＣＲを行うことに
より（Genetics 120, 621-623 (1988)）、また、ＲＡＣ
Ｅ法（Rapid Amplification of cDNA End、「ＰＣＲ実
験マニュアル」p25-33, ＨＢＪ出版局）などにより本発
明のＤＮＡを得ることも可能である。
【００２６】なお本発明のＤＮＡは、以上のような方法
によってクローニングされるゲノムＤＮＡ、あるいはｃ
ＤＮＡの他、本発明によりその塩基配列が明らかになっ
たため、配列番号２に基づく化学合成等によって得るこ
ともできる。本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ
ホモログとは、カルボニル還元酵素活性を害さない範囲
内において配列番号１に記載のアミノ酸配列に１個から
複数個のアミノ酸が欠失、付加または置換されたアミノ
酸配列を含むポリペプチドをコードするＤＮＡを含む。
上記ポリペプチドをコードするＤＮＡホモログとして
は、具体的には配列番号２に記載の塩基配列がコードす
るポリペプチドにおいて、カルボニル還元酵素活性を害
さない範囲内において、配列番号２に記載の塩基配列に
１から複数個のアミノ酸が欠失、付加または置換された
塩基配列を含むものが挙げられる。ここで複数個とは、
具体的には６０個以下、好ましくは３０個以下、より好
ましくは１０個以下である。
によってクローニングされるゲノムＤＮＡ、あるいはｃ
ＤＮＡの他、本発明によりその塩基配列が明らかになっ
たため、配列番号２に基づく化学合成等によって得るこ
ともできる。本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ
ホモログとは、カルボニル還元酵素活性を害さない範囲
内において配列番号１に記載のアミノ酸配列に１個から
複数個のアミノ酸が欠失、付加または置換されたアミノ
酸配列を含むポリペプチドをコードするＤＮＡを含む。
上記ポリペプチドをコードするＤＮＡホモログとして
は、具体的には配列番号２に記載の塩基配列がコードす
るポリペプチドにおいて、カルボニル還元酵素活性を害
さない範囲内において、配列番号２に記載の塩基配列に
１から複数個のアミノ酸が欠失、付加または置換された
塩基配列を含むものが挙げられる。ここで複数個とは、
具体的には６０個以下、好ましくは３０個以下、より好
ましくは１０個以下である。
【００２７】当業者であれば、配列番号２に記載のＤＮ
Ａに部位特異的変異導入法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
Ｒｅｓ．１０，ｐｐ．６４８７（１９８２）、Ｍｅｔ
ｈｏｄｓｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００，ｐｐ．４４８
（１９８３）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
２ｎｄＥｄｔ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）
ＰＣＲ Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ
ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ｐｐ．２００（１９９１））等を
用いて適宜置換、欠失、挿入及び／または付加変異を導
入することにより本発明のＤＮＡホモログを得ることが
可能である。
Ａに部位特異的変異導入法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
Ｒｅｓ．１０，ｐｐ．６４８７（１９８２）、Ｍｅｔ
ｈｏｄｓｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００，ｐｐ．４４８
（１９８３）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
２ｎｄＥｄｔ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）
ＰＣＲ Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ
ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ｐｐ．２００（１９９１））等を
用いて適宜置換、欠失、挿入及び／または付加変異を導
入することにより本発明のＤＮＡホモログを得ることが
可能である。
【００２８】また、本発明のＤＮＡのホモログは、本発
明のポリペプチドをコードするＤＮＡまたはその一部を
プローブとして用いて、カルボニル基の還元活性を有す
る任意の微生物から調整したＤＮＡに対し、コロニーハ
イブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーシ
ョン法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーショ
ン法等によりストリンジェントな条件下でハイブリダイ
ゼーションを行い、ハイブリダイズするＤＮＡを得るこ
とによっても取得できる。本発明のポリペプチドをコー
ドするＤＮＡの「一部」とは、プローブとして用いるの
に十分な長さのＤＮＡのことであり、具体的には１５ｂ
ｐ以上、好ましくは５０ｂｐ以上、より好ましくは１０
０ｂｐ以上のものである。
明のポリペプチドをコードするＤＮＡまたはその一部を
プローブとして用いて、カルボニル基の還元活性を有す
る任意の微生物から調整したＤＮＡに対し、コロニーハ
イブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーシ
ョン法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーショ
ン法等によりストリンジェントな条件下でハイブリダイ
ゼーションを行い、ハイブリダイズするＤＮＡを得るこ
とによっても取得できる。本発明のポリペプチドをコー
ドするＤＮＡの「一部」とは、プローブとして用いるの
に十分な長さのＤＮＡのことであり、具体的には１５ｂ
ｐ以上、好ましくは５０ｂｐ以上、より好ましくは１０
０ｂｐ以上のものである。
【００２９】各ハイブリダイゼーションは、Molecular
Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Sprin
g Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989.
（以後 "モレキュラークローニング第２版" と略す）等
に記載されている方法に準じて行うことができる。
Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Sprin
g Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989.
（以後 "モレキュラークローニング第２版" と略す）等
に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００３０】本明細書において「ストリンジェントな条
件下でハイブリダイズする塩基配列」とは、ＤＮＡをプ
ローブとして使用し、ストリンジェントな条件下、コロ
ニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイ
ゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼ
ーション法等を用いることにより得られるＤＮＡの塩基
配列を意味し、ストリンジェントな条件としては、例え
ば、コロニーハイブリダイゼーション法およびプラーク
ハイブリダイゼーション法においては、コロニーあるい
はプラーク由来のＤＮＡまたは該ＤＮＡの断片を固定化
したフィルターを用いて、０．７〜１．０Ｍの塩化ナト
リウム存在下６５℃でハイブリダイゼーションを行った
後、０．１〜２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣの組成は、１
５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウ
ム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄する条件
を挙げることができる。
件下でハイブリダイズする塩基配列」とは、ＤＮＡをプ
ローブとして使用し、ストリンジェントな条件下、コロ
ニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイ
ゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼ
ーション法等を用いることにより得られるＤＮＡの塩基
配列を意味し、ストリンジェントな条件としては、例え
ば、コロニーハイブリダイゼーション法およびプラーク
ハイブリダイゼーション法においては、コロニーあるい
はプラーク由来のＤＮＡまたは該ＤＮＡの断片を固定化
したフィルターを用いて、０．７〜１．０Ｍの塩化ナト
リウム存在下６５℃でハイブリダイゼーションを行った
後、０．１〜２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣの組成は、１
５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウ
ム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄する条件
を挙げることができる。
【００３１】上記のようにして単離された、本発明のポ
リペプチドをコードするＤＮＡを公知の発現ベクターに
発現可能に挿入することにより、カルボニル還元酵素発
現ベクターが提供される。また、この発現ベクターで形
質転換した形質転換体を培養することにより、カルボニ
ル還元酵素を該形質転換体から得ることができる。発現
ベクターとしては、本発明のＤＮＡを発現可能なベクタ
ーであれば特に限定されず、形質転換する宿主微生物の
種類などに応じて適宜選択可能である。あるいは、形質
転換体は、公知の宿主の染色体ＤＮＡに本発明のＤＮＡ
を発現可能に組み込むことによっても得ることができ
る。
リペプチドをコードするＤＮＡを公知の発現ベクターに
発現可能に挿入することにより、カルボニル還元酵素発
現ベクターが提供される。また、この発現ベクターで形
質転換した形質転換体を培養することにより、カルボニ
ル還元酵素を該形質転換体から得ることができる。発現
ベクターとしては、本発明のＤＮＡを発現可能なベクタ
ーであれば特に限定されず、形質転換する宿主微生物の
種類などに応じて適宜選択可能である。あるいは、形質
転換体は、公知の宿主の染色体ＤＮＡに本発明のＤＮＡ
を発現可能に組み込むことによっても得ることができ
る。
【００３２】形質転換体の作製方法としては、具体的に
は、微生物中において安定に存在するプラスミドベクタ
ーやファージベクター中に、本発明のＤＮＡを導入し、
構築された発現ベクターを該微生物中に導入するか、も
しくは、直接宿主ゲノム中に本発明のＤＮＡを導入し、
その遺伝情報を転写・翻訳させることができる。
は、微生物中において安定に存在するプラスミドベクタ
ーやファージベクター中に、本発明のＤＮＡを導入し、
構築された発現ベクターを該微生物中に導入するか、も
しくは、直接宿主ゲノム中に本発明のＤＮＡを導入し、
その遺伝情報を転写・翻訳させることができる。
【００３３】このとき、本発明のＤＮＡが宿主微生物中
で発現可能なプロモーターを含んでいない場合には、適
当なプロモーターを本発明のＤＮＡ鎖の5'-側上流に、
より好ましくはターミネーターを3'-側下流にそれぞれ
組み込むことができる。このプロモーター及びターミネ
ーターとしては、宿主として利用する微生物中において
機能することが知られているプロモーター及びターミネ
ーターであれば特に限定されず、これら各種微生物にお
いて利用可能なベクター、プロモーター及びターミネー
ターなどに関しては、例えば「微生物学基礎講座８遺伝
子工学・共立出版」、特に酵母に関しては、Adv. Bioch
em. Eng. 43, 75-102 (1990)、Yeast 8,423-488(199
2)、などに詳細に記述されている。
で発現可能なプロモーターを含んでいない場合には、適
当なプロモーターを本発明のＤＮＡ鎖の5'-側上流に、
より好ましくはターミネーターを3'-側下流にそれぞれ
組み込むことができる。このプロモーター及びターミネ
ーターとしては、宿主として利用する微生物中において
機能することが知られているプロモーター及びターミネ
ーターであれば特に限定されず、これら各種微生物にお
いて利用可能なベクター、プロモーター及びターミネー
ターなどに関しては、例えば「微生物学基礎講座８遺伝
子工学・共立出版」、特に酵母に関しては、Adv. Bioch
em. Eng. 43, 75-102 (1990)、Yeast 8,423-488(199
2)、などに詳細に記述されている。
【００３４】本発明のカルボニル還元酵素を発現させる
ための形質転換の対象となる宿主微生物としては、宿主
自体が本反応に悪影響を与えない限り特に限定されるこ
とはなく、具体的には以下に示すような微生物を挙げる
ことができる。
ための形質転換の対象となる宿主微生物としては、宿主
自体が本反応に悪影響を与えない限り特に限定されるこ
とはなく、具体的には以下に示すような微生物を挙げる
ことができる。
【００３５】エシェリヒア(Escherichia)属、バチルス
(Bacillus)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、セラ
チア(Serratia)属、ブレビバクテリウム(Brevibacteriu
m)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、スト
レプトコッカス(Streptococcus)属、ラクトバチルス(La
ctobacillus)属などに属する宿主ベクター系の確立され
ている細菌；ロドコッカス(Rhodococcus)属、ストレプ
トマイセス(Streptomyces)属などに属する宿主ベクター
系の確立されている放線菌；サッカロマイセス(Sacchar
omyces)属、クライベロマイセス(Kluyveromyces)属、シ
ゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属、チゴサ
ッカロマイセス(Zygosaccharomyces)属、ヤロウイア(Ya
rrowia)属、トリコスポロン(Trichosporon)属、ロドス
ポリジウム(Rhodosporidium)属、ハンゼヌラ(Hansenul
a)属、ピキア(Pichia)属、キャンディダ(Candida)属な
どに属する宿主ベクター系の確立されている酵母；ノイ
ロスポラ(Neurospora)属、アスペルギルス(Aspergillu
s)属、セファロスポリウム(Cephalosporium)属、トリコ
デルマ(Trichoderma)属などに属する宿主ベクター系の
確立されているカビ。
(Bacillus)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、セラ
チア(Serratia)属、ブレビバクテリウム(Brevibacteriu
m)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、スト
レプトコッカス(Streptococcus)属、ラクトバチルス(La
ctobacillus)属などに属する宿主ベクター系の確立され
ている細菌；ロドコッカス(Rhodococcus)属、ストレプ
トマイセス(Streptomyces)属などに属する宿主ベクター
系の確立されている放線菌；サッカロマイセス(Sacchar
omyces)属、クライベロマイセス(Kluyveromyces)属、シ
ゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属、チゴサ
ッカロマイセス(Zygosaccharomyces)属、ヤロウイア(Ya
rrowia)属、トリコスポロン(Trichosporon)属、ロドス
ポリジウム(Rhodosporidium)属、ハンゼヌラ(Hansenul
a)属、ピキア(Pichia)属、キャンディダ(Candida)属な
どに属する宿主ベクター系の確立されている酵母；ノイ
ロスポラ(Neurospora)属、アスペルギルス(Aspergillu
s)属、セファロスポリウム(Cephalosporium)属、トリコ
デルマ(Trichoderma)属などに属する宿主ベクター系の
確立されているカビ。
【００３６】上記微生物の中で宿主として好ましくは、
エシェリヒア(Escherichia)属、バチルス(Bacillus)
属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、コリネバ
クテリウム(Corynebacterium)属であり、特に好ましく
は、エシェリヒア(Escherichia)属、コリネバクテリウ
ム(Corynebacterium)属である。形質転換体の作製のた
めの手順、宿主に適合した組換えベクターの構築および
宿主の培養方法は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学
の分野において慣用されている技術に準じて行うことが
できる（例えば、Sambrookら、モレキュラー・クローニ
ング、Cold Spring Harbor Laboratories)。
エシェリヒア(Escherichia)属、バチルス(Bacillus)
属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、コリネバ
クテリウム(Corynebacterium)属であり、特に好ましく
は、エシェリヒア(Escherichia)属、コリネバクテリウ
ム(Corynebacterium)属である。形質転換体の作製のた
めの手順、宿主に適合した組換えベクターの構築および
宿主の培養方法は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学
の分野において慣用されている技術に準じて行うことが
できる（例えば、Sambrookら、モレキュラー・クローニ
ング、Cold Spring Harbor Laboratories)。
【００３７】以下、具体的に、好ましい宿主微生物、各
微生物における好ましい形質転換の手法、ベクター、プ
ロモーター、ターミネーターなどの例を挙げるが、本発
明はこれらの例に限定されない。エシェリヒア属、特に
大腸菌エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)において
は、プラスミドベクターとしては、pBR、pUC系プラスミ
ドが挙げられ、lac(β-ガラクトシダーゼ)、trp(トリプ
トファンオペロン)、tac、 trc (lac、trpの融合)、λ
ファージ pＬ、pＲなどに由来するプロモーターなどが
挙げられる。また、ターミネーターとしては、trpA由
来、ファージ由来、rrnBリボソーマルＲＮＡ由来のター
ミネーターなどが挙げられる。
微生物における好ましい形質転換の手法、ベクター、プ
ロモーター、ターミネーターなどの例を挙げるが、本発
明はこれらの例に限定されない。エシェリヒア属、特に
大腸菌エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)において
は、プラスミドベクターとしては、pBR、pUC系プラスミ
ドが挙げられ、lac(β-ガラクトシダーゼ)、trp(トリプ
トファンオペロン)、tac、 trc (lac、trpの融合)、λ
ファージ pＬ、pＲなどに由来するプロモーターなどが
挙げられる。また、ターミネーターとしては、trpA由
来、ファージ由来、rrnBリボソーマルＲＮＡ由来のター
ミネーターなどが挙げられる。
【００３８】バチルス属においては、ベクターとして
は、pUB110系プラスミド、pC194系プラスミドなどを挙
げることができ、また、染色体にインテグレートするこ
ともできる。プロモーター及びターミネーターとして
は、アルカリプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、α−ア
ミラーゼ等の酵素遺伝子のプロモーターやターミネータ
ーなどが利用できる。シュードモナス属においては、ベ
クターとしては、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas
putida)、シュードモナス・セパシア(Pseudomonas cep
acia)などで確立されている一般的な宿主ベクター系
や、トルエン化合物の分解に関与するプラスミド、TOL
プラスミドを基本にした広宿主域ベクター(RSF1010など
に由来する自律的複製に必要な遺伝子を含む）pKT240(G
ene, 26, 273-82(1983))を挙げることができる。
は、pUB110系プラスミド、pC194系プラスミドなどを挙
げることができ、また、染色体にインテグレートするこ
ともできる。プロモーター及びターミネーターとして
は、アルカリプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、α−ア
ミラーゼ等の酵素遺伝子のプロモーターやターミネータ
ーなどが利用できる。シュードモナス属においては、ベ
クターとしては、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas
putida)、シュードモナス・セパシア(Pseudomonas cep
acia)などで確立されている一般的な宿主ベクター系
や、トルエン化合物の分解に関与するプラスミド、TOL
プラスミドを基本にした広宿主域ベクター(RSF1010など
に由来する自律的複製に必要な遺伝子を含む）pKT240(G
ene, 26, 273-82(1983))を挙げることができる。
【００３９】ブレビバクテリウム属、特にブレビバクテ
リウム・ラクトファーメンタム(Brevibacterium lactof
ermentum)においては、ベクターとしては、pAJ43(Gene
39,281 (1985))などのプラスミドベクターを挙げること
ができる。プロモーター及びターミネーターとしては、
大腸菌で使用されている各種プロモーター及びターミネ
ーターが利用可能である。コリネバクテリウム属、特に
コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium g
lutamicum)においては、ベクターとしては、pCS11(特開
昭57-183799号公報)、pCB101(Mol. Gen. Genet. 196, 1
75 (1984)などのプラスミドベクターが挙げられる。
リウム・ラクトファーメンタム(Brevibacterium lactof
ermentum)においては、ベクターとしては、pAJ43(Gene
39,281 (1985))などのプラスミドベクターを挙げること
ができる。プロモーター及びターミネーターとしては、
大腸菌で使用されている各種プロモーター及びターミネ
ーターが利用可能である。コリネバクテリウム属、特に
コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium g
lutamicum)においては、ベクターとしては、pCS11(特開
昭57-183799号公報)、pCB101(Mol. Gen. Genet. 196, 1
75 (1984)などのプラスミドベクターが挙げられる。
【００４０】サッカロマイセス(Saccharomyces)属、特
にサッカロマイセス・セレビジアエ(Saccharomyces ce
revisiae) においては、ベクターとしては、YRp系、YEp
系、YCp系、YIp系プラスミドが挙げられる。また、アル
コール脱水素酵素、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱
水素酵素、酸性フォスファターゼ、β−ガラクトシダー
ゼ、ホスホグリセレートキナーゼ、エノラーゼといった
各種酵素遺伝子のプロモーター、ターミネーターが利用
可能である。シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyc
es)属においては、ベクターとしては、Mol. Cell. Bio
l. 6, 80 (1986)に記載のシゾサッカロマイセス・ポン
ベ由来のプラスミドベクターを挙げることができる。特
に、pAUR224は、宝酒造から市販されており容易に利用
できる。
にサッカロマイセス・セレビジアエ(Saccharomyces ce
revisiae) においては、ベクターとしては、YRp系、YEp
系、YCp系、YIp系プラスミドが挙げられる。また、アル
コール脱水素酵素、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱
水素酵素、酸性フォスファターゼ、β−ガラクトシダー
ゼ、ホスホグリセレートキナーゼ、エノラーゼといった
各種酵素遺伝子のプロモーター、ターミネーターが利用
可能である。シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyc
es)属においては、ベクターとしては、Mol. Cell. Bio
l. 6, 80 (1986)に記載のシゾサッカロマイセス・ポン
ベ由来のプラスミドベクターを挙げることができる。特
に、pAUR224は、宝酒造から市販されており容易に利用
できる。
【００４１】アスペルギルス(Aspergillus)属において
は、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger) 、ア
スペルギルス・オリジー (Aspergillus oryzae) などが
カビの中で最もよく研究されており、プラスミドや染色
体へのインテグレーションが利用可能であり、菌体外プ
ロテアーゼやアミラーゼ由来のプロモーターが利用可能
である（Trends in Biotechnology 7, 283-287 (198
9)）。
は、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger) 、ア
スペルギルス・オリジー (Aspergillus oryzae) などが
カビの中で最もよく研究されており、プラスミドや染色
体へのインテグレーションが利用可能であり、菌体外プ
ロテアーゼやアミラーゼ由来のプロモーターが利用可能
である（Trends in Biotechnology 7, 283-287 (198
9)）。
【００４２】また、上記以外でも、各種微生物に応じた
宿主ベクター系が確立されており、それらを適宜使用す
ることができる。また、微生物以外でも、植物、動物に
おいて様々な宿主・ベクター系が確立されており、特に
蚕を用いた昆虫などの動物中（Nature 315, 592-594 (1
985)）や菜種、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物中
に大量に異種タンパク質を発現させる系、及び大腸菌無
細胞抽出液や小麦胚芽などの無細胞タンパク質合成系を
用いた系が確立されており、好適に利用できる。
宿主ベクター系が確立されており、それらを適宜使用す
ることができる。また、微生物以外でも、植物、動物に
おいて様々な宿主・ベクター系が確立されており、特に
蚕を用いた昆虫などの動物中（Nature 315, 592-594 (1
985)）や菜種、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物中
に大量に異種タンパク質を発現させる系、及び大腸菌無
細胞抽出液や小麦胚芽などの無細胞タンパク質合成系を
用いた系が確立されており、好適に利用できる。
【００４３】さらに本発明は、上記の方法などで得られ
る本発明の形質転換体細胞、該形質転換体細胞培養物、
該形質転換体細胞処理物を、反応基質である下記一般式
（Ｉ）、（ＩＩ）及び（III）で表される化合物に作用
させることにより、該化合物のカルボニル基を不斉還元
させ、光学活性アルコールを製造する方法に関する。形
質転換体細胞、該形質転換体細胞培養物、該形質転換体
細胞処理物はいずれかを単独で用いてもよく、組み合わ
せて用いてもよい。下記式(I)
る本発明の形質転換体細胞、該形質転換体細胞培養物、
該形質転換体細胞処理物を、反応基質である下記一般式
（Ｉ）、（ＩＩ）及び（III）で表される化合物に作用
させることにより、該化合物のカルボニル基を不斉還元
させ、光学活性アルコールを製造する方法に関する。形
質転換体細胞、該形質転換体細胞培養物、該形質転換体
細胞処理物はいずれかを単独で用いてもよく、組み合わ
せて用いてもよい。下記式(I)
【００４４】
【化１２】
【００４５】（式中、Ｒは水素原子、アルキル基または
アリール基を示す）で表される化合物、下記式(II)
アリール基を示す）で表される化合物、下記式(II)
【００４６】
【化１３】
【００４７】（式中、Ｒは前記と同義である）で表され
る化合物、及び、下記式（III）
る化合物、及び、下記式（III）
【００４８】
【化１４】
【００４９】（式中、Ｒは前記と同義である）
本発明の製造方法に用いられる原料である、上記式
（I）〜（III）で表される化合物において、Ｒは、水素
原子、アルキル基またはアリール基を示す。アルキル基
としては、メチル基、エチル基、イソプロピル基、シク
ロプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｔ−ブチル
基、シクロヘキシル基、ベンジル基、フェネチル基等
の、アルキル基またはアリール基で置換されていてもよ
い直鎖、分岐若しくは環状のアルキル基である。アリー
ル基としては、フェニル基、メシチル基、ナフチル基等
の、アルキル基で置換されていても良いフェニル基又は
ナフチル基が挙げられる。上記Ｒとして好ましくは、Ｃ
1〜Ｃ4のアルキル基、ベンジル基又はフェニル基であ
り、より好ましくはＣ1〜Ｃ4のアルキル基であり、特に
好ましくはメチル基又はエチル基である。
（I）〜（III）で表される化合物において、Ｒは、水素
原子、アルキル基またはアリール基を示す。アルキル基
としては、メチル基、エチル基、イソプロピル基、シク
ロプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｔ−ブチル
基、シクロヘキシル基、ベンジル基、フェネチル基等
の、アルキル基またはアリール基で置換されていてもよ
い直鎖、分岐若しくは環状のアルキル基である。アリー
ル基としては、フェニル基、メシチル基、ナフチル基等
の、アルキル基で置換されていても良いフェニル基又は
ナフチル基が挙げられる。上記Ｒとして好ましくは、Ｃ
1〜Ｃ4のアルキル基、ベンジル基又はフェニル基であ
り、より好ましくはＣ1〜Ｃ4のアルキル基であり、特に
好ましくはメチル基又はエチル基である。
【００５０】本発明の製造方法において、上記式（II）
および（III）で表される化合物は少なくとも下記式（I
I'）および下記式（III'）で表される光学活性体を含
む。上記式（II）および（III）で表される化合物のう
ち下記式（II'）および下記式（III'）の含有量が多い
ことが好ましい。さらに上記式（II）および（III）で
表される化合物は下記式（II'）および下記式（III'）
からなることが好ましい。下記式（II'）および下記式
（III'）で表される化合物においてＲは前記と同義であ
る。
および（III）で表される化合物は少なくとも下記式（I
I'）および下記式（III'）で表される光学活性体を含
む。上記式（II）および（III）で表される化合物のう
ち下記式（II'）および下記式（III'）の含有量が多い
ことが好ましい。さらに上記式（II）および（III）で
表される化合物は下記式（II'）および下記式（III'）
からなることが好ましい。下記式（II'）および下記式
（III'）で表される化合物においてＲは前記と同義であ
る。
【００５１】
【化１５】
【００５２】（式中、Ｒは前記と同義である）
【００５３】
【化１６】
【００５４】（式中、Ｒは前記と同義である）
なお、本発明の製造方法により式（Ｉ）〜（III）及び
（II'）〜（III'）で表される化合物から得られる産物
は混合物でもよいが、少なくとも下記式（IV)を含む。
下記式（IV）で表される化合物においてＲは前記と同義
である。
（II'）〜（III'）で表される化合物から得られる産物
は混合物でもよいが、少なくとも下記式（IV)を含む。
下記式（IV）で表される化合物においてＲは前記と同義
である。
【００５５】
【化１７】
【００５６】（式中、Ｒは前記と同義である）
式（Ｉ）〜（III）及び（II'）〜（III'）で表される化
合物は、特開平１−２７９８６６号公報、特開平８−１
２７５８５号公報、特開平５−１７８８４１号公報等に
記載された方法と公知の方法を組み合わせることによっ
て、任意に製造することができる。これらの化合物は１
種あるいは２種以上を組み合わせて原料として使用する
ことができる。
合物は、特開平１−２７９８６６号公報、特開平８−１
２７５８５号公報、特開平５−１７８８４１号公報等に
記載された方法と公知の方法を組み合わせることによっ
て、任意に製造することができる。これらの化合物は１
種あるいは２種以上を組み合わせて原料として使用する
ことができる。
【００５７】原料として、式（I）で表される化合物を
用いて式（IＶ）で表される化合物を製造する場合に
は、その製造中間体として、式（II'）で表される化合
物を経由する場合と、式（III'）で表される化合物を経
由する場合がある。ついては、式（Ｉ）で表される化合
物から、あらかじめ式（II'）で表される化合物及び式
（III'）で表される化合物を製造し、それを単離し、さ
らに式（IＶ）で表される化合物へ誘導してもよいし、
式（II'）で表される化合物及び式（III'）で表される
化合物を単離することなく、そのまま式（IＶ）で表さ
れる化合物を製造してもよい。
用いて式（IＶ）で表される化合物を製造する場合に
は、その製造中間体として、式（II'）で表される化合
物を経由する場合と、式（III'）で表される化合物を経
由する場合がある。ついては、式（Ｉ）で表される化合
物から、あらかじめ式（II'）で表される化合物及び式
（III'）で表される化合物を製造し、それを単離し、さ
らに式（IＶ）で表される化合物へ誘導してもよいし、
式（II'）で表される化合物及び式（III'）で表される
化合物を単離することなく、そのまま式（IＶ）で表さ
れる化合物を製造してもよい。
【００５８】また、反応基質は、通常、基質濃度が０．
０１〜９０ｗ／ｖ%、好ましくは０．１〜３０ｗ／ｖ%の
範囲で用いられる。これらは、反応開始時に一括して添
加しても良いが、酵素の基質阻害があった場合の影響を
減らすと言う点や生成物の蓄積濃度を向上させるという
観点からすると、連続的もしくは間欠的に添加すること
が望ましい。
０１〜９０ｗ／ｖ%、好ましくは０．１〜３０ｗ／ｖ%の
範囲で用いられる。これらは、反応開始時に一括して添
加しても良いが、酵素の基質阻害があった場合の影響を
減らすと言う点や生成物の蓄積濃度を向上させるという
観点からすると、連続的もしくは間欠的に添加すること
が望ましい。
【００５９】本発明の製造方法において、カルボニル基
含有化合物に上記形質転換体を作用させるに当たって
は、該形質転換体細胞をそのまま、該形質転換体細胞培
養物、あるいは該形質転換体細胞を公知の方法によって
処理して得られる該形質転換体細胞処理物、例えば、該
形質転換体細胞をアセトン、ジメチルスルホキシド（Ｄ
ＭＳＯ）、トルエン等の有機溶媒や界面活性剤により処
理したもの、凍結乾燥処理したもの、物理的または酵素
的に破砕したもの等の菌体処理物、該形質転換体細胞中
の本発明の酵素画分を粗製物あるいは精製物として取り
出したもの、さらには、これらをポリアクリルアミドゲ
ル、カラギーナンゲル等に代表される担体に固定化した
ものを用いることができる。
含有化合物に上記形質転換体を作用させるに当たって
は、該形質転換体細胞をそのまま、該形質転換体細胞培
養物、あるいは該形質転換体細胞を公知の方法によって
処理して得られる該形質転換体細胞処理物、例えば、該
形質転換体細胞をアセトン、ジメチルスルホキシド（Ｄ
ＭＳＯ）、トルエン等の有機溶媒や界面活性剤により処
理したもの、凍結乾燥処理したもの、物理的または酵素
的に破砕したもの等の菌体処理物、該形質転換体細胞中
の本発明の酵素画分を粗製物あるいは精製物として取り
出したもの、さらには、これらをポリアクリルアミドゲ
ル、カラギーナンゲル等に代表される担体に固定化した
ものを用いることができる。
【００６０】また、本発明の製造方法においては、補酵
素ＮＡＤＰ+もしくはＮＡＤＰＨを添加するのが好まし
く、通常、０．００１mM〜１００mM、好ましくは０．０
１〜１０mM添加する。上記補酵素を添加する場合には、
ＮＡＤＰＨから生成するＮＡＤＰ+をＮＡＤＰＨへの再
生させることが生産効率向上のため好ましく、再生方法
としては、１）宿主微生物自体のＮＡＤＰ+還元能を利
用する方法、２）ＮＡＤＰ+からＮＡＤＰＨを生成する
能力を有する微生物やその処理物、あるいは、グルコー
ス脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵
素、アミノ酸脱水素酵素、有機酸脱水素酵素（リンゴ酸
脱水素酵素など）などのＮＡＤＰＨの再生に利用可能な
酵素（再生酵素）を反応系内に添加する方法、３）形質
転換体を製造するに当たり、ＮＡＤＰＨの再生に利用可
能な酵素である上記再生酵素類の遺伝子を本発明のＤＮ
Ａと同時に宿主に導入する方法が挙げられる。
素ＮＡＤＰ+もしくはＮＡＤＰＨを添加するのが好まし
く、通常、０．００１mM〜１００mM、好ましくは０．０
１〜１０mM添加する。上記補酵素を添加する場合には、
ＮＡＤＰＨから生成するＮＡＤＰ+をＮＡＤＰＨへの再
生させることが生産効率向上のため好ましく、再生方法
としては、１）宿主微生物自体のＮＡＤＰ+還元能を利
用する方法、２）ＮＡＤＰ+からＮＡＤＰＨを生成する
能力を有する微生物やその処理物、あるいは、グルコー
ス脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵
素、アミノ酸脱水素酵素、有機酸脱水素酵素（リンゴ酸
脱水素酵素など）などのＮＡＤＰＨの再生に利用可能な
酵素（再生酵素）を反応系内に添加する方法、３）形質
転換体を製造するに当たり、ＮＡＤＰＨの再生に利用可
能な酵素である上記再生酵素類の遺伝子を本発明のＤＮ
Ａと同時に宿主に導入する方法が挙げられる。
【００６１】このうち、上記１）の方法においては、反
応系にグルコースやエタノール、ギ酸などを添加する方
が好ましい。また、上記２）の方法においては、上記再
生酵素類を含む微生物、該微生物菌体をアセトン処理し
たもの、凍結乾燥処理したもの、物理的または酵素的に
破砕したもの等の菌体処理物、該酵素画分を粗製物ある
いは精製物として取り出したもの、さらには、これらを
ポリアクリルアミドゲル、カラギーナンゲル等に代表さ
れる担体に固定化したもの等を用いてもよく、また市販
の酵素を用いても良い。この場合、上記再生酵素の使用
量としては、具体的には、本発明のカルボニル還元酵素
に比較して、酵素活性で０．０１〜１００倍、好ましく
は０．５〜２０倍程度となるよう添加する。
応系にグルコースやエタノール、ギ酸などを添加する方
が好ましい。また、上記２）の方法においては、上記再
生酵素類を含む微生物、該微生物菌体をアセトン処理し
たもの、凍結乾燥処理したもの、物理的または酵素的に
破砕したもの等の菌体処理物、該酵素画分を粗製物ある
いは精製物として取り出したもの、さらには、これらを
ポリアクリルアミドゲル、カラギーナンゲル等に代表さ
れる担体に固定化したもの等を用いてもよく、また市販
の酵素を用いても良い。この場合、上記再生酵素の使用
量としては、具体的には、本発明のカルボニル還元酵素
に比較して、酵素活性で０．０１〜１００倍、好ましく
は０．５〜２０倍程度となるよう添加する。
【００６２】また、上記再生酵素の基質となる化合物、
例えば、グルコース脱水素酵素を利用する場合のグルコ
ース、ギ酸脱水素酵素を利用する場合のギ酸、アルコー
ル脱水素酵素を利用する場合のエタノールもしくはイソ
プロパノールなど、の添加も必要となるが、その添加量
としては、反応原料であるカルボニル基含有化合物に対
して、０．１〜２０倍モル当量、好ましくは１〜５倍モ
ル当量添加する。
例えば、グルコース脱水素酵素を利用する場合のグルコ
ース、ギ酸脱水素酵素を利用する場合のギ酸、アルコー
ル脱水素酵素を利用する場合のエタノールもしくはイソ
プロパノールなど、の添加も必要となるが、その添加量
としては、反応原料であるカルボニル基含有化合物に対
して、０．１〜２０倍モル当量、好ましくは１〜５倍モ
ル当量添加する。
【００６３】また、上記３）の方法においては、本発明
のＤＮＡと上記再生酵素類のＤＮＡを染色体に組み込む
方法、単一のベクター中に両ＤＮＡを導入し、宿主を形
質転換する方法及び両ＤＮＡをそれぞれ別個にベクター
に導入した後に宿主を形質転換する方法を用いることが
できるが、両ＤＮＡをそれぞれ別個にベクターに導入し
た後に宿主を形質転換する方法の場合、両ベクター同士
の不和合性を考慮してベクターを選択する必要がある。
のＤＮＡと上記再生酵素類のＤＮＡを染色体に組み込む
方法、単一のベクター中に両ＤＮＡを導入し、宿主を形
質転換する方法及び両ＤＮＡをそれぞれ別個にベクター
に導入した後に宿主を形質転換する方法を用いることが
できるが、両ＤＮＡをそれぞれ別個にベクターに導入し
た後に宿主を形質転換する方法の場合、両ベクター同士
の不和合性を考慮してベクターを選択する必要がある。
【００６４】単一のベクター中に複数の遺伝子を導入す
る場合には、プロモーター及びターミネーターなど発現
制御に関わる領域をそれぞれの遺伝子に連結する方法や
ラクトースオペロンのような複数のシストロンを含むオ
ペロンとして発現させることも可能である。
る場合には、プロモーター及びターミネーターなど発現
制御に関わる領域をそれぞれの遺伝子に連結する方法や
ラクトースオペロンのような複数のシストロンを含むオ
ペロンとして発現させることも可能である。
【００６５】本発明の製造方法は、反応基質及び本発明
の形質転換体細胞、該形質転換体細胞培養物または該形
質転換体処理物、並びに、必要に応じて添加された各種
補酵素及びその再生システムを含有する水性媒体中もし
くは該水性媒体と有機溶媒との混合物中で行われる。上
記水性媒体としては、リン酸ナトリウムやリン酸カリウ
ムなどを用いた緩衝液などを用いることができ、その緩
衝液に有機溶媒や、界面活性剤などの通常の酵素反応に
用いられる任意成分を適宜加えたものを用いることがで
きる。有機溶媒としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭ
ＳＯ）やテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）等の水溶性溶媒
や酢酸ブチルやヘキサン等の非水溶性有機溶媒などが挙
げられ、反応基質の溶解度が高い物を好ましく使用する
ことができる。界面活性剤としてはＴｗｅｅｎ８０やシ
ュガーエステルなどが挙げられる。
の形質転換体細胞、該形質転換体細胞培養物または該形
質転換体処理物、並びに、必要に応じて添加された各種
補酵素及びその再生システムを含有する水性媒体中もし
くは該水性媒体と有機溶媒との混合物中で行われる。上
記水性媒体としては、リン酸ナトリウムやリン酸カリウ
ムなどを用いた緩衝液などを用いることができ、その緩
衝液に有機溶媒や、界面活性剤などの通常の酵素反応に
用いられる任意成分を適宜加えたものを用いることがで
きる。有機溶媒としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭ
ＳＯ）やテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）等の水溶性溶媒
や酢酸ブチルやヘキサン等の非水溶性有機溶媒などが挙
げられ、反応基質の溶解度が高い物を好ましく使用する
ことができる。界面活性剤としてはＴｗｅｅｎ８０やシ
ュガーエステルなどが挙げられる。
【００６６】本発明の方法は、通常、４〜６０℃、好ま
しくは１０〜４５℃の反応温度で、通常ｐＨ３〜１１、
好ましくはｐＨ５〜８で行われる。また、膜リアクター
などを利用して行うことも可能である。本発明の方法に
より生成する光学活性アルコールは、反応終了後、反応
液中の菌体やタンパク質を遠心分離、膜処理などにより
分離した後に、酢酸エチル、トルエンなどの有機溶媒に
よる抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、晶析等の
などを適宜組み合わせることにより精製を行うことがで
きる。
しくは１０〜４５℃の反応温度で、通常ｐＨ３〜１１、
好ましくはｐＨ５〜８で行われる。また、膜リアクター
などを利用して行うことも可能である。本発明の方法に
より生成する光学活性アルコールは、反応終了後、反応
液中の菌体やタンパク質を遠心分離、膜処理などにより
分離した後に、酢酸エチル、トルエンなどの有機溶媒に
よる抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、晶析等の
などを適宜組み合わせることにより精製を行うことがで
きる。
【００６７】
【実施例】以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に
説明するが、その要旨を越えない限り本発明の技術分野
における通常の変更をすることができる。尚、（Ｅ）−
７−［２−シクロプロピル−４−（４−フルオロフェニ
ル）−キノリン−３−イル］−３，５−ジヒドロキシヘ
プト−６−エン酸エステル類は、目的とする３Ｒ，５Ｓ
体の他に異性体として、３Ｓ，５Ｒ体、３Ｒ，５Ｒ体及
び３Ｓ，５Ｓ体が存在し、（Ｅ）−７−［２−シクロプ
ロピル−４−（４−フルオロフェニル）−キノリン−３
−イル］−３，５−ジヒドロキシヘプト−６−エン酸エ
チルエステル（以後、ＤＯＬＥと略す）を例として示す
と、その構造式は以下の通りである。
説明するが、その要旨を越えない限り本発明の技術分野
における通常の変更をすることができる。尚、（Ｅ）−
７−［２−シクロプロピル−４−（４−フルオロフェニ
ル）−キノリン−３−イル］−３，５−ジヒドロキシヘ
プト−６−エン酸エステル類は、目的とする３Ｒ，５Ｓ
体の他に異性体として、３Ｓ，５Ｒ体、３Ｒ，５Ｒ体及
び３Ｓ，５Ｓ体が存在し、（Ｅ）−７−［２−シクロプ
ロピル−４−（４−フルオロフェニル）−キノリン−３
−イル］−３，５−ジヒドロキシヘプト−６−エン酸エ
チルエステル（以後、ＤＯＬＥと略す）を例として示す
と、その構造式は以下の通りである。
【００６８】３Ｓ，５Ｒ−ＤＯＬＥ及び３Ｒ，５Ｓ−Ｄ
ＯＬＥはシン（Ｓｙｎ）体のＤＯＬＥであり、 ３Ｓ，
５Ｓ−ＤＯＬＥ及び３Ｒ，５Ｒ−ＤＯＬＥはアンチ（ａ
ｎｔｉ）体のＤＯＬＥである。実施例中、目的生成物で
ある３Ｒ，５Ｓ体の純度をエナンチオマー過剰率で示す
ことがあるが、本実施例中では、エナンチオマー過剰率
を（3R,5S体 - 3S,5R体）／（3R,5S体 + 3S,5R体）（%
e.e.）で示した。
ＯＬＥはシン（Ｓｙｎ）体のＤＯＬＥであり、 ３Ｓ，
５Ｓ−ＤＯＬＥ及び３Ｒ，５Ｒ−ＤＯＬＥはアンチ（ａ
ｎｔｉ）体のＤＯＬＥである。実施例中、目的生成物で
ある３Ｒ，５Ｓ体の純度をエナンチオマー過剰率で示す
ことがあるが、本実施例中では、エナンチオマー過剰率
を（3R,5S体 - 3S,5R体）／（3R,5S体 + 3S,5R体）（%
e.e.）で示した。
【００６９】
【化１８】
【００７０】＜製造例１＞ （Ｅ）−７−［２−シクロ
プロピル−４−（４−フルオロフェニル）−キノリン−
３−イル］−３，５−ジオキソヘプト−６−エン酸エチ
ルエステル（以後、ＤＯＸＥと略す）の合成 攪拌機、滴下ロートおよび温度計を付けた５００ｍＬの
四つ口フラスコに、（Ｅ）−７−［２−シクロプロピル
−４−（４−フルオロフェニル）−キノリン−３−イ
ル］−５−ヒドロキシ−３−オキソヘプト−６−エン酸
エチルエステル（以後、５−ＭＯＬＥと略す）５．０２
ｇ（１１．２２ｍｍｏｌ）およびアセトン４２０ｍＬを
加え攪拌する。調製されたＪｏｎｅｓ酸化剤（濃硫酸３
ｍＬと酸化クロム３．３５ｇを混合させた後、水で２５
ｍＬまで希釈することにより得られた試剤）１０．５ｍ
Ｌを０℃で２０分を要して滴下し、氷冷下で２時間攪拌
を行った後、メタノール１０ｍＬをゆっくり加えて反応
を停止した。次に反応混合液を減圧下、アセトンを留去
させた後、酢酸エチル２５０ｍＬを加え、得られた溶液
を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液６０ｍＬで２回、引き
続き飽和食塩水溶液６０ｍＬで２回抽出・分液した後、
酢酸エチル溶液を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒
を留去した後、シリカゲルクロマトグラフィー（溶出溶
媒；ヘキサン：酢酸エチル＝２：１）で精製して、標記
化合物３．０３ｇ（収率：６０．６％）を得た。
プロピル−４−（４−フルオロフェニル）−キノリン−
３−イル］−３，５−ジオキソヘプト−６−エン酸エチ
ルエステル（以後、ＤＯＸＥと略す）の合成 攪拌機、滴下ロートおよび温度計を付けた５００ｍＬの
四つ口フラスコに、（Ｅ）−７−［２−シクロプロピル
−４−（４−フルオロフェニル）−キノリン−３−イ
ル］−５−ヒドロキシ−３−オキソヘプト−６−エン酸
エチルエステル（以後、５−ＭＯＬＥと略す）５．０２
ｇ（１１．２２ｍｍｏｌ）およびアセトン４２０ｍＬを
加え攪拌する。調製されたＪｏｎｅｓ酸化剤（濃硫酸３
ｍＬと酸化クロム３．３５ｇを混合させた後、水で２５
ｍＬまで希釈することにより得られた試剤）１０．５ｍ
Ｌを０℃で２０分を要して滴下し、氷冷下で２時間攪拌
を行った後、メタノール１０ｍＬをゆっくり加えて反応
を停止した。次に反応混合液を減圧下、アセトンを留去
させた後、酢酸エチル２５０ｍＬを加え、得られた溶液
を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液６０ｍＬで２回、引き
続き飽和食塩水溶液６０ｍＬで２回抽出・分液した後、
酢酸エチル溶液を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒
を留去した後、シリカゲルクロマトグラフィー（溶出溶
媒；ヘキサン：酢酸エチル＝２：１）で精製して、標記
化合物３．０３ｇ（収率：６０．６％）を得た。
【００７１】1H-NMR(300MHz, CDCl3, δppm): 7.79-7.1
9(8H, m), 7.71(1H, d), 6.03(1H,d), 5.51(1H,s), 4.2
1(2H, q), 3.40(2H, s), 2.35-2.40(1H, m), 1.39-1.41
(2H, m), 1.28(3H, t), 1.07-1.09(2H, m).
9(8H, m), 7.71(1H, d), 6.03(1H,d), 5.51(1H,s), 4.2
1(2H, q), 3.40(2H, s), 2.35-2.40(1H, m), 1.39-1.41
(2H, m), 1.28(3H, t), 1.07-1.09(2H, m).
【００７２】＜製造例２＞ ５Ｓ-（Ｅ）−７−〔２−
シクロプロピル−４−（４−フルオロフェニル）−キノ
リン−３−イル〕−５−ヒドロキシ−３−オキソ−ヘプ
ト−６−エン酸エチルエステル（以後、５Ｓ−ＭＯＬＥ
と略す）の合成 減圧下加熱乾燥した後に窒素ガスを導入したシュレンク
管に、（Ｓ）−２−〔Ｎ−３―メチル−５−tert-ブチ
ルサリチデン）アミノ〕−３−メチル−１−ブタノ−ル
０．８７ｇ（３．３ｍｍｏｌ）、塩化メチレン５ｍｌお
よびチタンテトラエトキシド０．６３ｍｌ（６．０ｍｍ
ｏｌ）を添加した後、室温で１時間攪拌混合した。該シ
ュレンク管を−５０℃に冷却後、（Ｅ）−３−〔２−シ
クロプロピル−４−（４−フルオロフェニル）- キノリ
ン−３−イル〕− プロプ−２−エン−１−ア−ル０．
９５ｇ（３．０ｍｍｏｌ）を塩化メチレン２ｍｌに溶解
して滴下し、５分間攪拌した後、更にジケテン０．５１
ｇ（６ｍｍｏｌ）を添加し、−５０℃を保ちながら２２
時間攪拌して反応させた。得られた反応混合液を、塩化
メチレン２５ｍｌと０．２４Ｍ重曹水２５ｍｌの混合溶
液中に添加し、２時間、室温で、激しく攪拌し２層溶液
を得た。得られた２層溶液は分液し、水層については塩
化メチレン１０ｍｌで抽出を２回行った。塩化メチレン
層と塩化メチレン抽出液とを合わて塩化メチレン溶液を
得た。該塩化メチレン溶液を無水硫酸マグネシウムで乾
燥し、溶媒を留去した後、シリカゲルクロマトグラフィ
−（溶出溶媒；ヘキサン：酢酸エチル＝３：２）で精製
して、５Ｓ-（Ｅ）−７−〔２−シクロプロピル−４−
（４−フルオロフェニル）−キノリン−３−イル〕−５
−ヒドロキシ−３−オキソ−ヘプト−６−エン酸エチル
エステル（５Ｓ−ＭＯＬＥ）０．７５ｇを得た（光学純
度：７３％ｅｅ、（Ｅ）−３−[２−シクロプロピル−
４−(４−フルオロフェニル)−キノリン−３−イル]−
プロプ−２−エン−１−ア−ルに対する収率：５６
％）。
シクロプロピル−４−（４−フルオロフェニル）−キノ
リン−３−イル〕−５−ヒドロキシ−３−オキソ−ヘプ
ト−６−エン酸エチルエステル（以後、５Ｓ−ＭＯＬＥ
と略す）の合成 減圧下加熱乾燥した後に窒素ガスを導入したシュレンク
管に、（Ｓ）−２−〔Ｎ−３―メチル−５−tert-ブチ
ルサリチデン）アミノ〕−３−メチル−１−ブタノ−ル
０．８７ｇ（３．３ｍｍｏｌ）、塩化メチレン５ｍｌお
よびチタンテトラエトキシド０．６３ｍｌ（６．０ｍｍ
ｏｌ）を添加した後、室温で１時間攪拌混合した。該シ
ュレンク管を−５０℃に冷却後、（Ｅ）−３−〔２−シ
クロプロピル−４−（４−フルオロフェニル）- キノリ
ン−３−イル〕− プロプ−２−エン−１−ア−ル０．
９５ｇ（３．０ｍｍｏｌ）を塩化メチレン２ｍｌに溶解
して滴下し、５分間攪拌した後、更にジケテン０．５１
ｇ（６ｍｍｏｌ）を添加し、−５０℃を保ちながら２２
時間攪拌して反応させた。得られた反応混合液を、塩化
メチレン２５ｍｌと０．２４Ｍ重曹水２５ｍｌの混合溶
液中に添加し、２時間、室温で、激しく攪拌し２層溶液
を得た。得られた２層溶液は分液し、水層については塩
化メチレン１０ｍｌで抽出を２回行った。塩化メチレン
層と塩化メチレン抽出液とを合わて塩化メチレン溶液を
得た。該塩化メチレン溶液を無水硫酸マグネシウムで乾
燥し、溶媒を留去した後、シリカゲルクロマトグラフィ
−（溶出溶媒；ヘキサン：酢酸エチル＝３：２）で精製
して、５Ｓ-（Ｅ）−７−〔２−シクロプロピル−４−
（４−フルオロフェニル）−キノリン−３−イル〕−５
−ヒドロキシ−３−オキソ−ヘプト−６−エン酸エチル
エステル（５Ｓ−ＭＯＬＥ）０．７５ｇを得た（光学純
度：７３％ｅｅ、（Ｅ）−３−[２−シクロプロピル−
４−(４−フルオロフェニル)−キノリン−３−イル]−
プロプ−２−エン−１−ア−ルに対する収率：５６
％）。
【００７３】＜実施例１＞ カルボニル還元酵素の単離
オガタエア・ミヌタ 変種ノンファーメンタス（Ogatae
a minuta var nonfermentans）ＩＦＯ １４７３株を２
０ＬのYM培地（グルコース24g、酵母エキス3g、麦芽エ
キス3g、ペプトン5g/L、 pH 6.0）で培養し、遠心分離
により菌体を調製した。得られた湿菌体のうち３００ｇ
を５０mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０、１ｍＭ
ＤＴＴ）で澱懸し、ダイノーミル（Ｄｙｎｏ−Ｍｉｌｌ
社製）により破砕後、遠心分離により菌体残渣を除去
し、無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液に12%w/vの
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）６０００を添加し、
遠心分離により上清を得た。その上清を標準緩衝液（１
０mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、１ｍＭ Ｄ
ＴＴ）で平衡化したＤＥＡＥセファロース６ＦＦ（２．
６ｃｍｘ２８ｃｍ）に添加した。標準緩衝液でカラムを
洗浄した後、さらに０．０７M塩化ナトリウムを含む標
準緩衝液で洗浄後、０．０７〜０．１８M塩化ナトリウ
ムの勾配溶出を行った。溶出した画分を回収し、カルボ
ニル還元酵素活性測定を行った。
a minuta var nonfermentans）ＩＦＯ １４７３株を２
０ＬのYM培地（グルコース24g、酵母エキス3g、麦芽エ
キス3g、ペプトン5g/L、 pH 6.0）で培養し、遠心分離
により菌体を調製した。得られた湿菌体のうち３００ｇ
を５０mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０、１ｍＭ
ＤＴＴ）で澱懸し、ダイノーミル（Ｄｙｎｏ−Ｍｉｌｌ
社製）により破砕後、遠心分離により菌体残渣を除去
し、無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液に12%w/vの
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）６０００を添加し、
遠心分離により上清を得た。その上清を標準緩衝液（１
０mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、１ｍＭ Ｄ
ＴＴ）で平衡化したＤＥＡＥセファロース６ＦＦ（２．
６ｃｍｘ２８ｃｍ）に添加した。標準緩衝液でカラムを
洗浄した後、さらに０．０７M塩化ナトリウムを含む標
準緩衝液で洗浄後、０．０７〜０．１８M塩化ナトリウ
ムの勾配溶出を行った。溶出した画分を回収し、カルボ
ニル還元酵素活性測定を行った。
【００７４】カルボニル還元酵素活性測定は以下の反応
液組成：酵素活性測定画分 200μL、にＮＡＤＰＨ ８
ｍＭの水酸化カリウム ０．１ｍＭの水溶液１０μＬ、
0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0）25μL、２０ｇ／Ｌ ＤＯＸ
Ｅ（ＤＭＳＯ溶液）１０μＬ添加したものを30℃、一夜
振とう反応させることで行った。活性検出は以下方法で
行った。反応終了後の反応液に酢酸エチルを０．５ｍＬ
加え激しく混合し、遠心分離にて有機層と水層とに分離
した。有機層を別の容器に移し、溶媒を濃縮遠心機で留
去し、乾固された生成物を酢酸エチル０．０１ｍＬで溶
解し、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）をおこなっ
た。ＴＬＣはシリカゲルプレート（メルク社製silica g
el 60 F 254)を用い、展開溶媒はヘキサン／酢酸エチル
＝１／１を用いた。展開終了後、ＵＶランプにて生成物
の確認をした。化合物（Ｉ）はＲｆ＝０．７６〜０．８
６、化合物（ＩＩ）および化合物（ＩＩＩ）は０．５４
〜０．６１、化合物（ＩＶ）（式中、Ｒ＝エチル基の化
合物：ＤＯＬＥ）はＲｆ＝０．３３である。
液組成：酵素活性測定画分 200μL、にＮＡＤＰＨ ８
ｍＭの水酸化カリウム ０．１ｍＭの水溶液１０μＬ、
0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0）25μL、２０ｇ／Ｌ ＤＯＸ
Ｅ（ＤＭＳＯ溶液）１０μＬ添加したものを30℃、一夜
振とう反応させることで行った。活性検出は以下方法で
行った。反応終了後の反応液に酢酸エチルを０．５ｍＬ
加え激しく混合し、遠心分離にて有機層と水層とに分離
した。有機層を別の容器に移し、溶媒を濃縮遠心機で留
去し、乾固された生成物を酢酸エチル０．０１ｍＬで溶
解し、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）をおこなっ
た。ＴＬＣはシリカゲルプレート（メルク社製silica g
el 60 F 254)を用い、展開溶媒はヘキサン／酢酸エチル
＝１／１を用いた。展開終了後、ＵＶランプにて生成物
の確認をした。化合物（Ｉ）はＲｆ＝０．７６〜０．８
６、化合物（ＩＩ）および化合物（ＩＩＩ）は０．５４
〜０．６１、化合物（ＩＶ）（式中、Ｒ＝エチル基の化
合物：ＤＯＬＥ）はＲｆ＝０．３３である。
【００７５】カルボニル還元酵素活性は、０．１３Ｍ塩
化ナトリウム付近にピークが見られた。溶出した活性画
分を回収し、硫安を終濃度０．３Ｍになるまで添加し、
０．３Ｍ硫安を含む標準緩衝液（１０mMリン酸カリウム
緩衝液（ｐＨ７．０）、１ｍＭ ＤＴＴ）で平衡化した
オクチルセファロースＣＬ４Ｂ（０．８cm×２０cm）に
添加し、硫安濃度を０．３〜０Ｍの勾配溶出を行った。
カルボニル還元酵素活性は、０Ｍ硫安付近にピークが見
られた。
化ナトリウム付近にピークが見られた。溶出した活性画
分を回収し、硫安を終濃度０．３Ｍになるまで添加し、
０．３Ｍ硫安を含む標準緩衝液（１０mMリン酸カリウム
緩衝液（ｐＨ７．０）、１ｍＭ ＤＴＴ）で平衡化した
オクチルセファロースＣＬ４Ｂ（０．８cm×２０cm）に
添加し、硫安濃度を０．３〜０Ｍの勾配溶出を行った。
カルボニル還元酵素活性は、０Ｍ硫安付近にピークが見
られた。
【００７６】溶出したピーク部分を回収し、限外濾過に
より標準溶液まで脱塩、濃縮した後同緩衝液で平衡化し
たＭｏｎｏＱ ＨＲ５／５に添加し、同緩衝液及び０．
０５Ｍ 塩化ナトリウムを含む同緩衝液で洗浄後、０．
０５Ｍ〜０．２５Ｍ塩化ナトリウムの濃度勾配溶出を行
った。カルボニル還元酵素活性は、０．１７Ｍ 塩化ナ
トリウム画分に溶出したため、この画分を回収し、濃縮
した。濃縮した酵素液をスーパーデックス２００ ＨＲ
１０／３０を用い、０．１５M塩化ナトリウムを含む標
準緩衝液でゲル濾過を行った。ゲル濾過により得られた
活性画分の分子量は、約１０．７万Ｄａであった。
より標準溶液まで脱塩、濃縮した後同緩衝液で平衡化し
たＭｏｎｏＱ ＨＲ５／５に添加し、同緩衝液及び０．
０５Ｍ 塩化ナトリウムを含む同緩衝液で洗浄後、０．
０５Ｍ〜０．２５Ｍ塩化ナトリウムの濃度勾配溶出を行
った。カルボニル還元酵素活性は、０．１７Ｍ 塩化ナ
トリウム画分に溶出したため、この画分を回収し、濃縮
した。濃縮した酵素液をスーパーデックス２００ ＨＲ
１０／３０を用い、０．１５M塩化ナトリウムを含む標
準緩衝液でゲル濾過を行った。ゲル濾過により得られた
活性画分の分子量は、約１０．７万Ｄａであった。
【００７７】また、上記活性画分をポリアクリルアミド
ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により解析した結
果、ほぼ単一バンドであり、その分子量は約２．７万Ｄ
ａであった。また、該酵素を種々のケトンやアルデヒド
と反応させることにより、具体的には、基質100mMのイ
ソプロパノール溶液を５μＬ、ＮＡＤＰＨ ８ｍＭ及び
水酸化カリウム ０．１ｍＭの水溶液１０μＬを0.1Mリ
ン酸緩衝液（pH7.0）で総量２５０μＬの反応液とした
ものの中でのＮＡＤＰＨ減少初速度を測定することによ
り、その還元活性を測定した。このときの２，２，２−
トリフルオロアセトフェノンでの吸光度変化量を１００
としたときの比活性を表1に示した。
ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により解析した結
果、ほぼ単一バンドであり、その分子量は約２．７万Ｄ
ａであった。また、該酵素を種々のケトンやアルデヒド
と反応させることにより、具体的には、基質100mMのイ
ソプロパノール溶液を５μＬ、ＮＡＤＰＨ ８ｍＭ及び
水酸化カリウム ０．１ｍＭの水溶液１０μＬを0.1Mリ
ン酸緩衝液（pH7.0）で総量２５０μＬの反応液とした
ものの中でのＮＡＤＰＨ減少初速度を測定することによ
り、その還元活性を測定した。このときの２，２，２−
トリフルオロアセトフェノンでの吸光度変化量を１００
としたときの比活性を表1に示した。
【００７８】
【表１】
【００７９】該酵素の至適ｐＨは、ｐＨの異なる複数の
緩衝液中で、２，２，２−トリフルオロアセトフェノン
還元活性を測定することで求めた。具体的には、0.1Mの
リン酸カリウム緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液及びクエ
ン酸緩衝液において、それぞれpHの異なるものを用意
し、活性測定した。反応の至適pHは５．０〜６．５であ
った。また、反応温度だけを変化させて、２，２，２−
トリフルオロアセトフェノン還元活性を測定し、カルボ
ニル還元酵素の作用至適温度を測定したところ、至適温
度は６０〜７０℃であった。
緩衝液中で、２，２，２−トリフルオロアセトフェノン
還元活性を測定することで求めた。具体的には、0.1Mの
リン酸カリウム緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液及びクエ
ン酸緩衝液において、それぞれpHの異なるものを用意
し、活性測定した。反応の至適pHは５．０〜６．５であ
った。また、反応温度だけを変化させて、２，２，２−
トリフルオロアセトフェノン還元活性を測定し、カルボ
ニル還元酵素の作用至適温度を測定したところ、至適温
度は６０〜７０℃であった。
【００８０】該酵素のｐH安定性は、0.1Mのリン酸カリ
ウム緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液及びクエン酸緩衝液
において異なるｐＨのものを複数用意し、それぞれ30
℃、30分間インキュベートし、残存活性を測定したとこ
ろ、ｐＨ５．５〜６．５において最も安定であった。該
酵素の温度安定性は、ｐＨ７．０で２０ｍＭのリン酸緩
衝液中、３０℃、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃及び
８０℃の温度でそれぞれ10分間放置した後、２，２，２
−トリフルオロアセトフェノン還元活性を測定すること
により調べた。それによると本発明の酵素は４０℃まで
７９%以上の残存活性を示し、５０℃以上で急速に失活
しはじめ、７０℃では活性が全くなくなることがわかっ
た。
ウム緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液及びクエン酸緩衝液
において異なるｐＨのものを複数用意し、それぞれ30
℃、30分間インキュベートし、残存活性を測定したとこ
ろ、ｐＨ５．５〜６．５において最も安定であった。該
酵素の温度安定性は、ｐＨ７．０で２０ｍＭのリン酸緩
衝液中、３０℃、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃及び
８０℃の温度でそれぞれ10分間放置した後、２，２，２
−トリフルオロアセトフェノン還元活性を測定すること
により調べた。それによると本発明の酵素は４０℃まで
７９%以上の残存活性を示し、５０℃以上で急速に失活
しはじめ、７０℃では活性が全くなくなることがわかっ
た。
【００８１】また、該酵素を種々の試薬中で30℃、10分
間処理した後、２，２，２−トリフルオロアセトフェノ
ン還元活性を測定したところ、該酵素は、硝酸水銀や塩
化鉛のような水銀（Ｉ）イオン、鉛（ＩＩ）イオン存在
下で活性が顕著に阻害された。
間処理した後、２，２，２−トリフルオロアセトフェノ
ン還元活性を測定したところ、該酵素は、硝酸水銀や塩
化鉛のような水銀（Ｉ）イオン、鉛（ＩＩ）イオン存在
下で活性が顕著に阻害された。
【００８２】＜実施例２＞ カルボニル還元酵素の部分
アミノ酸配列の解析 実施例１で得られたカルボニル還元酵素を含む画分を脱
塩、濃縮後、リジルエンドペプチダーゼを用いて、30℃
で終夜処理を行った。消化したペプチドを逆相ＨＰＬＣ
(アマシャム-ファルマシア製uRPC C2/C18、 46mm ×
１００mm) を用い、0.1% トリフルオロ酢酸 (TFA) 中で
アセトニトリルのグラジエント溶出によりペプチドを分
離し、分取した。分取したペプチドピーク３種をFrac2
0,27及び30とし、それぞれエドマン法によりアミノ酸配
列の解析を行った。Frac20,27及び30のそれぞれのアミ
ノ酸配列は配列番号３、４及び５に示した。同様にカル
ボニル還元酵素を含む画分を脱塩後エドマン法によりＮ
末端アミノ酸の解析を行い、結果を配列番号６で示し
た。
アミノ酸配列の解析 実施例１で得られたカルボニル還元酵素を含む画分を脱
塩、濃縮後、リジルエンドペプチダーゼを用いて、30℃
で終夜処理を行った。消化したペプチドを逆相ＨＰＬＣ
(アマシャム-ファルマシア製uRPC C2/C18、 46mm ×
１００mm) を用い、0.1% トリフルオロ酢酸 (TFA) 中で
アセトニトリルのグラジエント溶出によりペプチドを分
離し、分取した。分取したペプチドピーク３種をFrac2
0,27及び30とし、それぞれエドマン法によりアミノ酸配
列の解析を行った。Frac20,27及び30のそれぞれのアミ
ノ酸配列は配列番号３、４及び５に示した。同様にカル
ボニル還元酵素を含む画分を脱塩後エドマン法によりＮ
末端アミノ酸の解析を行い、結果を配列番号６で示し
た。
【００８３】＜実施例３＞ オガタエア・ミヌタ 変種
ノンファーメンタス（Ogataea minutavar nonfermentan
s）ＩＦＯ １４７３株由来の本発明のＤＮＡの配列解
析及び形質転換体の作製 オガタエア・ミヌタ 変種ノンファーメンタス（Ogatae
a minuta var nonfermentans）ＩＦＯ １４７３株をＹ
Ｍ培地で培養し、菌体を調製した。菌体からの総ＲＮＡ
の精製は、ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ（東洋紡社製）を
用いて行った。精製したＲＮＡをもとにしてＳｕｐｅｒ
ＳｃｒｉｐｔＩＩ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社
製）を用いてＦｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを合
成した。方法はそれぞれ添付の説明書通りに行った。
ノンファーメンタス（Ogataea minutavar nonfermentan
s）ＩＦＯ １４７３株由来の本発明のＤＮＡの配列解
析及び形質転換体の作製 オガタエア・ミヌタ 変種ノンファーメンタス（Ogatae
a minuta var nonfermentans）ＩＦＯ １４７３株をＹ
Ｍ培地で培養し、菌体を調製した。菌体からの総ＲＮＡ
の精製は、ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ（東洋紡社製）を
用いて行った。精製したＲＮＡをもとにしてＳｕｐｅｒ
ＳｃｒｉｐｔＩＩ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社
製）を用いてＦｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを合
成した。方法はそれぞれ添付の説明書通りに行った。
【００８４】実施例２で得られたN末端アミノ酸配列を
元にセンスデジェネレイト(degenerate)プライマー及び
配列番号３、４及び５のアミノ酸配列を元にそれぞれア
ンチセンスのデジェネレイト(degenerate)プライマーを
計４種類合成した。それぞれの塩基配列を配列番号７、
8、９、1０に示した。N末端と3つの部分アミノ酸配列の
組み合わせ（3通り）でプライマーを選び、 プライマー
を各４００ｐｍｏｌ、dNTP ０．４ｍｍｏｌ、上記で
合成したオガタエア・ミヌタ 変種ノンファーメンタス
（Ogataea minuta var nonfermentans）ＩＦＯ １４７
３株のｃＤＮＡ１μL、TaKaRa Taq用１０×緩衝液 (宝
酒造社製)５μL及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ２ユニッ
ト(宝酒造社製、商品名「TaKaRa Taq」)を含む５０μL
の反応液を用い、変性（94℃、30秒) 、アニール（50
℃、30秒）、伸長（72℃、1分）を30サイクル、PTC-200
Peltier Thermal Cycler (MJ Research社製)を用いて
行った。ＰＣＲ反応液の一部をアガロースゲル電気泳動
により解析した結果、配列番号７のプライマーと配列番
号８のプライマー、配列番号７のプライマーと配列番号
９のプライマー、配列番号７のプライマーと配列番号１
０との組み合わせにおいて特異的と思われるバンドが検
出できた。
元にセンスデジェネレイト(degenerate)プライマー及び
配列番号３、４及び５のアミノ酸配列を元にそれぞれア
ンチセンスのデジェネレイト(degenerate)プライマーを
計４種類合成した。それぞれの塩基配列を配列番号７、
8、９、1０に示した。N末端と3つの部分アミノ酸配列の
組み合わせ（3通り）でプライマーを選び、 プライマー
を各４００ｐｍｏｌ、dNTP ０．４ｍｍｏｌ、上記で
合成したオガタエア・ミヌタ 変種ノンファーメンタス
（Ogataea minuta var nonfermentans）ＩＦＯ １４７
３株のｃＤＮＡ１μL、TaKaRa Taq用１０×緩衝液 (宝
酒造社製)５μL及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ２ユニッ
ト(宝酒造社製、商品名「TaKaRa Taq」)を含む５０μL
の反応液を用い、変性（94℃、30秒) 、アニール（50
℃、30秒）、伸長（72℃、1分）を30サイクル、PTC-200
Peltier Thermal Cycler (MJ Research社製)を用いて
行った。ＰＣＲ反応液の一部をアガロースゲル電気泳動
により解析した結果、配列番号７のプライマーと配列番
号８のプライマー、配列番号７のプライマーと配列番号
９のプライマー、配列番号７のプライマーと配列番号１
０との組み合わせにおいて特異的と思われるバンドが検
出できた。
【００８５】上記で得られた３種類のＤＮＡ断片を、ア
ガロースゲル電気泳動を行い、目的とするバンドの部分
を切り出しGel Extraction kit(QIAGEN社製)にて精製
して回収した。得られたＤＮＡ断片を、pGEM-T Vector
System(Promega社製)によりTAクローニングし、大腸
菌DH5α株（東洋紡社製）を形質転換した。形質転換株
を１%バクトトリプトン、０．５%バクト酵母エキス及び
１%塩化ナトリウムを含む培地（以下、LB培地と略す）
にアンピシリン（１００μg/mL）を加え、１．５％バク
トアガーでプレート化したもの上で生育させ、いくつか
のコロニーを用いて、ベクターの配列より合成された配
列番号１１及び１２をプライマーとしてコロニーダイレ
クトＰＣＲを行い、挿入断片のサイズを確認した。目的
とするＤＮＡ断片が挿入されていると考えられるコロニ
ーを100μg/mLアンピシリンを含む液体ＬＢ培地で培養
し、Mini-Prep (QIAGEN製) によりプラスミドを精製し
た。配列番号７のプライマーと配列番号８のプライマ
ー、配列番号７のプライマーと配列番号９のプライマ
ー、配列番号７のプライマーと配列番号１０のプライマ
ーとの組み合わせから得られたプラスミドをそれぞれph
ir21-23、phir21-25、phir21-27とした。
ガロースゲル電気泳動を行い、目的とするバンドの部分
を切り出しGel Extraction kit(QIAGEN社製)にて精製
して回収した。得られたＤＮＡ断片を、pGEM-T Vector
System(Promega社製)によりTAクローニングし、大腸
菌DH5α株（東洋紡社製）を形質転換した。形質転換株
を１%バクトトリプトン、０．５%バクト酵母エキス及び
１%塩化ナトリウムを含む培地（以下、LB培地と略す）
にアンピシリン（１００μg/mL）を加え、１．５％バク
トアガーでプレート化したもの上で生育させ、いくつか
のコロニーを用いて、ベクターの配列より合成された配
列番号１１及び１２をプライマーとしてコロニーダイレ
クトＰＣＲを行い、挿入断片のサイズを確認した。目的
とするＤＮＡ断片が挿入されていると考えられるコロニ
ーを100μg/mLアンピシリンを含む液体ＬＢ培地で培養
し、Mini-Prep (QIAGEN製) によりプラスミドを精製し
た。配列番号７のプライマーと配列番号８のプライマ
ー、配列番号７のプライマーと配列番号９のプライマ
ー、配列番号７のプライマーと配列番号１０のプライマ
ーとの組み合わせから得られたプラスミドをそれぞれph
ir21-23、phir21-25、phir21-27とした。
【００８６】精製したプラスミドを用いて、挿入ＤＮＡ
の塩基配列をダイターミネーター法により解析した。決
定されたphir21-23、phir21-25、phir21-27の各挿入断
片部分の塩基配列をそれぞれ配列番号：１３、１４、１
５として示した。上記塩基配列を元に設計したプライマ
ーを用いて、オガタエア・ミヌタ 変種ノンファーメン
タス（Ogataea minuta var nonfermentans）ＩＦＯ １
４７３株から調製された総ＲＮＡに対し、５’ＲＡＣＥ
法及び３’ＲＡＣＥ法を行った。
の塩基配列をダイターミネーター法により解析した。決
定されたphir21-23、phir21-25、phir21-27の各挿入断
片部分の塩基配列をそれぞれ配列番号：１３、１４、１
５として示した。上記塩基配列を元に設計したプライマ
ーを用いて、オガタエア・ミヌタ 変種ノンファーメン
タス（Ogataea minuta var nonfermentans）ＩＦＯ １
４７３株から調製された総ＲＮＡに対し、５’ＲＡＣＥ
法及び３’ＲＡＣＥ法を行った。
【００８７】５’ＲＡＣＥ法は、配列番号１６、１７で
示される塩基配列のプライマーをGene Specific Prim
er(以下GSPと略す)1,2として用い、５’ＲＡＣＥ Ｓｙ
ｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔ
ｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄｓ、ｖｅｒ２．０(Ｌ
ｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製)にて行った後、そ
れをテンプレートとして再度配列番号１８で示される塩
基配列のプライマーをGSPとして５’ＲＡＣＥ法を行っ
た。３’ＲＡＣＥ法については、配列番号１９で示され
る塩基配列のプライマーをGSPとして用い、３’ＲＡＣ
Ｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆ
ｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄｓ(Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製)を用いて行った。なお、
各ＲＡＣＥ法はおのおの添付されている取扱説明書に基
づいておこなった。
示される塩基配列のプライマーをGene Specific Prim
er(以下GSPと略す)1,2として用い、５’ＲＡＣＥ Ｓｙ
ｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔ
ｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄｓ、ｖｅｒ２．０(Ｌ
ｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製)にて行った後、そ
れをテンプレートとして再度配列番号１８で示される塩
基配列のプライマーをGSPとして５’ＲＡＣＥ法を行っ
た。３’ＲＡＣＥ法については、配列番号１９で示され
る塩基配列のプライマーをGSPとして用い、３’ＲＡＣ
Ｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆ
ｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄｓ(Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製)を用いて行った。なお、
各ＲＡＣＥ法はおのおの添付されている取扱説明書に基
づいておこなった。
【００８８】得られたDNA断片はpGEM-T Vector Syste
m(Promega社製)によりTAクローニングし、大腸菌DH5α
株（東洋紡社製）を形質転換した。形質転換株を１００
μg/mLアンピシリンを含むＬＢ培地プレート上で生育さ
せ、いくつかのコロニーを用いて、ベクターの配列より
合成された配列番号１１、１２をプライマーとして用い
てコロニーダイレクトＰＣＲを行い、挿入断片のサイズ
を確認した。目的とするＤＮＡ断片が挿入されていると
考えられるコロニーを１００μg/mLアンピシリンを含む
液体ＬＢ培地で培養し、Mini-Prep (QIAGEN製) により
プラスミドを精製した後に、ダイターミネーター法によ
りＤＮＡ塩基配列の解析を行った。
m(Promega社製)によりTAクローニングし、大腸菌DH5α
株（東洋紡社製）を形質転換した。形質転換株を１００
μg/mLアンピシリンを含むＬＢ培地プレート上で生育さ
せ、いくつかのコロニーを用いて、ベクターの配列より
合成された配列番号１１、１２をプライマーとして用い
てコロニーダイレクトＰＣＲを行い、挿入断片のサイズ
を確認した。目的とするＤＮＡ断片が挿入されていると
考えられるコロニーを１００μg/mLアンピシリンを含む
液体ＬＢ培地で培養し、Mini-Prep (QIAGEN製) により
プラスミドを精製した後に、ダイターミネーター法によ
りＤＮＡ塩基配列の解析を行った。
【００８９】上記５’ＲＡＣＥ及び３’ＲＡＣＥで得ら
れたphir21-25の5'上流の塩基配列及び3'下流の塩基配
列と、配列番号１４に記載の塩基配列情報とを元に作成
したＤＮＡ配列についてGenetyx（ソフトウェア開発株
式会社製）を用いてORF検索を行い、本発明のＤＮＡ配
列及びコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番
号：２０に示される塩基配列及びアミノ酸配列に仮決定
した。
れたphir21-25の5'上流の塩基配列及び3'下流の塩基配
列と、配列番号１４に記載の塩基配列情報とを元に作成
したＤＮＡ配列についてGenetyx（ソフトウェア開発株
式会社製）を用いてORF検索を行い、本発明のＤＮＡ配
列及びコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番
号：２０に示される塩基配列及びアミノ酸配列に仮決定
した。
【００９０】配列番号２０に記載のアミノ酸配列を用い
てDDBJを対象にBLAST programを用いてホモロジー検索
を行った結果、既知のタンパク質の中でもっとも高いホ
モロジーを示したのは、シゾサッカロミセス・ポンベ
（Schizosaccharomyces pombe）のprobable short chai
n dehydrogenase（T41540）の３７．４%であった。引き
続き、上記配列番号２０に記載の配列を元に、クローニ
ング用のプライマーとして配列番号：２１に記載の塩基
配列及び配列番号：２２に記載の塩基配列を合成し、上
記プライマーを各５０pmol、dNTP２００nmol、オガタエ
ア・ミヌタ 変種ノンファーメンタス（Ogataea minuta
var nonfermentans）ＩＦＯ １４７３株のcDNA 1μL
、KOD-DNApolymerase用１０×緩衝液 (東洋紡社製)５
μL、KOD-DNA polymerase２．５ユニット(東洋紡社製)
を含む５０μLの反応液を用い、変性（９6℃、３０
秒)、アニール（５４℃、３０秒）、伸長（７４℃、１
分）を３０サイクル、PTC-200 Peltier Thermal Cycler
(MJ Research社製) を用いて行った。ＰＣＲ反応液の
一部をアガロースゲル電気泳動により解析した結果、特
異的と思われるバンドが検出できた。
てDDBJを対象にBLAST programを用いてホモロジー検索
を行った結果、既知のタンパク質の中でもっとも高いホ
モロジーを示したのは、シゾサッカロミセス・ポンベ
（Schizosaccharomyces pombe）のprobable short chai
n dehydrogenase（T41540）の３７．４%であった。引き
続き、上記配列番号２０に記載の配列を元に、クローニ
ング用のプライマーとして配列番号：２１に記載の塩基
配列及び配列番号：２２に記載の塩基配列を合成し、上
記プライマーを各５０pmol、dNTP２００nmol、オガタエ
ア・ミヌタ 変種ノンファーメンタス（Ogataea minuta
var nonfermentans）ＩＦＯ １４７３株のcDNA 1μL
、KOD-DNApolymerase用１０×緩衝液 (東洋紡社製)５
μL、KOD-DNA polymerase２．５ユニット(東洋紡社製)
を含む５０μLの反応液を用い、変性（９6℃、３０
秒)、アニール（５４℃、３０秒）、伸長（７４℃、１
分）を３０サイクル、PTC-200 Peltier Thermal Cycler
(MJ Research社製) を用いて行った。ＰＣＲ反応液の
一部をアガロースゲル電気泳動により解析した結果、特
異的と思われるバンドが検出できた。
【００９１】上記で検出されたバンド部分をQIAGEN Ge
l Extraction kit（キアゲン社製）にて回収した。回
収したＤＮＡ断片を制限酵素HindIIIとEcoRIで消化し、
アガロースゲル電気泳動を行い、目的とするバンドの部
分を切り出し、再度、QiagenGel Extraction kit (キ
アゲン社製) により精製後回収した。得られたＤＮＡ断
片を、EcoRI、及びHindIIIで消化したpKK223-3（ファル
マシア社製）とTakara Ligation Kitを用いて、ライゲ
ーションし、大腸菌JM109株を形質転換した。
l Extraction kit（キアゲン社製）にて回収した。回
収したＤＮＡ断片を制限酵素HindIIIとEcoRIで消化し、
アガロースゲル電気泳動を行い、目的とするバンドの部
分を切り出し、再度、QiagenGel Extraction kit (キ
アゲン社製) により精製後回収した。得られたＤＮＡ断
片を、EcoRI、及びHindIIIで消化したpKK223-3（ファル
マシア社製）とTakara Ligation Kitを用いて、ライゲ
ーションし、大腸菌JM109株を形質転換した。
【００９２】形質転換体をアンピシリン（５０μg/mL）
を含むＬＢ培地プレート上で生育させ、いくつかのコロ
ニーを用いて、ベクターの配列より合成された配列番号
２３で示される塩基配列のプライマー及び配列番号２４
で示される塩基配列のプライマーを用いてコロニーダイ
レクトＰＣＲを行い、挿入断片のサイズを確認した。目
的とするＤＮＡ断片が挿入されていると考えられる形質
転換体を５０μg/mLのアンピシリンを含む液体ＬＢ培地
で培養し、Qiagen 500（キアゲン社製）を用いてプラス
ミドを精製し、pKK223-3OCR1とした。プラスミドに挿入
したＤＮＡの塩基配列をダイターミネーター法により解
析したところ、挿入されたＤＮＡ断片は、配列番号：２
で表される塩基配列からなる遺伝子の5'上流にクローニ
ングのための６塩基が、3'下流にオガタエア・ミヌタ変
種ノンファーメンタス（Ogataea minuta var nonfermen
tans）ＩＦＯ １４７３株由来のダブルストップコドン
（TAGTAAT）とクローニングのため６塩基が付与された
ＤＮＡ断片であった。ｐＫＫ２３３−３ＯＣＲ１に挿入
されたＤＮＡ断片の塩基配列を配列番号：２５に、該Ｄ
ＮＡ断片がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列
番号：１に示した。
を含むＬＢ培地プレート上で生育させ、いくつかのコロ
ニーを用いて、ベクターの配列より合成された配列番号
２３で示される塩基配列のプライマー及び配列番号２４
で示される塩基配列のプライマーを用いてコロニーダイ
レクトＰＣＲを行い、挿入断片のサイズを確認した。目
的とするＤＮＡ断片が挿入されていると考えられる形質
転換体を５０μg/mLのアンピシリンを含む液体ＬＢ培地
で培養し、Qiagen 500（キアゲン社製）を用いてプラス
ミドを精製し、pKK223-3OCR1とした。プラスミドに挿入
したＤＮＡの塩基配列をダイターミネーター法により解
析したところ、挿入されたＤＮＡ断片は、配列番号：２
で表される塩基配列からなる遺伝子の5'上流にクローニ
ングのための６塩基が、3'下流にオガタエア・ミヌタ変
種ノンファーメンタス（Ogataea minuta var nonfermen
tans）ＩＦＯ １４７３株由来のダブルストップコドン
（TAGTAAT）とクローニングのため６塩基が付与された
ＤＮＡ断片であった。ｐＫＫ２３３−３ＯＣＲ１に挿入
されたＤＮＡ断片の塩基配列を配列番号：２５に、該Ｄ
ＮＡ断片がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列
番号：１に示した。
【００９３】＜実施例５＞ 本発明のＤＮＡによって形
質転換した大腸菌を用いたＤＯＸＥからのＤＯＬＥの製
造 実施例４で得られた形質転換体をアンピシリン（５０μ
g/mL）、0.1mM イソプロピル β−Ｄ−チオガラクトピ
ラノシド（IPTG）を含むＬＢ培地で３７℃で１７時間生
育させ、得られた菌体ブロス2mLを遠心分離により集菌
後、180μLの100mMリン酸カリウム緩衝液（pH７．０）
に懸濁した後に、下記に示す方法により、（Ｅ）−７−
［２−シクロプロピル−４−（４−フルオロフェニル）
−キノリン−３−イル］−３，５−ジオキソヘプト−６
−エン酸エチルエステル（ＤＯＸＥ）を基質として還元
活性を確認した。
質転換した大腸菌を用いたＤＯＸＥからのＤＯＬＥの製
造 実施例４で得られた形質転換体をアンピシリン（５０μ
g/mL）、0.1mM イソプロピル β−Ｄ−チオガラクトピ
ラノシド（IPTG）を含むＬＢ培地で３７℃で１７時間生
育させ、得られた菌体ブロス2mLを遠心分離により集菌
後、180μLの100mMリン酸カリウム緩衝液（pH７．０）
に懸濁した後に、下記に示す方法により、（Ｅ）−７−
［２−シクロプロピル−４−（４−フルオロフェニル）
−キノリン−３−イル］−３，５−ジオキソヘプト−６
−エン酸エチルエステル（ＤＯＸＥ）を基質として還元
活性を確認した。
【００９４】上記菌体懸濁物に2g/L NADP+ (オリエン
タル酵母社製)10μＬ、トルエン 1μＬを添加後、5分
間ボルテックスミキサーで攪拌した。50%グルコース 1
0μＬ、グルコースデヒドロゲナーゼ溶液（天野製薬社
製；２５U/mL） 10μＬ、上記基質をＤＭＳＯに20g/L
で溶解させたもの50μＬ（基質 １ｍｇ分）を添加後４
０℃で20時間振とう反応させた。反応終了後の反応懸濁
液にアセトニトリル１．７５ｍＬを添加して希釈後遠心
し、上清上の生成物を高速液体クロマトグラフィー（Ｈ
ＰＬＣ）を用いて測定した。ＨＰＬＣの条件は以下の通
りである。 カラム：MCIGEL CHP2MGM(三菱化学社製) 溶離液：メタノール／アセトニトリル／水／リン酸＝80
0／100／100／１ 流速：0.6ml/min 検出：ＵＶ２５４ｎｍ 温度：60℃ この結果、収量は３１９μｇであり、収率は３１．９%
であった。
タル酵母社製)10μＬ、トルエン 1μＬを添加後、5分
間ボルテックスミキサーで攪拌した。50%グルコース 1
0μＬ、グルコースデヒドロゲナーゼ溶液（天野製薬社
製；２５U/mL） 10μＬ、上記基質をＤＭＳＯに20g/L
で溶解させたもの50μＬ（基質 １ｍｇ分）を添加後４
０℃で20時間振とう反応させた。反応終了後の反応懸濁
液にアセトニトリル１．７５ｍＬを添加して希釈後遠心
し、上清上の生成物を高速液体クロマトグラフィー（Ｈ
ＰＬＣ）を用いて測定した。ＨＰＬＣの条件は以下の通
りである。 カラム：MCIGEL CHP2MGM(三菱化学社製) 溶離液：メタノール／アセトニトリル／水／リン酸＝80
0／100／100／１ 流速：0.6ml/min 検出：ＵＶ２５４ｎｍ 温度：60℃ この結果、収量は３１９μｇであり、収率は３１．９%
であった。
【００９５】また、光学純度の測定は、反応終了後の反
応液に酢酸エチルを０．５ｍＬ加え激しく混合し、遠心
分離にて有機層と水層とに分離した。有機層を別の容器
に移し、溶媒を濃縮遠心機で留去し、乾固された生成物
を酢酸エチル０．０１ｍＬで溶解し、薄層クロマトグラ
フィー（ＴＬＣ）をおこなった。ＴＬＣはシリカゲルプ
レート（メルク社製silica gel 60 F 254)を用い、展開
溶媒はヘキサン／酢酸エチル＝１／１を用いた。
応液に酢酸エチルを０．５ｍＬ加え激しく混合し、遠心
分離にて有機層と水層とに分離した。有機層を別の容器
に移し、溶媒を濃縮遠心機で留去し、乾固された生成物
を酢酸エチル０．０１ｍＬで溶解し、薄層クロマトグラ
フィー（ＴＬＣ）をおこなった。ＴＬＣはシリカゲルプ
レート（メルク社製silica gel 60 F 254)を用い、展開
溶媒はヘキサン／酢酸エチル＝１／１を用いた。
【００９６】展開終了後、ＵＶランプにて生成物の確認
をした。化合物（Ｉ）はＲｆ＝０．７６〜０．８６ 、
化合物（ＩＩ）および化合物（ＩＩＩ）は０．５４〜
０．６１、化合物（ＩＶ）（式中、Ｒ＝エチル基の化合
物：以下、ＤＯＬＥと略す）はＲｆ＝０．３３である。
ＤＯＬＥのＴＬＣ上のスポットを掻き取りイソプロパノ
ール０．２５ｍＬで溶出し、遠心分離後上清を高速液体
クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて光学純度およ
びＴＬＣ掻き取りサンプルの濃度を分析した。ＨＰＬＣ
の条件は以下の通りである。 カラム：ダイセルCHIRALCEL AD 溶離液：ヘキサン／エタノール／トリフルオロ酢酸＝９
００／１００／１ 流速：１ml/min 検出：ＵＶ２５４ｎｍ 温度：室温 その結果、光学純度は１００%e.e.、anti体は０．６%で
あった。また該遺伝子を含まないプラスミドpKK223-3を
持つ大腸菌を０．１mMIPTGを添加したＬＢ培地で終夜培
養した菌体を、同様に反応させてみたが上記生成物は認
められなかった。
をした。化合物（Ｉ）はＲｆ＝０．７６〜０．８６ 、
化合物（ＩＩ）および化合物（ＩＩＩ）は０．５４〜
０．６１、化合物（ＩＶ）（式中、Ｒ＝エチル基の化合
物：以下、ＤＯＬＥと略す）はＲｆ＝０．３３である。
ＤＯＬＥのＴＬＣ上のスポットを掻き取りイソプロパノ
ール０．２５ｍＬで溶出し、遠心分離後上清を高速液体
クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて光学純度およ
びＴＬＣ掻き取りサンプルの濃度を分析した。ＨＰＬＣ
の条件は以下の通りである。 カラム：ダイセルCHIRALCEL AD 溶離液：ヘキサン／エタノール／トリフルオロ酢酸＝９
００／１００／１ 流速：１ml/min 検出：ＵＶ２５４ｎｍ 温度：室温 その結果、光学純度は１００%e.e.、anti体は０．６%で
あった。また該遺伝子を含まないプラスミドpKK223-3を
持つ大腸菌を０．１mMIPTGを添加したＬＢ培地で終夜培
養した菌体を、同様に反応させてみたが上記生成物は認
められなかった。
【００９７】＜実施例６＞ 本発明のＤＮＡによって形
質転換した大腸菌を用いた５Ｓ−ＭＯＬＥからのＤＯＬ
Ｅの製造 実施例４で得られた形質転換体をアンピシリン（５０μ
g/mL）、0.1mM イソプロピル β−Ｄ−チオガラクトピ
ラノシド（IPTG）を含むＬＢ培地で３７℃で１７時間生
育させ、得られた菌体ブロス2mLを遠心分離により集菌
後、180μLの100mMリン酸カリウム緩衝液（pH７．０）
に懸濁した後に、下記に示す方法により、５Ｓ−（Ｅ）
−７−〔２−シクロプロピル−４−（４−フルオロフェ
ニル）−キノリン−３−イル〕−５−ヒドロキシ−３−
オキソ−ヘプト−６−エン酸エチルエステル（５Ｓ−Ｍ
ＯＬＥ）を基質として還元活性を確認した。
質転換した大腸菌を用いた５Ｓ−ＭＯＬＥからのＤＯＬ
Ｅの製造 実施例４で得られた形質転換体をアンピシリン（５０μ
g/mL）、0.1mM イソプロピル β−Ｄ−チオガラクトピ
ラノシド（IPTG）を含むＬＢ培地で３７℃で１７時間生
育させ、得られた菌体ブロス2mLを遠心分離により集菌
後、180μLの100mMリン酸カリウム緩衝液（pH７．０）
に懸濁した後に、下記に示す方法により、５Ｓ−（Ｅ）
−７−〔２−シクロプロピル−４−（４−フルオロフェ
ニル）−キノリン−３−イル〕−５−ヒドロキシ−３−
オキソ−ヘプト−６−エン酸エチルエステル（５Ｓ−Ｍ
ＯＬＥ）を基質として還元活性を確認した。
【００９８】上記菌体懸濁物に2g/L NADP+ (オリエン
タル酵母社製)10μＬ、トルエン 1μＬを添加後、5分
間ボルテックスミキサーで攪拌した。50%グルコース 1
0μＬ、グルコースデヒドロゲナーゼ溶液（天野製薬社
製；２５U/mL） 10μＬ、上記基質をＤＭＳＯに20g/L
で溶解させたもの50μＬ（基質 １ｍｇ分）を添加後４
０℃で20時間振とう反応させた。反応終了後の反応懸濁
液をアセトニトリルで希釈後遠心し、上清上の生成物を
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて測定
した。ＨＰＬＣの条件は以下の通りである。 カラム：コスモシル ５Ｃ１８ＭＳ−ＩＩ ４．６ｘ２
５０ｍｍ(ナカライ社製) 溶離液：メタノール／アセトニトリル／水／リン酸＝３
５０／１５０／５００／１ 流速：０．６ml/min 検出：ＵＶ２５４ｎｍ 温度：５０℃ この結果、収量は 807μｇであり、収率は 80.7%、ａ
ｎｔｉ体は 15.3％であった。
タル酵母社製)10μＬ、トルエン 1μＬを添加後、5分
間ボルテックスミキサーで攪拌した。50%グルコース 1
0μＬ、グルコースデヒドロゲナーゼ溶液（天野製薬社
製；２５U/mL） 10μＬ、上記基質をＤＭＳＯに20g/L
で溶解させたもの50μＬ（基質 １ｍｇ分）を添加後４
０℃で20時間振とう反応させた。反応終了後の反応懸濁
液をアセトニトリルで希釈後遠心し、上清上の生成物を
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて測定
した。ＨＰＬＣの条件は以下の通りである。 カラム：コスモシル ５Ｃ１８ＭＳ−ＩＩ ４．６ｘ２
５０ｍｍ(ナカライ社製) 溶離液：メタノール／アセトニトリル／水／リン酸＝３
５０／１５０／５００／１ 流速：０．６ml/min 検出：ＵＶ２５４ｎｍ 温度：５０℃ この結果、収量は 807μｇであり、収率は 80.7%、ａ
ｎｔｉ体は 15.3％であった。
【００９９】また、光学純度の測定は、反応終了後、反
応液に酢酸エチルを０．５ｍＬ加え激しく混合し、遠心
分離にて有機層と水層とに分離した。有機層を別の容器
に移し、溶媒を濃縮遠心機で留去し、乾固された生成物
を酢酸エチル０．０１ｍＬで溶解し、薄層クロマトグラ
フィー（ＴＬＣ）をおこなった。ＴＬＣはシリカゲルプ
レート（メルク社製silica gel 60 F 254)を用い、展開
溶媒はヘキサン／酢酸エチル＝１／１を用いた。展開終
了後、ＵＶランプにて生成物の確認をした。化合物
（Ｉ）はＲｆ＝０．７６〜０．８６ 、化合物（ＩＩ）
および化合物（ＩＩＩ）は０．５４〜０．６１、化合物
（ＩＶ）（式中、Ｒ＝エチル基の化合物：以下、ＤＯＬ
Ｅと略す）はＲｆ＝０．３３である。ＤＯＬＥのＴＬＣ
上のスポットを掻き取りイソプロパノール０．２５ｍＬ
で溶出し、遠心分離後上清を高速液体クロマトグラフィ
ー（ＨＰＬＣ）を用いて光学純度およびＴＬＣ掻き取り
サンプルの濃度を分析した。ＨＰＬＣの条件は以下の通
りである。 カラム：ダイセルCHIRALCEL AD 溶離液：ヘキサン／エタノール＝９５／５ 流速：１ml/min 検出：ＵＶ２５４ｎｍ 温度：５０℃ その結果、光学純度は97%e.e.、anti体は15.2%であっ
た。また該遺伝子を含まないプラスミドpKK223-3を持つ
大腸菌を０．１mMIPTGを添加したＬＢ培地で終夜培養し
た菌体を、同様に反応させてみたが上記生成物は認めら
れなかった。
応液に酢酸エチルを０．５ｍＬ加え激しく混合し、遠心
分離にて有機層と水層とに分離した。有機層を別の容器
に移し、溶媒を濃縮遠心機で留去し、乾固された生成物
を酢酸エチル０．０１ｍＬで溶解し、薄層クロマトグラ
フィー（ＴＬＣ）をおこなった。ＴＬＣはシリカゲルプ
レート（メルク社製silica gel 60 F 254)を用い、展開
溶媒はヘキサン／酢酸エチル＝１／１を用いた。展開終
了後、ＵＶランプにて生成物の確認をした。化合物
（Ｉ）はＲｆ＝０．７６〜０．８６ 、化合物（ＩＩ）
および化合物（ＩＩＩ）は０．５４〜０．６１、化合物
（ＩＶ）（式中、Ｒ＝エチル基の化合物：以下、ＤＯＬ
Ｅと略す）はＲｆ＝０．３３である。ＤＯＬＥのＴＬＣ
上のスポットを掻き取りイソプロパノール０．２５ｍＬ
で溶出し、遠心分離後上清を高速液体クロマトグラフィ
ー（ＨＰＬＣ）を用いて光学純度およびＴＬＣ掻き取り
サンプルの濃度を分析した。ＨＰＬＣの条件は以下の通
りである。 カラム：ダイセルCHIRALCEL AD 溶離液：ヘキサン／エタノール＝９５／５ 流速：１ml/min 検出：ＵＶ２５４ｎｍ 温度：５０℃ その結果、光学純度は97%e.e.、anti体は15.2%であっ
た。また該遺伝子を含まないプラスミドpKK223-3を持つ
大腸菌を０．１mMIPTGを添加したＬＢ培地で終夜培養し
た菌体を、同様に反応させてみたが上記生成物は認めら
れなかった。
【発明の効果】医薬、農薬等の中間体原料として産業上
有用な化合物である光学活性アルコール類を高光学純度
かつ高収率で得ることができる製造方法を提供する。
有用な化合物である光学活性アルコール類を高光学純度
かつ高収率で得ることができる製造方法を提供する。
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> Mitsubishi Chemical Corp. ; Nissan Chemical Industries, LTD
<120> 新規カルボニル還元酵素及びこれをコードする遺伝子、ならびにこれらを
利用した光学活性アルコールの製造方法
<130> J09655
<150> JP 2002-075921
<151> 2002-03-19
<160> 25
<210> 1
<211> 251
<212> PRT
<213> Ogataea minuta var nonfermentans
<400> 1
Met Ala Lys Thr Val Tyr Phe Ile Ala Gly Ala Ser Arg Gly Ile Gly
1 5 10 15
Leu Glu Val Ala Ser Gln Leu Ser Ala Asn Pro Asp Asn Tyr Val Ile
20 25 30
Ala Ser Tyr Arg Ser Glu Lys Ser Ala Ser Gly Leu Leu Glu Leu Ala
35 40 45
Lys Lys Asp Asn Val Asp Thr Ile Val Leu Asp Ile Ala Ser Gln Glu
50 55 60
Ser Ile Asp Ala Val Pro Ala Gln Ile Ser Lys Leu Thr Asp Gly Ile
65 70 75 80
Asp Val Ala Leu Ile Asn Ala Gly Ile Ala Asn Ala Met Cys Pro Ile
85 90 95
Leu Glu Cys Ser Arg Glu Ser Tyr Thr Asp His Trp Thr Thr Asn Ala
100 105 110
Leu Gly Pro Ile Met Leu Tyr Gln Ala Ile His Lys Phe Met Leu Gln
115 120 125
Arg Glu Thr Arg Lys Val Phe Phe Thr Thr Ser Ala Gly Gly Ser Ile
130 135 140
Gln Ala Lys Ile Pro Val Pro Val Ser Gly Tyr Gly Met Ser Lys Ala
145 150 155 160
Ala Leu Asn Tyr Ala Val Arg Lys Leu Ala Asp Glu Cys Tyr Lys Asp
165 170 175
Asn Phe Thr Ile Val Leu Leu His Pro Gly Phe Val Lys Thr Asp Met
180 185 190
Gly Gln Ser Ala Ile Gln Lys Met Ser Asn Gly Asn Ala Glu Leu Leu
195 200 205
Ala Tyr Ile Asp Ser Met Thr Ile Asp Val Pro Thr Ser Ala Gly Gln
210 215 220
Ile Val Gly Ala Ile Met Thr Leu Asp Lys Gln Ser Ser Gly Arg Phe
225 230 235 240
Ile Asn Ala Ala Asp Gln Phe Asp Met Pro Phe
245 250
<210> 2
<211> 753
<212> DNA
<213> Ogataea minuta var nonfermentans
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(753)
<400> 2
atg gct aaa act gtt tac ttc atc gca ggt gct tcc aga ggt atc ggt 48
Met Ala Lys Thr Val Tyr Phe Ile Ala Gly Ala Ser Arg Gly Ile Gly
1 5 10 15
ctc gag gtt gct tcc cag ctg agt gca aac cca gac aat tat gtt att 96
Leu Glu Val Ala Ser Gln Leu Ser Ala Asn Pro Asp Asn Tyr Val Ile
20 25 30
gca tcc tat aga tct gaa aag tct gct tca gga ctt ttg gag ctg gca 144
Ala Ser Tyr Arg Ser Glu Lys Ser Ala Ser Gly Leu Leu Glu Leu Ala
35 40 45
aag aag gat aat gtc gac aca att gtg ttg gat att gca agc cag gaa 192
Lys Lys Asp Asn Val Asp Thr Ile Val Leu Asp Ile Ala Ser Gln Glu
50 55 60
tcg att gat gct gtt cca gca cag att tcc aag ctg act gat gga atc 240
Ser Ile Asp Ala Val Pro Ala Gln Ile Ser Lys Leu Thr Asp Gly Ile
65 70 75 80
gat gtt gcc ttg atc aac gct gga att gcc aac gct atg tgt ccg att 288
Asp Val Ala Leu Ile Asn Ala Gly Ile Ala Asn Ala Met Cys Pro Ile
85 90 95
ctc gaa tgt tct aga gag tcc tac act gat cac tgg aca acc aat gcc 336
Leu Glu Cys Ser Arg Glu Ser Tyr Thr Asp His Trp Thr Thr Asn Ala
100 105 110
ttg ggt cca atc atg ctc tac caa gct att cat aag ttc atg ctc cag 384
Leu Gly Pro Ile Met Leu Tyr Gln Ala Ile His Lys Phe Met Leu Gln
115 120 125
aga gag acc aga aaa gtg ttc ttt acc acg agt gct ggt ggt tcc att 432
Arg Glu Thr Arg Lys Val Phe Phe Thr Thr Ser Ala Gly Gly Ser Ile
130 135 140
cag gct aag ata ccc gtg cct gtg agt ggt tac ggt atg tcc aag gct 480
Gln Ala Lys Ile Pro Val Pro Val Ser Gly Tyr Gly Met Ser Lys Ala
145 150 155 160
gcg ctt aat tat gct gtg aga aaa ctt gct gac gag tgc tac aag gac 528
Ala Leu Asn Tyr Ala Val Arg Lys Leu Ala Asp Glu Cys Tyr Lys Asp
165 170 175
aac ttc act att gtg ttg ctg cat cct ggt ttt gtt aag acg gac atg 576
Asn Phe Thr Ile Val Leu Leu His Pro Gly Phe Val Lys Thr Asp Met
180 185 190
ggt caa agc gcc att cag aag atg tca aat gga aat gct gag ctt ctt 624
Gly Gln Ser Ala Ile Gln Lys Met Ser Asn Gly Asn Ala Glu Leu Leu
195 200 205
gct tac att gac tca atg act att gat gtt cct acc agt gct ggc caa 672
Ala Tyr Ile Asp Ser Met Thr Ile Asp Val Pro Thr Ser Ala Gly Gln
210 215 220
atc gtc ggt gcc att atg acc ttg gac aag cag agc agc ggt aga ttt 720
Ile Val Gly Ala Ile Met Thr Leu Asp Lys Gln Ser Ser Gly Arg Phe
225 230 235 240
atc aac gct gct gac cag ttt gac atg cca ttt 753
Ile Asn Ala Ala Asp Gln Phe Asp Met Pro Phe
245 250
<210> 3
<211> 14
<212> PRT
<213> Ogataea minuta var nonfermentans
<400> 3
Val Phe Phe Thr Thr Ser Ala Gly Gly Ser Ile Gln Ala Lys
1 5 10
<210> 4
<211> 16
<212> PRT
<213> Ogataea minuta var nonfermentans
<400> 4
Gln Ser Ser Gly Arg Phe Ile Asn Ala Ala Asp Gln Phe Asp Met Pro
1 5 10 15
<210> 5
<211> 13
<212> PRT
<213> Ogataea minuta var nonfermentans
<400> 5
Asp Asn Phe Thr Ile Val Leu Leu His Pro Gly Phe Val
1 5 10
<210> 6
<211> 20
<212> PRT
<213> Ogataea minuta var nonfermentans
<400> 6
Ala Lys Thr Val Tyr Phe Ile Ala Gly Ala Ser Arg Gly Ile Gly Leu
1 5 10 15
Glu Val Ala Ser
20
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<220>
<221> modified_base
<222> (3,9,12,24)
<223> n=inosine
<400> 7
gcnaaracng tntayttyat hgcngg 26
<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<220>
<221> modified_base
<222> (4,13,16,19,22,25,28)
<223> n=inosine
<400> 8
yttngcytgd atnswnccnc cngcnswng 29
<210> 9
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<220>
<221> modified_base
<222> (1,19,22)
<223> n=inosine
<400> 9
nggcatrtcr aaytgrtcng cngcrttdat ra 32
<210> 10
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<220>
<221> modified_base
<222> (1,7,10,16,19,22,28)
<223> n=inosine
<400> 10
nacraanccn ggrtgnarna rnacdatngt raa 33
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 11
tatttaggtg acactatag 19
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 12
taatacgact cactataggg 20
<210> 13
<211> 438
<212> DNA
<213> Ogataea minuta var nonfermentans
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(438)
<400> 13
gcg aaa acg gtg tat ttc atc gcg ggt gct tcc aga ggt atc ggt ctc 48
Ala Lys Thr Val Tyr Phe Ile Ala Gly Ala Ser Arg Gly Ile Gly Leu
1 5 10 15
gag gtt gct tcc cag ctg agt gca aac cca gac aat tat gtt att gca 96
Glu Val Ala Ser Gln Leu Ser Ala Asn Pro Asp Asn Tyr Val Ile Ala
20 25 30
tcc tat aga tct gaa aag tct gct tca gga ctt ttg gag ctg gca aag 144
Ser Tyr Arg Ser Glu Lys Ser Ala Ser Gly Leu Leu Glu Leu Ala Lys
35 40 45
aag gat aat gtc gac aca att gtg ttg gat att gca agc cag gaa tcg 192
Lys Asp Asn Val Asp Thr Ile Val Leu Asp Ile Ala Ser Gln Glu Ser
50 55 60
att gat gct gtt cca gca cag att tcc aag ctg act gat gga atc gat 240
Ile Asp Ala Val Pro Ala Gln Ile Ser Lys Leu Thr Asp Gly Ile Asp
65 70 75 80
gtt gcc ttg atc aac gct gga att gcc aac gct atg tgt ccg att ctc 288
Val Ala Leu Ile Asn Ala Gly Ile Ala Asn Ala Met Cys Pro Ile Leu
85 90 95
gaa tgt tct aga gag tcc tac act gat cac tgg aca acc aat gcc ttg 336
Glu Cys Ser Arg Glu Ser Tyr Thr Asp His Trp Thr Thr Asn Ala Leu
100 105 110
ggt cca atc atg ctc tac caa gct att cat aag ttc atg ctc cag aga 384
Gly Pro Ile Met Leu Tyr Gln Ala Ile His Lys Phe Met Leu Gln Arg
115 120 125
gag acc aga aaa gtg ttc ttt acc acc acc gcc ggc ggc acc att cag 432
Glu Thr Arg Lys Val Phe Phe Thr Thr Thr Ala Gly Gly Thr Ile Gln
130 135 140
gcc aag 438
Ala Lys
145
<210> 14
<211> 747
<212> DNA
<213> Ogataea minuta var nonfermentans
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(747)
<400> 14
gcg aaa acg gtg tat ttc atc gcg ggt gct tcc aga ggt atc ggt ctc 48
Ala Lys Thr Val Tyr Phe Ile Ala Gly Ala Ser Arg Gly Ile Gly Leu
1 5 10 15
gag gtt gct tcc cag ctg agt gca aac cca gac aat tat gtt att gca 96
Glu Val Ala Ser Gln Leu Ser Ala Asn Pro Asp Asn Tyr Val Ile Ala
20 25 30
tcc tat aga tct gaa aag tct gct tca gga ctt ttg gag ctg gca aag 144
Ser Tyr Arg Ser Glu Lys Ser Ala Ser Gly Leu Leu Glu Leu Ala Lys
35 40 45
aag gat aat gtc gac aca att gtg ttg gat att gca agc cag gaa tcg 192
Lys Asp Asn Val Asp Thr Ile Val Leu Asp Ile Ala Ser Gln Glu Ser
50 55 60
att gat gct gtt cca gca cag att tcc aag ctg act gat gga atc gat 240
Ile Asp Ala Val Pro Ala Gln Ile Ser Lys Leu Thr Asp Gly Ile Asp
65 70 75 80
gtt gcc tta atc aac gct gga att gcc aac gct atg tgt ccg att ctc 288
Val Ala Leu Ile Asn Ala Gly Ile Ala Asn Ala Met Cys Pro Ile Leu
85 90 95
gaa tgt tct aga gag tcc tac act gat cac tgg aca acc aat gcc ttg 336
Glu Cys Ser Arg Glu Ser Tyr Thr Asp His Trp Thr Thr Asn Ala Leu
100 105 110
ggt cca atc atg ctc tac caa gct att cat aag ttc atg ctc cag aga 384
Gly Pro Ile Met Leu Tyr Gln Ala Ile His Lys Phe Met Leu Gln Arg
115 120 125
gag acc aga aaa gtg ttc ttt acc acg agt gct ggt ggt tcc att cag 432
Glu Thr Arg Lys Val Phe Phe Thr Thr Ser Ala Gly Gly Ser Ile Gln
130 135 140
gct aag ata ccc gtg cct gtg agt ggt tac ggt atg tcc aag gct gcg 480
Ala Lys Ile Pro Val Pro Val Ser Gly Tyr Gly Met Ser Lys Ala Ala
145 150 155 160
ctt aat tat gct gtg aga aaa ctt gct gac gag tgc tac aag gac aac 528
Leu Asn Tyr Ala Val Arg Lys Leu Ala Asp Glu Cys Tyr Lys Asp Asn
165 170 175
ttc act att gtg ttg ctg cat cct ggt ttt gtt aag acg gac atg ggt 576
Phe Thr Ile Val Leu Leu His Pro Gly Phe Val Lys Thr Asp Met Gly
180 185 190
caa agc gcc att cag aag atg tca aat gga aat gct gag ctt ctt gct 624
Gln Ser Ala Ile Gln Lys Met Ser Asn Gly Asn Ala Glu Leu Leu Ala
195 200 205
tac att gac tca atg act att gat gtt cct acc agt gct ggc caa atc 672
Tyr Ile Asp Ser Met Thr Ile Asp Val Pro Thr Ser Ala Gly Gln Ile
210 215 220
gtc ggt gcc att atg acc ttg gac aag cag agc agc ggt aga ttc atc 720
Val Gly Ala Ile Met Thr Leu Asp Lys Gln Ser Ser Gly Arg Phe Ile
225 230 235 240
aac gcc gcc gac caa ttt gac atg ccc 747
Asn Ala Ala Asp Gln Phe Asp Met Pro
245
<210> 15
<211> 561
<212> DNA
<213> Ogataea minuta var nonfermentans
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(561)
<400> 15
gcg aag acg gtg tac ttc atc gcg ggt gct tcc aga ggt atc ggt ctc 48
Ala Lys Thr Val Tyr Phe Ile Ala Gly Ala Ser Arg Gly Ile Gly Leu
1 5 10 15
gag gtt gct tcc cag ctg agt gca aac cca gac aat tat gtt att gca 96
Glu Val Ala Ser Gln Leu Ser Ala Asn Pro Asp Asn Tyr Val Ile Ala
20 25 30
tcc tat aga tct gaa aag tct gct tca gga ctt ttg gag ctg gca aag 144
Ser Tyr Arg Ser Glu Lys Ser Ala Ser Gly Leu Leu Glu Leu Ala Lys
35 40 45
aag gat aat gtc gac aca att gtg ttg gat att gca agc cag gaa tcg 192
Lys Asp Asn Val Asp Thr Ile Val Leu Asp Ile Ala Ser Gln Glu Ser
50 55 60
att gat gct gtt cca gca cag att tcc aag ctg act gat gga atc gat 240
Ile Asp Ala Val Pro Ala Gln Ile Ser Lys Leu Thr Asp Gly Ile Asp
65 70 75 80
gtt gcc ttg atc aac gct gga att gcc aac gct atg tgt ccg att ctc 288
Val Ala Leu Ile Asn Ala Gly Ile Ala Asn Ala Met Cys Pro Ile Leu
85 90 95
gaa tgt tct aga gag tcc tac act gat cac tgg aca acc aat gcc ttg 336
Glu Cys Ser Arg Glu Ser Tyr Thr Asp His Trp Thr Thr Asn Ala Leu
100 105 110
ggt cca atc atg ctc tac caa gct att cat aag ttc atg ctc cag aga 384
Gly Pro Ile Met Leu Tyr Gln Ala Ile His Lys Phe Met Leu Gln Arg
115 120 125
gag acc aga aaa gtg ttc ttt acc acg agt gct ggt ggt tcc att cag 432
Glu Thr Arg Lys Val Phe Phe Thr Thr Ser Ala Gly Gly Ser Ile Gln
130 135 140
gct aag ata ccc gtg cct gtg agt ggt tac ggt atg tcc aag gct gcg 480
Ala Lys Ile Pro Val Pro Val Ser Gly Tyr Gly Met Ser Lys Ala Ala
145 150 155 160
ctt aat tat gct gtg aga aaa ctt gct gac gag tgc tac aag gac aac 528
Leu Asn Tyr Ala Val Arg Lys Leu Ala Asp Glu Cys Tyr Lys Asp Asn
165 170 175
ttc acc att gtc ctc ttc cac ccc ggc ttc gtc 561
Phe Thr Ile Val Leu Phe His Pro Gly Phe Val
180 185
<210> 16
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 16
agcagggccc ataacgttag caattcctgc 30
<210> 17
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 17
gtgatgtcga tcccatccgt cagctgggag 30
<210> 18
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 18
atttgggaac gcacaccctc aattgactcc 30
<210> 19
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 19
cttgctgacg agtgctacaa ggac 24
<210> 20
<211> 1158
<212> DNA
<213> Ogataea minuta var nonfermentans
<220>
<221> CDS
<222> (114)..(876)
<400> 20
aactccgtgt aagaattcag atctaggggc ctagaatttg aaatttcttg aaagatcgat 60
atgactgaaa tactataaaa gaagctgggt ttccgggtat atctcatagc atc atg 116
Met
1
gct aaa act gtt tac ttc att gct ggt gct tct aga ggt atc ggc ctc 164
Ala Lys Thr Val Tyr Phe Ile Ala Gly Ala Ser Arg Gly Ile Gly Leu
5 10 15
gag gtt gcc acc caa ttg agt tcc aac cct gat aat tat gtt ata gga 212
Glu Val Ala Thr Gln Leu Ser Ser Asn Pro Asp Asn Tyr Val Ile Gly
20 25 30
tcg tac aga tct aaa aag agc gct tcc gct cta atg gaa tta gcc aag 260
Ser Tyr Arg Ser Lys Lys Ser Ala Ser Ala Leu Met Glu Leu Ala Lys
35 40 45
aag gaa aat gtg gat acg gtc att ctg gac att gcc agc cag gag tca 308
Lys Glu Asn Val Asp Thr Val Ile Leu Asp Ile Ala Ser Gln Glu Ser
50 55 60 65
att gag ggt gtg cgt tcc caa atc tcc cag ctg acg gat ggg atc gac 356
Ile Glu Gly Val Arg Ser Gln Ile Ser Gln Leu Thr Asp Gly Ile Asp
70 75 80
atc aca ttg atc aat gca gga att gct aac gtt atg ggc cct gct gct 404
Ile Thr Leu Ile Asn Ala Gly Ile Ala Asn Val Met Gly Pro Ala Ala
85 90 95
acc acc tct aga gaa gat tat gtt act cac tgg acc acc aat gct cta 452
Thr Thr Ser Arg Glu Asp Tyr Val Thr His Trp Thr Thr Asn Ala Leu
100 105 110
ggt cca atc atg gtg tac aag gag atc cac gaa ttg atg ttg aag aag 500
Gly Pro Ile Met Val Tyr Lys Glu Ile His Glu Leu Met Leu Lys Lys
115 120 125
gat act aga aag gta ttc ttt act acg agt gct ggt ggt tcc att cag 548
Asp Thr Arg Lys Val Phe Phe Thr Thr Ser Ala Gly Gly Ser Ile Gln
130 135 140 145
gct aag ata ccc gtg cct gtg agt ggt tac ggt atg tcc aag gct gcg 596
Ala Lys Ile Pro Val Pro Val Ser Gly Tyr Gly Met Ser Lys Ala Ala
150 155 160
ctt aat tat gct gtg aga aaa ctt gct gac gag tgc tac aag gac aac 644
Leu Asn Tyr Ala Val Arg Lys Leu Ala Asp Glu Cys Tyr Lys Asp Asn
165 170 175
ttc act att gtg ttg ctg cat cct ggt ttt gtt aag acg gac atg ggt 692
Phe Thr Ile Val Leu Leu His Pro Gly Phe Val Lys Thr Asp Met Gly
180 185 190
caa agc gcc att cag aag atg tca aat gga aat gct gag ctt ctt gct 740
Gln Ser Ala Ile Gln Lys Met Ser Asn Gly Asn Ala Glu Leu Leu Ala
195 200 205
tac att gac tca atg act att gat gtt cct acc agt gct ggc caa atc 788
Tyr Ile Asp Ser Met Thr Ile Asp Val Pro Thr Ser Ala Gly Gln Ile
210 215 220 225
gtc ggt gcc att atg acc ttg gac aag cag agc agc ggt aga ttt atc 836
Val Gly Ala Ile Met Thr Leu Asp Lys Gln Ser Ser Gly Arg Phe Ile
230 235 240
aac gct gct gac cag ttt gac atg cca ttt tag taa cgaagatcta gggatt 888
Asn Ala Ala Asp Gln Phe Asp Met Pro Phe
245 250
gagcagtcag caggagaatc gaacctcatt gcagatttca gacaagtaga ggctacgcta 948
atatggatca gttgtggatt ctctgctcgt ctctactctc ttcggcccta acttggagtt 1008
caggttcaga tttaacaaac ttatttcgat gaaggaaaag agacattgac taacataatt 1068
ccgaggccga taaaagtctt gatagcttga attacttact tattctatag aaataaaacg 1128
cctgcggtgt ggcaaaaaaa aaaaaaaaaa 1158
<210> 21
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 21
ggggaattca tggctaaaac tgtttacttc a 31
<210> 22
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 22
ccccaagctt attactaaaa tggcatgtca aactggtc 38
<210> 23
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 23
gagcggataa caatttcaca cagg 24
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 24
cttctctcat ccgccaaaac 20
<210> 25
<211> 772
<212> DNA
<213> Ogataea minuta var nonfermentans
<220>
<221> CDS
<222> (7)..(759)
<400> 25
gaattc atg gct aaa act gtt tac ttc atc gca ggt gct tcc aga ggt 48
Met Ala Lys Thr Val Tyr Phe Ile Ala Gly Ala Ser Arg Gly
1 5 10
atc ggt ctc gag gtt gct tcc cag ctg agt gca aac cca gac aat tat 96
Ile Gly Leu Glu Val Ala Ser Gln Leu Ser Ala Asn Pro Asp Asn Tyr
15 20 25 30
gtt att gca tcc tat aga tct gaa aag tct gct tca gga ctt ttg gag 144
Val Ile Ala Ser Tyr Arg Ser Glu Lys Ser Ala Ser Gly Leu Leu Glu
35 40 45
ctg gca aag aag gat aat gtc gac aca att gtg ttg gat att gca agc 192
Leu Ala Lys Lys Asp Asn Val Asp Thr Ile Val Leu Asp Ile Ala Ser
50 55 60
cag gaa tcg att gat gct gtt cca gca cag att tcc aag ctg act gat 240
Gln Glu Ser Ile Asp Ala Val Pro Ala Gln Ile Ser Lys Leu Thr Asp
65 70 75
gga atc gat gtt gcc ttg atc aac gct gga att gcc aac gct atg tgt 288
Gly Ile Asp Val Ala Leu Ile Asn Ala Gly Ile Ala Asn Ala Met Cys
80 85 90
ccg att ctc gaa tgt tct aga gag tcc tac act gat cac tgg aca acc 336
Pro Ile Leu Glu Cys Ser Arg Glu Ser Tyr Thr Asp His Trp Thr Thr
95 100 105 110
aat gcc ttg ggt cca atc atg ctc tac caa gct att cat aag ttc atg 384
Asn Ala Leu Gly Pro Ile Met Leu Tyr Gln Ala Ile His Lys Phe Met
115 120 125
ctc cag aga gag acc aga aaa gtg ttc ttt acc acg agt gct ggt ggt 432
Leu Gln Arg Glu Thr Arg Lys Val Phe Phe Thr Thr Ser Ala Gly Gly
130 135 140
tcc att cag gct aag ata ccc gtg cct gtg agt ggt tac ggt atg tcc 480
Ser Ile Gln Ala Lys Ile Pro Val Pro Val Ser Gly Tyr Gly Met Ser
145 150 155
aag gct gcg ctt aat tat gct gtg aga aaa ctt gct gac gag tgc tac 528
Lys Ala Ala Leu Asn Tyr Ala Val Arg Lys Leu Ala Asp Glu Cys Tyr
160 165 170
aag gac aac ttc act att gtg ttg ctg cat cct ggt ttt gtt aag acg 576
Lys Asp Asn Phe Thr Ile Val Leu Leu His Pro Gly Phe Val Lys Thr
175 180 185 190
gac atg ggt caa agc gcc att cag aag atg tca aat gga aat gct gag 624
Asp Met Gly Gln Ser Ala Ile Gln Lys Met Ser Asn Gly Asn Ala Glu
195 200 205
ctt ctt gct tac att gac tca atg act att gat gtt cct acc agt gct 672
Leu Leu Ala Tyr Ile Asp Ser Met Thr Ile Asp Val Pro Thr Ser Ala
210 215 220
ggc caa atc gtc ggt gcc att atg acc ttg gac aag cag agc agc ggt 720
Gly Gln Ile Val Gly Ala Ile Met Thr Leu Asp Lys Gln Ser Ser Gly
225 230 235
aga ttt atc aac gct gct gac cag ttt gac atg cca ttt tag taa taa 768
Arg Phe Ile Asn Ala Ala Asp Gln Phe Asp Met Pro Phe
240 245 250
gctt 772
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
Ｃ１２Ｐ 17/12 5/00 Ａ
(72)発明者 上田 誠
神奈川県横浜市青葉区鴨志田町1000番地
三菱化学株式会社内
(72)発明者 原 磨理
神奈川県横浜市青葉区鴨志田町1000番地
三菱化学株式会社内
Ｆターム(参考） 4B024 AA03 BA08 CA01 CA04 CA05
CA06 CA09 CA11 DA06 EA04
FA10 GA11 GA19 HA01
4B050 CC01 CC04 DD04 FF11E
FF12E LL05
4B064 AE49 BH01 BH04 BH08 CA02
CA21 CB18 CC03 CC24 CD04
CD09 CD12 CD15 CD20 CE08
DA01 DA11
4B065 AA26X AA72Y AB01 AC14
BA02 BA25 BD01 BD02 BD15
BD27 CA18 CA28 CA44 CA47
CA60
Claims (7)
- 【請求項１】 下記（Ａ）または（Ｂ）の何れかのアミ
ノ酸配列を有するポリペプチド。 （Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列。 （Ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１か
ら複数個のアミノ酸が欠失、付加または置換されている
アミノ酸配列であって、カルボニル還元酵素活性を有す
るポリペプチドのアミノ酸配列。 - 【請求項２】 下記（ａ）から（ｅ）の何れかの塩基配
列を有するＤＮＡ。 （ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペ
プチドをコードする塩基配列。 （ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１か
ら複数個のアミノ酸が欠失、付加または置換されている
アミノ酸配列からなるポリペプチドであって、カルボニ
ル還元酵素活性を有するポリペプチドをコードする塩基
配列。 （ｃ）配列番号２に記載の塩基配列。 （ｄ）配列番号２に記載の塩基配列において、１から複
数個の塩基が欠失、付加または置換されている塩基配列
であって、カルボニル還元酵素活性を有するポリペプチ
ドをコードする塩基配列。 （ｅ）配列番号２に記載の塩基配列もしくはその相補配
列またはそれらの一部とストリンジェントな条件下でハ
イブリダイズする塩基配列であって、カルボニル還元酵
素活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列。 - 【請求項３】 請求項２に記載のＤＮＡをベクターに組
み込んで得られる組換え体ＤＮＡ。 - 【請求項４】 請求項３に記載の組換え体ＤＮＡを保有
する形質転換体。 - 【請求項５】 請求項２に記載のＤＮＡを染色体ＤＮＡ
に組み込んで得られる形質転換体。 - 【請求項６】 下記式(I) 【化１】 （式中、Ｒは水素原子、アルキル基またはアリール基を
示す）で表される化合物、下記式(II) 【化２】 （式中、Ｒは前記と同義である）で表される化合物、及
び、下記式（III） 【化３】 （式中、Ｒは前記と同義である）で表される化合物から
なる群より選ばれるカルボニル基含有化合物に、請求項
４または５に記載の形質転換体細胞、該形質転換体細胞
培養物、該形質転換体細胞処理物からなる群より選ばれ
るいずれかを作用させてカルボニル基含有化合物を不斉
還元させることを特徴とする下記式(IV) 【化４】 （式中、Ｒは前記と同義である）で表される化合物の製
造方法。 - 【請求項７】 式（II）及び式（III）で表される化合
物が、それぞれ下記式（II’） 【化５】 （式中、Ｒは前記と同義である）及び下記式（III’） 【化６】 （式中、Ｒは前記と同義である）で表される光学活性体
であることを特徴とする請求項６に記載の製造方法。
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-
2003
- 2003-03-18 JP JP2003074017A patent/JP4270918B2/ja not_active Expired - Fee Related
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