JP4295531B2 - 新規カルボニル還元酵素及びこれをコードするｄｎａ、ならびにこれらを利用した光学活性アルコールの製造方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、カルボニル基含有化合物を還元して、医薬、農薬等の中間体原料として産業上有用な化合物である光学活性アルコール類に変換する活性を有するタンパク質、該タンパク質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体、該形質転換体および／または該形質転換体処理物を用いた光学活性アルコール類の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
光学活性３−ヒドロキシ−３−（２’−チエニル）プロピオン酸エステル誘導体は生理活性又は薬理活性成分（医薬品、農薬など）の中間原料として有用な物質である。生理活性成分は光学異性体を選択的に製造することが求められ、該プロピオン酸エステル誘導体の光学活性体は、さらに有用な中間原料となり得ると考えられる。
しかしながら、微生物を用いてカルボニル基を不斉還元する方法は各種研究がなされているものの、例えばチオフェン環に隣接する位置に存在するカルボニル基を不斉還元する方法としては、２，５−ジアセチルチオフェンをパン酵母を用いて還元する方法（例えば、非特許文献１参照。）やトリフルオロメチル−（２’−チエニル）ケトンをＧｅｏｔｒｉｃｕｍ ｃａｎｄｉｄｕｍを用いて還元する方法（例えば、非特許文献２参照。）が知られているのみである。
また、（Ｓ）−３−ヒドロキシ−３−（２’−チエニル）プロピオン酸エステル誘導体については不斉触媒を用いた化学合成法による製造の報告があるが（例えば、非特許文献３参照。）、生成する（Ｓ）−３−ヒドロキシ−３−（２’−チエニル）プロピオン酸エステル誘導体の光学純度は８５％ｅ．ｅ．と低い。
一般的に、化学合成法によるカルボニル基の不斉還元は、触媒が高価である、触媒残渣の除去等プロセス上煩雑な工程が必要になること等の難点があり、より安価で簡便な製造法の開発が望まれていた。
【０００３】
【非特許文献１】
Tetrahedron Asymmetry Vol.8, pp3467, 1997
【非特許文献２】
Tetrahedron Vol.54, pp8393, 1998
【非特許文献３】
C.R.Acad.Sci.Paris, t.2, Serie II, pp175, 1999
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
従って、より光学純度の高い（Ｓ）−３−ヒドロキシ−３−（２’−チエニル）プロピオン酸エステル誘導体を安価かつ簡便に製造する新規な方法を提供することを本発明の課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために、（Ｓ）−３−ヒドロキシ−３−（２’−チエニル）プロピオン酸エステル誘導体の製造方法について鋭意検討した結果、原料となる３−オキソ−３−（２’−チエニル）プロピオン酸エステル誘導体の還元反応を触媒する新規酵素を単離し、該酵素をコードする遺伝子を単離してその塩基配列を解析した。さらに、該遺伝子の形質転換体を作製し、該遺伝子を発現させた形質転換体細胞、該形質転換体処理物および／または培養液を、原料となる３−オキソ−３−（２’−チエニル）プロピオン酸エステル誘導体に作用させることにより、高い光学純度かつ高濃度で目的物（Ｓ）−３−ヒドロキシ−３−（２’−チエニル）プロピオン酸エステル誘導体を得ることができることを見い出した。本発明はこれらの知見に基づいて成し遂げられたものである。
【０００６】
すなわち、本発明の要旨は、
（１）以下の（Ａ）〜（Ｃ）の何れかのアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列
（Ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１から複数個のアミノ酸が欠失、付加または置換されているアミノ酸配列であって、カルボニル基を還元して光学活性アルコールを合成する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列
（Ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、カルボニル基を還元して光学活性アルコールを合成する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列
（２）以下の（Ａ）〜（Ｆ）の何れかの塩基配列を有するＤＮＡ。
（Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする塩基配列
（Ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から複数個のアミノ酸が欠失、付加または置換されているアミノ酸配列であって、カルボニル基を還元して光学活性アルコールを合成する能力を有するタンパク質をコードする塩基配列
（Ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、カルボニル基を還元して光学活性アルコールを合成する能力を有するタンパク質をコードする塩基配列
（Ｄ）配列番号２に記載の塩基配列
（Ｅ）配列番号２に記載の塩基酸配列において、１から複数個の塩基が欠失、付加または置換されている塩基配列であって、カルボニル基を還元して光学活性アルコールを合成する能力を有するタンパク質をコードする塩基配列
（Ｆ）配列番号２に記載の塩基酸配列またはその相補配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列であって、カルボニル基を還元して光学活性アルコールを合成する能力を有するタンパク質をコードする塩基配列
（３）（２）に記載のＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡ。
（４）（３）に記載の組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体。
（５）（２）に記載のＤＮＡを染色体ＤＮＡに組み込んで得られる形質転換体。
（６）下記一般式（Ｉ）
【０００７】
【化５】
【０００８】
（式中、Ｒ1は水素原子、置換されていてもよいアルキル基または置換されていてもよいアリール基を示し、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、ニトロ基、ヒドロキシ基、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアリール基または置換されていてもよいアルコキシ基を示す）で表される３−オキソ−３−（２’−チエニル）プロピオン酸エステル誘導体に、以下の（Ａ）または（Ｂ）に記載の形質転換体細胞、該形質転換体細胞処理物および／または培養液を作用させ、下記一般式（ＩＩ）
【０００９】
【化６】
【００１０】
（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は前記と同義である）で表される（Ｓ）−３−ヒドロキシ−３−（２’−チエニル）プロピオン酸エステル誘導体を生成させることを特徴とする光学活性３−ヒドロキシ−３−（２’−チエニル）プロピオン酸エステル誘導体の製造方法。
（Ａ）（４）または（５）に記載の形質転換体。
（Ｂ）配列番号１または配列番号１６に記載のアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、カルボニル基を還元して光学活性アルコールを合成する能力を有するタンパク質をコードする塩基配列を有するＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体、又は、該ＤＮＡを染色体ＤＮＡに組み込んで得られる形質転換体。
（７）下記一般式（Ｉ）
【００１１】
【化７】
【００１２】
（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は前記と同義である）で表される３−オキソ−３−（２’−チエニル）プロピオン酸エステル誘導体に、エクシグオバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、該細菌処理物および／または培養液を作用させ、下記一般式（ＩＩ）
【００１３】
【化８】
【００１４】
（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は前記と同義である）で表される（Ｓ）−３−ヒドロキシ−３−（２’−チエニル）プロピオン酸エステル誘導体を生成させることを特徴とする光学活性３−ヒドロキシ−３−（２’−チエニル）プロピオン酸エステル誘導体の製造方法。
（８）Ｒ2、Ｒ3及びＲ4が、共に水素原子であることを特徴とする（６）または（７）に記載の製造方法。
及び
（９）Ｒ1が炭素数１〜４のアルキル基であることを特徴とする（６）〜（８）のいずれかに記載の製造方法に存する。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明を詳細に説明する。
本発明のタンパク質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するもの、又は該アミノ酸配列のホモログであってカルボニル還元酵素活性を有するもの（以下これを単に「カルボニル還元酵素」と称することがある）である。
本明細書において、カルボニル還元酵素活性とは、カルボニル基含有化合物中のカルボニル基を不斉還元して光学活性なアルコール類とする活性をいう。このような活性は、カルボニル基含有化合物を基質として含有し、さらにＮＡＤＰＨを補酵素として含有する反応系において、酵素として、目的のタンパク質、該タンパク質を発現する能力を有する形質転換体、または形質転換体処理物を作用させてＮＡＤＰＨ減少初速度を測定することにより測定することができる。
本発明のタンパク質は、本発明によってそのアミノ酸配列および該アミノ酸配列をコードする塩基配列が明らかになったので、後述するように本発明のタンパク質のアミノ酸配列の一部又は全部をコードする塩基配列を元にして作製したプローブを用いて、カルボニル基の還元活性を有する任意の微生物から還元酵素をコードするＤＮＡを単離した後、それを元に通常の遺伝子工学的手法を用いて得ることができる。また、本発明を完成するにあたってなされたように、カルボニル基の還元活性を有する微生物、すなわち、カルボニル還元酵素をコードするＤＮＡを有する微生物、例えば、好ましくはエクシグオバクテリウム属細菌の培養物より精製することも出来る。
【００１６】
エクシグオバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌としては、例えば、本発明者等により単離されたエクシグオバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ．ＭＣＩ４３２２株が特に本発明のカルボニル還元酵素の産生能に優れている。尚、エクシグオバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ．ＭＣＩ４３２２株は、独立行政法人産業総合研究所特許生物寄託センターに受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１９２３９として寄託されている。
【００１７】
先ず該菌株の同定結果を示す。
１．形態的性質
（１）細胞の形及び大きさ
若い細胞は桿状（０．８〜１．０×１．５〜２．０μｍ）を示し、培養経過に従い球状が見られる
（２） 細胞の多形性 顕著な多形性は無し
（３） 運動性の有無 有 （周鞭毛）
（４） 胞子の有無 無
【００１８】
２．培養的性質
（１） 肉汁寒天平板培養 ３０℃、４８時間培養後
円形、全縁滑らか、低凸状、オレンジ色、不透明、光沢あり、
（２） 肉汁液体培養 混濁が見られるが、液面における膜の形成は無し
（３） ゼラチン穿刺培養 ゼラチンの液化あり
（４） リトマスミルク リトマスの還元、カゼインの消化が見られる
【００１９】
【００２０】
４．化学分類学的性質
（１）主要なイソプレノイドキノン メナキノン ＭＫ−７
（２）菌体内ＤＮＡのＧＣ含量（ｍｏｌ％） ４６．８％
【００２１】
５．分類学的考察
（１）属の同定
該菌株（ＭＣＩ４３２２株）はオレンジ色のコロニーを形成する通性嫌気性のグラム陽性桿菌で、運動性（周鞭毛）を示し芽胞を形成しない。また、カタラーゼ陽性、高アルカリ条件下で生育可能で、ゼラチン、デンプン、カゼインの加水分解性を有する。これらの特徴はバージェイズマニュアル ディターミネイティブ バクテリオロジー［Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ］ 第９版 ５７７頁（１９９４）に記載されているエクシグオバクテリウム属（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の性状とよく合致したため、本菌株ＭＣＩ４３２２株はエクシグオバクテリウム属（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に含まれることが示唆された。
【００２２】
（２）種の同定
本菌株の１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列を決定し、相同性検索を行ったところ、相同率９９．６％でエクシグオバクテリウム アセティカム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｙｌｉｃｕｍ）ＮＣＩＭＢ９８８９株の１６Ｓ ｒＤＮＡ（ACCESSION No. X70313）に対し最も高い相同性を示した。
しかし、菌株同定キット ＡＰＩ ５０ＣＨＥ（bioMerieux社製）の試験結果によると、インターナショナル ジャーナル オブ システマティック アンドエヴォルーショナリー マイクロバイオロジー［ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ］第５２巻、１１７１−１１７６頁（２００２）による、糖からの酸の生成において本菌株とエクシグオバクテリウム アセティカム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｙｌｉｃｕｍ）とは完全には一致しなかった。
以上の結果から本菌株をエクシグオバクテリウム エスピー（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）ＭＣＩ４３２２と同定した。
【００２３】
微生物の培養物からの本発明のタンパク質の取得方法としては、通常の酵素の精製方法を用いることができ、例えば、以下の方法で行うことができる。上記微生物をＬＢ培地等の細菌の培養に用いられる一般的な培地で培養することで十分に増殖させた後に回収し、ＤＴＴ（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）等の還元剤や、フェニルメタンスルホニルフルオリド（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｓｕｌｆｏｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉｄｅ；ＰＭＳＦ）の様なプロテアーゼ阻害剤を加えた緩衝液中で破砕して無細胞抽出液とする。無細胞抽出液から、タンパク質の溶解度による分画（有機溶媒による沈殿や硫安などによる塩析など）や、陽イオン交換、陰イオン交換、ゲル濾過、疎水、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、キレート、色素、抗体等を用いたアフィニティークロマトグラフィー等を適宜組み合わせることにより精製することが出来る。
例えば、ＨｉＰｒｅｐ Ｑ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー、ＭｏｎｏＱ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いたゲル濾過、Ｃｅｒａｍｉｃ Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ，Ｔｙｐｅ−ＩＩ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いたハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー等を経て電気泳動的にほぼ単一バンドまで精製することが出来る。
【００２４】
このように精製されたエクシグオバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ．ＭＣＩ４３２２に由来する本発明のタンパク質は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下、「ＳＤＳ−ＰＡＧＥ」と略す）によると約２８，０００Ｄａのサブユニット１種からなり、また、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ ＨＲ１０／３０（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いたゲル濾過に決定された分子量は、約１２０，０００Ｄａである。
【００２５】
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば、以下のような方法によって単離することができる。
まず、本発明のタンパク質を上記の方法等にて精製後、Ｎ末端アミノ酸配列を解析し、さらに、リジルエンドペプチダーゼ、Ｖ８プロテアーゼなどの酵素により切断し、逆相液体クロマトグラフィーなどによりペプチド断片を精製後、プロテインシーケンサーによりアミノ酸配列を解析することにより複数のアミノ酸配列を決める。
決定したアミノ酸配列を元にＰＣＲ用のプライマーを設計し、カルボニル還元酵素生産微生物株の染色体ＤＮＡもしくは、ｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、アミノ酸配列から設計したＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより本発明のＤＮＡの一部を得ることができる。さらに、得られたＤＮＡ断片をプローブとして、カルボニル還元酵素生産微生物株の染色体ＤＮＡの制限酵素消化物をファージ、プラスミドなどに導入し、大腸菌を形質転換して得られたライブラリーやｃＤＮＡライブラリーを利用して、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーションなどにより、本発明のＤＮＡを得ることができる。
また、ＰＣＲにより得られたＤＮＡ断片の塩基配列を解析し、得られた配列から、既知のＤＮＡの外側に伸長させるためのＰＣＲプライマーを設計し、カルボニル還元酵素生産微生物株の染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で消化後、自己環化反応によりＤＮＡを鋳型としてｉｎｖｅｓｅ ＰＣＲを行うことにより（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １２０，６２１−６２３（１９８８））、本発明のＤＮＡを得ることも可能である。
なお本発明のＤＮＡは、以上のような方法によってクローニングされたゲノムＤＮＡ、あるいはｃＤＮＡの他、本発明によりその塩基配列が明らかになったため、配列番号２に基づく化学合成等によって得ることもできる。
【００２６】
本発明のタンパク質のホモログとは、カルボニル基還元酵素活性を害さない範囲内において配列番号１に記載のアミノ酸配列に一個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を有するものである。ここで数個とは、具体的には２０個以下、好ましくは１０個以下、より好ましくは５個以下である。
また、本発明のタンパク質のホモログとは、配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上のホモロジーを有するタンパク質をいう。
ちなみに上記タンパク質のホモロジー検索は、例えば、ＤＮＡ Ｄａｔａｂａｎｋ ｏｆ ＪＡＰＡＮ（ＤＤＢＪ）を対象に、ＦＡＳＴＡやＢＬＡＳＴなどのプログラムを用いて行うことができる。配列番号１に記載のアミノ酸配列を用いてＤＤＢＪを対象にＢＬＡＳＴ ｐｒｏｇｒａｍを用いてホモロジー検索を行った結果、既知のタンパク質の中でもっとも高いホモロジーを示したのは、クロストリジウム アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）のＯｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＡＫ７６７４８、配列番号１６）であり、５７％の相同性を示した。
【００２７】
また、本発明のＤＮＡは、上記タンパク質をコードするＤＮＡまたはそのホモログであって、カルボニル還元酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである。
上記タンパク質をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号２で表される塩基配列を含むものが挙げられる。
【００２８】
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡホモログとは、カルボニル基還元酵素活性を害さない範囲内において配列番号１に記載のアミノ酸配列に１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡを含む。ここで数個とは、具体的には６０個以下、好ましくは３０個以下、より好ましくは１０個以下である。
当業者であれば、配列番号２に記載のＤＮＡに部位特異的変異導入法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１０，ｐｐ．６４８７（１９８２）、Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００，ｐｐ．４４８（１９８３）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ Ｅｄｔ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）ＰＣＲ Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ｐｐ．２００（１９９１））等を用いて適宜置換、欠失、挿入及び／または付加変異を導入することにより本発明のＤＮＡホモログを得ることが可能である。
【００２９】
また、本発明のタンパク質のアミノ酸配列またはその一部や、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡまたはその一部を元に、例えばＤＮＡ Ｄａｔａｂａｎｋ ｏｆ ＪＡＰＡＮ（ＤＤＢＪ）等のデータベースに対してホモロジー検索を行って、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡホモログの塩基配列情報を手に入れることも可能である。当業者であれば、この塩基配列情報を元に寄託菌株からのＰＣＲ等により該ＤＮＡ断片を手に入れることが可能である。
さらに、本発明のＤＮＡのホモログは、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡまたはその一部をプローブとして用いて、カルボニル基の還元活性を有する任意の微生物から調製したＤＮＡに対し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等によりストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションを行い、ハイブリダイズするＤＮＡを得ることによっても取得できる。本発明のタンパク質をコードするＤＮＡの「一部」とは、プローブとして用いるのに十分な長さのＤＮＡのことであり、具体的には１５ｂｐ以上、好ましくは５０ｂｐ以上、より好ましくは１００ｂｐ以上のものである。
【００３０】
各ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．，１９８９．（以後「モレキュラークローニング 第２版」 と略す）等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００３１】
本明細書において「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、ＤＮＡをプローブとして使用し、ストリンジェントな条件下、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡの塩基配列を意味し、ストリンジェントな条件としては、例えば、コロニーハイブリダイゼーション法およびプラークハイブリダイゼーション法においては、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡまたは該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０Ｍの塩化ナトリウム存在下６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣの組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄する条件を挙げることができる。
【００３２】
上記のようにして単離された、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを公知の発現ベクターに発現可能に挿入することにより、カルボニル還元酵素発現ベクターが提供される。また、この発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養することにより、カルボニル還元酵素を該形質転換体から得ることができる。あるいは、形質転換体は、公知の宿主の染色体ＤＮＡに本発明のＤＮＡを発現可能に組み込むことによっても得ることができる。
【００３３】
形質転換体の作製方法としては、具体的には、微生物中において安定に存在するプラスミドベクターやファージベクター中に、本発明のＤＮＡを導入し、構築された発現ベクターを該微生物中に導入するか、もしくは、直接宿主ゲノム中に本発明のＤＮＡを導入し、その遺伝情報を転写・翻訳させる必要がある。
このとき、本発明のＤＮＡが宿主微生物中で発現可能なプロモーターを含んでいない場合には、適当なプロモーターを本発明のＤＮＡ鎖の５’−側上流に、より好ましくはターミネーターを３’−側下流にそれぞれ組み込む必要がある。このプロモーター及びターミネーターとしては、宿主として利用する微生物中において機能することが知られているプロモーター及びターミネーターであれば特に限定されず、これら各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター及びターミネーターなどに関しては、例えば「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版」、特に酵母に関しては、Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇ． ４３，７５−１０２（１９９０）、Ｙｅａｓｔ ８，４２３−４８８（１９９２）などに詳細に記述されている。
【００３４】
本発明のカルボニル還元酵素を発現させるための形質転換の対象となる宿主微生物としては、宿主自体が本反応に悪影響を与えない限り特に限定されることはなく、具体的には以下に示すような微生物を挙げることができる。
エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属などに属する宿主ベクター系の確立されている細菌。
ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属などに属する宿主ベクター系の確立されている放線菌。
サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クライベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、チゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属などに属するの宿主ベクター系の確立されている酵母。
【００３５】
ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属などに属するの宿主ベクター系の確立されているカビ。
上記微生物の中で宿主として好ましくは、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属であり、特に好ましくは、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属である。
形質転換体作製のための手順、宿主に適合した組換えベクターの構築および宿主の培養方法は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができる（例えば、「モレキュラークローニング 第２版」）。
【００３６】
以下、具体的に、好ましい宿主微生物、各微生物における好ましい形質転換の手法、ベクター、プロモーター、ターミネーターなどの例を挙げるが、本発明はこれらの例に限定されない。
エシェリヒア属、特にエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）においては、プラスミドベクターとしては、ｐＢＲ、ｐＵＣ系プラスミドが挙げられ、ｌａｃ（β−ガラクトシダーゼ）、ｔｒｐ（トリプトファンオペロン）、ｔａｃ、ｔｒｃ（ｌａｃ、ｔｒｐの融合）、λファージＰＬ、ＰＲなどに由来するプロモーターなどが挙げられる。また、ターミネーターとしては、ｔｒｐＡ由来、ファージ由来、ｒｒｎＢリボソーマルＲＮＡ由来のターミネーターなどが挙げられる。
【００３７】
バチルス属においては、ベクターとしては、ｐＵＢ１１０系プラスミド、ｐＣ１９４系プラスミドなどを挙げることができ、また、染色体にインテグレートすることもできる。プロモーター及びターミネーターとしては、アルカリプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、α−アミラーゼ等の酵素遺伝子のプロモーターやターミネーターなどが利用できる。
【００３８】
シュードモナス属においては、ベクターとしては、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・セパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａ）などで確立されている一般的な宿主ベクター系や、トルエン化合物の分解に関与するプラスミド、ＴＯＬプラスミドを基本にした広宿主域ベクター（ＲＳＦ１０１０などに由来する自律的複製に必要な遺伝子を含む）ｐＫＴ２４０（Ｇｅｎｅ，２６，２７３−８２（１９８３））を挙げることができる。
【００３９】
ブレビバクテリウム属、特にブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）においては、ベクターとしては、ｐＡＪ４３（Ｇｅｎｅ ３９，２８１（１９８５））などのプラスミドベクターを挙げることができる。プロモーター及びターミネーターとしては、大腸菌で使用されている各種プロモーター及びターミネーターが利用可能である。
【００４０】
コリネバクテリウム属、特にコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）においては、ベクターとしては、ｐＣＳ１１（特開昭５７−１８３７９９号公報）、ｐＣＢ１０１（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９６，１７５（１９８４））などのプラスミドベクターが挙げられる。
【００４１】
サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、特にサッカロマイセス・セレビジアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）においては、ベクターとしては、ＹＲｐ系、ＹＥｐ系、ＹＣｐ系、ＹＩｐ系プラスミドが挙げられる。また、アルコール脱水素酵素、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、酸性フォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ホスホグリセレートキナーゼ、エノラーゼといった各種酵素遺伝子のプロモーター、ターミネーターが利用可能である。
【００４２】
シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属においては、ベクターとしては、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６，８０（１９８６）に記載のシゾサッカロマイセス・ポンベ由来のプラスミドベクターを挙げることができる。特に、ｐＡＵＲ２２４は、宝酒造から市販されており容易に利用できる。
【００４３】
アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属においては、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリジー （Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）などがカビの中で最もよく研究されており、プラスミドや染色体へのインテグレーションが利用可能であり、菌体外プロテアーゼやアミラーゼ由来のプロモーターが利用可能である（Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７，２８３−２８７（１９８９））。
また、上記以外でも、各種微生物に応じた宿主ベクター系が確立されており、それらを適宜使用することができる。
【００４４】
また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が確立されており、特に蚕を用いた昆虫などの動物中（Ｎａｔｕｒｅ ３１５，５９２−５９４（１９８５））や菜種、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物中に大量に異種タンパク質を発現させる系、及び大腸菌無細胞抽出液や小麦胚芽などの無細胞タンパク質合成系を用いた系が確立されており、好適に利用できる。
さらに本発明は、上記の方法などで得られる本発明の形質転換体細胞、該形質転換体細胞処理物および／または培養液を、反応基質である下記一般式（Ｉ）で表される化合物に作用させることにより、該化合物のカルボニル基を不斉還元させ、下記一般式（ＩＩ）光学活性アルコールを製造することができる。
また本発明は、上記ＤＮＡと５７％の相同性を有するクロストリジウム アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）のＯｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＡＡＫ７６７４８）（配列番号１６）をコードするＤＮＡの形質転換体細胞、該形質転換体細胞処理物および／または培養液を、反応基質である下記一般式（Ｉ）
【００４５】
【化９】
【００４６】
（式中、Ｒ1は水素原子、置換されていてもよいアルキル基または置換されていてもよいアリール基を示し、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、ニトロ基、ヒドロキシ基、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアリール基または置換されていてもよいアルコキシ基を示す）で表される化合物に作用させることにより、該化合物のカルボニル基を不斉還元させ、下記一般式（ＩＩ）
【００４７】
【化１０】
【００４８】
（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は、前記と同義である）の光学活性アルコールを製造することもできる。
また本発明は、配列番号１または配列番号１６に記載のアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、カルボニル基を還元して光学活性アルコールを合成する能力を有するタンパク質をコードする塩基配列を有するＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体、又は、該ＤＮＡを染色体ＤＮＡに組み込んで得られる形質転換体細胞、該形質転換体細胞処理物および／または培養液を、反応基質である上記一般式（Ｉ）で表される化合物に作用させることにより、該化合物のカルボニル基を不斉還元させ、上記一般式（ＩＩ）光学活性アルコールを製造することもできる。
【００４９】
また本発明は、エクシグオバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、該細菌処理物および／または培養液を、反応基質である上記一般式（Ｉ）で表される化合物に作用させることにより、該化合物のカルボニル基を不斉還元させ、上記一般式（ＩＩ）光学活性アルコールを製造することもできる。
エクシグオバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌としては、例えば、本発明者等により単離されたエクシグオバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ．ＭＣＩ４３２２株が好適に使用される。
【００５０】
前記一般式（Ｉ）おいて、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4の定義中の原子および基を具体的に説明する。
先ず、上記アルキル基、アリール基及びアルコキシ基の置換基としては、反応に悪影響を与えない基であれば特に限定はないが、具体的には、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、ハロゲン基、シアノ基、アミノ基、ニトロ基及びヒドロキシル基等が挙げられる。
本発明において、アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ターシャリーブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ターシャリーペンチル基、イソアミル基、ｎ−へキシル基等の炭素数１〜８の直鎖、分岐鎖、環状アルキル基が挙げられる。これらの中で、炭素数１〜４のアルキル基が好ましく、メチル基又はエチル基が特に好ましい。
アリール基としては、例えば、フェニル基、メシチル基、ナフチル基等が挙げられる。
【００５１】
アルコキシ基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、イソブトキシ基、ターシャリーブトキシ基等が挙げられる。これらの中で炭素数１〜４のアルコキシ基が好ましい。
ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子等が挙げられる。
置換されていてもよいアルキル基としては、上記置換基で置換されていてもよいアルキル基を示し、具体的には、例えば上記アルキル基やベンジル基、フェネチル基、トリフルオロメチル基、シアノメチル基、アミノメチル基、ヒドロキシメチル基、ニトロメチル基、メトキシメチル基等が挙げられる。
置換されていてもよいアリール基としては、上記置換基で置換されていてもよいアリール基を示し、具体的には、例えば上記アルキル基やクロロフェニル基、アミノフェニル基、ヒドロキシフェニル基、ニトロフェニル基、メトキシフェニル基等が挙げられる。
置換されていてもよいアルコキシ基としては、上記置換基で置換されていてもよいアルコキシ基を示し、具体的には、例えば上記アルコキシ基やベンジロキシ基、フェノキシ基、トリフルオロメトキシ基等が挙げられる。
【００５２】
上記一般式（Ｉ）中のＲ1として、好ましくは炭素数１〜４のアルキル基、ベンジル基又はフェニル基であり、より好ましくは炭素数１〜４のアルキル基であり、特に好ましくはメチル基又はエチル基である。
また、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4として、好ましくは水素原子、ハロゲン原子、ニトロ基、ヒドロキシ基、炭素数１〜４のアルキル基または炭素数１〜４のアルコキシ基であり、より好ましくは水素原子である。更に、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は共に水素原子が好ましい。
【００５３】
上記一般式（Ｉ）で表される化合物としては、分子量が１０００以下、好ましくは７５０以下、より好ましくは５００以下のものであり、具体的には、例えば３−オキソ−３−（２’−チエニル）プロピオン酸メチルエステル、３−オキソ−３−（２’−チエニル）プロピオン酸エチルエステル、３−オキソ−３−（２’−チエニル）プロピオン酸プロピルエステル、３−オキソ−３−（２’−チエニル）プロピオン酸イソプロピルエステル、３−オキソ−３−（２’−チエニル）プロピオン酸シクロプロピルエステル、３−オキソ−３−（２’−チエニル）プロピオン酸ブチルエステル、３−オキソ−３−（２’−チエニル）プロピオン酸イソブチルエステル、３−オキソ−３−（２’−チエニル）プロピオン酸ターシャリーブチルエステル等が挙げられる。
【００５４】
上記一般式（Ｉ）で表される化合物は、Ｒｅｃｌ．Ｔｒａｖ．Ｃｈｉｍ．Ｐａｙｓ−Ｂａｓ（１９６７）８６，３７等に記載されているような公知の方法に準じてまたはそれらの組み合わせにより、容易に合成することができる。
上記一般式（ＩＩ）で表される化合物として、具体的には、例えば（Ｓ）−３−ヒドロキシ−３−（２’−チエニル）プロピオン酸メチルエステル、（Ｓ）−３−ヒドロキシ−３−（２’−チエニル）プロピオン酸エチルエステル、（Ｓ）−３−ヒドロキシ−３−（２’−チエニル）プロピオン酸プロピルエステル、（Ｓ）−３−ヒドロキシ−３−（２’−チエニル）プロピオン酸イソプロピルエステル、（Ｓ）−３−ヒドロキシ−３−（２’−チエニル）プロピオン酸シクロプロピルエステル、（Ｓ）−３−ヒドロキシ−３−（２’−チエニル）プロピオン酸ブチルエステル、（Ｓ）−３−ヒドロキシ−３−（２’−チエニル）プロピオン酸イソブチルエステル、（Ｓ）−３−ヒドロキシ−３−（２’−チエニル）プロピオン酸ターシャリーブチルエステル等が挙げられる。
【００５５】
また、反応基質となる上記一般式（Ｉ）で表される化合物は、通常、基質濃度が０．０１〜９０％ｗ／ｖ、好ましくは０．１〜３０％ｗ／ｖの範囲で用いられる。反応基質は、反応開始時に一括して添加しても良いが、酵素の基質阻害があった場合の影響を減らすと言う点や生成物の蓄積濃度を向上させるという観点からすると、連続的もしくは間欠的に添加することが望ましい。
本発明の製造方法において、式（Ｉ）のカルボニル基含有化合物（反応基質）に上記形質転換体細胞を作用させるに当たっては、該形質転換体細胞をそのまま、あるいは該形質転換体細胞処理物、例えば、該形質転換体細胞をアセトン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、トルエン等の有機溶媒や界面活性剤により処理したもの、凍結乾燥処理したもの、物理的または酵素的に破砕したもの等の細胞処理物、該形質転換体細胞中の本発明の酵素画分を粗製物あるいは精製物として取り出したもの、さらには、これらをポリアクリルアミドゲル、カラギーナンゲル等に代表される担体に固定化したものを用いることができる。
【００５６】
また、本発明の製造方法においては、補酵素ＮＡＤＰ+もしくはＮＡＤＰＨを添加するのが好ましく、通常、０．００１ｍＭ〜１００ｍＭ、好ましくは０．０１〜１０ｍＭ添加する。
上記補酵素を添加する場合には、ＮＡＤＰＨから生成するＮＡＤＰ+をＮＡＤＰＨへの再生させることが生産効率向上のため好ましく、再生方法としては、
１）宿主微生物自体のＮＡＤＰ+還元能を利用する方法、
２）ＮＡＤＰ+からＮＡＤＰＨを生成する能力を有する微生物やその処理物、あるいは、グルコース脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素、有機酸脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素など）などのＮＡＤＰＨの再生に利用可能な酵素（再生酵素）を反応系内に添加する方法、
３）形質転換体を製造するに当たり、ＮＡＤＰＨの再生に利用可能な酵素である上記再生酵素類の遺伝子を本発明のＤＮＡと同時に宿主に導入する方法が挙げられる。
【００５７】
このうち、上記１）の方法においては、反応系にグルコースやエタノール、ギ酸などを添加する方が好ましい。
また、上記２）の方法においては、上記再生酵素類を含む微生物、該微生物菌体をアセトン処理したもの、凍結乾燥処理したもの、物理的または酵素的に破砕したもの等の菌体処理物、該酵素画分を粗製物あるいは精製物として取り出したもの、さらには、これらをポリアクリルアミドゲル、カラギーナンゲル等に代表される担体に固定化したもの等を用いてもよく、また市販の酵素を用いても良い。
【００５８】
この場合、上記再生酵素の使用量としては、具体的には、本発明のカルボニル還元酵素に比較して、酵素活性で０．０１〜１００倍、好ましくは０．５〜２０倍程度となるよう添加する。
また、上記再生酵素の基質となる化合物、例えば、グルコース脱水素酵素を利用する場合のグルコース、ギ酸脱水素酵素を利用する場合のギ酸、アルコール脱水素酵素を利用する場合のエタノールもしくはイソプロパノールなどの添加も必要となるが、その添加量としては、反応原料であるカルボニル基含有化合物に対して、０．１〜２０倍モル当量、好ましくは１〜５倍モル当量添加する。
また、上記３）の方法においては、本発明のＤＮＡと上記再生酵素類のＤＮＡを染色体に組み込む方法、単一のベクター中に両ＤＮＡを導入し、宿主を形質転換する方法及び両ＤＮＡをそれぞれ別個にベクターに導入した後に宿主を形質転換する方法を用いることができるが、両ＤＮＡをそれぞれ別個にベクターに導入した後に宿主を形質転換する方法の場合、両ベクター同士の不和合性を考慮してベクターを選択する必要がある。
【００５９】
単一のベクター中に複数の遺伝子を導入する場合には、プロモーター及びターミネーターなど発現制御に関わる領域をそれぞれの遺伝子に連結する方法やラクトースオペロンのような複数のシストロンを含むオペロンとして発現させることも可能である。
本発明の製造方法は、反応基質及び本発明の形質転換体および／または該形質転換体処理物、並びに、必要に応じて添加された各種補酵素及びその再生システムを含有する水性媒体中もしくは該水性媒体と有機溶媒との混合物中で行われる。
【００６０】
上記、水性媒体としては、水又は緩衝液が挙げられ、また、有機溶媒としては、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、ｎ−ヘキサン、ジメチルスルホキシド等、反応基質の溶解度が高い物を使用することができる。
本発明の方法は、通常４〜６０℃、好ましくは１０〜４５℃の反応温度で、通常ｐＨ３〜１１、好ましくはｐＨ５〜８で行われる。また、膜リアクターなどを利用して行うことも可能である。
本発明の方法により生成する光学活性アルコールは、反応終了後、反応液中の菌体やタンパク質を遠心分離、膜処理などにより分離した後に、酢酸エチル、トルエンなどの有機溶媒による抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、晶析等のなどを適宜組み合わせることにより精製を行うことができる。
【００６１】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
（１）カルボニル還元酵素の単離
エクシグオバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ） ｓｐ． ＭＣＩ４３２２株を６ＬのＬＢ培地（トリプトン（Ｄｉｆｃｏ社製）１０ｇ、酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）５ｇ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ）で培養し、遠心分離により菌体を調製した。得られた湿菌体２４ｇを１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）、０．１ｍＭ ＤＴＴ（以下これを単に「バッファー」と称する）で懸濁し、超音波破砕機（２０１Ｍ・久保田商事社製）により破砕後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液をバッファーに対して透析し、ＨｉＰｒｅｐ １６／１０ Ｑ ＦＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）での陰イオン交換クロマトグラフィーを行った。塩化ナトリウム０〜０．６Ｍのグラジエント溶出で、カルボニル還元酵素活性は、０．１５Ｍ 塩化ナトリウム付近にピークが見られた。
溶出した活性画分を回収し、バッファーに対して透析後、ＭｏｎｏＱ ＨＲ１０／１０（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）での陰イオン交換クロマトグラフィーを行った。塩化ナトリウム０〜０．４Ｍのグラジエント溶出で、カルボニル還元酵素活性は、０．２Ｍ塩化ナトリウム付近にピークが見られた。
【００６２】
溶出したピーク部分を回収し、限外濾過により濃縮した後Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ ＨＲ１０／３０（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用い、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含むバッファーでゲル濾過を行った。ゲル濾過により得られた活性画分の分子量は、約１２０，０００Ｄａであった。
溶出したピーク部分を回収し、Ｃｅｒａｍｉｃ Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ，Ｔｙｐｅ−ＩＩ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）でのハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーを行った。リン酸カリウム１０〜４００ｍＭのグラジエント溶出で、カルボニル還元酵素活性は、５０ｍＭ リン酸カリウム付近にピークが見られた。
上記活性画分をポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により解析した結果、ほぼ単一バンドであり、その分子量は約２８，０００Ｄａであった。
【００６３】
（２）カルボニル還元酵素のアミノ酸配列の解析
上記（１）で得られたカルボニル還元酵素を含む画分を脱塩、濃縮後、エドマン法によりＮ末端アミノ酸の解析を行い４０残基のＮ末端アミノ酸配列を決定した。結果を配列番号３に示す。
また、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）後のカルボニル還元酵素のバンドを切り出し、リジルエンドペプチダーゼを用いたゲル内消化法（タンパク質実験ノート・下、羊土社）により得たペプチドを逆相ＨＰＬＣ（アマシャム バイオサイエンス社製 μＲＰＣ Ｃ２／Ｃ１８ ＰＣ３．２／３）を用い、ペプチドを分離し、分取した。分取したペプチドピーク２種をそれぞれエドマン法によりアミノ酸配列の解析を行った。それぞれのアミノ酸配列は配列番号４，５に示した。
【００６４】
（３）エクシグオバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ．ＭＣＩ４３２２由来の本発明ＤＮＡの配列解析及び形質転換体の作製
エクシグオバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ．ＭＣＩ４３２２をＬＢ培地で培養し、菌体を調製した。
【００６５】
菌体からのゲノムＤＮＡをＤｎｅａｓｙ ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて抽出、精製した。
上記（２）で得られた配列番号３のＮ末端アミノ酸配列を元にセンスデジェネレイト（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）プライマー及び配列番号５の内部アミノ酸配列を元にアンチセンスのデジェネレイト（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）プライマーを計２種類合成した。それぞれの塩基配列を配列番号６，７に示した。この２種のプライマーを用いて、エクシグオバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ．ＭＣＩ４３２２のゲノムＤＮＡに対してデジェネレイト（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）ＰＣＲを行ったところ、約５００ｂｐの増幅断片が認められた。
このＤＮＡ断片を、アガロースゲル電気泳動を行い、約５００ｂｐの断片のバンドを切り出しＱＩＡＥＸ ＩＩ ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）にて精製して回収した。得られたＤＮＡ断片を、ｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にライゲーションし、大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡社製）を形質転換した。形質転換株を、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ寒天培地で生育させ、いくつかのコロニーを用いて、Ｔ７プライマー（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）とＳＰ６プライマー（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いたコロニーダイレクトＰＣＲを行い、挿入断片のサイズを確認した。目的とするＤＮＡ断片が挿入されていると考えられるコロニーを、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ培地で培養し、ＱＩＡＰｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉ Ｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）によりプラスミドを精製した。
精製したプラスミドを用いて、挿入ＤＮＡの塩基配列をダイターミネーター法により解析した。決定された塩基配列を配列番号８として示した。
【００６６】
上記塩基配列を元に設計した配列番号９および１０に示す２種の遺伝子特異的プライマーを用いて、エクシグオバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ．ＭＣＩ４３２２のゲノムＤＮＡに対し、文献法に従ってｉｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲを行った。
Ｉｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲに用いた制限酵素はＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＫｐｎＩ、ＳｐｈＩの５種であったが、ＥｃｏＲＩの系で約５ｋｂｐの断片が増幅した。
増幅断片をアガロースゲル電気泳動を行い、約５ｋｂｐの断片のバンドを切り出しＱＩＡＥＸ ＩＩ ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）にて精製して回収した。得られたＤＮＡ断片を鋳型とし、ダイターミネーター法による塩基配列の解析を行った。解析した１８８２ｂｐの断片の塩基配列を配列番号１１として示す。
こうして得られた配列番号１１に記載の塩基配列と、配列番号３，４および５のアミノ酸配列の情報を元に推定されたＯＲＦ全長の塩基配列を配列番号２に、該ＤＮＡがコードするアミノ酸配列を配列番号１に示した。
【００６７】
引き続き、上記配列番号１１に記載の配列を元に、クローニング用のプライマーとして配列番号１２に記載の塩基配列及び配列番号１３に記載の塩基配列を合成し、上記プライマーを各５０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ各１０００ｎｍｏｌ、エクシグオバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ．ＭＣＩ４３２２のゲノムＤＮＡ ２５０ｎｇ、ＥｘＴａｑ ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ用１０×緩衝液（タカラバイオ社製）１０μＬ、ＥｘＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ５ユニット（タカラバイオ社製）を含む１００μＬの反応液を用い、変性（９５℃、１分）、アニール（４８℃、１分）、伸長（７２℃、１分）を２５サイクル、ＧｅｎｅＡｍｐ ２４００ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて行った。ＰＣＲ反応液の一部をアガロースゲル電気泳動により解析した結果、特異的と思われるバンドが検出できた。
【００６８】
上記で検出されたバンド部分をＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）にて回収した。回収したＤＮＡ断片を制限酵素ＰｓｔＩとＥｃｏＲＩで消化し、アガロースゲル電気泳動を行い、目的とするバンドの部分を切り出し、再度、Ｑｉａｇｅｎ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）により精製後回収した。得られたＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＩ、及びＰｓｔＩで消化したｐＫＫ２２３−３とＴａｋａｒａ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて、ライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。
【００６９】
形質転換体をアンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ寒天培地上で生育させ、コロニーダイレクトＰＣＲを行い、挿入断片のサイズを確認した。
目的とするＤＮＡ断片が挿入されていると考えられる形質転換体を５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地で培養し、ＱＩＡＥＸ ＩＩ ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてプラスミドを精製し、ｐＥｘＳＤＲ１とした。
【００７０】
プラスミドに挿入したＤＮＡの塩基配列をダイターミネーター法により解析したところ、挿入されたＤＮＡ断片は、配列番号２に記載の塩基配列を有しており、該ＤＮＡには配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在した。
配列番号１に記載のアミノ酸配列を用いてＤＤＢＪを対象にＢＬＡＳＴ ｐｒｏｇｒａｍを用いてホモロジー検索を行った結果、既知のタンパク質の中でもっとも高いホモロジーを示したのは、クロストリジウム アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）のＯｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＡＫ７６７４８、配列番号１６）であり、５７％の相同性を示した。
【００７１】
（４）本発明のＤＮＡによって形質転換した大腸菌を用いた（Ｓ）−３−ヒドロキシ−３−（２’−チエニル）プロピオン酸エチルエステル合成
上記（３）で得られた形質転換体をアンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）、０．１ｍＭ イソプロピル β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含むＬＢ培地で３７℃で１７時間生育させ、得られた菌体ブロス１ｍＬを遠心分離により集菌後、下記に示す方法により、３−オキソ−３−（２’−チエニル）プロピオン酸エチルエステルを基質として還元活性を確認した。
上記菌体に２００μＬの反応液（０．６ｇ／Ｌ ＮＡＤＰ+（オリエンタル酵母社製）、５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）、０．０４Ｍ グルコース、０．２ｇ／Ｌグルコースデヒドロゲナーゼ（天野製薬社製、７６ｕｎｉｔ／ｍｇ）、０．０２Ｍ ３−オキソ−３−（２’−チエニル）プロピオン酸エチルエステル）を添加後３０℃で２０時間振とう反応させた。反応終了後の反応液を酢酸エチル抽出、濃縮し、（Ｓ）−３−ヒドロキシ−３−（２’−チエニル）プロピオン酸エチルエステルを定量した。
【００７２】
定量は濃縮液を２−プロパノールで溶解し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて測定した。ＨＰＬＣの条件は以下の通りである。
カラム： Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ ＡＤ−ＲＨ（ダイセル化学社製） ３５℃
溶離液： １０ｍＭ リン酸カリウムバッファー ｐＨ６．０／アセトニトリル＝７０／３０
流速： １ｍｌ／ｍｉｎ
検出： ＵＶ２４５ｎｍ
この結果、（Ｓ）−３−ヒドロキシ−３−（２’−チエニル）プロピオン酸エチルエステルの収量は７６３μｇであり、収率は９５．４％、光学純度は９９．８％ｅ．ｅ．以上であった。
また該遺伝子を含まないプラスミドｐＫＫ２２３−３を持つ大腸菌を上記と同様の方法で培養し、反応させてみたが上記生成物は認められなかった。
【００７３】
（５）クロストリジウム アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）由来Ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＡＡＫ７６７４８）の形質転換体作製
上記（３）で決定したエクシグオバクテリウム オーランティアカム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｍ） ＤＳＭ ６２０８由来の本発明のＤＮＡと高い相同性を示した、クロストリジウム アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）由来Ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＡＫ７６７４８、配列番号１６）のＤＮＡ配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＥ００１４３８、配列番号１７）を元に配列番号：１４および１５に記載の塩基配列を合成し、上記プライマーを各５０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ各１０００ｎｍｏｌ、クロストリジウム アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ８２４のゲノムＤＮＡ ２５０ｎｇ 、ＥｘＴａｑ ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ用１０×緩衝液（タカラバイオ社製）１０μＬ、ＥｘＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ５ユニット（タカラバイオ社製）を含む１００μＬの反応液を用い、変性（９５℃、１分）、アニール（５３℃、１分）、伸長（７２℃、１分）を２５サイクル、ＧｅｎｅＡｍｐ２４００ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製） を用いて行った。ＰＣＲ反応液の一部をアガロースゲル電気泳動により解析した結果、特異的と思われるバンドが検出できた。
【００７４】
上記で検出されたバンド部分をＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）にて回収した。回収したＤＮＡ断片を制限酵素ＰｓｔＩとＥｃｏＲＩで消化し、アガロースゲル電気泳動を行い、目的とするバンドの部分を切り出し、再度、Ｑｉａｇｅｎ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製） により精製後回収した。得られたＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＩ、及びＰｓｔＩで消化したｐＫＫ２２３−３とＴａｋａｒａ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて、ライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。
【００７５】
形質転換体をアンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ寒天培地上で生育させ、コロニーダイレクトＰＣＲを行い、挿入断片のサイズを確認した。
目的とするＤＮＡ断片が挿入されていると考えられる形質転換体を５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地で培養し、ＱＩＡＰｒｅｐＳｐｉｎ Ｍｉｎｉ Ｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてプラスミドを精製し、ｐＣａＳＤＲ１とした。
プラスミドに挿入したＤＮＡの塩基配列をダイターミネーター法により解析したところ、挿入されたＤＮＡ断片は、配列番号１７に記載の塩基配列と一致した。
【００７６】
（６）クロストリジウム アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）由来Ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＡＡＫ７６７４８）をコードするＤＮＡによって形質転換した大腸菌を用いた（Ｓ）−３−ヒドロキシ−３−（２’−チエニル）プロピオン酸エチルエステル合成
上記（５）で得られた形質転換体をアンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）、０．１ｍＭイソプロピル β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含むＬＢ培地で３７℃で１７時間生育させ、得られた菌体ブロス１ｍＬを遠心分離により集菌後、下記に示す方法により、３−オキソ−３−（２’−チエニル）プロピオン酸エチルエステルを基質として還元活性を確認した。
上記菌体に２００μＬの反応液（０．６ｇ／Ｌ ＮＡＤＰ+（オリエンタル酵母社製）、５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）、０．０４Ｍ グルコース、０．２ｇ／Ｌグルコースデヒドロゲナーゼ（天野製薬社製、７６ｕｎｉｔ／ｍｇ）、０．０２Ｍ ３−オキソ−３−（２’−チエニル）プロピオン酸エチルエステル）を添加後３０℃で２０時間振とう反応させた。反応終了後の反応液を酢酸エチル抽出、濃縮し、（Ｓ）−３−ヒドロキシ−３−（２’−チエニル）プロピオン酸エチルエステルを定量した。
定量は濃縮液を２−プロパノールで溶解し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて測定した。
この結果、（Ｓ）−３−ヒドロキシ−３−（２’−チエニル）プロピオン酸エチルエステルの収量は４５０μｇであり、収率は５６．３％、光学純度は９９．８％ｅ．ｅ．以上であった。
【００７７】
【発明の効果】
医薬、農薬等の中間体原料として産業上有用な化合物である光学活性アルコール類を高光学純度かつ高収率で得ることができる製造方法を提供する。
【００７８】
【配列表】
【００７９】
【００８０】
【００８１】
【００８２】
【００８３】
【００８４】
【００８５】
【００８６】
【００８７】
【００８８】
【００８９】
【００９０】
【００９１】
【００９２】
【００９３】
【００９４】
【００９５】
【発明の属する技術分野】
本発明は、カルボニル基含有化合物を還元して、医薬、農薬等の中間体原料として産業上有用な化合物である光学活性アルコール類に変換する活性を有するタンパク質、該タンパク質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体、該形質転換体および／または該形質転換体処理物を用いた光学活性アルコール類の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
光学活性３−ヒドロキシ−３−（２’−チエニル）プロピオン酸エステル誘導体は生理活性又は薬理活性成分（医薬品、農薬など）の中間原料として有用な物質である。生理活性成分は光学異性体を選択的に製造することが求められ、該プロピオン酸エステル誘導体の光学活性体は、さらに有用な中間原料となり得ると考えられる。
しかしながら、微生物を用いてカルボニル基を不斉還元する方法は各種研究がなされているものの、例えばチオフェン環に隣接する位置に存在するカルボニル基を不斉還元する方法としては、２，５−ジアセチルチオフェンをパン酵母を用いて還元する方法（例えば、非特許文献１参照。）やトリフルオロメチル−（２’−チエニル）ケトンをＧｅｏｔｒｉｃｕｍ ｃａｎｄｉｄｕｍを用いて還元する方法（例えば、非特許文献２参照。）が知られているのみである。
また、（Ｓ）−３−ヒドロキシ−３−（２’−チエニル）プロピオン酸エステル誘導体については不斉触媒を用いた化学合成法による製造の報告があるが（例えば、非特許文献３参照。）、生成する（Ｓ）−３−ヒドロキシ−３−（２’−チエニル）プロピオン酸エステル誘導体の光学純度は８５％ｅ．ｅ．と低い。
一般的に、化学合成法によるカルボニル基の不斉還元は、触媒が高価である、触媒残渣の除去等プロセス上煩雑な工程が必要になること等の難点があり、より安価で簡便な製造法の開発が望まれていた。
【０００３】
【非特許文献１】
Tetrahedron Asymmetry Vol.8, pp3467, 1997
【非特許文献２】
Tetrahedron Vol.54, pp8393, 1998
【非特許文献３】
C.R.Acad.Sci.Paris, t.2, Serie II, pp175, 1999
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
従って、より光学純度の高い（Ｓ）−３−ヒドロキシ−３−（２’−チエニル）プロピオン酸エステル誘導体を安価かつ簡便に製造する新規な方法を提供することを本発明の課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために、（Ｓ）−３−ヒドロキシ−３−（２’−チエニル）プロピオン酸エステル誘導体の製造方法について鋭意検討した結果、原料となる３−オキソ−３−（２’−チエニル）プロピオン酸エステル誘導体の還元反応を触媒する新規酵素を単離し、該酵素をコードする遺伝子を単離してその塩基配列を解析した。さらに、該遺伝子の形質転換体を作製し、該遺伝子を発現させた形質転換体細胞、該形質転換体処理物および／または培養液を、原料となる３−オキソ−３−（２’−チエニル）プロピオン酸エステル誘導体に作用させることにより、高い光学純度かつ高濃度で目的物（Ｓ）−３−ヒドロキシ−３−（２’−チエニル）プロピオン酸エステル誘導体を得ることができることを見い出した。本発明はこれらの知見に基づいて成し遂げられたものである。
【０００６】
すなわち、本発明の要旨は、
（１）以下の（Ａ）〜（Ｃ）の何れかのアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列
（Ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１から複数個のアミノ酸が欠失、付加または置換されているアミノ酸配列であって、カルボニル基を還元して光学活性アルコールを合成する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列
（Ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、カルボニル基を還元して光学活性アルコールを合成する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列
（２）以下の（Ａ）〜（Ｆ）の何れかの塩基配列を有するＤＮＡ。
（Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする塩基配列
（Ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から複数個のアミノ酸が欠失、付加または置換されているアミノ酸配列であって、カルボニル基を還元して光学活性アルコールを合成する能力を有するタンパク質をコードする塩基配列
（Ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、カルボニル基を還元して光学活性アルコールを合成する能力を有するタンパク質をコードする塩基配列
（Ｄ）配列番号２に記載の塩基配列
（Ｅ）配列番号２に記載の塩基酸配列において、１から複数個の塩基が欠失、付加または置換されている塩基配列であって、カルボニル基を還元して光学活性アルコールを合成する能力を有するタンパク質をコードする塩基配列
（Ｆ）配列番号２に記載の塩基酸配列またはその相補配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列であって、カルボニル基を還元して光学活性アルコールを合成する能力を有するタンパク質をコードする塩基配列
（３）（２）に記載のＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡ。
（４）（３）に記載の組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体。
（５）（２）に記載のＤＮＡを染色体ＤＮＡに組み込んで得られる形質転換体。
（６）下記一般式（Ｉ）
【０００７】
【化５】
（式中、Ｒ1は水素原子、置換されていてもよいアルキル基または置換されていてもよいアリール基を示し、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、ニトロ基、ヒドロキシ基、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアリール基または置換されていてもよいアルコキシ基を示す）で表される３−オキソ−３−（２’−チエニル）プロピオン酸エステル誘導体に、以下の（Ａ）または（Ｂ）に記載の形質転換体細胞、該形質転換体細胞処理物および／または培養液を作用させ、下記一般式（ＩＩ）
【０００９】
【化６】
（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は前記と同義である）で表される（Ｓ）−３−ヒドロキシ−３−（２’−チエニル）プロピオン酸エステル誘導体を生成させることを特徴とする光学活性３−ヒドロキシ−３−（２’−チエニル）プロピオン酸エステル誘導体の製造方法。
（Ａ）（４）または（５）に記載の形質転換体。
（Ｂ）配列番号１または配列番号１６に記載のアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、カルボニル基を還元して光学活性アルコールを合成する能力を有するタンパク質をコードする塩基配列を有するＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体、又は、該ＤＮＡを染色体ＤＮＡに組み込んで得られる形質転換体。
（７）下記一般式（Ｉ）
【００１１】
【化７】
（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は前記と同義である）で表される３−オキソ−３−（２’−チエニル）プロピオン酸エステル誘導体に、エクシグオバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、該細菌処理物および／または培養液を作用させ、下記一般式（ＩＩ）
【００１３】
【化８】
（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は前記と同義である）で表される（Ｓ）−３−ヒドロキシ−３−（２’−チエニル）プロピオン酸エステル誘導体を生成させることを特徴とする光学活性３−ヒドロキシ−３−（２’−チエニル）プロピオン酸エステル誘導体の製造方法。
（８）Ｒ2、Ｒ3及びＲ4が、共に水素原子であることを特徴とする（６）または（７）に記載の製造方法。
及び
（９）Ｒ1が炭素数１〜４のアルキル基であることを特徴とする（６）〜（８）のいずれかに記載の製造方法に存する。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明を詳細に説明する。
本発明のタンパク質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するもの、又は該アミノ酸配列のホモログであってカルボニル還元酵素活性を有するもの（以下これを単に「カルボニル還元酵素」と称することがある）である。
本明細書において、カルボニル還元酵素活性とは、カルボニル基含有化合物中のカルボニル基を不斉還元して光学活性なアルコール類とする活性をいう。このような活性は、カルボニル基含有化合物を基質として含有し、さらにＮＡＤＰＨを補酵素として含有する反応系において、酵素として、目的のタンパク質、該タンパク質を発現する能力を有する形質転換体、または形質転換体処理物を作用させてＮＡＤＰＨ減少初速度を測定することにより測定することができる。
本発明のタンパク質は、本発明によってそのアミノ酸配列および該アミノ酸配列をコードする塩基配列が明らかになったので、後述するように本発明のタンパク質のアミノ酸配列の一部又は全部をコードする塩基配列を元にして作製したプローブを用いて、カルボニル基の還元活性を有する任意の微生物から還元酵素をコードするＤＮＡを単離した後、それを元に通常の遺伝子工学的手法を用いて得ることができる。また、本発明を完成するにあたってなされたように、カルボニル基の還元活性を有する微生物、すなわち、カルボニル還元酵素をコードするＤＮＡを有する微生物、例えば、好ましくはエクシグオバクテリウム属細菌の培養物より精製することも出来る。
【００１６】
エクシグオバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌としては、例えば、本発明者等により単離されたエクシグオバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ．ＭＣＩ４３２２株が特に本発明のカルボニル還元酵素の産生能に優れている。尚、エクシグオバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ．ＭＣＩ４３２２株は、独立行政法人産業総合研究所特許生物寄託センターに受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１９２３９として寄託されている。
【００１７】
先ず該菌株の同定結果を示す。
１．形態的性質
（１）細胞の形及び大きさ
若い細胞は桿状（０．８〜１．０×１．５〜２．０μｍ）を示し、培養経過に従い球状が見られる
（２） 細胞の多形性 顕著な多形性は無し
（３） 運動性の有無 有 （周鞭毛）
（４） 胞子の有無 無
【００１８】
２．培養的性質
（１） 肉汁寒天平板培養 ３０℃、４８時間培養後
円形、全縁滑らか、低凸状、オレンジ色、不透明、光沢あり、
（２） 肉汁液体培養 混濁が見られるが、液面における膜の形成は無し
（３） ゼラチン穿刺培養 ゼラチンの液化あり
（４） リトマスミルク リトマスの還元、カゼインの消化が見られる
【００１９】
４．化学分類学的性質
（１）主要なイソプレノイドキノン メナキノン ＭＫ−７
（２）菌体内ＤＮＡのＧＣ含量（ｍｏｌ％） ４６．８％
【００２１】
５．分類学的考察
（１）属の同定
該菌株（ＭＣＩ４３２２株）はオレンジ色のコロニーを形成する通性嫌気性のグラム陽性桿菌で、運動性（周鞭毛）を示し芽胞を形成しない。また、カタラーゼ陽性、高アルカリ条件下で生育可能で、ゼラチン、デンプン、カゼインの加水分解性を有する。これらの特徴はバージェイズマニュアル ディターミネイティブ バクテリオロジー［Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ］ 第９版 ５７７頁（１９９４）に記載されているエクシグオバクテリウム属（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の性状とよく合致したため、本菌株ＭＣＩ４３２２株はエクシグオバクテリウム属（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に含まれることが示唆された。
【００２２】
（２）種の同定
本菌株の１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列を決定し、相同性検索を行ったところ、相同率９９．６％でエクシグオバクテリウム アセティカム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｙｌｉｃｕｍ）ＮＣＩＭＢ９８８９株の１６Ｓ ｒＤＮＡ（ACCESSION No. X70313）に対し最も高い相同性を示した。
しかし、菌株同定キット ＡＰＩ ５０ＣＨＥ（bioMerieux社製）の試験結果によると、インターナショナル ジャーナル オブ システマティック アンドエヴォルーショナリー マイクロバイオロジー［ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ］第５２巻、１１７１−１１７６頁（２００２）による、糖からの酸の生成において本菌株とエクシグオバクテリウム アセティカム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｙｌｉｃｕｍ）とは完全には一致しなかった。
以上の結果から本菌株をエクシグオバクテリウム エスピー（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）ＭＣＩ４３２２と同定した。
【００２３】
微生物の培養物からの本発明のタンパク質の取得方法としては、通常の酵素の精製方法を用いることができ、例えば、以下の方法で行うことができる。上記微生物をＬＢ培地等の細菌の培養に用いられる一般的な培地で培養することで十分に増殖させた後に回収し、ＤＴＴ（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）等の還元剤や、フェニルメタンスルホニルフルオリド（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｓｕｌｆｏｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉｄｅ；ＰＭＳＦ）の様なプロテアーゼ阻害剤を加えた緩衝液中で破砕して無細胞抽出液とする。無細胞抽出液から、タンパク質の溶解度による分画（有機溶媒による沈殿や硫安などによる塩析など）や、陽イオン交換、陰イオン交換、ゲル濾過、疎水、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、キレート、色素、抗体等を用いたアフィニティークロマトグラフィー等を適宜組み合わせることにより精製することが出来る。
例えば、ＨｉＰｒｅｐ Ｑ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー、ＭｏｎｏＱ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いたゲル濾過、Ｃｅｒａｍｉｃ Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ，Ｔｙｐｅ−ＩＩ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いたハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー等を経て電気泳動的にほぼ単一バンドまで精製することが出来る。
【００２４】
このように精製されたエクシグオバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ．ＭＣＩ４３２２に由来する本発明のタンパク質は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下、「ＳＤＳ−ＰＡＧＥ」と略す）によると約２８，０００Ｄａのサブユニット１種からなり、また、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ ＨＲ１０／３０（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いたゲル濾過に決定された分子量は、約１２０，０００Ｄａである。
【００２５】
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば、以下のような方法によって単離することができる。
まず、本発明のタンパク質を上記の方法等にて精製後、Ｎ末端アミノ酸配列を解析し、さらに、リジルエンドペプチダーゼ、Ｖ８プロテアーゼなどの酵素により切断し、逆相液体クロマトグラフィーなどによりペプチド断片を精製後、プロテインシーケンサーによりアミノ酸配列を解析することにより複数のアミノ酸配列を決める。
決定したアミノ酸配列を元にＰＣＲ用のプライマーを設計し、カルボニル還元酵素生産微生物株の染色体ＤＮＡもしくは、ｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、アミノ酸配列から設計したＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより本発明のＤＮＡの一部を得ることができる。さらに、得られたＤＮＡ断片をプローブとして、カルボニル還元酵素生産微生物株の染色体ＤＮＡの制限酵素消化物をファージ、プラスミドなどに導入し、大腸菌を形質転換して得られたライブラリーやｃＤＮＡライブラリーを利用して、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーションなどにより、本発明のＤＮＡを得ることができる。
また、ＰＣＲにより得られたＤＮＡ断片の塩基配列を解析し、得られた配列から、既知のＤＮＡの外側に伸長させるためのＰＣＲプライマーを設計し、カルボニル還元酵素生産微生物株の染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で消化後、自己環化反応によりＤＮＡを鋳型としてｉｎｖｅｓｅ ＰＣＲを行うことにより（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １２０，６２１−６２３（１９８８））、本発明のＤＮＡを得ることも可能である。
なお本発明のＤＮＡは、以上のような方法によってクローニングされたゲノムＤＮＡ、あるいはｃＤＮＡの他、本発明によりその塩基配列が明らかになったため、配列番号２に基づく化学合成等によって得ることもできる。
【００２６】
本発明のタンパク質のホモログとは、カルボニル基還元酵素活性を害さない範囲内において配列番号１に記載のアミノ酸配列に一個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を有するものである。ここで数個とは、具体的には２０個以下、好ましくは１０個以下、より好ましくは５個以下である。
また、本発明のタンパク質のホモログとは、配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上のホモロジーを有するタンパク質をいう。
ちなみに上記タンパク質のホモロジー検索は、例えば、ＤＮＡ Ｄａｔａｂａｎｋ ｏｆ ＪＡＰＡＮ（ＤＤＢＪ）を対象に、ＦＡＳＴＡやＢＬＡＳＴなどのプログラムを用いて行うことができる。配列番号１に記載のアミノ酸配列を用いてＤＤＢＪを対象にＢＬＡＳＴ ｐｒｏｇｒａｍを用いてホモロジー検索を行った結果、既知のタンパク質の中でもっとも高いホモロジーを示したのは、クロストリジウム アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）のＯｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＡＫ７６７４８、配列番号１６）であり、５７％の相同性を示した。
【００２７】
また、本発明のＤＮＡは、上記タンパク質をコードするＤＮＡまたはそのホモログであって、カルボニル還元酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである。
上記タンパク質をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号２で表される塩基配列を含むものが挙げられる。
【００２８】
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡホモログとは、カルボニル基還元酵素活性を害さない範囲内において配列番号１に記載のアミノ酸配列に１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡを含む。ここで数個とは、具体的には６０個以下、好ましくは３０個以下、より好ましくは１０個以下である。
当業者であれば、配列番号２に記載のＤＮＡに部位特異的変異導入法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１０，ｐｐ．６４８７（１９８２）、Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００，ｐｐ．４４８（１９８３）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ Ｅｄｔ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）ＰＣＲ Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ｐｐ．２００（１９９１））等を用いて適宜置換、欠失、挿入及び／または付加変異を導入することにより本発明のＤＮＡホモログを得ることが可能である。
【００２９】
また、本発明のタンパク質のアミノ酸配列またはその一部や、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡまたはその一部を元に、例えばＤＮＡ Ｄａｔａｂａｎｋ ｏｆ ＪＡＰＡＮ（ＤＤＢＪ）等のデータベースに対してホモロジー検索を行って、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡホモログの塩基配列情報を手に入れることも可能である。当業者であれば、この塩基配列情報を元に寄託菌株からのＰＣＲ等により該ＤＮＡ断片を手に入れることが可能である。
さらに、本発明のＤＮＡのホモログは、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡまたはその一部をプローブとして用いて、カルボニル基の還元活性を有する任意の微生物から調製したＤＮＡに対し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等によりストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションを行い、ハイブリダイズするＤＮＡを得ることによっても取得できる。本発明のタンパク質をコードするＤＮＡの「一部」とは、プローブとして用いるのに十分な長さのＤＮＡのことであり、具体的には１５ｂｐ以上、好ましくは５０ｂｐ以上、より好ましくは１００ｂｐ以上のものである。
【００３０】
各ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．，１９８９．（以後「モレキュラークローニング 第２版」 と略す）等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００３１】
本明細書において「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、ＤＮＡをプローブとして使用し、ストリンジェントな条件下、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡの塩基配列を意味し、ストリンジェントな条件としては、例えば、コロニーハイブリダイゼーション法およびプラークハイブリダイゼーション法においては、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡまたは該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０Ｍの塩化ナトリウム存在下６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣの組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄する条件を挙げることができる。
【００３２】
上記のようにして単離された、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを公知の発現ベクターに発現可能に挿入することにより、カルボニル還元酵素発現ベクターが提供される。また、この発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養することにより、カルボニル還元酵素を該形質転換体から得ることができる。あるいは、形質転換体は、公知の宿主の染色体ＤＮＡに本発明のＤＮＡを発現可能に組み込むことによっても得ることができる。
【００３３】
形質転換体の作製方法としては、具体的には、微生物中において安定に存在するプラスミドベクターやファージベクター中に、本発明のＤＮＡを導入し、構築された発現ベクターを該微生物中に導入するか、もしくは、直接宿主ゲノム中に本発明のＤＮＡを導入し、その遺伝情報を転写・翻訳させる必要がある。
このとき、本発明のＤＮＡが宿主微生物中で発現可能なプロモーターを含んでいない場合には、適当なプロモーターを本発明のＤＮＡ鎖の５’−側上流に、より好ましくはターミネーターを３’−側下流にそれぞれ組み込む必要がある。このプロモーター及びターミネーターとしては、宿主として利用する微生物中において機能することが知られているプロモーター及びターミネーターであれば特に限定されず、これら各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター及びターミネーターなどに関しては、例えば「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版」、特に酵母に関しては、Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇ． ４３，７５−１０２（１９９０）、Ｙｅａｓｔ ８，４２３−４８８（１９９２）などに詳細に記述されている。
【００３４】
本発明のカルボニル還元酵素を発現させるための形質転換の対象となる宿主微生物としては、宿主自体が本反応に悪影響を与えない限り特に限定されることはなく、具体的には以下に示すような微生物を挙げることができる。
エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属などに属する宿主ベクター系の確立されている細菌。
ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属などに属する宿主ベクター系の確立されている放線菌。
サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クライベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、チゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属などに属するの宿主ベクター系の確立されている酵母。
【００３５】
ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属などに属するの宿主ベクター系の確立されているカビ。
上記微生物の中で宿主として好ましくは、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属であり、特に好ましくは、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属である。
形質転換体作製のための手順、宿主に適合した組換えベクターの構築および宿主の培養方法は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができる（例えば、「モレキュラークローニング 第２版」）。
【００３６】
以下、具体的に、好ましい宿主微生物、各微生物における好ましい形質転換の手法、ベクター、プロモーター、ターミネーターなどの例を挙げるが、本発明はこれらの例に限定されない。
エシェリヒア属、特にエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）においては、プラスミドベクターとしては、ｐＢＲ、ｐＵＣ系プラスミドが挙げられ、ｌａｃ（β−ガラクトシダーゼ）、ｔｒｐ（トリプトファンオペロン）、ｔａｃ、ｔｒｃ（ｌａｃ、ｔｒｐの融合）、λファージＰＬ、ＰＲなどに由来するプロモーターなどが挙げられる。また、ターミネーターとしては、ｔｒｐＡ由来、ファージ由来、ｒｒｎＢリボソーマルＲＮＡ由来のターミネーターなどが挙げられる。
【００３７】
バチルス属においては、ベクターとしては、ｐＵＢ１１０系プラスミド、ｐＣ１９４系プラスミドなどを挙げることができ、また、染色体にインテグレートすることもできる。プロモーター及びターミネーターとしては、アルカリプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、α−アミラーゼ等の酵素遺伝子のプロモーターやターミネーターなどが利用できる。
【００３８】
シュードモナス属においては、ベクターとしては、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・セパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａ）などで確立されている一般的な宿主ベクター系や、トルエン化合物の分解に関与するプラスミド、ＴＯＬプラスミドを基本にした広宿主域ベクター（ＲＳＦ１０１０などに由来する自律的複製に必要な遺伝子を含む）ｐＫＴ２４０（Ｇｅｎｅ，２６，２７３−８２（１９８３））を挙げることができる。
【００３９】
ブレビバクテリウム属、特にブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）においては、ベクターとしては、ｐＡＪ４３（Ｇｅｎｅ ３９，２８１（１９８５））などのプラスミドベクターを挙げることができる。プロモーター及びターミネーターとしては、大腸菌で使用されている各種プロモーター及びターミネーターが利用可能である。
【００４０】
コリネバクテリウム属、特にコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）においては、ベクターとしては、ｐＣＳ１１（特開昭５７−１８３７９９号公報）、ｐＣＢ１０１（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９６，１７５（１９８４））などのプラスミドベクターが挙げられる。
【００４１】
サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、特にサッカロマイセス・セレビジアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）においては、ベクターとしては、ＹＲｐ系、ＹＥｐ系、ＹＣｐ系、ＹＩｐ系プラスミドが挙げられる。また、アルコール脱水素酵素、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、酸性フォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ホスホグリセレートキナーゼ、エノラーゼといった各種酵素遺伝子のプロモーター、ターミネーターが利用可能である。
【００４２】
シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属においては、ベクターとしては、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６，８０（１９８６）に記載のシゾサッカロマイセス・ポンベ由来のプラスミドベクターを挙げることができる。特に、ｐＡＵＲ２２４は、宝酒造から市販されており容易に利用できる。
【００４３】
アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属においては、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリジー （Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）などがカビの中で最もよく研究されており、プラスミドや染色体へのインテグレーションが利用可能であり、菌体外プロテアーゼやアミラーゼ由来のプロモーターが利用可能である（Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７，２８３−２８７（１９８９））。
また、上記以外でも、各種微生物に応じた宿主ベクター系が確立されており、それらを適宜使用することができる。
【００４４】
また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が確立されており、特に蚕を用いた昆虫などの動物中（Ｎａｔｕｒｅ ３１５，５９２−５９４（１９８５））や菜種、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物中に大量に異種タンパク質を発現させる系、及び大腸菌無細胞抽出液や小麦胚芽などの無細胞タンパク質合成系を用いた系が確立されており、好適に利用できる。
さらに本発明は、上記の方法などで得られる本発明の形質転換体細胞、該形質転換体細胞処理物および／または培養液を、反応基質である下記一般式（Ｉ）で表される化合物に作用させることにより、該化合物のカルボニル基を不斉還元させ、下記一般式（ＩＩ）光学活性アルコールを製造することができる。
また本発明は、上記ＤＮＡと５７％の相同性を有するクロストリジウム アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）のＯｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＡＡＫ７６７４８）（配列番号１６）をコードするＤＮＡの形質転換体細胞、該形質転換体細胞処理物および／または培養液を、反応基質である下記一般式（Ｉ）
【００４５】
【化９】
（式中、Ｒ1は水素原子、置換されていてもよいアルキル基または置換されていてもよいアリール基を示し、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、ニトロ基、ヒドロキシ基、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアリール基または置換されていてもよいアルコキシ基を示す）で表される化合物に作用させることにより、該化合物のカルボニル基を不斉還元させ、下記一般式（ＩＩ）
【００４７】
【化１０】
（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は、前記と同義である）の光学活性アルコールを製造することもできる。
また本発明は、配列番号１または配列番号１６に記載のアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、カルボニル基を還元して光学活性アルコールを合成する能力を有するタンパク質をコードする塩基配列を有するＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体、又は、該ＤＮＡを染色体ＤＮＡに組み込んで得られる形質転換体細胞、該形質転換体細胞処理物および／または培養液を、反応基質である上記一般式（Ｉ）で表される化合物に作用させることにより、該化合物のカルボニル基を不斉還元させ、上記一般式（ＩＩ）光学活性アルコールを製造することもできる。
【００４９】
また本発明は、エクシグオバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、該細菌処理物および／または培養液を、反応基質である上記一般式（Ｉ）で表される化合物に作用させることにより、該化合物のカルボニル基を不斉還元させ、上記一般式（ＩＩ）光学活性アルコールを製造することもできる。
エクシグオバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌としては、例えば、本発明者等により単離されたエクシグオバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ．ＭＣＩ４３２２株が好適に使用される。
【００５０】
前記一般式（Ｉ）おいて、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4の定義中の原子および基を具体的に説明する。
先ず、上記アルキル基、アリール基及びアルコキシ基の置換基としては、反応に悪影響を与えない基であれば特に限定はないが、具体的には、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、ハロゲン基、シアノ基、アミノ基、ニトロ基及びヒドロキシル基等が挙げられる。
本発明において、アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ターシャリーブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ターシャリーペンチル基、イソアミル基、ｎ−へキシル基等の炭素数１〜８の直鎖、分岐鎖、環状アルキル基が挙げられる。これらの中で、炭素数１〜４のアルキル基が好ましく、メチル基又はエチル基が特に好ましい。
アリール基としては、例えば、フェニル基、メシチル基、ナフチル基等が挙げられる。
【００５１】
アルコキシ基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、イソブトキシ基、ターシャリーブトキシ基等が挙げられる。これらの中で炭素数１〜４のアルコキシ基が好ましい。
ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子等が挙げられる。
置換されていてもよいアルキル基としては、上記置換基で置換されていてもよいアルキル基を示し、具体的には、例えば上記アルキル基やベンジル基、フェネチル基、トリフルオロメチル基、シアノメチル基、アミノメチル基、ヒドロキシメチル基、ニトロメチル基、メトキシメチル基等が挙げられる。
置換されていてもよいアリール基としては、上記置換基で置換されていてもよいアリール基を示し、具体的には、例えば上記アルキル基やクロロフェニル基、アミノフェニル基、ヒドロキシフェニル基、ニトロフェニル基、メトキシフェニル基等が挙げられる。
置換されていてもよいアルコキシ基としては、上記置換基で置換されていてもよいアルコキシ基を示し、具体的には、例えば上記アルコキシ基やベンジロキシ基、フェノキシ基、トリフルオロメトキシ基等が挙げられる。
【００５２】
上記一般式（Ｉ）中のＲ1として、好ましくは炭素数１〜４のアルキル基、ベンジル基又はフェニル基であり、より好ましくは炭素数１〜４のアルキル基であり、特に好ましくはメチル基又はエチル基である。
また、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4として、好ましくは水素原子、ハロゲン原子、ニトロ基、ヒドロキシ基、炭素数１〜４のアルキル基または炭素数１〜４のアルコキシ基であり、より好ましくは水素原子である。更に、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は共に水素原子が好ましい。
【００５３】
上記一般式（Ｉ）で表される化合物としては、分子量が１０００以下、好ましくは７５０以下、より好ましくは５００以下のものであり、具体的には、例えば３−オキソ−３−（２’−チエニル）プロピオン酸メチルエステル、３−オキソ−３−（２’−チエニル）プロピオン酸エチルエステル、３−オキソ−３−（２’−チエニル）プロピオン酸プロピルエステル、３−オキソ−３−（２’−チエニル）プロピオン酸イソプロピルエステル、３−オキソ−３−（２’−チエニル）プロピオン酸シクロプロピルエステル、３−オキソ−３−（２’−チエニル）プロピオン酸ブチルエステル、３−オキソ−３−（２’−チエニル）プロピオン酸イソブチルエステル、３−オキソ−３−（２’−チエニル）プロピオン酸ターシャリーブチルエステル等が挙げられる。
【００５４】
上記一般式（Ｉ）で表される化合物は、Ｒｅｃｌ．Ｔｒａｖ．Ｃｈｉｍ．Ｐａｙｓ−Ｂａｓ（１９６７）８６，３７等に記載されているような公知の方法に準じてまたはそれらの組み合わせにより、容易に合成することができる。
上記一般式（ＩＩ）で表される化合物として、具体的には、例えば（Ｓ）−３−ヒドロキシ−３−（２’−チエニル）プロピオン酸メチルエステル、（Ｓ）−３−ヒドロキシ−３−（２’−チエニル）プロピオン酸エチルエステル、（Ｓ）−３−ヒドロキシ−３−（２’−チエニル）プロピオン酸プロピルエステル、（Ｓ）−３−ヒドロキシ−３−（２’−チエニル）プロピオン酸イソプロピルエステル、（Ｓ）−３−ヒドロキシ−３−（２’−チエニル）プロピオン酸シクロプロピルエステル、（Ｓ）−３−ヒドロキシ−３−（２’−チエニル）プロピオン酸ブチルエステル、（Ｓ）−３−ヒドロキシ−３−（２’−チエニル）プロピオン酸イソブチルエステル、（Ｓ）−３−ヒドロキシ−３−（２’−チエニル）プロピオン酸ターシャリーブチルエステル等が挙げられる。
【００５５】
また、反応基質となる上記一般式（Ｉ）で表される化合物は、通常、基質濃度が０．０１〜９０％ｗ／ｖ、好ましくは０．１〜３０％ｗ／ｖの範囲で用いられる。反応基質は、反応開始時に一括して添加しても良いが、酵素の基質阻害があった場合の影響を減らすと言う点や生成物の蓄積濃度を向上させるという観点からすると、連続的もしくは間欠的に添加することが望ましい。
本発明の製造方法において、式（Ｉ）のカルボニル基含有化合物（反応基質）に上記形質転換体細胞を作用させるに当たっては、該形質転換体細胞をそのまま、あるいは該形質転換体細胞処理物、例えば、該形質転換体細胞をアセトン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、トルエン等の有機溶媒や界面活性剤により処理したもの、凍結乾燥処理したもの、物理的または酵素的に破砕したもの等の細胞処理物、該形質転換体細胞中の本発明の酵素画分を粗製物あるいは精製物として取り出したもの、さらには、これらをポリアクリルアミドゲル、カラギーナンゲル等に代表される担体に固定化したものを用いることができる。
【００５６】
また、本発明の製造方法においては、補酵素ＮＡＤＰ+もしくはＮＡＤＰＨを添加するのが好ましく、通常、０．００１ｍＭ〜１００ｍＭ、好ましくは０．０１〜１０ｍＭ添加する。
上記補酵素を添加する場合には、ＮＡＤＰＨから生成するＮＡＤＰ+をＮＡＤＰＨへの再生させることが生産効率向上のため好ましく、再生方法としては、
１）宿主微生物自体のＮＡＤＰ+還元能を利用する方法、
２）ＮＡＤＰ+からＮＡＤＰＨを生成する能力を有する微生物やその処理物、あるいは、グルコース脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素、有機酸脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素など）などのＮＡＤＰＨの再生に利用可能な酵素（再生酵素）を反応系内に添加する方法、
３）形質転換体を製造するに当たり、ＮＡＤＰＨの再生に利用可能な酵素である上記再生酵素類の遺伝子を本発明のＤＮＡと同時に宿主に導入する方法が挙げられる。
【００５７】
このうち、上記１）の方法においては、反応系にグルコースやエタノール、ギ酸などを添加する方が好ましい。
また、上記２）の方法においては、上記再生酵素類を含む微生物、該微生物菌体をアセトン処理したもの、凍結乾燥処理したもの、物理的または酵素的に破砕したもの等の菌体処理物、該酵素画分を粗製物あるいは精製物として取り出したもの、さらには、これらをポリアクリルアミドゲル、カラギーナンゲル等に代表される担体に固定化したもの等を用いてもよく、また市販の酵素を用いても良い。
【００５８】
この場合、上記再生酵素の使用量としては、具体的には、本発明のカルボニル還元酵素に比較して、酵素活性で０．０１〜１００倍、好ましくは０．５〜２０倍程度となるよう添加する。
また、上記再生酵素の基質となる化合物、例えば、グルコース脱水素酵素を利用する場合のグルコース、ギ酸脱水素酵素を利用する場合のギ酸、アルコール脱水素酵素を利用する場合のエタノールもしくはイソプロパノールなどの添加も必要となるが、その添加量としては、反応原料であるカルボニル基含有化合物に対して、０．１〜２０倍モル当量、好ましくは１〜５倍モル当量添加する。
また、上記３）の方法においては、本発明のＤＮＡと上記再生酵素類のＤＮＡを染色体に組み込む方法、単一のベクター中に両ＤＮＡを導入し、宿主を形質転換する方法及び両ＤＮＡをそれぞれ別個にベクターに導入した後に宿主を形質転換する方法を用いることができるが、両ＤＮＡをそれぞれ別個にベクターに導入した後に宿主を形質転換する方法の場合、両ベクター同士の不和合性を考慮してベクターを選択する必要がある。
【００５９】
単一のベクター中に複数の遺伝子を導入する場合には、プロモーター及びターミネーターなど発現制御に関わる領域をそれぞれの遺伝子に連結する方法やラクトースオペロンのような複数のシストロンを含むオペロンとして発現させることも可能である。
本発明の製造方法は、反応基質及び本発明の形質転換体および／または該形質転換体処理物、並びに、必要に応じて添加された各種補酵素及びその再生システムを含有する水性媒体中もしくは該水性媒体と有機溶媒との混合物中で行われる。
【００６０】
上記、水性媒体としては、水又は緩衝液が挙げられ、また、有機溶媒としては、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、ｎ−ヘキサン、ジメチルスルホキシド等、反応基質の溶解度が高い物を使用することができる。
本発明の方法は、通常４〜６０℃、好ましくは１０〜４５℃の反応温度で、通常ｐＨ３〜１１、好ましくはｐＨ５〜８で行われる。また、膜リアクターなどを利用して行うことも可能である。
本発明の方法により生成する光学活性アルコールは、反応終了後、反応液中の菌体やタンパク質を遠心分離、膜処理などにより分離した後に、酢酸エチル、トルエンなどの有機溶媒による抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、晶析等のなどを適宜組み合わせることにより精製を行うことができる。
【００６１】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
（１）カルボニル還元酵素の単離
エクシグオバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ） ｓｐ． ＭＣＩ４３２２株を６ＬのＬＢ培地（トリプトン（Ｄｉｆｃｏ社製）１０ｇ、酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）５ｇ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ）で培養し、遠心分離により菌体を調製した。得られた湿菌体２４ｇを１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）、０．１ｍＭ ＤＴＴ（以下これを単に「バッファー」と称する）で懸濁し、超音波破砕機（２０１Ｍ・久保田商事社製）により破砕後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液をバッファーに対して透析し、ＨｉＰｒｅｐ １６／１０ Ｑ ＦＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）での陰イオン交換クロマトグラフィーを行った。塩化ナトリウム０〜０．６Ｍのグラジエント溶出で、カルボニル還元酵素活性は、０．１５Ｍ 塩化ナトリウム付近にピークが見られた。
溶出した活性画分を回収し、バッファーに対して透析後、ＭｏｎｏＱ ＨＲ１０／１０（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）での陰イオン交換クロマトグラフィーを行った。塩化ナトリウム０〜０．４Ｍのグラジエント溶出で、カルボニル還元酵素活性は、０．２Ｍ塩化ナトリウム付近にピークが見られた。
【００６２】
溶出したピーク部分を回収し、限外濾過により濃縮した後Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ ＨＲ１０／３０（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用い、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含むバッファーでゲル濾過を行った。ゲル濾過により得られた活性画分の分子量は、約１２０，０００Ｄａであった。
溶出したピーク部分を回収し、Ｃｅｒａｍｉｃ Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ，Ｔｙｐｅ−ＩＩ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）でのハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーを行った。リン酸カリウム１０〜４００ｍＭのグラジエント溶出で、カルボニル還元酵素活性は、５０ｍＭ リン酸カリウム付近にピークが見られた。
上記活性画分をポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により解析した結果、ほぼ単一バンドであり、その分子量は約２８，０００Ｄａであった。
【００６３】
（２）カルボニル還元酵素のアミノ酸配列の解析
上記（１）で得られたカルボニル還元酵素を含む画分を脱塩、濃縮後、エドマン法によりＮ末端アミノ酸の解析を行い４０残基のＮ末端アミノ酸配列を決定した。結果を配列番号３に示す。
また、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）後のカルボニル還元酵素のバンドを切り出し、リジルエンドペプチダーゼを用いたゲル内消化法（タンパク質実験ノート・下、羊土社）により得たペプチドを逆相ＨＰＬＣ（アマシャム バイオサイエンス社製 μＲＰＣ Ｃ２／Ｃ１８ ＰＣ３．２／３）を用い、ペプチドを分離し、分取した。分取したペプチドピーク２種をそれぞれエドマン法によりアミノ酸配列の解析を行った。それぞれのアミノ酸配列は配列番号４，５に示した。
【００６４】
（３）エクシグオバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ．ＭＣＩ４３２２由来の本発明ＤＮＡの配列解析及び形質転換体の作製
エクシグオバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ．ＭＣＩ４３２２をＬＢ培地で培養し、菌体を調製した。
【００６５】
菌体からのゲノムＤＮＡをＤｎｅａｓｙ ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて抽出、精製した。
上記（２）で得られた配列番号３のＮ末端アミノ酸配列を元にセンスデジェネレイト（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）プライマー及び配列番号５の内部アミノ酸配列を元にアンチセンスのデジェネレイト（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）プライマーを計２種類合成した。それぞれの塩基配列を配列番号６，７に示した。この２種のプライマーを用いて、エクシグオバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ．ＭＣＩ４３２２のゲノムＤＮＡに対してデジェネレイト（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）ＰＣＲを行ったところ、約５００ｂｐの増幅断片が認められた。
このＤＮＡ断片を、アガロースゲル電気泳動を行い、約５００ｂｐの断片のバンドを切り出しＱＩＡＥＸ ＩＩ ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）にて精製して回収した。得られたＤＮＡ断片を、ｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にライゲーションし、大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡社製）を形質転換した。形質転換株を、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ寒天培地で生育させ、いくつかのコロニーを用いて、Ｔ７プライマー（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）とＳＰ６プライマー（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いたコロニーダイレクトＰＣＲを行い、挿入断片のサイズを確認した。目的とするＤＮＡ断片が挿入されていると考えられるコロニーを、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ培地で培養し、ＱＩＡＰｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉ Ｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）によりプラスミドを精製した。
精製したプラスミドを用いて、挿入ＤＮＡの塩基配列をダイターミネーター法により解析した。決定された塩基配列を配列番号８として示した。
【００６６】
上記塩基配列を元に設計した配列番号９および１０に示す２種の遺伝子特異的プライマーを用いて、エクシグオバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ．ＭＣＩ４３２２のゲノムＤＮＡに対し、文献法に従ってｉｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲを行った。
Ｉｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲに用いた制限酵素はＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＫｐｎＩ、ＳｐｈＩの５種であったが、ＥｃｏＲＩの系で約５ｋｂｐの断片が増幅した。
増幅断片をアガロースゲル電気泳動を行い、約５ｋｂｐの断片のバンドを切り出しＱＩＡＥＸ ＩＩ ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）にて精製して回収した。得られたＤＮＡ断片を鋳型とし、ダイターミネーター法による塩基配列の解析を行った。解析した１８８２ｂｐの断片の塩基配列を配列番号１１として示す。
こうして得られた配列番号１１に記載の塩基配列と、配列番号３，４および５のアミノ酸配列の情報を元に推定されたＯＲＦ全長の塩基配列を配列番号２に、該ＤＮＡがコードするアミノ酸配列を配列番号１に示した。
【００６７】
引き続き、上記配列番号１１に記載の配列を元に、クローニング用のプライマーとして配列番号１２に記載の塩基配列及び配列番号１３に記載の塩基配列を合成し、上記プライマーを各５０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ各１０００ｎｍｏｌ、エクシグオバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ．ＭＣＩ４３２２のゲノムＤＮＡ ２５０ｎｇ、ＥｘＴａｑ ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ用１０×緩衝液（タカラバイオ社製）１０μＬ、ＥｘＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ５ユニット（タカラバイオ社製）を含む１００μＬの反応液を用い、変性（９５℃、１分）、アニール（４８℃、１分）、伸長（７２℃、１分）を２５サイクル、ＧｅｎｅＡｍｐ ２４００ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて行った。ＰＣＲ反応液の一部をアガロースゲル電気泳動により解析した結果、特異的と思われるバンドが検出できた。
【００６８】
上記で検出されたバンド部分をＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）にて回収した。回収したＤＮＡ断片を制限酵素ＰｓｔＩとＥｃｏＲＩで消化し、アガロースゲル電気泳動を行い、目的とするバンドの部分を切り出し、再度、Ｑｉａｇｅｎ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）により精製後回収した。得られたＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＩ、及びＰｓｔＩで消化したｐＫＫ２２３−３とＴａｋａｒａ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて、ライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。
【００６９】
形質転換体をアンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ寒天培地上で生育させ、コロニーダイレクトＰＣＲを行い、挿入断片のサイズを確認した。
目的とするＤＮＡ断片が挿入されていると考えられる形質転換体を５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地で培養し、ＱＩＡＥＸ ＩＩ ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてプラスミドを精製し、ｐＥｘＳＤＲ１とした。
【００７０】
プラスミドに挿入したＤＮＡの塩基配列をダイターミネーター法により解析したところ、挿入されたＤＮＡ断片は、配列番号２に記載の塩基配列を有しており、該ＤＮＡには配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在した。
配列番号１に記載のアミノ酸配列を用いてＤＤＢＪを対象にＢＬＡＳＴ ｐｒｏｇｒａｍを用いてホモロジー検索を行った結果、既知のタンパク質の中でもっとも高いホモロジーを示したのは、クロストリジウム アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）のＯｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＡＫ７６７４８、配列番号１６）であり、５７％の相同性を示した。
【００７１】
（４）本発明のＤＮＡによって形質転換した大腸菌を用いた（Ｓ）−３−ヒドロキシ−３−（２’−チエニル）プロピオン酸エチルエステル合成
上記（３）で得られた形質転換体をアンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）、０．１ｍＭ イソプロピル β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含むＬＢ培地で３７℃で１７時間生育させ、得られた菌体ブロス１ｍＬを遠心分離により集菌後、下記に示す方法により、３−オキソ−３−（２’−チエニル）プロピオン酸エチルエステルを基質として還元活性を確認した。
上記菌体に２００μＬの反応液（０．６ｇ／Ｌ ＮＡＤＰ+（オリエンタル酵母社製）、５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）、０．０４Ｍ グルコース、０．２ｇ／Ｌグルコースデヒドロゲナーゼ（天野製薬社製、７６ｕｎｉｔ／ｍｇ）、０．０２Ｍ ３−オキソ−３−（２’−チエニル）プロピオン酸エチルエステル）を添加後３０℃で２０時間振とう反応させた。反応終了後の反応液を酢酸エチル抽出、濃縮し、（Ｓ）−３−ヒドロキシ−３−（２’−チエニル）プロピオン酸エチルエステルを定量した。
【００７２】
定量は濃縮液を２−プロパノールで溶解し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて測定した。ＨＰＬＣの条件は以下の通りである。
カラム： Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ ＡＤ−ＲＨ（ダイセル化学社製） ３５℃
溶離液： １０ｍＭ リン酸カリウムバッファー ｐＨ６．０／アセトニトリル＝７０／３０
流速： １ｍｌ／ｍｉｎ
検出： ＵＶ２４５ｎｍ
この結果、（Ｓ）−３−ヒドロキシ−３−（２’−チエニル）プロピオン酸エチルエステルの収量は７６３μｇであり、収率は９５．４％、光学純度は９９．８％ｅ．ｅ．以上であった。
また該遺伝子を含まないプラスミドｐＫＫ２２３−３を持つ大腸菌を上記と同様の方法で培養し、反応させてみたが上記生成物は認められなかった。
【００７３】
（５）クロストリジウム アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）由来Ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＡＡＫ７６７４８）の形質転換体作製
上記（３）で決定したエクシグオバクテリウム オーランティアカム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｍ） ＤＳＭ ６２０８由来の本発明のＤＮＡと高い相同性を示した、クロストリジウム アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）由来Ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＡＫ７６７４８、配列番号１６）のＤＮＡ配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＥ００１４３８、配列番号１７）を元に配列番号：１４および１５に記載の塩基配列を合成し、上記プライマーを各５０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ各１０００ｎｍｏｌ、クロストリジウム アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ８２４のゲノムＤＮＡ ２５０ｎｇ 、ＥｘＴａｑ ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ用１０×緩衝液（タカラバイオ社製）１０μＬ、ＥｘＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ５ユニット（タカラバイオ社製）を含む１００μＬの反応液を用い、変性（９５℃、１分）、アニール（５３℃、１分）、伸長（７２℃、１分）を２５サイクル、ＧｅｎｅＡｍｐ２４００ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製） を用いて行った。ＰＣＲ反応液の一部をアガロースゲル電気泳動により解析した結果、特異的と思われるバンドが検出できた。
【００７４】
上記で検出されたバンド部分をＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）にて回収した。回収したＤＮＡ断片を制限酵素ＰｓｔＩとＥｃｏＲＩで消化し、アガロースゲル電気泳動を行い、目的とするバンドの部分を切り出し、再度、Ｑｉａｇｅｎ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製） により精製後回収した。得られたＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＩ、及びＰｓｔＩで消化したｐＫＫ２２３−３とＴａｋａｒａ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて、ライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。
【００７５】
形質転換体をアンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ寒天培地上で生育させ、コロニーダイレクトＰＣＲを行い、挿入断片のサイズを確認した。
目的とするＤＮＡ断片が挿入されていると考えられる形質転換体を５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地で培養し、ＱＩＡＰｒｅｐＳｐｉｎ Ｍｉｎｉ Ｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてプラスミドを精製し、ｐＣａＳＤＲ１とした。
プラスミドに挿入したＤＮＡの塩基配列をダイターミネーター法により解析したところ、挿入されたＤＮＡ断片は、配列番号１７に記載の塩基配列と一致した。
【００７６】
（６）クロストリジウム アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）由来Ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＡＡＫ７６７４８）をコードするＤＮＡによって形質転換した大腸菌を用いた（Ｓ）−３−ヒドロキシ−３−（２’−チエニル）プロピオン酸エチルエステル合成
上記（５）で得られた形質転換体をアンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）、０．１ｍＭイソプロピル β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含むＬＢ培地で３７℃で１７時間生育させ、得られた菌体ブロス１ｍＬを遠心分離により集菌後、下記に示す方法により、３−オキソ−３−（２’−チエニル）プロピオン酸エチルエステルを基質として還元活性を確認した。
上記菌体に２００μＬの反応液（０．６ｇ／Ｌ ＮＡＤＰ+（オリエンタル酵母社製）、５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）、０．０４Ｍ グルコース、０．２ｇ／Ｌグルコースデヒドロゲナーゼ（天野製薬社製、７６ｕｎｉｔ／ｍｇ）、０．０２Ｍ ３−オキソ−３−（２’−チエニル）プロピオン酸エチルエステル）を添加後３０℃で２０時間振とう反応させた。反応終了後の反応液を酢酸エチル抽出、濃縮し、（Ｓ）−３−ヒドロキシ−３−（２’−チエニル）プロピオン酸エチルエステルを定量した。
定量は濃縮液を２−プロパノールで溶解し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて測定した。
この結果、（Ｓ）−３−ヒドロキシ−３−（２’−チエニル）プロピオン酸エチルエステルの収量は４５０μｇであり、収率は５６．３％、光学純度は９９．８％ｅ．ｅ．以上であった。
【００７７】
【発明の効果】
医薬、農薬等の中間体原料として産業上有用な化合物である光学活性アルコール類を高光学純度かつ高収率で得ることができる製造方法を提供する。
【００７８】
【配列表】
Claims (9)
- 下記（Ａ）〜（Ｂ）の何れかのアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列
（Ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１から複数個のアミノ酸が欠失、付加または置換されているアミノ酸配列であって、カルボニル基を還元して光学活性アルコールを合成する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列 - 下記（Ａ）〜（Ｄ）の何れかの塩基配列を有するＤＮＡ。
（Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする塩基配列
（Ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から複数個のアミノ酸が欠失、付加または置換されているアミノ酸配列であって、カルボニル基を還元して光学活性アルコールを合成する能力を有するタンパク質をコードする塩基配列
（Ｃ）配列番号２に記載の塩基配列
（Ｄ）配列番号２に記載の塩基配列において、１から複数個の塩基が欠失、付加または置換されている塩基配列であって、カルボニル基を還元して光学活性アルコールを合成する能力を有するタンパク質をコードする塩基配列 - 請求項２に記載のＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡ。
- 請求項３に記載の組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体。
- 請求項２に記載のＤＮＡを染色体ＤＮＡに組み込んで得られる形質転換体。
- 下記一般式（Ｉ）
（Ａ）請求項４または５に記載の形質転換体。 - 下記一般式（Ｉ）
- Ｒ２、Ｒ３及びＲ４が、共に水素原子であることを特徴とする請求項６または７に記載の製造方法。
- Ｒ１が炭素数１〜４のアルキル基であることを特徴とする請求項６〜８のいずれかに記載の製造方法。
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