CN102268393B - 一株微小杆菌属菌株mg2及其应用 - Google Patents

一株微小杆菌属菌株mg2及其应用 Download PDF

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本发明涉及一株微小杆菌属菌株MG2及其应用，属环境微生物应用领域。本发明通过常规的方法从自然界中进行菌株分离、纯化、培养，获得该野生型微小杆菌属(Exiguobacterium sp.)菌株MG2。MG2菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号：CGMCC NO.4866。MG2菌株具有很高的脱色高效性，能作为降解三苯甲烷类染料孔雀绿的应用。本发明的微小杆菌属菌株MG2同已报道的其它降解孔雀绿的菌株相比，其优点在于：具有很高的脱色高效性，还能扩宽降解染料的菌种范围，使得环境中的孔雀绿、结晶紫多了一条人工降解的途径，降低了治理环境污染的成本。

Description

一株微小杆菌属菌株MG2及其应用
技术领域：
本发明涉及一株微小杆菌属菌株MG2及其应用，属环境微生物应用领域。
背景技术：
随着科技的发展，合成染料被广泛应用于纺织、皮革、食品、日用化工等行业中。但这些染料通常含有复杂的芳香环结构、化学稳定性高、环境可降解性低，且多数染料及其代谢中间产物具有致突变性、致癌性和其他毒性，这也使得染料成为重要的环境污染物之一。作为污染源，染料的首先特点就是污染量大。据统计，目前世界染料年产量约为80～90万吨，我国染料年产量达15万吨，位居世界前列。在染料的使用过程中大约有10％～15％被直接排放到污水处理系统或环境中。其废水治理率不足30％，治理合格率仅57.6％。因此，仅从废水治理方面来看，染料行业的环境保护任务也是相当艰巨的。
其中的三苯甲烷类染料是以三苯甲烷为母体的一类染料，其分子结构是中心碳原子上连有三个苯环，不同的侧链基团决定了不同染料结构和一些相应的特性。这类染料具有着色力强、色泽鲜艳等特点，因而被广泛用于纺织、造纸、医药、食品和化妆品等领域。较常见的有：孔雀绿、结晶紫、碱性品红等。此外，它们还被广泛用做治疗皮肤病的药剂。但体外试验表明，这些化合物具有有丝分裂毒性。孔雀绿在浓度低至0.1mg/L时，对哺乳动物细胞都是高毒性的，能促进肝脏肿瘤的形成以及导致小白兔和鱼的异常增殖。因此，必须采取有效的措施来将染料的危害降到最低。
对于染料处理，目前各国主要有：物理、化学和生物的方法。但物化法的运行成本通常较高，效率较差，且容易产生二次污染。生物降解染料废水具有成本低，无二次污染，生态恢复性好等优点，已成为国内外学者研究的热点。生物降解处理是一种急待开发的新技术，因而筛选高效广谱的染料脱色菌株具有重要的理论和实用价值。
微小杆菌属(Exiguobacterium sp.)是一类广泛存在于环境中的杆状革兰氏阳性细菌。Exiguobacterium sp.MG2是我们实验室从弥勒河流水域中分离、筛选得到的一株高效降解孔雀绿的菌株。关于其对三苯甲烷类染料的脱色活性和相关机理尚未见报道。
发明内容：
本发明的目的在于提供一株微小杆菌属菌株MG2及其应用，通过对微小杆菌MG2的研究，开发生物脱色剂。
本发明筛选到的一株微小杆菌属菌株MG2，其特征为：幼龄培养物为杆菌，老龄培养物为球状，革兰氏阳性。在LB平板培上菌落呈圆形，浅橙红色，平坦，不透明，色素不扩散，表面湿润，边缘较整齐。研究还发现，该菌株具有高效的降解三苯甲烷类染料孔雀绿和结晶紫的活性。
本发明人在开展染料脱色机理的研究中，从弥勒河流水域中分离的细菌中按活性筛选的方法得到该微小杆菌属菌株MG2，发现其对三苯甲烷类染料具极高的脱色活性。该菌株于2011年5月16日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。(CGMCC)对菌株进行鉴定，确定为微小杆菌属(Exiguobacterium sp.)，根据其功能我们将其命名为微小杆菌MG2(Exiguobacterium sp.MG2)，保藏号：CGMCC NO.4866。
本发明是这样实现的：
一、筛选纯化出微小杆菌属菌株MG2
微小杆菌属MG2的纯化、培养方法(以下为重量百分比)：
1、平板纯化培养
LB平板培养基配方为：0.5％Yeast Extract，1％Tryptone，1％NaCl，1.5-2％Agar，pH自然。将混合菌体接种到平板培养基上，37℃下培养，获得单菌落。
2、液体扩大培养
LB液体培养基配方为：0.5％Yeast Extract，1％Tryptone，1％NaCl，余下的为水，pH自然。将平板上的单菌落接种进液体培养基，过夜培养直到OD600为0.50～0.60。恒温摇床温度为37℃，转速为190rpm。
二、微小杆菌属菌株MG2对孔雀绿的脱色试验：
1、不同菌株脱色能力的测试
脱色培养基成分为：0.5％Yeast Extract，1％Tryptone，1％NaCl，40mg/L的孔雀绿。将经过过夜培养的菌液按一定的接种量接种进脱色培养基，定时测试不同菌株的脱色率，筛选出其中脱色能力最强的一株。
2、脱色率的计算方法
孔雀绿的特征性吸收波峰为617nm，脱色率就是通过紫外-可见光扫描式分光光度仪测试在最大吸收波峰处峰值的降低情况来进行计算的。将脱色后的培养液离心处理(12,000rpm，2分钟)，上清在617nm处测吸光度。脱色率的计算公式为：
脱色率(％)＝100(A-B)/A
其中A是未经细菌脱色的617nm吸光度
    B为细菌脱色后的617nm吸光度
3、微小杆菌属MG2的脱色率实验
(1)不同染料浓度下的脱色率实验方法
MG2接种在含90ml LB液体培养基的250ml三角瓶中过夜培养，温度37℃，转速190rpm，使最终菌体的OD600为0.50～0.60。加入10ml已进行灭菌处理的孔雀绿溶液，使其终浓度分别为500mg/l、1000mg/l、1500mg/l、2000mg/l、2500mg/l，然后置190rpm、37℃的恒温摇床进行脱色培养，每隔一段时间取样进行脱色率的测试。
(2)pH对脱色率影响实验，方法如下：
菌种接种在含90ml LB液体培养基的250ml三角瓶中过夜培养，温度37℃，转速190rpm，使最终菌体的OD600为0.35～0.40。加入10ml已进行灭菌处理的孔雀绿溶液，使其终浓度为50mg/l，用HCl和NaOH将其最终PH分别调至5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，然后置于190rpm、37℃的恒温摇床脱色培养，每隔一段时间取样进行脱色率的测试。
4、脱色机理的探究实验
将细菌在含90ml LB培养基的250ml的三角瓶中37℃、190rpm过夜培养，当OD600为0.60时，8,000rpm离心10分钟，将离心下的菌体加入到50mg/l孔雀绿溶液中。上清10,000rpm离心20分钟以充分地去除菌体。两次离心后的上清中加入孔雀绿使其终浓度为50mg/l，在不同的时间段内取样测脱色活性。
5、实验结果
从现在已有的报道来看，能对孔雀绿脱色的最高浓度是500μmol/l(约182mg/l)，Pseudomonas otitidis W/L3在12小时内能降解到95％，而微小杆菌MG2在孔雀绿的浓度高达2500mg/L时，0.5小时对其脱色率可高达50％；而2小时后其脱色率则可以超过90％以上。具体数据如下表。pH6-8为该菌株脱色的适宜条件，其中pH为7左右的中性条件为最佳的脱色条件。菌体和胞外物质相比，脱色主要通过菌体自身来实现，在上清的脱色率为32.2％时，菌体的脱色率可达97.3％。
表 微小杆菌MG2在不同孔雀绿浓度下的脱色率
Figure BSA00000536742000031
本发明的微小杆菌属菌株MG2同已报道的其它降解孔雀绿的菌株相比，其优点在于：具有很高的脱色高效性，还能扩宽降解染料的菌种范围，使得环境中的孔雀绿、结晶紫多了一条人工降解的途径，降低了治理环境污染的成本。
附图说明：
图1微小杆菌属菌株MG2的菌落形态照片及其光镜下的菌体照片。其中图1-a为微小杆菌属菌株MG2微小杆菌属菌株MG2的菌落形态；图1-b为光镜观察的微小杆菌属菌株MG2，幼龄时为杆状，老龄时为球状。
图2微小杆菌属菌株MG2在不同孔雀绿浓度下的脱色率。
图3pH对微小杆菌属菌株MG2脱色率的影响。
具体实施方式：
以下是本发明的实施例，但本发明的内容并不局限于此。
实施例一：菌株的筛选、纯化
将未分纯的菌体接种到LB平板上，配方为：0.5％Yeast Extract，1％Tryptone，1％NaCl，1.5-2％Agar，pH自然。37℃培养过夜，挑取其中的单菌落再次在LB平板上划线，直到确定分纯为止。将分纯的菌落分别进行对孔雀绿的脱色实验，脱色培养基成分为：0.5％Yeast Extract，1％Tryptone，1％NaCl，50mg/L的孔雀绿。选取其中脱色能力最强的一株，通过菌株鉴定后确定其为Exiguobacterium sp.，根据其功能，我们将其命名为微小杆菌属菌株MG2。
实施例二：pH对微小杆菌属菌株MG2的脱色率影响实验
将MG2菌株接种到含90ml LB液体培养基的250ml三角瓶中，培养基配方为：0.5％Yeast Extract，1％Tryptone，1％NaCl，pH自然。过夜培养，直到OD600为0.50～0.60。无菌接入10ml 500mg/l的孔雀绿(终浓度为50mg/l)后，用HCl和NaOH调其PH为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，然后置于37℃的恒温摇床上进行脱色培养，转速为190rpm。对照组不接菌。每隔一定时间取样1ml，12,000rpm离心2分钟，在617nm处测吸光度，并利用公式计算出脱色率，所用公式为：脱色率(％)＝100(对照组吸光度-实验组吸光度)/对照组吸光度

Claims (2)

1.一株微小杆菌属(Exiguobacterium sp.)菌株MG2，其保藏号为：CGMCCNO.4866。
2.权利要求1所述的微小杆菌MG2菌株降解三苯甲烷类染料孔雀绿的应用。
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