CN103937723B - 海微小杆菌及微生物菌剂和它们的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种海微小杆菌(Exiguobacterium marinum)，其保藏编号为CGMCC NO.8841。本发明还提供了一种微生物菌剂，该微生物菌剂包含培养基和菌体，所述菌体包括保藏编号为CGMCC NO.8841的海微小杆菌。本发明还提供了如上所述的海微小杆菌和如上所述的微生物菌剂在降解石油烃中的应用。通过上述技术方案，本发明可以更加有效地提高治理海洋石油污染的效率。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种海微小杆菌、一种微生物菌剂和它们的应用。
背景技术
海洋溢油的频繁发生不仅给海洋养殖业、旅游业等造成巨大的经济损失，还会对海洋生态环境及人类健康造成长远的负面影响。因此，如何消除海洋溢油污染、修复受损海洋生态环境成为海洋环境保护的重要内容之一。随着石油的海上开采和运输的发展，海洋石油污染的问题日趋严重。例如钻井平台倾覆、输油管道爆裂或油轮失事，都会导致大量石油泄漏到海洋环境中，如不采取科学有效的应对措施予以清除，都会造成难以估量的海洋生态灾难。
实践证明，海洋石油污染一旦发生，如能采取有效措施，损失就会小得多。迄今为止，海面油污的处理大致分为物理处理法、化学处理法和生物处理法三种。物理处理法主要采用的设备包括：拦油栅、浮油回收船、撇油器、吸油栏、消油剂喷洒装置、浮动油囊、轻便储油器、油拖网等；化学处理法是喷洒各种化学药剂，如分散剂、去垢剂、洗涤剂和其他表面活性剂等，采用这种方法能够把海面的浮油分散成极小的颗粒，使其在海水中乳化、分散、溶解或沉降到海底；生物处理法是根据某些微生物具有氧化和分解石油的能力，来清除海中的石油。
其中，生物处理法由于具有成本低、较彻底、无二次污染等优点，逐渐成为处理溢油的一种有效途径。但是生物处理法的效率受到微生物的石油烃降解速率的限制，而目前能够降解石油烃的微生物的降解速率仍然较低。
发明内容
为了克服现有的微生物菌株降解石油烃的速率较低的缺陷，本发明提供了一种海微小杆菌，该海微小杆菌(Exiguobacterium marinum)的保藏编号为CGMCC NO.8841。
本发明还提供了一种微生物菌剂，该微生物菌剂包含培养基和菌体，所述菌体包括保藏编号为CGMCC NO.8841的海微小杆菌。
本发明还提供了如上所述的海微小杆菌和如上所述的微生物菌剂在降解石油烃中的应用。本发明还提供了如上所述的海微小杆菌和如上所述的微生物菌剂在降解原油中的应用。
通过上述技术方案，本发明的微生物菌株能够以较高的速率降解石油烃，从而提高了治理海洋石油污染的效率。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
生物材料保藏
本发明的海微小杆菌(Exiguobacterium marinum)是本发明的发明人从山东烟台渤海采集的海岸带冻结沉积样品中分离的纯培养物，其保藏编号为CGMCC NO.8841，保藏日期为2014年2月21日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为海微小杆菌(Exiguobacteriummarinum)。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
本发明提供了一种海微小杆菌，该海微小杆菌(Exiguobacteriummarinum)的保藏编号为CGMCC NO.8841。
本发明还提供了一种微生物菌剂，该微生物菌剂包含培养基和菌体，所述菌体包括保藏编号为CGMCC NO.8841的海微小杆菌。
其中，所述微生物菌剂中含有的菌体的量可以在很大范围内改变，优选情况下，每克所述微生物菌剂所含的总活菌数可以为(2-300)×108CFU。
根据本发明，所述培养基的种类可以在很大范围内改变，可以为各种能够用于培养海微小杆菌的培养基，例如，可以为牛肉膏蛋白胨培养基、肉汤培养基、LB培养基等常用培养基作为种子培养基，用于菌种的保存；而发酵的培养基一般用于生产，这些培养基的种类也为本领域技术人员所公知。上述培养基能够商购得到或者根据“微生物培养基手册”(MicrobiologyCulture Media Manual)的记载制备得到。例如，种子培养基可以为牛肉膏蛋白胨培养基，其含有1-3g/L的牛肉膏、5-15g/L的蛋白胨、3-8g/L的氯化钠和15-20g/L的琼脂。例如发酵培养基可以含有：40-150g/L的豆饼粉、0.5-8g/L的氯化钠、0.5-5g/L的碳酸钙、2-10g/L的磷酸二氢钾和1-10g/L的硫酸亚铁。
其中，上述各种培养基可以按照常规的灭菌方法进行灭菌后备用，例如在115-125℃和1.5-2个标准大气压的条件下灭菌10-30分钟。
其中，为了进一步提高所述微生物菌剂降解石油烃的效果，优选地，所述微生物菌剂还含有营养盐；所述营养盐包括NaBr、H3BO3、SrCl2、NaF、酒石酸钾钠和柠檬酸三钠。更优选地，每千克微生物菌剂中含有50-100mg的NaBr、10-40mg的H3BO3、10-40mg的SrCl2、1-5mg的NaF、0.5-5g的酒石酸钾钠和10-100mg的柠檬酸三钠。
其中，所述微生物菌剂的制备方法可以包括：将海微小杆菌接种于培养基中进行培养，使得到的每克微生物菌剂的总活菌数为(2-300)×108CFU。培养的温度可以为28℃。
其中，为了进一步提高所述微生物菌剂降解石油烃的效果，优选地，所述微生物菌剂的制备方法还可以包括：将在发酵培养基中进行培养后得到的物料与营养盐混合；所述营养盐包括NaBr、H3BO3、SrCl2、NaF、酒石酸钾钠和柠檬酸三钠。更优选地，营养盐的用量使得每千克所述微生物菌剂中含有50-100mg的NaBr、10-40mg的H3BO3、10-40mg的SrCl2、1-5mg的NaF、0.5-5g的酒石酸钾钠和10-100mg的柠檬酸三钠。
本发明还提供了如上所述的海微小杆菌和如上所述的微生物菌剂在降解石油烃中的应用。
其中，所述石油烃可以包括烷烃和/或芳烃；所述烷烃的碳原子数可以为11-35，所述芳烃的碳原子数可以为10-20。
本发明还提供了如上所述的海微小杆菌和如上所述的微生物菌剂在降解原油中的应用。
以下通过实施例进一步详细说明本发明：
实施例1
本实施例用于说明本发明的海微小杆菌的培养及微生物菌剂的制备。
将保藏编号为CGMCC NO.8841的海微小杆菌(Exiguobacteriummarinum)接种到LB培养基(含10g/L的胰蛋白胨、5g/L的酵母提取物、10g/L的NaCl和余量的水)中，培养至菌密度OD600值为0.6-0.8，得到种子菌液。
将100mL上述种子菌液加入100L发酵培养基中(发酵培养基含有80g/L的豆饼粉、3g/L的氯化钠、3g/L的碳酸钙、5g/L的磷酸二氢钾和5g/L的硫酸亚铁)，在30℃下培养，在培养过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至每克培养液中的海微小杆菌的活菌数为109CFU，所得到的培养液即为本实施例的微生物菌剂。
实施例2
本实施例用于说明本发明的海微小杆菌的培养及微生物菌剂的制备。
将保藏编号为CGMCC NO.8841的海微小杆菌(Exiguobacteriummarinum)接种到LB培养基(含10g/L的胰蛋白胨、5g/L的酵母提取物、10g/L的NaCl和余量的水)中，培养至菌密度OD600值为0.6-0.8，得到种子菌液。
将100mL上述种子菌液加入100L发酵培养基中(发酵培养基含有80g/L的豆饼粉、3g/L的氯化钠、3g/L的碳酸钙、5g/L的磷酸二氢钾和5g/L的硫酸亚铁)，在30℃下培养，在培养过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至每克培养液中的海微小杆菌的活菌数为109CFU，在每kg上述得到的培养液中，加入80mg的NaBr、30mg的H3BO3、20mg的SrCl2、3mg的NaF、2g的酒石酸钾钠和50mg的柠檬酸三钠，混合后得到的物料即为本实施例的微生物菌剂。
实施例3
本实施例用于说明本发明的海微小杆菌的培养及微生物菌剂的制备。
将保藏编号为CGMCC NO.8841的海微小杆菌(Exiguobacteriummarinum)接种到LB培养基(含10g/L的胰蛋白胨、5g/L的酵母提取物、10g/L的NaCl和余量的水)中，培养至菌密度OD600值为0.6-0.8，得到种子菌液。
将100mL上述种子菌液加入100L发酵培养基中(发酵培养基含有40g/L的豆饼粉、6g/L的氯化钠、1g/L的碳酸钙、8g/L的磷酸二氢钾和8g/L的硫酸亚铁)，在30℃下培养，在培养过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至每克培养液中的海微小杆菌的活菌数为109CFU，在每kg上述得到的培养液中，加入50mg的NaBr、10mg的H3BO3、40mg的SrCl2、5mg的NaF、5g的酒石酸钾钠和100mg的柠檬酸三钠，混合后得到的物料即为本实施例的微生物菌剂。
实施例4
本实施例用于说明本发明的海微小杆菌的培养及微生物菌剂的制备。
将保藏编号为CGMCC NO.8841的海微小杆菌(Exiguobacteriummarinum)接种到LB培养基(含10g/L的胰蛋白胨、5g/L的酵母提取物、10g/L的NaCl和余量的水)中，培养至菌密度OD600值为0.6-0.8，得到种子菌液。
将100mL上述种子菌液加入100L发酵培养基中(发酵培养基含有120g/L的豆饼粉、1g/L的氯化钠、4g/L的碳酸钙、3g/L的磷酸二氢钾和2g/L的硫酸亚铁)，在30℃下培养，在培养过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至每克培养液中的海微小杆菌的活菌数为109CFU，在每kg上述得到的培养液中，加入90mg的NaBr、35mg的H3BO3、15mg的SrCl2、2mg的NaF、1g的酒石酸钾钠和15mg的柠檬酸三钠，混合后得到的物料即为本实施例的微生物菌剂。
对比例1
将购自ATCC的商品号为BAA-1283TM的微小杆菌(Exiguobacterium sp.)接种到LB培养基(含10g/L的胰蛋白胨、5g/L的酵母提取物、10g/L的NaCl和余量的水)中，培养至菌密度OD600值为0.6-0.8，得到种子菌液。
将100mL上述种子菌液加入100L发酵培养基中(发酵培养基含有80g/L的豆饼粉、3g/L的氯化钠、3g/L的碳酸钙、5g/L的磷酸二氢钾和5g/L的硫酸亚铁)，在30℃下培养，在培养过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至每克培养液中的微小杆菌的活菌数为109CFU，所得到的培养液即为本对比例的微生物菌剂。
对比例2
将购自购自ATCC的商品号为BAA-1283TM的微小杆菌(Exiguobacterium sp.)接种到LB培养基(含10g/L的胰蛋白胨、5g/L的酵母提取物、10g/L的NaCl和余量的水)中，培养至菌密度OD600值为0.6-0.8，得到种子菌液。
将100mL上述种子菌液加入100L发酵培养基中(发酵培养基含有80g/L的豆饼粉、3g/L的氯化钠、3g/L的碳酸钙、5g/L的磷酸二氢钾和5g/L的硫酸亚铁)，在30℃下培养，在培养过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至每克培养液中的微小杆菌的活菌数为109CFU，在每kg上述得到的培养液中，加入80mg的NaBr、30mg的H3BO3、20mg的SrCl2、3mg的NaF、2g的酒石酸钾钠和50mg的柠檬酸三钠，混合后得到的物料即为本对比例的微生物菌剂。
测试实施例1
本测试实施例中，在实验室环境测试实施例1-4和对比例1-2的微生物菌剂的降解石油烃的效果。
将海边泥沙(取自山东烟台莱州湾，已干燥并灭菌)、水、十六烷和菲按重量比(1000:500:20:20)混合均匀，得到模拟石油烃污染的待处理样品。
取实施例1-4和对比例1-2的微生物菌剂各20mL，分别与1kg上述待处理样品混合，在25℃避光下培养10或20天后，得到处理后的样品。用二氯甲烷萃取处理后的样品，并用气相色谱法测定处理后的样品中的十六烷和菲的残留量，并计算十六烷和菲的降解率，结果如表1所示。
表1
根据表1的数据可见，本发明的保藏编号为CGMCC NO.8841的海微小杆菌(Exiguobacterium marinum)相对于其它微小杆菌，具有突出的降解石油烃的能力。
测试实施例2
本测试实施例中，在实验室环境测试实施例1-4和对比例1-2的微生物菌剂的降解原油的效果。
将海边泥沙(取自山东烟台莱州湾，已干燥并灭菌)、水和原油(购自山东东营胜利油田)按重量比(1000:500:40)混合均匀，得到模拟原油污染的待处理样品。
取实施例1-4和对比例1-2的微生物菌剂各2L，分别与100kg上述待处理样品混合，在户外放置15天(测试地点为山东烟台莱州湾，时间为9月10日至25日)后，得到处理后的样品。用100mL二氯甲烷萃取100g处理后的样品，得到萃取液。用重量法测定原油降解率，具体操作包括将萃取液转移至烧瓶中，在40℃的条件下旋转蒸发去除二氯甲烷，称量带有残留油污的烧瓶总重，减去烧瓶本身重量，得到残留原油的重量，用降解原油的重量除以处理前原油的重量，即得到原油降解率。并用气相色谱-质谱联用法对处理前原油和残留原油中碳原子数11-35的烷烃和碳原子数10-20的芳烃进行色谱峰半定量，并计算降解率，结果如表2所示。
表2
根据表2的数据可见，本发明的保藏编号为CGMCC NO.8841的海微小杆菌(Exiguobacterium marinum)相对于其它微小杆菌，具有优异的降解原油的能力，并且芳烃降解能力优于烷烃降解能力。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (10)
1.一种海微小杆菌，其特征在于：该海微小杆菌(Exiguobacteriummarinum)的保藏编号为CGMCC NO.8841。
2.一种微生物菌剂，该微生物菌剂包含培养基和菌体，其特征在于：所述菌体为保藏编号为CGMCC NO.8841的海微小杆菌。
3.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于：每克所述微生物菌剂所含的总活菌数为(2-300)×108CFU。
4.根据权利要求2或3所述的微生物菌剂，其特征在于：所述培养基为牛肉膏蛋白胨培养基、肉汤培养基和LB培养基中的至少一种。
5.根据权利要求2或3所述的微生物菌剂，其特征在于：所述培养基含有40-150g/L的豆饼粉、0.5-8g/L的氯化钠、0.5-5g/L的碳酸钙、2-10g/L的磷酸二氢钾和1-10g/L的硫酸亚铁。
6.根据权利要求2或3所述的微生物菌剂，其特征在于：所述微生物菌剂还含有营养盐；所述营养盐包括NaBr、H3BO3、SrCl2、NaF、酒石酸钾钠和柠檬酸三钠。
7.根据权利要求6所述的微生物菌剂，其特征在于，每千克微生物菌剂中含有50-100mg的NaBr、10-40mg的H3BO3、10-40mg的SrCl2、1-5mg的NaF、0.5-5g的酒石酸钾钠和10-100mg的柠檬酸三钠。
8.权利要求1所述的海微小杆菌和权利要求2-7中任意一项所述的微生物菌剂在降解石油烃中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述石油烃包括烷烃和/或芳烃；所述烷烃的碳原子数为11-35，所述芳烃的碳原子数为10-20。
10.权利要求1所述的海微小杆菌和权利要求2-7中任意一项所述的微生物菌剂在降解原油中的应用。
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