CN110468077B - 微小杆菌Bn-88、微生物菌剂及其降解石油烃应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物领域，具体而言，提供了一种微小杆菌Bn‑88、微生物菌剂及其降解石油烃应用。本发明通过菌株筛选得到保藏编号为CGMCC NO.16607的微小杆菌Bn‑88，该菌种易培养，生长繁殖快，在降解石油烃时表现出高效性和多样性，有较好的应用前景。此外，微小杆菌Bn‑88可以降低高碱性环境的pH值，用于处理高碱性废水。

Description

微小杆菌Bn-88、微生物菌剂及其降解石油烃应用
技术领域
本发明涉及微生物领域，具体而言，涉及一种微小杆菌Bn-88、微生物菌剂及其降解石油烃应用。
背景技术
石油工业迅速发展的同时带来了许多环境问题，直接危害人类的生产和生活。石油烃的有些成分对人体有致癌变、致畸变等作用，且能通过食物链在动植物及人体内富集，被列为重点污染物。石油烃污染的环境的治理已引起许多国家的高度重视。现阶段常见的石油烃污染修复方法主要有物理法、化学法和生物法。但物理法一般设备复杂且前期准备工作量大，修复成本高，不利于技术的广泛推广应用；化学法往往是投加相应药剂，外源物质的引入，对环境有二次污染的隐患。生物法是目前最为环保的治理方案，主要方法是微生物修复和植物富集或二者联合作用。植物修复由于植物对生长环境有一定要求，适用性有限；微生物修复费用低，操作简单，无二次污染，能在去除污染物质的同时恢复环境中菌群的多样性，有利于环境生态系统的运转。石油烃污染微生物修复的关键，在于高效降解菌种的筛选。
菌株的筛选和培养：在复杂的微生物群落结构中，针对功能微生物的代谢特征，可利用选择性培养基筛选出具有特定功能的微生物。现有技术中，对石油烃降解微生物的筛选时，样品经过多次富集后，将富集液接种至以石油烃为唯一碳源的选择性培养基中进行筛选、纯化。筛选纯化一般有两种形式，一是富集液接种至液体的选择性培养基中，经多次驯化转接后，获得对石油烃有降解作用的混合菌群；二是富集液经梯度稀释后涂布于固体的选择性培养基平板上，培养后挑选单一菌落后多次转接，获得可以石油烃为唯一碳源的单一菌株。
现有的石油烃降解菌株筛选方法，筛选出的混合菌群是多种降解菌共同作用降解石油烃，作用机理复杂，且不易发酵扩大培养，易出现菌群功能效果不稳定等问题，较难实际应用推广。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种微小杆菌Bn-88，提供一种高效快速环保降解原油及石油烃的新菌株。
本发明的第二目的在于提供一种微生物菌剂，提供一种适应性更好，降解原油或石油烃效果更好的微生物菌剂。
本发明的第三目的在于提供上述微小杆菌或微生物菌剂在降解原油、高碱性废水处理或降解石油烃中的应用。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种微小杆菌Bn-88，保藏编号为CGMCC NO.16607。
一种微生物菌剂，微生物菌剂包括培养基和菌体，所述菌体包括保藏编号为CGMCCNO.16607的微小杆菌Bn-88。
进一步地，培养基包括固体培养基或液体培养基，优选为液体培养基；
优选地，培养基包括牛肉膏蛋白胨培养基、肉汤培养基或LB培养基，优选为牛肉膏蛋白胨培养基，每1L牛肉膏蛋白胨培养基包括：8-12g蛋白胨、3-7g氯化钠和2-4g牛肉膏。
进一步地，所述微小杆菌Bn-88的菌量为2×107cfu/mL-6.5×1011cfu/mL。
微小杆菌Bn-88或微生物菌剂在降解原油中的应用。
进一步地，微小杆菌Bn-88的使用量为2×107-1×1010cfu/100mg原油，优选为2×108-1×109cfu/100mg原油，进一步优选为4×108-1×109cfu/100mg原油。
进一步地，所述微小杆菌Bn-88的使用条件为pH 5.5-11.5，优选为pH6-10。
微小杆菌Bn-88或微生物菌剂在高碱性废水处理中的应用。
进一步地，所述高碱性废水的pH值不高于10；
优选地，所述高碱性废水的pH值为7-10。
微小杆菌Bn-88或微生物菌剂在降解石油烃中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明通过菌株筛选得到保藏编号为CGMCC NO.16607的微小杆菌Bn-88，该菌株为单一菌种，生长繁殖快，菌株的迟缓期短，在接种4h后可迅速增长进入对数期，20h左右即可达到稳定期。该菌株的石油烃降解能力较强，微小杆菌Bn-88可以以原油为唯一碳源迅速生长繁殖，可将石油烃降解为水和二氧化碳及其他代谢产物。该菌种易培养，生长繁殖快，在降解石油烃时表现出高效性和多样性，有较好的应用前景。此外，微小杆菌Bn-88可以降低高碱性环境的pH值，用于处理高碱性废水。
本申请提供的微生物菌剂含有保藏编号为CGMCC NO.16607的微小杆菌Bn-88，该微生物菌剂由于含有微小杆菌Bn-88所以具有上述微小杆菌Bn-88的各种优势。微生物菌剂可以是现有的降解原油或石油烃的菌剂中额外添加微小杆菌Bn-88，在原有的基础上进一步提高菌剂的处理效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例2中菌株Bn-88的菌落形态；
图2为实施例2中菌株Bn-88的菌体形态；
图3为实施例3中菌株Bn-88的生长曲线；
图4为实施例5中菌株Bn-88对石油烃的降解作用；
图5为实施例6中菌株Bn-88不同接种量对降解率的影响。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。
本发明中的微小杆菌Bn-88，于2018年10月24日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏单位地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.16607，该菌株的分类名为微小杆菌，拉丁名：Exiguobacterium sp。
该菌株为单一菌种，生长繁殖快，菌株的迟缓期短，在接种4h后可迅速增长进入对数期，20h左右即可达到稳定期。该菌株的石油烃降解能力较强，微小杆菌Bn-88可以以原油为唯一碳源迅速生长繁殖，可将石油烃降解为水和二氧化碳及其他代谢产物。该菌种易培养，生长繁殖快，在降解石油烃时表现出高效性和多样性，有较好的应用前景。此外，微小杆菌Bn-88可以降低高碱性环境的pH值，用于处理高碱性废水。
一种微生物菌剂，微生物菌剂包括培养基和菌体，菌体包括保藏编号为CGMCCNO.16607的微小杆菌Bn-88。该微生物菌剂由于含有微小杆菌Bn-88所以具有上述微小杆菌Bn-88的各种优势。微生物菌剂可以是现有的降解原油或石油烃的菌剂中额外添加微小杆菌Bn-88，在原有的基础上进一步提高菌剂的处理效果。
在优选地实施方式中，微生物菌剂的培养基可以为固体培养基或液体培养基，优选为液体培养基；微生物的培养基可以为牛肉膏蛋白胨培养基或LB培养基，优选为牛肉膏蛋白胨培养基，具体为每1L培养基包括：8-12g蛋白胨、3-7g氯化钠和2-4g牛肉膏。可以根据应用场景的不同，选择不同的培养基以扩大菌剂的应用范围。
在优选地实施方式中，微生物菌剂中微小杆菌Bn-88的菌量为2×107cfu/mL-6.5×1011cfu/mL。需要说明的是微生物菌剂中菌量的典型但非限制性的为2×107cfu/mL、5×107cfu/mL、1×108cfu/mL、5×108cfu/mL、6.5×108cfu/mL、109cfu/mL、5×109cfu/mL、1×1010cfu/mL、5×1010cfu/mL、1×1011cfu/mL或6.5×1011cfu/mL。
本发明提供的微小杆菌Bn-88或微生物菌剂在降解原油中的应用。微小杆菌Bn-88对原油中石油烃具有良好的降解作用，可以大幅度降低原油中总石油烃的含量，并不会产生二次污染。
在优选地实施方式中，微小杆菌Bn-88的使用量为2×107-1×1010cfu/100mg原油，优选为2×108-1×109cfu/100mg原油，进一步优选为4×108-1×109cfu/100mg原油。微小杆菌的使用量过少，菌群对环境的适应性降低，需要较长的降解时间；使用量过大，降解效率提升不明显，菌剂浪费。微小杆菌Bn-88的使用量典型但非限制性的为2×107cfu/100mg原油、5×107cfu/100mg原油、1×108cfu/100mg原油、5×108cfu/100mg原油、1×109cfu/100mg原油、5×109cfu/100mg原油或1×1010cfu/100mg原油。
进一步地，微小杆菌Bn-88的使用条件为pH 5.5-11.5，优选为6-10。试验发现本发明提供的微小杆菌Bn-88可耐受pH 5.5-11.5范围。微小杆菌Bn-88的使用条件中pH典型但非限制的为5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5或11。
本发明提供微小杆菌Bn-88或微生物菌剂在高碱性废水处理中的应用。本发明通过试验发现，微小杆菌Bn-88可通过生长代谢将水中较高pH降低至中性至弱碱性，可用于高碱性废水的处理。
进一步地，高碱性废水的pH值不高于10。高碱性废水的pH值具体为7-10，由于微小杆菌Bn-88在pH6-10的环境中可以正常生长，所以，对于pH值不高于10的高碱性废水具有良好的降低pH值能力。
本发明最后提供微小杆菌Bn-88或微生物菌剂在降解石油烃中的应用。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
实施例1菌株的筛选
富集培养基：即营养肉汤培养基，蛋白胨10g，氯化钠5g，牛肉膏3g，蒸馏水1000ml，如配固体培养基，需加入琼脂2％。
降解培养基：NaCl 1.0g，(NH4)2·SO4 0.617g，KH2PO4 0.50g，K2HPO41.0g，MgSO40.50g，CaCl2 0.1g，KCl 0.10g，FeSO4·7H2O 0.01g，原油1000mg，蒸馏水1000ml，pH调至7.0-7.2，如配固体培养基，需加入琼脂2％，高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌20min后，备用。
取10g东营某地中度石油烃污染土壤，加90ml蒸馏水，搅拌均匀，采用移液枪取10ml混合液接种至100mL富集培养基中，35℃，190r/min恒温培养24h后，10％接种量转接至新的富集培养基中，连续富集3代，上述富集液梯度稀释，涂布接种于含油的选择性培养基平板上，35℃恒温培养箱中培养3-5d。挑选单一菌落划线接种于降解培养基平板中培养，重复此操作2-3次进行纯化，获得可以原油为唯一碳源的单一菌株。
实施例2菌株的鉴定
通过细胞形态、菌落特征、生理生化特性和16S rRNA序列对菌株进行鉴定。
根据东秀珠，蔡妙英的《常见细菌系统鉴定手册》测定菌株的形态和生理生化特征。
菌株16S rRNA基因的克隆及序列分析方法如下：
(1)菌株基因组DNA的提取使用北京全式金生物技术有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒；
(2)采用16S rRNA基因通用引物
27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’(SEQ ID NO.1)，
1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’(SEQ ID NO.2)，
以基因组DNA为模板，进行PCR扩增。
扩增条件为：95℃预变性2min，然后95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸90s，共35个循环，最终72℃延伸10min。
PCR产物由生工生物(上海)工程股份有限公司进行测序，结果如SEQ ID NO.3所示。测序结果通过NCBI网站在GeneBank数据库进行同源性分析，确定菌株种属分类。
菌株的菌落形态如图1所示，具体可以看出：菌落呈橘黄色，圆形，表面光滑有光泽，中心显湿亮，边缘略干，且菌落色素不扩散。
菌株的菌体形态如图2所示，具体为菌体杆状，具有周生鞭毛，是一类兼性好氧的革兰氏阳性菌。
菌株生理生化特性如下表：
试验名称 结果 试验名称 结果
革兰氏染色 + 淀粉水解 +
甲基红(M.R) — 明胶液化 +
V-P测定 + 接触酶反应 —
硝酸盐还原 — 氧化酶反应 +
葡萄糖发酵 + 过氧化氢酶 +
测得菌株Bn-88的16S rRNA序列长度为1422bp。通过GeneBank数据库中序列比对，结果显示该菌株与基因库中Exiguobacterium sp菌株同源性达99％以上，结合菌体形态及生理生化特性，鉴定该菌株为微小杆菌属(Exiguobacterium sp)。
实施例3菌株Bn-88的生长曲线
菌株生长曲线绘制：挑取一环菌苔，接种至营养肉汤培养基中，30℃，150r/min，培养20h，制备成种子液。分装若干支培养管，每管分装营养肉汤培养基5mL，每支培养管按5％的接种量接种种子液，放入30℃，150r/min培养，在2h、4h、6h、8h、10h、12h、16h、20h、24h、28h、32h、36h、48h时分别取样，以比浊法测定菌体浓度。每次取3支平行样，测定OD600平均值表示该取样时间点培养液的菌体浓度。测定不同培养时间的吸光度值，绘制菌株生长曲线，结果如图3所示。
由结果可知，菌株的生长繁殖分为4个时期：迟缓期、对数期、稳定期、衰亡期。菌株迟缓期短，在接种4h后迅速增长进入对数期，在20h左右到达稳定期；由此可见，该菌株在培养基中可快速生长繁殖。
实施例4菌株Bn-88的耐酸碱性
将菌株Bn-88在不同pH培养基中进行培养，结果发现菌株Bn-88可以耐受pH5.5-11.5的范围进行生长，在生长过程中，对高碱性环境也有改善的作用，即随着菌株的生长，培养环境中的pH值呈下降趋势。
实施例5菌株Bn-88降解石油烃的作用
以实验室前期筛选的两株对石油烃有降解作用的菌株CK1和CK2为对照菌株，测定菌株Bn-88对石油烃的降解作用。
取Bn-88和两株对照菌株的菌苔接种于活化培养基中扩大培养，分别制备菌悬液：以富集培养基，30℃，150r/min培养24h，吸取10mL培养液，2000r/min离心10min，弃去上清液，再用10mL生理盐水洗涤沉淀，混匀，再次离心，如此重复3次，以除去菌种培养液中营养物质。用10mL生理盐水混匀，制成降解菌种菌悬液(测定菌含量约为2×108cfu/mL)。
取2mL各菌种菌悬液分别接种至100mL(原油浓度为1000mg/L)降解培养基中，以添加2mL生理盐水为空白对照，用以消除石油烃蒸发及培养过程中其他环境因素的影响，设3次重复。35℃，190rpm/min恒温培养3d、7d。以重量法测定菌种处理和空白处理瓶中总石油烃含量，计算Bn-88和两株对照菌株处理对原油的降解率。
降解率(％)＝(M空白-M菌)/M空白×100％；
菌株Bn-88和两株对照菌株CK1、CK2对石油烃的降解作用见图4。由结果可知，3株菌中，菌株Bn-88对石油烃的降解率最高，培养3d、7d的降解率都高于其他两株降解菌。且该菌株在培养3d时就能达到较高的降解率为61.11％，培养7d时降解率达到72.57％；而对照菌株在培养3d时对石油烃的降解率较低，培养7d时才能达到较高一些的降解率，但仍低于菌株Bn-88对石油烃的降解率。由此可见，菌株Bn-88可以快速、高效降解石油烃。
实施例6菌株Bn-88不同接种量对降解率的影响
参照实施例5中的方法制备降解菌种菌悬液后，按0.1％、0.5％、1％、2％、5％的不同接种量接种至100mL降解培养基中，设3次重复，分别添加与0.1％、0.5％、1％、2％、5％接种量等量的生理盐水为空白对照，35℃，190rpm/min恒温培养3d。测定各处理瓶中总石油烃含量。计算原油降解率，确定菌种初始接种量对降解率的影响。
菌株Bn-88对石油烃的降解率随接种量的变化曲线见图5，由图结果可见，石油烃的降解率随菌种接种量的增加而提高。接种量在0.1％-1％范围时，随着接种量的增加降解率大幅提高，在接种量为1％时，石油烃降解率达到56.58％；接种量在1％-5％范围时，降解率随接种量增加而有所提高，但增幅较小。可能的原因是接种量大，菌生长密度增加，不利于单个菌体的生长产生表面活性物质，从而影响菌体对石油烃的吸收降解。在菌种应用时，为获得较高的降解率，并综合考虑经济适用性，应将接种量控制在一定范围，根据实际需求，确定合适的接种量。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京本农投资控股有限公司
<120> 微小杆菌Bn-88、微生物菌剂及其降解石油烃应用
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ggctttctcg caaggtaccg tcaaggtacg agcattacct ctcgtacttg ttcttccctt 1020
acaacagagt tttacgatcc gaaaaccttc atcactcacg cggcgttgct ccatcagact 1080
ttcgtccatt gtggaagatt ccctactgct gcctcccgta ggagtctggg ccgtgtctca 1140
gtcccagtgt ggccgatcac cctctcaggt cggctatgca tcgtcgcctt ggtgggccat 1200
taccccacca actagctaat gcaccgcaag gccatcccaa ggtgacgccg gagcgccttt 1260
catcatcaga ccatgcggtc tgaagaacta ttcggtatta gctccgattt ctcggagtta 1320
tcccaatcct tggggcaggt tccttacgtg ttactcaccc gtccgccgct cattcccttc 1380
acttccctcc gaagagttcc gtgagcttcc tgcgctcgac tg 1422

Claims (14)

1.一种微小杆菌Bn-88，其特征在于，保藏编号为CGMCC NO.16607。
2.一种微生物菌剂，其特征在于，微生物菌剂包括培养基和菌体，所述菌体包括保藏编号为CGMCC NO.16607的微小杆菌Bn-88。
3.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，培养基包括固体培养基或液体培养基。
4.根据权利要求3所述的微生物菌剂，其特征在于，培养基为液体培养基。
5.根据权利要求3所述的微生物菌剂，其特征在于，培养基包括牛肉膏蛋白胨培养基、肉汤培养基或LB培养基。
6.根据权利要求5所述的微生物菌剂，其特征在于，培养基为牛肉膏蛋白胨培养基，每1L牛肉膏蛋白胨培养基包括：8-12g蛋白胨、3-7g氯化钠和2-4g牛肉膏。
7.权利要求2-6任一项所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微小杆菌Bn-88的菌量为2×107cfu/cm3-6.5×1011 cfu/cm3。
8.权利要求1所述的微小杆菌Bn-88或权利要求2-7任一项所述的微生物菌剂在降解原油中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，微小杆菌Bn-88的使用量为2×107-1×1010cfu/100mg原油。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，微小杆菌Bn-88的使用量为2×108-1×109cfu/100mg原油。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，微小杆菌Bn-88的使用量为4×108-1×109cfu/100mg原油。
12.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述微小杆菌Bn-88的使用条件为pH5.5-11.5。
13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述微小杆菌Bn-88的使用条件为pH6-10。
14.权利要求1所述的微小杆菌Bn-88或权利要求2-7任一项所述的微生物菌剂在降解石油烃中的应用。
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