WO2007099764A1 - 新規カルボニル還元酵素、その遺伝子、およびそれらを利用した光学活性アルコールの製造方法 - Google Patents

新規カルボニル還元酵素、その遺伝子、およびそれらを利用した光学活性アルコールの製造方法 Download PDF

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WO2007099764A1
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polypeptide
dna
seq
optically active
reductase
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Masahiro Funaki
Noriyuki Kizaki
Yoshihiko Yasohara
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Kaneka Corporation
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group

Definitions

  • Novel carbonyl reductase its gene, and method for producing optically active alcohol using the same
  • the present invention relates to a novel carboreductase, a gene thereof, and a method for producing an optically active alcohol using them.
  • Optically active alcohols such as ⁇ -hydroxyesters are useful compounds as synthetic raw materials and intermediates for agricultural chemicals and pharmaceuticals.
  • There are known methods for asymmetric reduction of j8-ketoesters using reductase to produce optically active 8-hydroxyesters Patent Documents 1 and 2, Non-Patent Documents 1 and 2).
  • Patent Document 1 JP-A-8-103269
  • Patent Document 2 International Publication No. 2003-093477
  • Non-Patent Document 1 Kataoka, M. et al., Stereoselective reduction of ethyl 4— chl oro— 3— oxo butanoate by Escherichia coli transformant cells coexpr essing the aldehyde reductase and glucose dehydrogenase genes. A ppl. Microbiol. Biotechnol., 51, 486 —490 (1999).
  • Non-Patent Document 2 Matsuyama, A. et al., Practical applications of biocatalysis for the manufacture of chiral alcohols such as (R) ⁇ 1, 3— butanedi ol by stereospecific oxidoreduction. Asymmetric Catalysis on Industrial Scale (Wiley— VCH Verlag), 217-231 (2004).
  • An object of the present invention is to provide a novel carbonyl reductase, a gene thereof, and a method for producing an optically active alcohol using them, which are different from the reductases described in the above background art documents.
  • One feature of the present invention is the following DNA (a) or (b):
  • One feature of the present invention is the DNA according to (1), which encodes a polypeptide having an activity for asymmetric reduction of 13-ketoesters.
  • One feature of the present invention is a polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by the DNA according to either (1) or (2).
  • a polypeptide comprising an amino acid sequence having 70% or more homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, and having a carbocyclic group reduced, to produce an optically active alcohol A polypeptide having the activity to be produced.
  • One feature of the present invention is a DNA encoding the polypeptide according to (4).
  • One feature of the present invention is a vector comprising the DNA according to any one of (1), (2) or (5).
  • One feature of the present invention is the vector according to (6), wherein the vector recognizes Ndel at the start codon portion of the gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • a double-stranded DNA with a site added and an EcoRI recognition site added immediately after the stop codon and plasmid pUCNT were digested with Ndel and EcoRI, respectively, and ligated to each other.
  • the vector is the constructed recombinant plasmid pNTBA.
  • One feature of the present invention is the vector according to (6), further comprising DNA encoding a polypeptide having reduced coenzyme regeneration activity.
  • One feature of the present invention is a transformant obtained by transforming a host cell with the vector according to any one of (6) to (8).
  • One feature of the present invention is the transformation according to (9), wherein the host cell is Escherichia coli. Is the body.
  • One feature of the present invention is that the polypeptide according to (3) or (4) or the transformant according to (9) or (10) is added with a carbonyl group. It is a method for producing an optically active alcohol characterized in that it is reacted with a compound having the same.
  • One feature of the present invention is that the polypeptide according to (3) or (4) or the transformant according to (9) or (10) is reacted with ⁇ -ketoesters.
  • the present invention provides a novel carbonyl reductase, a gene thereof, and a method for producing a useful optically active alcohol using them.
  • polypeptide in the embodiment of the present invention is a polypeptide having an activity of reducing a compound having a carbonyl group to produce a photoactive alcohol.
  • polypeptide in the embodiment of the present invention is a polypeptide having the activity of asymmetrically reducing j8-ketoesters to produce —hydroxyesters.
  • Such a polypeptide can be isolated from a biological force such as a microorganism having the activity.
  • a polypeptide having the amino acid sequence ability shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing encoded by the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing can be given.
  • a compound having a certain level of homology (identity) with the polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing and having a carbonyl group is reduced to produce an optically active alcohol.
  • a polypeptide that has the activity of asymmetrically reducing j8-ketoesters to form ⁇ -hydroxyesters is equivalent to the polypeptide.
  • sequence homology is determined using, for example, a homology search program FASTA (WR Pearson, WR & Lipman, DJ, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 2444— 2448 (1988)).
  • FASTA WR Pearson, WR & Lipman, DJ, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 2444— 2448 (1988)
  • FASTA WR Pearson, WR & Lipman, DJ, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 2444— 2448 (1988)
  • such a polypeptide is obtained by ligating DNA having a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and DNA that hybridizes under stringent conditions to an appropriate vector. Then, it is obtained by introducing into a suitable host cell and expressing.
  • a polypeptide consisting of an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 It can also be obtained by making substitutions, insertions, deletions or additions.
  • the number of amino acids causing substitution, insertion, deletion or addition is not limited as long as the polypeptide after the substitution does not lose the above activity, but is preferably 20 amino acids or less, more preferably 15 amino acids or less, more preferably 10 amino acids or less, and most preferably 5, 4, 3, or 2 or less.
  • the microorganism that is the origin of the polypeptide of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include bacteria belonging to the genus Baenibacillus, and particularly preferred is Baenibacillus alvei. ) NBRC3343.
  • the microorganisms can be obtained from the Biological Resource Department of the Biotechnology Headquarters, National Institute of Technology and Evaluation (Kisarazu Kisarazu 2-5-8, Chiba Prefecture).
  • a medium for culturing the microorganism that is the source of the polypeptide of the present invention as long as the microorganism grows, a normal liquid nutrient medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, organic nutrients, and the like Can be used.
  • Isolation of the polypeptide having the microbial strength that is the origin of the polypeptide of the present invention can be carried out by appropriately combining known protein purification methods. For example, it can be implemented as follows.
  • the microorganism is cultured in an appropriate medium, and the cells are collected from the culture solution by centrifugation or filtration.
  • the obtained cells are crushed by an ultrasonic crusher or a physical method using glass beads and the like, and the cell residue is removed by centrifugation to obtain a cell-free extract.
  • salting out (ammonium sulfate precipitation, sodium phosphate precipitation, etc.), solvent precipitation (protein fraction precipitation with acetone or ethanol), dialysis, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, reverse phase chromatography
  • the polypeptide of the present invention is isolated from the cell-free extract by using a technique such as ultrafiltration alone or in combination.
  • the “DNA” of the present invention is a DNA encoding the polypeptide of the above-described embodiment, and any DNA can be used as long as it can express the polypeptide in a host cell introduced according to the method described below. Any untranslated region may be included. If the polypeptide can be obtained, those skilled in the art can obtain the DNA of the present invention from the microorganism that is the origin of the polypeptide by a known method. For example, the DNA of the present invention can be obtained by the method shown below.
  • the isolated polypeptide of the present invention is digested with an appropriate endopeptidase, and the resulting peptide fragment is fractionated by reverse-phase HPLC. Then, for example, a part or all of the amino acid sequences of these peptide fragments are determined by ABI492 type sequencer (Applied Biosystems).
  • a PCR (Polymerase Chain Reaction) primer for amplifying a part of the DNA encoding the polypeptide is synthesized.
  • the chromosomal DNA of the microorganism that is the origin of the polypeptide is prepared by a conventional DNA isolation method, for example, the method of Visser et al. (Appl. Microbiol. Biotechnol., 53, 415 (2000)).
  • PCR is performed using the PCR primers described above, a part of the DNA encoding the polypeptide is amplified, and the nucleotide sequence is amplified.
  • the base sequence can be determined using, for example, ABI373A DNA Sequencer (Applied Biosystems).
  • DNA comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • a compound having a nucleotide sequence that is complementary to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and a DNA that hybridizes under stringent conditions and has a carbocyclic group is reduced.
  • a DNA encoding a polypeptide having an activity to generate an optically active alcohol or an activity to asymmetrically reduce j8-ketoesters to form ⁇ -hydroxyesters is also included in the DNA of the present invention.
  • a DNA consisting of a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and a DNA that hybridizes under stringent conditions are expressed as follows.
  • a DN force consisting of a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing forms a hybrid specifically. Say DNA.
  • the stringent conditions are, for example, 75 mM trisodium citrate, 750 mM sodium chloride, 0.5% sodium dodecyl sulfate, 0.1% ushi serum albumin, 0.1% polypyrrolidone. And 0.1% Ficoll 400 (Amersham Bioscience Co., Ltd.) in an aqueous solution consisting of 15 mM trisodium citrate, 150 mM sodium chloride, and 0.1% dodecyl after hybridization at 65 ° C. This is the condition under which cleaning is performed at 60 ° C using an aqueous solution composed of sodium sulfate. Preferably, after hybridization under the above conditions, washing is performed at 65 ° C.
  • the cleaning is performed at 65 ° C. using an aqueous solution having a compositional power of 1.5 mM trisodium citrate, 15 mM sodium sodium chloride, and 0.1% sodium dodecyl sulfate.
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 has a base sequence in which a base is substituted, inserted, deleted and Z or added, and DNA encoding a polypeptide having the activity of reducing a compound having a carbonyl group to produce an optically active alcohol, or the activity of asymmetrically reducing ketoesters to produce ⁇ -hydroxyesters Is also included.
  • the number of bases to be substituted, inserted, deleted and deleted or added is not limited as long as the polypeptide encoded by DNA does not lose the above activity, but is preferably 50 bases or less, more preferably 30 salts. No more than groups, more preferably no more than 20 bases, most preferably no more than 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, or 2 bases.
  • the “vector” of the present invention is not particularly limited as long as it can express the gene encoded by the DNA in a suitable host cell.
  • examples of such vectors include plasmid vectors, phage vectors, cosmid vectors, and shuttle vectors that can exchange genes with other host strains can also be used.
  • Such vectors usually contain regulatory elements such as lacUV5 promoter, trp promoter, trc promoter, tac promoter, lpp promoter, tufB promoter, recA promoter, pL promoter, etc., and are operable with the DNA of the present invention. It can be suitably used as an expression vector comprising an expression unit linked to the.
  • a plasmid pUC NT that can be easily obtained and prepared by those skilled in the art based on the description in International Publication No. WO94Z03613 can be suitably used.
  • the regulatory element refers to a base sequence having a functional promoter and any associated transcription element (eg, enhancer, CCAAT box, TATA box, SPI site, etc.).
  • any associated transcription element eg, enhancer, CCAAT box, TATA box, SPI site, etc.
  • operably linked refers to a promoter that regulates the expression of a gene, It means that various regulatory elements such as henhansa and genes are operably linked in the host cell. It is a matter well known to those skilled in the art that the type and kind of regulatory factor can vary depending on the host.
  • a plasmid pNTBA described later in which the DNA shown in SEQ ID NO: 1 is introduced into pUCNT, can be mentioned.
  • Examples of host cells described in the present specification include bacteria, yeasts, filamentous fungi, plant cells, animal cells, etc., but Escherichia coli, which is preferred by bacteria from the introduction and expression efficiency, is particularly preferred.
  • the vector containing the DNA of the present invention can be introduced into a host cell by a known method. When Escherichia coli is used as the host cell, the vector can be introduced into the host cell by using, for example, a commercially available E. coli HB101 competent cell (manufactured by Takara Bio Inc.).
  • Escherichia coli HB101 The bacteriological properties of Escherichia coli HB101 are described in “BIOCHEMICALS FOR LIFE SCIENCE” (Toyobo Co., Ltd., 1993, pages 116-119) and various other known literatures. It is well known.
  • the “transformant” of the present invention can be obtained by incorporating DNA encoding the polypeptide of the present invention into the vector and introducing it into a host cell.
  • the “transformant” of the present invention includes not only cultured cells but also processed products thereof.
  • the treated product here refers to, for example, cells treated with a surfactant or an organic solvent, dried cells, disrupted cells, crude cell extracts, etc., and those obtained by immobilizing them by known means. And so long as the enzymatic activity of the polypeptide of the present invention remains.
  • the transformant of the present invention can be cultured using a normal liquid nutrient medium containing a carbon source, nitrogen source, inorganic salts, organic nutrients and the like as long as it grows.
  • Examples of the transformant of the present invention include E. coli HB101 (pNTBA) described later.
  • Escherichia coli HB101 (pNTBA) has the same mycological properties as Escherichia coli HB101 except that it can produce a specific enzyme by genetic recombination.
  • the substrate for the reduction reaction includes a carbonyl group that can be reduced by the “polypeptide” of the present invention. Any compound may be used. Preferred are j8-ketoesters. Specifically, for example, methyl acetoacetate, acetoacetate ethyl, t-butyl acetoacetate, 4-chloromethyl acetoacetate, 4-ethyl chloroacetoacetate, octyl chloroacetoacetate, 4-ethyl acetoacetate acetate, 4-benzoyloxyacetate Ethyl acetate, methyl 2-oxocyclopentanecarboxylate, ethyl 2-oxocyclopentanecarboxylate, acetoacetanilide, o-acetoacetaniside, p-acetoacetoaniside, etc.
  • the substrate may be added all at the beginning of the reaction, or may be added in portions as the reaction proceeds.
  • the temperature during the reaction is usually 10 to 60 ° C, preferably 20 to 40 ° C, and the pH during the reaction is in the range of 2.5 to 9, preferably 5 to 9.
  • the amount of the enzyme source in the reaction solution may be appropriately determined according to the ability to reduce these substrates.
  • the substrate concentration in the reaction solution is preferably 0.01 to 50% ( 1 ⁇ ⁇ 7), and more preferably 0.1 to 30% (wZv).
  • the reaction is usually carried out with shaking or stirring with aeration.
  • the reaction time is appropriately determined depending on the substrate concentration, the amount of enzyme source, and other reaction conditions. Usually, it is preferable to set each condition so that the reaction is completed in 2 to 168 hours.
  • NADH reduced nicotinamide adenine dinucleotide
  • NADPH dinucleotide phosphate
  • glucose dehydrogenase as an enzyme that reduces to a reduced form
  • glucose coexisting as a substrate for reduction or formate dehydrogenase as an enzyme that reduces to reduced form, and formic acid as a substrate to reduce
  • % means “% by weight” unless otherwise specified.
  • a polypeptide having the activity of reducing acetacetolide was asymmetrically isolated from the above-mentioned Paenibacillus alvei N BRC3343 and purified to single. Unless otherwise specified, purification operations were performed at 4 ° C.
  • the reduction activity for acetoacetolide includes: lOO mM phosphate buffer (pH 6.5) containing 1.3% (vZv) dimethyl sulfoxide; 40 mM substrate acetatetolide, 0.25 mM coenzyme NADPH, and The rate of decrease in absorbance at a wavelength of 340 nm when the crude enzyme was added and reacted at 30 ° C for 1 minute was also calculated. Under this reaction condition, the activity to oxidize L mol NADPH to NADP in 1 minute was defined as lunit.
  • Bacteria were collected from the culture broth by centrifugation and washed with 0.8% aqueous sodium chloride solution.
  • the cells are suspended in a 10 mM phosphate buffer (pH 7.0) containing 5 mM 13 mercaptoethanol and 10% glycerin, disrupted using a SONIFIER250 ultrasonic crusher (manufactured by BRANSON), and then centrifuged.
  • the cell residue was removed by separation to obtain a cell-free extract.
  • the cell-free extract after nucleic acid removal treatment was pre-equilibrated with 10 mM phosphate buffer (pH 7.0) containing 5 mM ⁇ -mercaptoethanol and 10% glycerin DEAE— TOY OPEARL 650M (manufactured by Tosohichi Corporation) ) Applied to a column (400 ml) to adsorb the active fraction. After washing the column with the same buffer, the active fraction was eluted with a linear gradient of NaCl (from 0M to 0.5M).
  • Ammonium sulfate is dissolved in the active fraction obtained by DEAE-TO YOPEARL column chromatography to a final concentration of 1.2 M. 1.2 M ammonium sulfate and 5 mM j8-mercaptoethanol and 10%
  • the column was applied to a Phenyl-TOYOPEARL 650M (manufactured by Tosohichi Co., Ltd.) column (90 ml) pre-equilibrated with a 10 mM phosphate buffer (pH 7.0) containing glycerin to adsorb the active fraction. After washing the column with the same buffer, the active fraction was eluted with a linear gradient of ammonium sulfate (from 1.2 M to 0.2 M). The active fractions were collected and dialyzed overnight against 10 mM phosphate buffer ( ⁇ 7.0) containing 5 mM j8-mercaptoethanol and 10% glycerin.
  • the active fraction obtained by Phenyl-TOYOPEARL column chromatography was pre-equilibrated with 10 mM phosphate buffer (pH 7.0) containing 13 mercaptoethanol and 10% glycerin. Blue Sepharose 6 Fast Flow (Amersham Bioscience Co., Ltd.) Product) column (40 ml) to adsorb the active fraction. After washing the column with the same buffer, the active fraction was eluted with a NaCl linear gradient (from 0 M to 1 M).
  • Ammonium sulfate is dissolved in the active fraction obtained by Blue Sepharose column chromatography to a final concentration of 1.2M, and then 1.2M ammonium sulfate, 5mM j8-mercaptoethanol and 10% glycerin are dissolved.
  • the solution was applied to a Butyl-TOYOPEARL 650M (manufactured by Tosohichi Co., Ltd.) column (10 ml) pre-equilibrated with a 10 mM phosphate buffer solution (pH 7.0) containing the active fraction. After washing the column with the same buffer, ammonium sulfate The active fraction was eluted with a linear gradient (1.2 M force up to 0.2 M). The active fractions were collected and dialyzed overnight against 10 mM phosphate buffer (PH 7.0) containing 5 mM j8-mercaptoethanol and 10% glycerin.
  • the active fraction obtained by Butyl- TOYOPEARL column chromatography was pre-equilibrated with 10 mM phosphate buffer ( ⁇ H7.0) containing 5 mM ⁇ -mercaptoethanol and 10% glycerin 2 ', 5' -ADP Sepharose (Amersham Biosciences) column (35 ml) was used to adsorb the active fraction. After washing the column with the same buffer, the active fraction was eluted with a NaCl linear gradient (0M force up to 0.5M) to obtain a purified preparation of a single polypeptide by electrophoresis.
  • the purified polypeptide obtained in Example 1 was denatured in the presence of 8M urea and then digested with lysyl endopeptidase (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) derived from achromobacter.
  • the amino acid sequence of the obtained peptide fragment was ABI492 Type protein sequencer (manufactured by PerkinElmer).
  • Chromosomal DNA was extracted according to the method of Visser et al. (Appl. Microbiol. Biotechnol., 53, 415 (200000)) for the cell strength of Paenibacillus alvei NBRC 3343 cultured in the same manner as in Example 1. .
  • PCR was performed using the obtained chromosomal DNA as a saddle, and a DNA fragment of approximately 0.5 kbp, which is considered to be part of the target gene, was amplified. .
  • PCR was performed using TaKaRa Ex Taq (manufactured by Tacarano) as a DNA polymerase, and the reaction conditions were in accordance with the instruction manual.
  • This DNA fragment was cloned into the plasmid pT7Blue T—Vector (Novagen) and ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing
  • the nucleotide sequence was analyzed using a Ready Reaction Kit (Perkin Elmer) and ABI 373A DNA Sequencer (Perkin Elmer). The resulting base sequence is shown in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing.
  • the chromosomal DNA of Paenibacillus alvei NBRC3343 prepared above was completely digested with the restriction enzyme EcoRI, and the resulting mixture of DNA fragments was intramolecularly cyclized with T4 ligase.
  • EcoRI restriction enzyme
  • T4 ligase T4 ligase
  • the entire base sequence of the gene containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 was determined by i-PCR (Nucl. Acids Res., 16, 8186 (1988)). The results are shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • i-PCR was performed using TaKaRa LA Taq (manufactured by Takara Bio Inc.) as a DNA polymerase, and the reaction conditions were in accordance with the instruction manual.
  • the amino acid sequence encoded by the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is shown in SEQ ID NO: 2.
  • PCR was performed using TaKaRa Ex Taq (manufactured by Tacarano) as a DNA polymerase, and the reaction conditions were in accordance with the instruction manual.
  • This DNA is digested with Ndel and Eco RI and inserted between the Ndel recognition site and EcoRI recognition site downstream of the lac promoter of plasmid pUCNT (International Publication No. WO94Z03613) to construct a recombinant vector pNTBA did.
  • E. coli HB101 complex cell manufactured by Takara Bio Inc.
  • E. coli HBlOl pNTBA
  • E. coli HBlOl (pUCNT) containing plasmid vector pUCNT was also cultured in the same manner.
  • the cells were collected by centrifugation and suspended in 50 ml of lOOmM phosphate buffer (pH 6.5). These were crushed using a UH-50 type ultrasonic homogenizer (manufactured by SMT), and then the cell residue was removed by centrifugation to obtain a cell-free extract. The cell-free extracts were assayed for acetate-to-lide reduction activity. As a result, E. coli HBlOKpN ⁇ ) was found to be 31.7 U / mg and E. coli HB101 (pUCNT) was unable to detect activity. The protein concentration in the cell-free extract was measured using a protein assembly kit (manufactured by BIO-RAD).
  • Substrate Relative Substrate Relative activity (%) activity (%) methyl acetoacetate 37 acetone 0 ethyl acetoacetate 1 1 2-butanone 0 tert-butyl acetoacetate 41 2-hexanone 6 methyl propionylacetate 0 2-octanone 13 methyl 4-chloroacetoacetate 732 chloroacetone 109 ethyl 4 -chloroacetoacetate 859 acetoin 0 n -octyl 4-chl oroacetoacetate 1265 methyl iso-propyl ketone 0 ethyl 4-bromoacetoacetate 0 cyclopropyl methyl ketone 1 ethyl 4-azideacetoacetate 0 tetrahydrothiophen-3-one 10 ethyl 4-hydroxy acetoacetate 0 cyclopentanone 7 ethyl 4- acetoxyacetoacetate 25 1 -

Abstract

　新規カルボニル還元酵素、その遺伝子およびそれらを利用した光学活性アルコールの製造方法を提供することを課題とする。　本発明の一つの特徴は、以下の（ａ）配列表の配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または（ｂ）配列表の配列番号１に示す塩基配列と相補的な塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、カルボニル基を有する化合物を還元し、光学活性アルコールを生成する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡである。本発明の一つの特徴は、前記ポリペプチド等を利用した光学活性アルコールの製造方法である。                                                                                                                                              

Description

明 細 書
新規カルボニル還元酵素、その遺伝子、およびそれらを利用した光学活 性アルコールの製造方法
技術分野
[0001] 本発明は、新規カルボ-ル還元酵素、その遺伝子およびそれらを利用した光学活 性アルコールの製造方法に関する。
背景技術
[0002] 光学活性アルコール類、例えば βーヒドロキシエステル類は、農薬、医薬品等の合 成原料及び中間体として有用な化合物である。還元酵素を用いて j8—ケトエステル 類を不斉還元し、光学活性な )8—ヒドロキシエステル類を製造する方法が知られて いる (特許文献 1、 2、非特許文献 1、 2)。
特許文献 1 :特開平 8 - 103269号公報
特許文献 2 :国際公開第 2003— 093477号公報
非特許文献 1 :Kataoka, M.ら, Stereoselective reduction of ethyl 4— chl oro— 3— oxo butanoate by Escherichia coli transformant cells coexpr essing the aldehyde reductase and glucose dehydrogenase genes. A ppl. Microbiol. Biotechnol. , 51, 486—490 (1999) .
非特許文献 2 : Matsuyama, A.ら, Practical applications of biocatalysis for the manufacture of chiral alcohols such as (R)― 1 , 3— butanedi ol by stereospecific oxidoreduction . Asymmetric Catalysis on Indu strial Scale ( Wiley— VCH Verlag) , 217— 231 (2004) .
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0003] 本発明は、上記背景技術の各文献に記載の還元酵素とは異なる、新規カルボニル 還元酵素、その遺伝子およびそれらを利用した光学活性アルコールの製造方法を 提供することを課題とする。
課題を解決するための手段 [0004] (1)本発明の一つの特徴は、以下の（a)又は（b)の DNAである。
(a)配列表の配列番号 1に示す塩基配列を含む DNA;
(b)配列表の配列番号 1に示す塩基配列と相補的な塩基配列を含む DNAとストリン ジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ、カルボ-ル基を有する化合物を還元し、 光学活性アルコールを生成する活性を有するポリペプチドをコードする DNA。
[0005] (2)本発明の一つの特徴は、（1)に記載の DNAであり、かつ、 13ーケトエステル類 を不斉的に還元する活性を有するポリペプチドをコードする DNAである。
[0006] (3)本発明の一つの特徴は、（1)又は（2)のいずれかに記載の DNAにコードされ るアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
[0007] (4)本発明の一つの特徴は、以下の（a)又は（b)のポリペプチドである。
(a)配列表の配列番号 2に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；
(b)配列表の配列番号 2に示すアミノ酸配列と 70%以上の相同性を示すアミノ酸配 列からなるポリペプチドであり、かつ、カルボ-ル基を有する化合物を還元し、光学活 性アルコールを生成する活性を有するポリペプチド。
[0008] (5)本発明の一つの特徴は、（4)に記載のポリペプチドをコードする DNAである。
[0009] (6)本発明の一つの特徴は、（1)、 （2)又は（5)のいずれかに記載の DNAを含む ベクターである。
[0010] (7)本発明の一つの特徴は、（6)に記載のベクターであり、かつ、該ベクターが、配 列表の配列番号 1に示す塩基配列からなる遺伝子の開始コドン部分に Ndel認識部 位が付加され、終始コドンの直後に EcoRI認識部位が付加された二本鎖 DNAと、プ ラスミド pUCNT (国際公開第 WO94Z03613号公報）を、それぞれ Ndel及び Eco RIで消化し、互いにライゲーシヨンして構築した、組換えプラスミド pNTBAであるべ クタ一である。
[0011] (8)本発明の一つの特徴は、還元型補酵素再生活性を有するポリペプチドをコー ドする DNAをさらに含む、（6)に記載のベクターである。
[0012] (9)本発明の一つの特徴は、（6)〜（8)のいずれかに記載のベクターにより宿主細 胞を形質転換して得られる形質転換体である。
[0013] (10)本発明の一つの特徴は、前記宿主細胞が大腸菌である（9)記載の形質転換 体である。
[0014] (11)本発明の一つの特徴は、（3)又は (4)に記載のポリペプチド、又は、（9)また は（10)に記載の形質転換体を、カルボ二ル基を有する化合物と反応させることを特 徴とする光学活性アルコールの製造方法である。
[0015] (12)本発明の一つの特徴は、（3)又は (4)に記載のポリペプチド、又は、（9)また は（10)に記載の形質転換体を、 βーケトエステル類と反応させることを特徴とする光 学活性 j8—ヒドロキシエステル類の製造方法である。
[0016] 本発明のその他の特徴及びその効果は、以下に説明する実施形態および実施例 によって明らかにされる。
発明の効果
[0017] 本発明により、新規カルボニル還元酵素、その遺伝子およびそれらを利用した有用 な光学活性アルコールの製造方法が提供される。
発明を実施するための最良の形態
[0018] 以下、本発明を実施形態を用いて詳細に説明する。本発明はこれらにより限定され るものではない。
[0019] 以下、実施形態に基づいて本発明を詳述する。
[0020] 1.ポリペプチド
本発明の実施形態の「ポリペプチド」は、カルボ二ル基を有する化合物を還元し、光 学活性アルコールを生成する活性を有するポリペプチドである。また、本発明の実施 形態の「ポリペプチド」は、 j8—ケトエステル類を不斉的に還元し、 —ヒドロキシエス テル類を生成する活性を有するポリペプチドである。このようなポリペプチドは、当該 活性を有する微生物などの生物力 単離することができる。本発明のポリペプチドの 例としては、配列表の配列番号 1に示す塩基配列によってコードされる、配列表の配 列番号 2に示すアミノ酸配列力もなるポリペプチドを挙げることができる。また、配列表 の配列番号 2に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと一定値以上の相同性（同一 性)を有し、かつ、カルボ二ル基を有する化合物を還元し、光学活性アルコールを生 成する活性を有するか、または j8—ケトエステル類を不斉的に還元し、 βーヒドロキ シエステル類を生成する活性を有するポリペプチドは、当該ポリペプチドと同等であり 、本発明に含まれる。
[0021] ここで配列の相同性は、例えば、相同性検索プログラム FASTA (W. R. Pearson , W. R. & Lipman, D. J. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 2444— 2448 (1988) )を用いて 2つのアミノ酸配列を比較解析した場合に、配列全体に対する Ide ntityの値で表される。配列表の配列番号 2に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド と一定値以上の相同性を有するポリペプチドとしては、当該ポリペプチドとの相同性 力 S 70%以上、好ましくは 80%以上、より好ましくは 90%以上であるポリペプチドを挙 げることができる。
[0022] このようなポリペプチドは、例えば、先述の、配列表の配列番号 1に示す塩基配列と 相補的な塩基配列力 なる DNAとストリンジヱントな条件下でハイブリダィズする DN Aを適当なベクターに連結した後、適当な宿主細胞に導入して発現させることにより 得られる。
[0023] また、例えば、 Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley an d Sons (1989) )等に記載の公知の方法に従い、配列表の配列番号 2に示すアミノ 酸配列からなるポリペプチドに、アミノ酸の置換、挿入、欠失または付加を生じさせる ことによつても取得できる。置換、挿入、欠失または付加を生じさせるアミノ酸の数は、 その置換等した後のポリペプチドが上記活性を失わない限り制限されな 、が、好まし くは 20アミノ酸以下であり、より好ましくは 15アミノ酸以下、さらに好ましくは 10ァミノ 酸以下、最も好ましくは、 5、 4、 3、または 2個以下である。
[0024] 本発明のポリペプチドの起源となる微生物は、特に限定されないが、例えばバエ- バチルス（Paenibacillus)属に属するバクテリアが挙げられ、特に好ましいものとして はバエ-バチルス ·アルべィ（Paenibacillus alvei) NBRC3343を挙げることがで きる。当該微生物は、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部 生物遺伝資源部門（千葉県木更津巿かずさ鎌足 2— 5 -8)より入手することができる
[0025] 本発明のポリペプチドの起源となる微生物を培養するための培地としては、その微 生物が増殖する限り、通常の、炭素源、窒素源、無機塩類、有機栄養素などを含む 液体栄養培地を用いることができる。 [0026] 本発明のポリペプチドの起源となる微生物力もの該ポリペプチドの単離は、公知の 蛋白質精製法を適当に組み合わせて用いることにより実施できる。例えば、以下のよ うに実施できる。
[0027] まず、当該微生物を適当な培地で培養し、培養液から遠心分離、あるいは、濾過に より菌体を集める。得られた菌体を、超音波破砕機、あるいは、グラスビーズ等を用い た物理的手法で破砕した後、遠心分離にて菌体残さを除き、無細胞抽出液を得る。 そして、塩析 (硫酸アンモ-ゥム沈殿、リン酸ナトリウム沈殿など）、溶媒沈殿 (アセトン またはエタノールなどによる蛋白質分画沈殿法）、透析、ゲル濾過クロマトグラフィー 、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、限外濾過等の手法を単独で 、または組み合わせて用いることにより、該無細胞抽出液から本発明のポリペプチド を単離する。
[0028] 2. DNA
本発明の「DNA」は、上述の実施形態のポリペプチドをコードする DNAであり、後 述する方法に従って導入された宿主細胞内で該ポリペプチドを発現し得るものであ ればいかなるものでもよぐ任意の非翻訳領域を含んでいてもよい。該ポリペプチドが 取得できれば、該ポリペプチドの起源となる微生物より、当業者であれば公知の方法 で本発明の DNAを取得できる。例えば、以下に示した方法で本発明の DNAを取得 できる。
[0029] まず、単離された本発明のポリペプチドを適当なエンドべプチダーゼを用いて消化 し、生じたペプチド断片を逆相 HPLCにより分取する。そして、例えば、 ABI492型プ 口ティンシークェンサ一（Applied Biosystems社製）により、これらのペプチド断片 のアミノ酸配列の一部または全部を決定する。
[0030] このようにして得られたアミノ酸配列情報をもとにして、該ポリペプチドをコードする D NAの一部を増幅するための PCR (Polymerase Chain Reaction)プライマーを 合成する。次に、通常の DNA単離法、例えば、 Visserらの方法 (Appl. Microbiol . Biotechnol. , 53, 415 (2000) )により、該ポリペプチドの起源となる微生物の染 色体 DNAを調製する。この染色体 DNAを铸型として、先述の PCRプライマーを用 いて PCRを行い、該ポリペプチドをコードする DNAの一部を増幅し、その塩基配列 を決定する。塩基配列の決定は、例えば、 ABI373A型 DNA Sequencer (Appl led Biosystems社製）等を用いて行うことができる。
[0031] 該ポリペプチドをコードする DNAの一部の塩基配列が明らかになれば、例えば、 i — PCR法（Nucl. Acids Res. , 16, 8186 (1988) )によりその全体の配列を決定 することができる。
[0032] このようにして得られる本発明の DNAの例としては、配列表の配列番号 1に示す塩 基配列を含む DNAを挙げることができる。また、配列表の配列番号 1に示す塩基配 列と相補的な塩基配列力 なる DNAとストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズする DNAであって、かつ、カルボ-ル基を有する化合物を還元し、光学活性アルコール を生成する活性を有するか、または j8—ケトエステル類を不斉的に還元し、 β—ヒド ロキシエステル類を生成する活性を有するポリペプチドをコードする DNAも本発明の DNAに包含される。
[0033] 配列表の配列番号 1に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなる DNAと、ストリン ジェントな条件下でハイブリダィズする DNAとは、コ口-一'ハイブリダィゼーシヨン法 、プラーク 'ハイブリダィゼーシヨン法、あるいはサザンノヽイブリダィゼーシヨン法等を 実施した際、配列表の配列番号 1に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなる DN Α力 特異的にハイブリッドを形成する DNAを言う。
[0034] ここで、ストリンジェントな条件とは、例えば、 75mMクェン酸三ナトリウム、 750mM 塩化ナトリウム、 0. 5%ドデシル硫酸ナトリウム、 0. 1%ゥシ血清アルブミン、 0. 1%ポ リビュルピロリドン、および、 0. l%Ficoll 400 (アマシャムバイオサイエンス株式会 社製)の組成からなる水溶液中、 65°Cでハイブリダィズさせた後に、 15mMクェン酸 三ナトリウム、 150mM塩化ナトリウム、および 0. 1%ドデシル硫酸ナトリウムの組成か らなる水溶液を用いて、 60°Cで洗浄が行われる条件を言う。好ましくは、上記条件で ハイブリダィズさせた後に、 15mMクェン酸三ナトリウム、 150mM塩化ナトリウム、お よび 0. 1%ドデシル硫酸ナトリウムの組成力もなる水溶液を用いて、 65°Cで洗浄が 行われる条件であり、より好ましくは、 1. 5mMクェン酸三ナトリウム、 15mM塩ィ匕ナト リウム、および 0. 1%ドデシル硫酸ナトリウムの組成力もなる水溶液を用いて、 65°Cで 洗浄が行われる条件である。本明細書において記述されている、上記 DNAの単離、 および後述するベクターの調製、形質転換等の遺伝子操作は、特に明記しない限り
、 Molecular Cloning 2nd Edition (Cold spring Harbor Laooratory Pr ess (1989) )等の成書に記載されている方法により実施できる。また、本明細書の記 述に用いられる％は、特に断りのない限り、％(wZv)を意味する。
[0035] 本発明の DN Aの例としては、上記の各 DNAのほか、配列番号 1に示す塩基配列 において、塩基が置換、挿入、欠失および Z又は付加された塩基配列を有し、かつ 、カルボ二ル基を有する化合物を還元し、光学活性アルコールを生成する活性、また は —ケトエステル類を不斉的に還元し、 β—ヒドロキシエステル類を生成する活性 を有するポリペプチドをコードする DNAも含まれる。上記の置換、挿入、欠失および Ζ又は付加される塩基の数は、 DNAによってコードされるポリペプチドが上記活性 を失わない限り制限されないが、好ましくは 50塩基以下であり、より好ましくは 30塩 基以下、さらに好ましくは 20塩基以下、最も好ましくは、 10、 9、 8、 7、 6、 5、 4、 3、ま たは 2個以下である。
[0036] 3.ベクター
本発明の「ベクター」は、適当な宿主細胞内で前記 DNAがコードする遺伝子を発 現できるものであれば、特に限定されない。このようなベクターとしては、例えば、ブラ スミドベクター、ファージベクター、コスミドベクターなどが挙げられ、さらに、他の宿主 株との間での遺伝子交換が可能なシャトルベクターも使用できる。
[0037] このようなベクターは、通常、 lacUV5プロモーター、 trpプロモーター、 trcプロモー ター、 tacプロモーター、 lppプロモーター、 tufBプロモーター、 recAプロモーター、 p Lプロモーター等の制御因子を含み、本発明の DNAと作動可能に連結された発現 単位を含む発現ベクターとして好適に使用できる。例えば、国際公開第 WO94Z03 613号公報の記載に基づ 、て当業者が容易に取得及び調製可能なプラスミド pUC NTが好適に使用できる。
[0038] 前記制御因子は、機能的プロモーター及び、任意の関連する転写要素（例えばェ ンハンサー、 CCAATボックス、 TATAボックス、 SPI部位など）を有する塩基配列を いう。
[0039] 上記の「作動可能に連結」という用語は、遺伝子の発現を調節するプロモーター、 ェンハンサ一等の種々の調節エレメントと遺伝子が、宿主細胞中で作動し得る状態 で連結されることをいう。制御因子のタイプ及び種類力 宿主に応じて変わり得ること は、当業者に周知の事項である。本発明のベクターの例としては、 pUCNTに配列番 号 1に示す DNAを導入した、後述するプラスミド pNTBAを挙げることができる。
[0040] 4.宿主細胞
本明細書内に記載される宿主細胞としては、細菌、酵母、糸状菌、植物細胞、動物 細胞などが挙げられるが、導入及び発現効率から細菌が好ましぐ大腸菌が特に好 ましい。本発明の DNAを含むベクターは、公知の方法により宿主細胞に導入できる 。宿主細胞として大腸菌を用いる場合、例えば、市販の E. coli HB101コンビテント セル (タカラバイオ社製)を用いることにより、当該ベクターを宿主細胞に導入できる。 ェシエリヒア'コリ（Escherichia coli) HB101の菌学的性質は、「BIOCHEMICALS FOR LIFE SCIENCE」（東洋紡績株式会社、 1993年、 116— 119頁）およびその 他種々の公知文献に記載されており当業者に周知である。
[0041] 5.形皙転橼体
本発明の「形質転換体」は、本発明のポリペプチドをコードする DNAを、前記べク ターに組み込み、これを宿主細胞に導入することにより得られる。なお、本発明の「形 質転換体」は、培養菌体は言うまでもなぐその処理物も含まれる。ここで言う処理物 とは、例えば、界面活性剤や有機溶媒で処理した細胞、乾燥細胞、破砕処理した細 胞、細胞の粗抽出液等のほか、公知の手段でそれらを固定ィ匕したものを意味し、本 発明のポリペプチドの酵素活性が残存する限りはこれに含まれる。本発明の形質転 換体の培養は、それが増殖する限り、通常の、炭素源、窒素源、無機塩類、有機栄 養素などを含む液体栄養培地を用いて実施できる。本発明の形質転換体の例として は、後述する E. coli HB101 (pNTBA)が挙げられる。ェシエリヒア'コリ（Escherich ia coli) HB101 (pNTBA)は、遺伝子組換えによって特定の酵素を産生し得る性 質以外は、上記ェシエリヒア'コリ（Escherichia coli) HB101と同様の菌学的性質 を有する。
[0042] 6.還元反応
還元反応の基質としては、本発明の「ポリペプチド」が還元し得るカルボ二ル基を含 む化合物であればいずれでもよい。好ましくは j8—ケトエステル類である。具体的に は、たとえばァセト酢酸メチル、ァセト酢酸ェチル、ァセト酢酸 tーブチル、 4 クロ口 ァセト酢酸メチル、 4 クロロアセト酢酸ェチル、 4 クロロアセト酢酸オタチル、 4ーァ セトキシァセト酢酸ェチル、 4 ベンゾィルォキシァセト酢酸ェチル、 2—ォキソシクロ ペンタンカルボン酸メチル、 2—ォキソシクロペンタンカルボン酸ェチル、ァセトァセト ァニリド、 o ァセトァセトァニシジド、 p ァセトァセトァニシジドなどである。
[0043] 還元反応の際には、基質を反応の初期に一括して添加してもよぐ反応の進行にあ わせて分割して添加してもよい。反応時の温度は通常 10〜60°C、好ましくは、 20〜 40°Cであり、反応時の pHは 2. 5〜9、好ましくは、 5〜9の範囲である。反応液中の 酵素源の量はこれらの基質を還元する能力に応じ適宜決定すればよい。また、反応 液中の基質濃度は 0. 01〜50% (1\^7 )が好ましぐょり好ましくは、0. 1〜30% ( wZv)である。反応は通常、振とうまたは通気攪拌しながら行なう。反応時間は基質 濃度、酵素源の量及びその他の反応条件により適宜決定される。通常、 2〜168時 間で反応が終了するように各条件を設定することが好まし 、。
[0044] 還元反応を促進させるために、一般に生物学的方法による還元反応に必要とされ て 、る還元型ニコチンアミド ·アデ-ンジヌクレオチド（以降 NADHと省略する）、還元 型ニコチンアミド.アデ-ンジヌクレオチドりん酸（以降 NADPHと省略する）等の補酵 素を添加することにより、反応を促進させることもできる。この場合、具体的には、反応 液に直接これらを添加する。
[0045] また、還元反応を促進させるために、 NAD+もしくは NADP+をそれぞれの還元型へ 還元する酵素、及び還元するための基質を共存させて反応を行うと優れた結果が得 られるので好ましい。例えば、還元型へ還元する酵素としてグルコース脱水素酵素、 還元するための基質としてグルコースを共存させる力、または、還元型へ還元する酵 素としてギ酸脱水素酵素、還元するための基質としてギ酸を共存させる。
[0046] 本発明の DNAと補酵素再生能を有する酵素をコードする DNAの両方を導入され た形質転換体を用いると、別途、補酵素再生酵素を調製する必要がない。該形質転 換体を得るには、 2つの DNAを別々に導入してもよいし、両方の DNAを含むベクタ 一で形質転換を行ってもょ 、。 実施例
[0047] 以下、実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例によ り何ら限定されるものではない。なお、以下の記載において、「％」は特に断らない限 り「重量％」を意味する。
[0048] 施 ί列 ί)ポリペプチド、の
以下の方法に従って、上述のバエ-バチルス 'アルべィ（Paenibacillus alvei) N BRC3343より、ァセトァセトァ-リドを不斉的に還元する活性を有するポリペプチドを 分離し、単一に精製した。特に断りのない限り、精製操作は 4°Cで行った。
[0049] ァセトァセトァ -リドに対する還元活性は、 1.3% (vZv)のジメチルスルホキシドを 含む lOOmMリン酸緩衝液（pH6. 5)に、 40mMの基質ァセトァセトァ-リド、 0. 25 mMの補酵素 NADPH、および粗酵素を添加し、 30°Cで 1分間反応させた際の、波 長 340nmにおける吸光度の減少速度力も算出した。本反応条件において、 1分間 に: L molの NADPHを NADPに酸化する活性を、 lunitと定義した。
[0050] (微生物の培養）
5Lジャーフアーメンター（丸菱バイオェンジ社製）に、肉エキス 10g、ペプトン 10g、 酵母エキス 5g、塩ィ匕ナトリウム 3g、アデ力ノール LG— 109 (日本油脂製) 0. lg (いず れも 1L当たり）の組成カゝらなる液体培地 (pH7) 3Lを調製し、 120°Cで 20分間蒸気 殺菌をおこなった。この培地に、予め同培地にて前培養しておいたバエ-バチルス' アルべィ（Paenibacillus alvei) NBRC3343株の培養液を 50ml接種し、攪拌回転 数 450rpm、通気量 0. 9NL/min, 30°Cで 40時間培養を行った。
[0051] (無細胞抽出液の調製）
上記の培養液から遠心分離により菌体を集め、 0. 8%塩ィ匕ナトリウム水溶液を用い て菌体を洗浄した。この菌体を、 5mMの 13 メルカプトエタノール及び 10%グリセリ ンを含む 10mMリン酸緩衝液 (pH7. 0)に懸濁し、 SONIFIER250型超音波破砕 機 (BRANSON社製)を用いて破砕した後、遠心分離にて菌体残渣を除き、無細胞 抽出液を得た。
[0052] (核酸の除去）
上記で得た無細胞抽出液に、 3. 5%硫酸プロタミン水溶液を添加し、 30分攪拌後 、遠心分離により沈殿を除去した。
[0053] (DEAE— TO YOPEARLカラムクロマトグラフィー）
核酸除去処理を行った無細胞抽出液を、 5mMの β メルカプトエタノール及び 10 %グリセリンを含む 10mMリン酸緩衝液 (pH7. 0)で予め平衡化した DEAE— TOY OPEARL 650M (東ソ一株式会社製)カラム (400ml)に供し、活性画分を吸着さ せた。同一緩衝液でカラムを洗浄した後、 NaClのリニアグラジェント（0Mから 0. 5M まで）により活性画分を溶出させた。
[0054] (Phenyl— TOYOPEARLカラムクロマトグラフィー）
DEAE—TO YOPEARLカラムクロマトグラフィーにより得られた活性画分に終濃 度 1.2Mとなるよう硫酸アンモ-ゥムを溶解し、 1.2Mの硫酸アンモ-ゥム及び 5mM の j8—メルカプトエタノール及び 10%グリセリンを含む 10mMリン酸緩衝液（pH7. 0 )で予め平衡化した Phenyl—TOYOPEARL 650M (東ソ一株式会社製）カラム（ 90ml)に供し、活性画分を吸着させた。同一緩衝液でカラムを洗浄した後、硫酸アン モ-ゥムのリニアグラジェント（1.2Mから 0.2Mまで）により活性画分を溶出させた。活 性画分を集め、 5mMの j8—メルカプトエタノール及び 10%グリセリンを含む 10mM リン酸緩衝液 (ρΗ7. 0)にて 1夜透析を行った。
[0055] (Blue Sepharoseカラムクロマトグラフィー）
Phenyl—TOYOPEARLカラムクロマトグラフィーにより得られた活性画分を、の 13 メルカプトエタノール及び 10%グリセリンを含む 10mMリン酸緩衝液 (pH7. 0)で 予め平衡化した Blue Sepharose6 Fast Flow (アマシャムバイオサイエンス株式 会社製)カラム (40ml)に供し、活性画分を吸着させた。同一緩衝液でカラムを洗浄 した後、 NaClのリニアグラジェント (0Mから 1Mまで）により活性画分を溶出させた。
[0056] (Butyl— TOYOPEARLカラムクロマトグラフィー）
Blue Sepharoseカラムクロマトグラフィーにより得られた活性画分に終濃度 1.2M となるよう硫酸アンモ-ゥムを溶解し、 1.2Mの硫酸アンモ-ゥム及び 5mMの j8—メ ルカプトエタノール及び 10%グリセリンを含む 10mMリン酸緩衝液（pH7. 0)で予め 平衡化した Butyl—TOYOPEARL 650M (東ソ一株式会社製）カラム（10ml)に 供し、活性画分を吸着させた。同一緩衝液でカラムを洗浄した後、硫酸アンモ-ゥム のリニアグラジェント（1.2M力 0.2Mまで）により活性画分を溶出させた。活性画分 を集め、 5mMの j8—メルカプトエタノール及び 10%グリセリンを含む 10mMリン酸 緩衝液 (PH7. 0)にて 1夜透析を行った。
[0057] (2', 5'— ADP Sepharoseカラムクロマトグラフィー）
Butyl— TOYOPEARLカラムクロマトグラフィーにより得られた活性画分を、 5mM の β—メルカプトエタノール及び 10%グリセリンを含むを含む 10mMリン酸緩衝液 (ρ H7. 0)で予め平衡化した 2', 5' -ADP Sepharose (アマシャムバイオサイエンス 株式会社製)カラム（35ml)に供し、活性画分を吸着させた。同一緩衝液でカラムを 洗浄した後、 NaClのリニアグラジェント (0M力も 0. 5Mまで）により活性画分を溶出 させ、電気泳動的に単一なポリペプチドの精製標品を得た。
[0058] 施例 2)遣伝早のクローニング
(PCRプライマーの作製）
実施例 1で得られた精製ポリペプチドを 8M尿素存在下で変性した後、ァクロモバク ター由来のリシルエンドべプチダーゼ (和光純薬工業株式会社製)で消化し、得られ たペプチド断片のアミノ酸配列を ABI492型プロテインシーケンサー（パーキンエル マー社製）により決定した。このアミノ酸配列から予想される DNA配列に基づき、該 ポリペプチドをコードする遺伝子の一部を PCRにより増幅するためのプライマー 1： 5' CARGAYCTNACNAAYAARAC— 3' (配列表の配列番号 3)、および、プライマー 2 ： 5' ARNGCYTCNGTCATNCCCAT— 3' (配列表の配列番号 4)を合成した。
[0059] (PCRによる遺伝子の増幅）
実施例 1と同様に培養したバエ-バチルス ·アルべィ（Paenibacillusalvei) NBRC 3343の菌体力も Visser等の方法（Appl. Microbiol. Biotechnol. , 53, 415 (20 00) )に従って染色体 DNAを抽出した。次に、上記で調製した DNAプライマー 1お よび 2を用い、得られた染色体 DNAを铸型として PCRを行ったところ、 目的遺伝子の 一部と考えられる約 0. 5kbpの DNA断片が増幅された。 PCRは、 DNAポリメラ—ゼ として TaKaRa Ex Taq (タカラノィォ社製)を用いて行い、反応条件はその取り扱 い説明書に従った。この DNA断片を、プラスミド pT7Blue T— Vector (Novagen 社製）にクローユングし、 ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Perkin Elmer社製）および ABI 373A DNA Seque ncer (Perkin Elmer社製)を用 Vヽてその塩基配列を解析した。その結果判明した 塩基配列を、配列表の配列番号 5に示した。
[0060] (i PCR法による目的遺伝子の全長配列の決定）
上記で調製したバエ-バチルス ·アルべィ（Paenibacillus alvei) NBRC3343の 染色体 DNAを、制限酵素 EcoRIで完全消化し、得られた DNA断片の混合物を T4 リガーゼにより分子内環化させた。これを铸型として用い、 i— PCR法 (Nucl. Acids Res. , 16, 8186 (1988) )により、上述の配列番号 5に示す塩基配列を含む遺伝 子の全塩基配列を決定した。その結果を配列表の配列番号 1に示した。 i— PCRは、 DNAポリメラ一ゼとして TaKaRa LA Taq (タカラバイオ社製）を用いて行い、反応 条件はその取り扱い説明書に従った。また、配列番号 1に示した塩基配列がコードす るアミノ酸配列を配列番号 2に示した。
[0061] 施例 3) ベクターの構签
プライマー 3： 5' - ATTAAACATATGAAATTGCAAGATCTTACG - 3' (配列表の 配列番号 6)と、プライマー 4： 5' - AAAGAATTCTTACTGTGGATTGGTTGTCC - 3 ' (配列表の配列番号 7)を用い、実施例 2で得たバエ-バチルス ·アルべィ（Paeniba cillusalvei) NBRC3343の染色体 DNAを铸型として PCRを行った。その結果、配 列表の配列番号 1に示す塩基配列からなる遺伝子の開始コドン部分に Ndel認識部 位が付加され、かつ終始コドンの直後に EcoRI認識部位が付加された二本鎖 DNA を得た。 PCRは、 DNAポリメラ一ゼとして TaKaRa Ex Taq (タカラノィォ社製）を 用いて行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。この DNAを Ndel及び Eco RIで消化し、プラスミド pUCNT (国際公開第 WO94Z03613号公報）の lacプロモ 一ターの下流の Ndel認識部位と EcoRI認識部位との間に挿入し、組換えベクター p NTBAを構築した。
[0062] (実施例 4)形皙転椽体の作製
実施例 3で構築した組換えベクター pNTBAを用いて、 E. coli HB101コンビテン トセル (タカラバイオ社製)を形質転換し、 E. coli HBlOl (pNTBA)を得た。これを 、 200 /z gZmlのアンピシリンを含む 2 XYT培地（トリプトン 1. 6%、イーストエキス 1. 0%、 NaClO. 5%、 pH7. 0) 50mlに接種し、 37°Cで 24時間振盪培養した。また、 比較例として、プラスミドベクター pUCNTを含む E. coli HBlOl (pUCNT)も同様 に培養した。これらを遠心分離によって菌体を集め、 50mlの lOOmMリン酸緩衝液（ pH6. 5)に懸濁した。これらを、 UH— 50型超音波ホモゲナイザー（SMT社製）を用 いて破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。これら無 細胞抽出液のァセトァセトァ -リド還元活性を測定したところ、 E. coli HBlOKpN ΤΒΑ)では 31. 7U/mg、 E. coli HB101 (pUCNT)では活性が検出できなかつ た。なお、無細胞抽出液中の蛋白質濃度は、プロテインアツセィキット (BIO— RAD 社製)を用いて測定した。
[0063] (実施例 5) (R)—4—クロ口一 3 ヒドロキシ酪酸ェチルの製诰
実施例 4と同様に調製した E. coli HBlOl (pNTBA)菌体の無細胞抽出液 lml に、 4 クロロアセト酢酸ェチル（ j8—ケトエステル類に含まれる） 10mg、グルコース 2 5mg、 NADPO. 5mg、グルコース脱水素酵素「GLUCDH"Amano2"」（天野ェン ザィム株式会社製） lmg、 1. 0Mリン酸緩衝液 (pH6. 5) 0. lmlを添カ卩し、 30°Cで 1 6時間振とうした。反応終了後に反応液を酢酸ェチルで抽出し、フ 二ルイソシァネ ートで誘導体化を行った。これを薄層クロマトグラフィーによって精製した。この誘導 体化された 4 クロロー 3—ヒドロキシ酪酸ェチルを用 、て光学純度を測定したところ 、 99%ee以上であった。 4—クロ口一 3—ヒドロキシ酪酸ェチル（ j8—ヒドロキシエステ ル類に含まれる）の光学純度の測定は、高速液体クロマトクロマトグラフィー (カラム： ダイセル化学工業株式会社製 CHIRALCEL Oj (lD4. 6mm X 250mm)を装着し た HPLCを用いて行った。
[0064] (実施例 6)ポリペプチドの某晳特異性
0. 2% (vZv)のジメチルスルフォキシドを含む lOOmMリン酸緩衝液（pH6. 5)に 、基質となるカルボ二ルイ匕合物を終濃度 lmM、補酵素 NADPHを終濃度 0. 25m Mとなるようそれぞれ溶解した。これに、実施例 1で調製した精製ポリペプチドを適当 量添加し、 30°Cで 3分間反応を行った。当該反応液の波長 340nmにおける吸光度 の減少速度から、各カルボ二ルイ匕合物に対する還元活性を算出し、これをァセトァセ トァ -リドに対する活性を 100%とした場合の相対値で表し、表 1に示した。表 1から 明らかなように本発明の実施形態のポリペプチドは、広範なカルボ二ル基を有する化 合物に対して還元活性を示した。
[表 1]
Substrate Relative Substrate Relative activity (%) activity(%) methyl acetoacetate 37 acetone 0 ethyl acetoacetate 1 1 2-butanone 0 tert-butyl acetoacetate 41 2-hexanone 6 methyl propionylacetate 0 2-octanone 13 methyl 4-chloroacetoacetate 732 chloroacetone 109 ethyl 4-chloroacetoacetate 859 acetoin 0 n -octyl 4-chl oroacetoacetate 1265 methyl iso-propyl ketone 0 ethyl 4-bromoacetoacetate 0 cyclopropyl methyl ketone 1 ethyl 4-azideacetoacetate 0 tetrahydrothiophen-3-one 10 ethyl 4-hydroxy acetoacetate 0 cyclopentanone 7 ethyl 4-acetoxyacetoacetate 25 1 -tetralone 0 ethyl 4-benzyloxyacetoacetate 55 7-methoxy-2-tetralone 0 methyl 2-oxocyclopentanecarboxylate 6 isophorone 0 ethyl 2-oxocyclopentanecarboxylate 9 diacetyl 580 methyl pyruvate 1 12 acetylacetone 33 ethyl pyruvate 363 acetophenone 15 dihydro-4,4-dimethyl-2,3-furandione 1213 2'-chloroacetophenone 19 acetoacetanilide 100 2,2,2-trifluoroacetophenone 56
3-phenyl-3-oxopentanamide 78 2-chloroacetophenone 1 19 p -acetoacetanisidide 622 propiophenone 19 o -acetoacetoariisidide 31 benzylacetone 4
Λ^-acetoacet l-o-toIuidine 13 2,3'-dich1oroacetophenone 70
N -acetoacet l-p-toluidine 234 3'，5'-bis(trifluoromethyl)acetophenone 17
4-chloroacetoactanilide 287 o -chlorobenzaldehyde 78
2'5 -dichloroacetoacetanilide 170 m -chlorobenzaldehyde 9
2-keto-n -butyric acid 6 o -nitrobenzal dehyde 42
2- keto-" -valeric acid 10 p -nitrobenzaldehyde 7 oxalacetic acid 1 w -butylaldehyde 23 levulinic acid 10 3-phenylpropionaldehyde 58

Claims

請求の範囲
[I] 以下の（a)又は（b)の DNA:
(a)配列表の配列番号 1に示す塩基配列を含む DNA;
(b)配列表の配列番号 1に示す塩基配列と相補的な塩基配列を含む DNAとストリン ジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ、カルボ-ル基を有する化合物を還元し、 光学活性アルコールを生成する活性を有するポリペプチドをコードする DNA。
[2] 請求項 1に記載の DNAであり、かつ、 j8—ケトエステル類を不斉的に還元する活 性を有するポリペプチドをコードする DNA。
[3] 請求項 1又は 2の 、ずれかに記載の DNAにコードされるアミノ酸配列を含むポリべ プチド。
[4] 以下の（a)又は (b)のポリペプチド：
(a)配列表の配列番号 2に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；
(b)配列表の配列番号 2に示すアミノ酸配列と 70%以上の相同性を示すアミノ酸配 列からなるポリペプチドであり、かつ、カルボ-ル基を有する化合物を還元し、光学活 性アルコールを生成する活性を有するポリペプチド。
[5] 請求項 4に記載のポリペプチドをコードする DNA。
[6] 請求項 1、 2又は 5のいずれかに記載の DNAを含むベクター。
[7] 請求項 6に記載のベクターであり、かつ、該ベクターが、配列表の配列番号 1に示 す塩基配列からなる遺伝子の開始コドン部分に Ndel認識部位が付加され、終始コド ンの直後に EcoRI認識部位が付加された二本鎖 DNAと、プラスミド pUCNT (国際 公開第 WO94Z03613号公報）を、それぞれ Ndel及び EcoRIで消化し、互いにラ ィゲーシヨンして構築した、組換えプラスミド pNTBAであるベクター。
[8] 還元型補酵素再生活性を有するポリペプチドをコードする DNAをさらに含む、請 求項 6に記載のベクター。
[9] 請求項 6〜8のいずれかに記載のベクターにより宿主細胞を形質転換して得られる 形質転換体。
[10] 前記宿主細胞が大腸菌である請求項 9記載の形質転換体。
[II] 請求項 3又は 4に記載のポリペプチド、又は、請求項 9または 10に記載の形質転換 体を、カルボ-ル基を有する化合物と反応させることを特徴とする光学活性アルコー ルの製造方法。
請求項 3又は 4に記載のポリペプチド、又は、請求項 9または 10に記載の形質転換 体を、 β—ケトエステル類と反応させることを特徴とする光学活性 j8—ヒドロキシエス テル類の製造方法。
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