CN1322129C - 新型羰基还原酶及其编码基因、以及利用它们制备光学活性醇的方法 - Google Patents
新型羰基还原酶及其编码基因、以及利用它们制备光学活性醇的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供Ogataea属微生物来源的新型羰基还原酶和编码该蛋白的DNA。用该羰基还原酶还原酮，可生产出光学活性醇，尤其是(E)-7-[2-环丙基-4-(4-氟苯基)-喹啉-3-基]-3，5-二羟基庚-6-烯酸酯类。本发明的羰基还原酶是活性和立体选择性良好的酶。因此，本发明可提供光学活性醇类的制备方法，该物质是作为医药、农药等中间材料而在产业上有用的化合物。
Description
技术领域
本发明涉及具有还原含羰基化合物，使其转变成光学活性醇类的活性的肽，该光学活性醇类是作为医药、农药等中间原料在产业上有用的化合物。本发明还涉及编码上述肽的DNA、将该DNA整合到载体而得到的重组DNA、包含该重组DNA的转化体。另外，本发明还涉及利用上述转化体、该转化体的培养物或该转化体的处理物制备光学活性醇的方法。
背景技术
作为(E)-7-[2-环丙基-4-(4-氟苯基)-喹啉-3-基]-3，5-二羟基庚-6-烯酸酯类的化学制备方法，已知有例如专利文献1中如下所示的制备流程：
另外，专利文献2中也报道了用光学活性Schiff碱的制备方法。
专利文献3中报道了用(R)-3-叔-丁基二甲基甲硅烷氧基-6-二甲氧基氧膦基-5-氧代己酸甲酯在极低温度下制备的方法。
另一方面，作为更廉价且副产物少的制备方法，考虑将用微生物细胞和/或该细胞处理物从含羰基化合物进行立体选择性还原，生成光学活性醇的方法用于制备上述化合物的方法，作为应用羰基的侧链有喹啉骨架的化合物的方法，非专利文献1中记载了应用微杆菌(Microbacterium campoquemadoensis)MB5614株进行以下反应。
另外，非专利文献2中记载了用面包酵母进行以下反应。
但是，对于象(E)-7-[2-环丙基-4-(4-氟苯基)-喹啉-3-基]-3，5-二氧代-庚-6-烯酸酯这样，羰基的α位存在烯烃且羰基连续存在的化合物，还不知道用微生物进行立体选择性还原的例子。
<非专利文献1>
Appl microbiol Biotechnol(1998)49：p.709-717
<非专利文献2>
Bioorg Med Chem Lett，vol8，p1403-(1998)
<专利文献1>
特开平1-279866号公报
<专利文献2>
特开平8-92217号公报
<专利文献3>
特开平8-127585号公报
发明内容
因此，希望开发出工业上能廉价制备(3R，5S)-(E)-7-[2-环丙基-4-(4-氟苯基)-喹啉-3-基]-3，5-二羟基庚-6-烯酸酯类的新型制备方法。
为了解决上述课题，本发明者们对(3R，5S)-(E)-7-[2-环丙基-4-(4-氟苯基)-喹啉-3-基]-3，5-二羟基庚-6-烯酸酯类的制备方法进行了大量研究，结果发现：分离催化作为原料的含羰基化合物的还原反应的新型酶，用重组菌表达该酶，使之作用于作为原料的含羰基化合物，可获得高光学纯度且高浓度的目的物，由此完成了本发明。
即，本发明的要点是：
(1)包含下述(A)或(B)中任意一项的氨基酸序列的多肽：
(A)序列号1中记载的氨基酸序列；
(B)具有羰基还原酶活性的多肽的氨基酸序列，该氨基酸序列是在序列号1的氨基酸序列中有一个或多个氨基酸发生缺失、添加或取代的氨基酸序列。
(2)包含下列(a)～(e)任意一项的碱基序列的DNA：
(a)编码由序列号1中记载的氨基酸序列构成的多肽的碱基序列；
(b)编码由下述氨基酸序列构成、且具有羰基还原酶活性的多肽的碱基序列，所述氨基酸序列是在序列号1的氨基酸序列中有一个或多个氨基酸发生缺失、添加或取代的氨基酸序列；
(c)序列号2中记载的碱基序列；
(d)编码具有羰基还原酶活性的多肽的碱基序列，该碱基序列是在序列号2记载的碱基序列中有一个或多个碱基发生缺失、添加或取代的碱基序列；
(e)编码具有羰基还原酶活性的多肽的碱基序列，该碱基序列是在严紧条件下与序列号2中记载的碱基序列或其互补序列或它们的一部分杂交的碱基序列。
(3)一种重组DNA，其通过将(2)所述的DNA重组到载体中而得到。
(4)一种转化体，其包含(3)所述的重组DNA。
(5)一种转化体，其通过将(2)所述的DNA重组到染色体DNA中而得到。
(6)光学活性醇的制备方法，其特征在于，用权利要求4或权利要求5所述的转化体细胞、该转化体细胞的培养物或该转化体细胞的处理物不对称还原含羰基化合物。
(7)(6)所述的制备方法，其特征在于，含羰基化合物为下式(II’)和下式(III’)所示的光学活性体：
(式中R表示氢原子、烷基或芳基)；
(式中R与上述意思相同)。
发明的最佳实施方式
以下对本发明进行详细说明。
本发明的多肽是具有序列号1中氨基酸序列的多肽或其同源物，且具有羰基还原酶活性。
本说明书中，羰基还原酶活性是指对含羰基化合物中的羰基进行不对称还原形成光学活性醇类的活性。该活性的测定可以如下进行：以含羰基化合物为底物，在含有底物、还含有NADPH作为辅酶的反应体系中，以目的多肽、转化细胞、转化细胞培养物或转化细胞处理物作为酶进行作用，测定NADPH减少初速度。
由于本发明阐明了其氨基酸序列和编码该氨基酸序列的碱基序列，因此本发明的多肽可以如下获得：用以后述以编码本发明多肽的部分或全部氨基酸序列的碱基序列为基础制作的探针，从具有羰基还原活性的任意微生物分离出编码还原酶的DNA后，以此为基础，利用常规的基因工程学方法获得本发明的多肽。另外，为了完成本发明，也可以从具有羰基还原活性的微生物，即具有编码羰基还原酶的DNA的微生物中进行纯化，例如从Ogataea属酵母的培养物中纯化。
作为Ogataea属酵母，例如Ogataea minuta具有特别好的产生本发明羰基还原酶的能力，该酵母是以IFO 1473株从财团法人发酵研究所购入的。
作为从微生物的培养物获得本发明多肽的方法，可应用常规的酵母纯化方法，例如可应用以下方法：用YM培养基等用于真菌培养的普通培养基培养上述微生物，使之充分增殖后回收，在加入了DTT(二硫苏糖醇)等还原剂和苯甲基磺酰氟(PMSF)等蛋白酶抑制剂的缓冲液中使之破碎，获得无细胞提取液。通过根据蛋白质溶解度进行的级分分离(用有机溶剂沉淀和硫酸铵等盐析等)和阳离子交换、阴离子交换、凝胶过滤、疏水性色谱、利用鳌合剂、色素、抗体等的亲和层析色谱等的适当组合从无细胞提取液中进行纯化。例如，经过应用DEAE-Sepharose的阴离子交换色谱、应用辛基-Sepharose的疏水性色谱、应用Q-Sepharose的阴离子交换色谱、应用Superdex200的凝胶过滤等，可纯化成电泳中基本出现单一条带。
如此纯化出的Ogataea minuta来源的本发明多肽具有以下典型性状：
(1)最适pH 5.0-6.0
(2)分子量 用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(以下简称SDS-PAGE)测定的分子量约27,000Da。该酶还具有以下性状特征：
(3)稳定的pH范围 在pH 5.5-6.5比较稳定。
(4)作用适宜温度范围 最适温度为60-70℃。
(5)温度稳定性 40℃或40℃以下比较稳定。
(6)抑制 该酶受汞(I)离子、铅(II)离子抑制。
用上述方法分离的本发明多肽不仅对含羰基化合物，而且对二羰基化合物也具有很好的不对称还原能力。
本发明多肽的同源物是指含有在不影响羰基还原酶活性的范围内，在序列号1的氨基酸序列中有一个或多个氨基酸发生缺失、添加或取代的氨基酸序列的多肽。这里，多个具体是指20个或20个以下，优选10个或10个以下，更优选5个或5个以下。
另外，本发明多肽的同源物是指其氨基酸序列与序列号1中的氨基酸序列有至少50％、优选至少60％或70％，更优选80％或80％以上同源性的多肽。
上面所讲多肽同源性的检索可以例如日本DNA数据库(DDBJ)为对象，用FASTA program或BLAST程序等进行。用序列号1中的氨基酸序列以为DDBJ对象，用BLAST程序进行同源性检索的结果表明，在已知的蛋白质中，显示同源性最高的为粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的可能的短链脱氢酶(T41540)，同源性为37.4％。
另外，本发明的DNA是编码上述多肽的DNA或是编码其具有羰基还原酶活性的同源物的DNA。
作为编码上述多肽的DNA，具体可以列举序列号2中的碱基序列。
编码本发明多肽的DNA可通过例如以下方法进行分离。
首先，用上述方法等对本发明的多肽进行纯化后，分析其N末端的氨基酸序列，再用赖氨酸残基肽酶(lysylendopeptidase)、V8蛋白酶等酶进行酶切后，通过逆相液体色谱等纯化肽片段，然后用蛋白质测序仪分析氨基酸序列，确定多个氨基酸序列。
以测定的氨基酸序列为基础设计PCR用的引物，以生产羰基还原酶的微生物株的染色体DNA或cDNA文库为模板，应用根据氨基酸序列设计的PCR引物进行PCR，得到本发明DNA的一部分。再以所得DNA片断为探针，利用将生产羰基还原酶的微生物株的染色体DNA的限制性酶消化物导入噬菌体、质粒等载体中，并转化大肠杆菌而得到的文库和cDNA文库，通过集落杂交或蚀斑杂交等，得到本发明的DNA。另外，可分析通过PCR所得的DNA片段的碱基序列，根据所得碱基序列设计外侧延长已知DNA用的PCR引物，用适当的限制酶消化生产羰基还原酶的微生物株的染色体DNA后，以DNA为模板，通过自身环化反应进行逆相PCR(Genetics 120，621-623(1988))，或者通过RACE法(Rapid Amplification of cDNA End，《PCRExperiment Manual》p 25-33，HBJ出版社)等获得本发明的DNA。
除了用上述方法克隆的基因组DNA或cDNA以外，由于本发明阐明了其碱基序列，所以可以序列号2为基础通过化学合成等获得本发明的DNA。
编码本发明多肽的DNA同源物包括编码包含下述氨基酸序列的多肽的DNA，该氨基酸序列是在不影响羰基还原酶活性的范围内，在序列号1的氨基酸序列中有一个或多个氨基酸发生缺失、添加或取代的氨基酸序列。作为编码上述多肽的DNA同源物，具体包括在序列号2的碱基序列所编码的多肽中，在不破坏羰基还原酶活性的范围内，序列号2的碱基序列中有一个或多个氨基酸发生缺失、添加或取代的碱基序列。这里，多个具体是指60个或60个以下，优选30个或30个以下，更优选10个或10个以下。
本领域技术人员可利用定点突变导入法(Nucleic Acid Res.10，pp.6487(1982)；Methodsin Enzymol.100，pp.448(1983)；Molecular Cloning 2ndEdt.，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)PCR A Practical Approach IRL Presspp.200(1991))等将适宜的取代、缺失、插入和/或附加突变导入序列号2的DNA中，得到本发明的DNA同源物。
另外，本发明的DNA同源物还可用编码本发明多肽的DNA或其一部分作探针，针对具有羰基还原活性的任意微生物来源的DNA，应用集落杂交法、蚀斑杂交法、或Southern印迹杂交法等，在严紧条件下进行杂交，获得杂交的DNA。编码本发明多肽的DNA的“一部分”是指，足够作为探针长度的DNA，具体是15bp或15bp以上，优选50bp或50bp以上，更优选100bp或100bp以上的DNA。
各种杂交可参照Molecular Cloning：A laboratory Mannual，2nd Ed.，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY.，1989(以后略作“MolecularCloning，2ndEd”.)记载的方法进行。
本说明书中“严紧条件下杂交的碱基序列”是指使用DNA作探针，在严紧条件下，应用集落杂交法、蚀斑杂交法、或Southern印迹杂交法等获得的DNA碱基序列。作为严紧条件包括，例如在集落杂交法和蚀斑杂交法中，用固定了集落或蚀斑来源的DNA或DNA片段的滤膜，在0.7-1.0M氯化钠的存在下于65℃进行杂交，然后用0.1-2×SSC溶液(1×SSC的组成是150mM氯化钠、15mM枸橼酸钠)在65℃的条件下洗涤滤膜。
将如上分离出的编码本发明多肽的DNA以可表达的方式插入到公知表达载体中，由此提供羰基还原酶表达载体。另外，通过培养用该表达载体转化的转化体，可从该转化体获得羰基还原酶。作为表达载体，只要是可表达本发明DNA的载体即可，对此无特定限制，可根据所转化的宿主微生物的种类进行适当选择。或者，通过将本发明的DNA以可表达的方式整合到公知宿主的染色体DNA中而获得转化体。
作为转化体的制备方法，具体而言，将本发明的DNA导入在微生物中稳定存在的质粒载体或噬菌体载体中，将所构建的表达载体导入该微生物，或者将本发明的DNA直接导入宿主基因组中，然后进行转录、翻译。
当本发明的DNA不含有在宿主微生物中可表达的启动子时，可将适当的启动子插入到本发明DNA链的5’端上游，更优选将终止子插入到3’端下游。作为启动子和终止子，只要是在作为宿主应用的微生物中功能已知的启动子和终止子即可，无特殊限制。关于各种微生物中可利用的载体、启动子和终止子，例如在《微生物学基础讲座8遗传子工学，共力出版》中有详细论述，在Adv.Biochem.Eng.43，75-102(1990)；Yeast 8，423-488(1992)等有特别关于酵母的论述。
作为能表达本发明羰基还原酶的转化对象的宿主微生物，无特殊限制，只要宿主自身对本反应不带来负面影响即可，具体而言，包括如下所示微生物。
属于大肠杆菌属(Escherichia)、杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、杀雷氏菌属(Serratia)、短杆菌属(Brevibacterium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、链球菌属(Streptococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)等的确立了宿主载体体系的细菌。
属于红球菌属(Rhodococcus)、链霉菌属(Streptomyces)等的确立了宿主载体体系的放线菌。
属于酵母属(Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、Yarrowia属、毛孢子菌属(Trichosporon)、红冬孢酵母(Rhodosporidium)、汉逊酵母属(Hansenula)、毕赤酵母属(Pichia)、假丝酵母属(Candida)等的确立了宿主载体体系的酵母。
属于脉胞菌属(Neurospora)、曲霉属(Aspergillus)、头胞属(Cephalosporium)、木霉属(Trichoderma)等的确立了宿主载体体系的霉菌。
作为宿主，上述微生物中优选大肠杆菌属、杆菌属、短杆菌属、棒状杆菌属，特别优选大肠杆菌属、棒状杆菌属。
制备转化体的过程、适于宿主的重组载体的构建及宿主的培养方法，可按照分子生物学、生物工程学、基因工程学领域中常用的技术手段进行(例如，Sambrook等，Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory)。
以下，对优选的宿主微生物、各微生物中优选的转化技术、载体、启动子、终止子等进行具体说明，但本发明并不限定于这些例子。
大肠杆菌属，特别是大肠埃希氏菌(Escherichia coli)中，质粒载体包括pBR、pUC系质粒，lac(β-半乳糖苷酶)、trp(色氨酸操纵子)、tac、trc(lac、trp的融合)、λ噬菌体PL、PR等来源的启动子等。另外，终止子包括trpA来源、噬菌体来源、rrnB核糖体RNA来源的终止子等。
杆菌属中可应用pUB110系质粒、pC194系质粒等作载体，另外，还可整合到染色体中。作为启动子和终止子可利用碱性蛋白酶、中性蛋白酶、α-淀粉酶等酶基因的启动子和终止子等。
假单胞菌属中，作为载体，可以列举用恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)、洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)等确立的一般宿主载体系统，或以参与甲苯化合物分解的质粒、TOL质粒为基础的广宿主范围载体(包含来自RSF1010等的自主复制所需的基因)pK240(Gene，26，273-82(1983))。
短杆菌属，特别是乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)中，可例举pAJ43(Gene 39，281(1985))等质粒载体作为载体。作为启动子和终止子，可利用大肠杆菌中所使用的各种启动子和终止子。棒状杆菌属，特别是谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)中，作为载体包括pCS11(特开昭57-183799号公报)、pCB101(Mol.Gen.Genet.196，175(1984)等质粒载体。
酵母(Saccharomyces)属，特别是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，作为载体包括YRp系、YEp系、YCp系、YIp系质粒。另外，可利用醇脱氢酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、酸性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、磷酸甘油酸激酶、烯醇化酶等各种酶基因的启动子和终止子。
裂殖酵母(Schizosaccharomyces)属中可用Mol.Cell.Biol.6，80(1986)中记载的来自粟酒裂殖酵母的质粒载体作载体。
曲霉菌属中，黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)等是霉菌中研究最多的，可利用质粒和与染色体的整合，可利用细胞外蛋白酶和淀粉酶来源的启动子(Trends in Biotechnology 7，283-287(1989))。
除此之外，可建立与各种微生物相适应的宿主载体体系，适当使用。此外，除微生物以外可建立植物、动物中的各种宿主载体体系，尤其是构建在昆虫蚕等的动物中(Nature 315，592-594(1985))、菜种、玉米、马铃薯等植物中大量表达异种蛋白质的体系，以及应用大肠杆菌无细胞提取液和小麦胚芽等无细胞蛋白质合成体系的体系，适当应用。
本发明还涉及制备光学活性醇的方法，该方法以下列通式(I)、(II)及(III)所示的化合物为反应底物，将用上述方法获得的本发明的转化细胞、该转化细胞的培养物、该转化细胞的处理物作用于上述化合物，使该化合物的羰基不对称还原。转化细胞、该转化细胞的培养物、该转化细胞的处理物每一种均可单独使用，也可联合使用。
式(I)
(式中，R为氢原子、烷基或芳基)；
式(II)
(式中，R与上述意思相同)；
式(III)
(式中，R与上述意思相同)。
在本发明制备方法所用的原料式(I)～(III)所示的化合物中，R表示氢原子、烷基或芳基。
作为烷基，可以是甲基、乙基、异丙基、环丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、环己基、苄基、苯乙基等可以被烷基或芳基取代的直链、支链或环状的烷基。
作为芳基，包括苯基、2，4，6-三甲苯基、萘基等可以被烷基取代的苯基或萘基。
上述R优选C1-C4的烷基、苄基或苯基，更优选C1～C4的烷基，特别优选甲基或乙基。
本发明的制备方法中，上述式(II)和(III)表示的化合物至少包含下式(II′)和(III′)中表示的光学活性体。优选上述式(II)和(III)表示的化合物中式(II′)和(III′)的含量较多。更优选上述式(II)和(III)表示的化合物由下式(II′)和(III′)构成。下式(II′)和(III′)表示的化合物中R与上述意思相同。
(式中，R与上述意思相同)；
(式中，R与上述意思相同)。
根据本发明的制备方法，从式(I)～(III)及(II′)～(III′)所表示的化合物得到的产物可为混合物，但至少包含下式(IV)。下式(IV)表示的化合物中R与上述意思相同。
(式中，R与上述意思相同)。
式(I)～(III)及(II′)～(III′)表示的化合物，可通过将特开平1-279866号公报、特开平8-127585号公报、特开平5-178841号公报等中记载的方法与公知的方法组合任意制备。可使用1种或多种上述化合物作为原料。
作为原料，用(I)表示的化合物制备(IV)表示的化合物时，作为中间体，有时式(II′)表示的化合物为中间体，有时式(III′)表示的化合物为中间体。
可从(I)表示的化合物预先制备式(II′)表示的化合物和式(III′)表示的化合物，将其分离，再衍生成(IV)表示的化合物；也可不分离(II′)表示的化合物和(III′)表示的化合物，而直接制备(IV)表示的化合物。
反应底物，通常底物浓度为0.01-90w/v％，优选0.1-30w/v％。底物可在反应开始时一次性添加，但从减轻酶底物抑制时的影响和提高产物的蓄积浓度的观点来考虑的话，希望连续或间歇性地添加。
本发明的制备方法中，将上述转化体作用于含羰基化合物时，可直接使用该转化体细胞，或使用该转化体细胞培养物、或将该转化体细胞用公知的方法进行处理得到的转化体细胞处理物，例如，将该转化体细胞用丙酮、二甲基亚砜(DMSO)、甲苯等有机溶剂或表面活性剂进行处理的处理物，冷冻干燥处理物，用物理或酶进行破碎等细胞处理物，将该转化体细胞中的本发明的酶级分以粗制物或纯化物的形式取出，然后将它们固定到以聚丙烯酰胺凝胶、角叉菜胶等为代表的载体上使用。
另外，本发明的制备方法中，优选添加辅酶NADP+或NADPH，通常添加0.001mM～100mM，优选0.01～10mM。
添加上述辅酶时，由于从NADPH生成的NADP+可再生成NADPH，所以可提高生产效率，作为再生方法，包括1)利用宿主微生物自身的NADP+还原能力的方法；2)向反应体系中添加具有从NADP+生成NADPH能力的微生物和其处理物，或者添加葡萄糖脱氢酶、蚁酸脱氢酶、醇脱氢酶、氨基酸脱氢酶、有机酸脱氢酶(苹果酸脱氢酶等)等可用于NADPH再生的酶(再生酶)的方法；3)在制备转化体时，将上述可用于NADPH再生的酶(再生酶)的基因与本发明的DNA同时导入宿主。
其中，上述1)的方法中，优选向反应体系中添加葡萄糖、乙醇、蚁酸等的方法。
上述2)的方法中，可应用含上述再生酶类的微生物、用丙酮处理该微生物细胞的产物、冷冻干燥处理物、物理性或用酶进行破碎等的细胞处理物、将该酶级分以粗提物或纯化物的形式取出的产物，再将它们固定到以聚丙烯酰胺、角叉菜胶等为代表的载体上使用。还可应用商品化的酶。
此时，上述再生酶的用量，具体地讲，以酶活性计，为本发明羰基还原酶的0.01-100倍、优选0.5-20倍的量。
另外，有必要添加上述再生酶的底物化合物，例如利用葡萄糖脱氢酶时添加葡萄糖，利用蚁酸脱氢酶时添加蚁酸，利用醇脱氢酶时添加乙醇或异丙醇等。相对于反应原料含羰基化合物，其添加量为0.1-20倍摩尔当量，优选1-5倍摩尔当量。
另外，上面3)的方法中，将本发明的DNA与上述再生酶类的DNA重组到染色体中的方法，可采用将两种DNA导入同一载体中转化宿主的方法，以及将两种DNA分别单独导入载体然后转化宿主的方法。当采用将两种DNA分别单独导入载体然后转化宿主的方法时，有必要考虑两个载体间的不相容性来选择载体。
当将多个基因导入单一载体中时，可以采用将启动子和终止子等与表达调控相关的区域分别连接到各个基因的方法和以包含例如乳糖操纵子等多个顺反子的操纵子形式进行表达的方法。
本发明的制备方法在含有反应底物与本发明的转化体细胞、该转化体细胞培养物或该转化体细胞处理物，以及根据需要添加的各种辅酶及其再生系统的水性介质中或该水性介质与有机溶剂的混合物中进行。作为上述水性介质，可以用使用了磷酸钠或磷酸钙等的缓冲液等，该缓冲液中可适当添加有机溶剂或表面活性剂等普通酶反应中应用的任意成分。作为有机溶剂，包括二甲基亚砜(DMSO)和四氢呋喃(THF)等水溶性溶剂，或醋酸丁酯、己烷等非水溶性有机溶剂等，优选使用反应底物溶解度高的溶剂。表面活性剂包括吐温Tween 80和糖酯等。
本发明的方法通常在4-60℃进行，优选0-45℃的反应温度；通常pH在3-11，优选pH为5-8。另外可利用膜反应器等进行。
通过本发明方法生成的光学活性醇可以如下进行纯化：在反应终止后，将反应液中的细胞或蛋白质离心分离，并通过膜处理分离，然后适当组合进行利用醋酸乙酯、甲苯等有机溶剂的提取、蒸馏、柱色谱、晶析等。
实施例
以下列举实施例对本发明进行更具体说明。但只要不离开其要点，可在本发明的技术领域中进行常规变更。
另外，(E)-7-[2-环丙基-4-(4-氟苯基)-喹啉-3-基]-3，5-二羟基庚-6-烯酸酯除了3R，5S外，作为异构体还存在3S，5R体、3R，5R体及3S，5S体，以(E)-7-[2-环丙基-4-(4-氟苯基)-喹啉-3-基]-3，5-二羟基庚-6-烯酸酯(以后略作DOLE)为例，其结构式如下。
3S，5R-DOLE与3R，5S-DOLE为DOLE的顺式(Syn)异构体，3S，5S-DOLE与3R，5R-DOLE为DOLE的反式(anti)异构体。
实施例中，作为目的产物的3R，5S体的纯度用对映体过剩率表示，本实施例中用(3R，5S体-3S，5R体)/(3R，5S体+3S，5R体)(％e.e.)表示对映体过剩
Syn-DOLE
3S，5R-DOLE 3R，5S-DOLE
anti-DOLE
3S，5S-DOLE ·3R，5R-DOLE
率。
<制备例1>(E)-7-[2-环丙基-4-(4-氟苯基)-喹啉-3-基]-3，5-二氧代(oxo)庚-6-烯酸酯(以后略作DOXE)的合成
往带有搅拌机、滴液漏斗和温度计的500mL四颈烧瓶中加入(E)-7-[2-环丙基-4-(4-氟苯基)-喹啉-3-基]-5-羟基-3-氧代庚-6-烯酸酯(以后略作5-MOLE)5.02g(11.22mmol)和420mL丙酮并搅拌。在0℃用20分钟滴加配制的Jones氧化剂(浓硫酸3mL和3.35g氧化铬混和后，用水稀释到25mL而得到的试剂)10.5mL，在冰冷下搅拌2小时，然后缓慢加入甲醇10mL终止反应。接着在减压下将丙酮从反应混和液中馏去后，加入醋酸乙酯250mL，用饱和碳酸氢钠水溶液60mL对所得溶液提取两次，然后用饱和食盐水60mL提取两次，分液后用无水硫酸镁干燥醋酸乙酯溶液，馏去溶剂后，用硅胶色谱(洗脱溶剂：己烷∶醋酸乙酯＝2∶1)进行纯化，得到标题化合物3.03g(收率：60.6％)。
1H-NMR(300MHz，CDCl3，δppm)：7.79-7.19(8H，m)，7.71(1H，d)，6.03(1H，d)，5.51(1H，s)，4.21(2H，q)，3.40(2H，s)，2.35-2.40(1H，m)，1.39-1.41(2H，m)，1.28(3H，t)，1.07-1.09(2H，m).
<制备例2>5S-(E)-7-[2-环丙基-4-(4-氟苯基)-喹啉-3-基]-5-羟基-3-氧-庚-6-烯酸酯(以后略作5S-MOLE)的合成
往减压加热干燥后充入了氮气的Schlenk管中加入(S)-2-[N-3-甲基-5-叔-丁基亚水杨基(サリチデン)氨基]-3-甲基-丁醇0.87g(3.3mol)、二氯甲烷5ml和四乙氧基钛0.63mL(6.0mmoL)，室温搅拌1小时。将该Schlenk管冷却到-50℃后，将(E)-3-[2-环丙基-4-(4-氟苯基)-喹啉-3-基]-丙-2-烯-1-醛0.95g(3.0mmoL)溶于2ml二氯乙烷中并滴下，搅拌5分钟后，添加双烯酮(diketene)0.51g(6mmoL)，保持在-50℃，搅拌22小时进行反应。将所得混和液添加到二氯甲烷25ml和0.24M碳酸氢钠水溶液25mL的混合溶液中，室温剧烈搅拌2小时，得到2层溶液。将所得2层溶液分液，用二氯甲烷10ml提取水层2次。合并二氯甲烷层和二氯甲烷提取液，得到二氯甲烷溶液。用无水硫酸镁干燥，馏去溶剂后，用硅胶色谱(洗脱溶剂：己烷∶醋酸乙酯＝3∶2)纯化，得到5S-(E)-7-[2-环丙基-4-(4-氟苯基)-喹啉-3-基]-5-羟基-3-氧-庚-6-烯酸酯(5S-MOLE)0.75g(光学纯度：73％e.e.，相对(E)-3-[2-环丙基-4-(4-氟苯基)-喹啉-3-基]-丙-2-烯-1-醛的回收率为56％)。
<实施例1>羰基还原酶的分离
用20L YM培养基(葡萄糖24g、酵母提取物3g、麦芽提取物3g、蛋白胨5g/L、pH 6.0)培养Ogataea minuta var nonfermentans IFO 1473株，通过离心分离制备细胞。用50mM磷酸钾缓冲液(PH 7.0、1mM DTT)悬浮所得湿细胞中的300g，用ダイノ-ミル(DyNO-MILL公司)破碎后，通过离心分离除去细胞残渣，获得无细胞提取液。向该无细胞提取液中加入12％w/v的聚乙二醇(PEG)6000，离心分离获得上清。将该上清加到用标准缓冲液(10mM磷酸钾缓冲液(pH 7.0)、1mM DTT)平衡过的DEAE Sepharose6FF(2.6cm×28cm)中。用标准缓冲液洗涤柱子后，再用含0.07M氯化钠的标准缓冲液洗涤，用0.07～0.18M氯化钠进行梯度洗脱。回收洗脱的级分，测定羰基还原酶活性。
羰基还原酶活性测定通过将以下反应液在30℃振荡反应一晚上进行：向200μL酶活测定级分中加入含有8mM NADPH的0.1mM氢氧化钾水溶液10μL、0.1M磷酸缓冲液(pH 7.0)25μL、20g/L DOXE(DMSO溶液)10μL。用以下方法进行活性检测：向反应终止后的反应液中加入0.5mL醋酸乙酯并剧烈混合，通过离心分离分为有机层和水层。将有机层移到其它容器中，用浓缩离心机馏去溶剂，用0.01mL醋酸乙酯溶解干涸的生成物，进行薄层层析(TLC)。TLC使用硅胶板(メルク公司silica gel 60 F254)，展开剂为己烷/醋酸乙酯＝1/1。展开后，用紫外灯确认生成物。化合物(I)Rf＝0.76～0.86，化合物(II)和化合物(III)Rf＝0.54～0.61，化合物(IV)(式中，R＝乙基的化合物：DOLE)Rf＝0.33。
在0.13M氯化钠附近可看到羰基还原酶活性的峰。回收洗脱出的活性级分，添加硫酸铵使其终浓度为0.3M，然后将其加到用含0.3M硫酸铵的标准缓冲液(10mM磷酸钾缓冲液(PH7.0)、1mM DTT))平衡过的辛基-SepharoseCL4B(0.8cm×20cm)柱上，用0.3-0M浓度的硫酸铵进行梯度洗脱。在0M硫酸铵附近可可看到羰基还原酶活性的峰。
回收洗脱的峰部分，通过超滤脱盐、浓缩至标准溶液后，加到用相同缓冲液平衡过的MonoQ HR5/5中，用相同缓冲液及含0.05M氯化钠的同种缓冲液洗涤后，用0.05M-0.25M的氯化钠进行浓度梯度洗脱。由于在0.17M氯化钠的洗脱级分中存在羰基还原酶活性，所以回收该级分，浓缩。用Superdex200 HR10/30、含0.15M氯化钠的标准缓冲液对浓缩的酶液进行凝胶过滤。通过凝胶过滤所得的活性级分的分子量为10.7万Da。
此外，用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析上述活性级分，结果基本上为单一条带，其分子量约2.7万Da。
此外，通过该酶与多种酮或醛进行反应测定其还原活性，具体而言，用0.1M磷酸缓冲液(pH 7.0)将100mM底物的异丙醇溶液5μL与包含8mMNADPH和0.1mM氢氧化钾的水溶液10μL调配成总量为250μL的反应液，测定其中NADPH的减少初速度。此时，以2，2，2-三氟苯乙酮的吸光度变化量为100，其比活性如表1所示。
表1
| 底物 | 比活性(％) |
| 邻-硝基苯甲醛 | 52.6 |
| 间-硝基苯甲醛 | 45.6 |
| 邻-氯苯甲醛 | 81.2 |
| 间-氯苯甲醛 | 14.3 |
| 对-氯苯甲醛 | 15.2 |
| 二乙酰基(Diacetyl) | 12.3 |
| 2，3-戊二酮 | 21.5 |
| 3-氯-2，4-戊二酮 | 32.7 |
| 1-溴-3，3-二甲基-2-丁酮 | 55.4 |
| 乙基-3-甲基-2-氧代丁酸酯(oxobutanoate) | 72.1 |
| α-酮-泛内酯 | 26.3 |
| 2-氯-环己酮 | 163.0 |
| 2-氯-2-甲基-环己酮 | 105.4 |
| 苯基·乙基酮 | 18.8 |
| 苄基乙腈 | 25.9 |
| 乙基苯甲酰乙酸酯 | 10.9 |
| 间-氯-苯乙酮 | 30.7 |
| 对-氯-苯乙酮 | 10.2 |
| 间-溴-苯乙酮 | 21.3 |
| 2-氯-苯乙酮 | 19.6 |
| 2，2，2-三氟-苯乙酮 | 100.0 |
在pH不同的多种缓冲液中测定2，2，2-三氟苯乙酮还原活性，求出该酶的最适pH。具体而言，准备多种pH不同的0.1M磷酸钾缓冲液、醋酸钠缓冲液和柠檬酸缓冲液，测定其活性。反应的最适pH为5.0-6.5。
另外，仅变化反应温度，测定2，2，2-三氟苯乙酮还原活性。测定羰基还原酶的作用最适温度时，其最适温度为60-70℃。
该酶的pH稳定性如下测定：准备多种不同pH的0.1M磷酸钾缓冲液、醋酸钠缓冲液和柠檬酸缓冲液，分别在30℃温育30分钟，测定其残存活性，结果表明pH为5.5-6.5时最稳定。
在pH 7.0的20mM磷酸缓冲液中，于30℃、40℃、50℃、60℃、70℃和80℃的温度下分别放置10分钟，然后测定2，2，2-三氟苯乙酮还原活性，以检测该酶的温度稳定性。结果表明，本发明的酶在40℃或40℃以下显示79％以上的残存活性，在50℃以上时开始迅速失活，到70℃时活性全无。
另外，在多种试剂中将该酶于30℃处理10分钟后，测定2，2，2-三氟苯乙酮还原活性时发现，在硝酸汞或氯化铅等的汞(I)离子、铅(II)离子存在下，该酶的活性显著受到抑制。
<实施例2>羰基还原酶的部分氨基酸序列解析
将实施例1中所得含羰基还原酶的级分脱盐、浓缩后，用赖氨酸残基肽酶在30℃整夜处理。用逆相HPLC(アマシヤム-フアルマシア制uRPCC2/C18、46mm×100mm)分析消化的肽，通过在0.1％三氟醋酸(TFA)中的乙腈梯度洗脱将肽分离、分级。分级所获得的3种肽峰为Frac20、27和30，分别用Edman法分析其氨基酸序列。Frac20、27和30的氨基酸序列分别示于序列号3、4、5中。同样地，将含羰基还原酶的级分脱盐后，用Edman法分析其N末端的氨基酸序列，结果如序列号6所示。
<实施例3>Ogataea minuta var nonfermentans IFO 1473株来源的本发明DNA的序列分析及转化体的制备
用YM培养基培养Ogataea minuta var nonfermentans IFO 1473株，制备细胞。
应用MagExtractor(东洋纺社制)从细胞中纯化总RNA。以纯化的RNA为基础，用SuperScriptII(Life Technology社制)合成第一链cDNA。方法分别按照说明书进行。
根据实施例2中所得N末端氨基酸序列合成正义简并引物，根据序列号3、4和5的氨基酸序列分别设计反义简并引物，共4种引物。其碱基序列分别示于序列号7、8、9、10中。以N末端与3个部分氨基酸序列的组合(3种)选择引物。用含引物各400pmoL、dNTP 0.4mmoL、上述合成的Ogataeaminuta var nonfermentans IFO 1473株的cDNA 1μL、TaKaRa Taq用10×缓冲液(宝酒造社制)5μL及耐热性DNA聚合酶2U(宝酒造社制，商品名“TaKaRa Taq”)的50μL反应液，用PTC-200 Peltier Thermal Cycler (MJResearch社制)进行变性(94℃、30秒)、退火(50℃、30秒)、延长(72℃、1分)30个循环。取一部分PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳，结果序列号7的引物与序列号8的引物、序列号7的引物与序列号9的引物、序列号7的引物与序列号10的引物组合时可检测出被视为特异性的条带。
将上面所得3种DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳，切出目的条带的一部分，用Gel Extraction试剂盒(QIAGEN社制)纯化、回收。用pGEM-T VectorSystem(Promega社制)对所得DNA片段进行TA克隆，转化大肠杆菌DH5α株(东洋纺社制)。向含1％细菌用胰蛋白胨、0.5％细菌用酵母提取物和1％氯化钠的培养基(以下、略作LB培养基)中加入氨苄青霉素(100μg/mL)，用1.5％细菌培养用琼脂铺板，让转化株在板上生长，应用几个集落，以根据载体序列合成的序列号11和12作引物，进行集落直接(colony direct) PCR，确认插入片段的大小。用含100μg/mL氨苄青霉素的液体LB培养基培养认为插入了目的DNA片段的集落，用Mini-Prep(QIAGEN制)纯化质粒。序列号7的引物与序列号8的引物、序列号7的引物与序列号9的引物、序列号7的引物与序列号10的引物组合所得质粒分别命名为phir21-23、phir21-25、phir21-27。
用纯化质粒通过双终止子法分析插入DNA的碱基序列。所测定的phir21-23、phir21-25、phir21-27的各插入片段部分的碱基序列分别示于序列号13、14、15。
用根据上述碱基序列设计的引物，对从Ogataea minuta var nonfermentansIFO 1473株制备的总RNA进行5’RACE法及3’RACE法。
5’RACE法是用序列号16、17中所示碱基序列的引物作为基因特异性引物(以下略作GSP)1、2，用5’RACE System for Rapid Amplificationof cDNA Ends、ver 2.0(Life Technology公司)进行后，以此为模板再度用序列号18中所示碱基序列的引物作GSP进行5’RACE。
3’RACE是用序列号19中所示碱基序列的引物作GSP，用3’RACESystem for Rapid Amplification of cDNA Ends、ver 2.0(LifeTechnology公司)进行。各RACE法按各自的说明书进行。
用pGEM-T Vector System(Promega社制)对所得DNA片段进行TA克隆，转化大肠杆菌DH5α(东洋纺社制)。让转化株在含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基平板上生长，用几个集落，用从载体序列合成的序列11、12作引物进行集落直接PCR，确认插入片段的大小。用含100μg/mL氨苄青霉素的液体LB培养基培养认为插入了目的DNA片段的集落，用Mini-Prep(QIAGEN)纯化质粒后，通过双终止子法分析DNA碱基序列。
用Genetyx(ソフトウエア开发株式会社制)对以通过上述5’RACE和3’RACE所得的phir21-25的5′上游碱基序列和3′下游碱基序列、以及序列号14中的碱基序列为基础制备的DNA序列进行ORF检索，本发明的DNA序列及其编码的蛋白质的氨基酸序列暂定为序列号20所示碱基序列及氨基酸序列。
用序列号20中的氨基酸序列，以DDBJ为对象，用BLAST program进行同源性检索，结果在已知蛋白质中，显示最高同源性的是粟酒裂殖酵母的可能的短链脱氢酶(T41540)，同源性为37.4％。接下来，以序列号20中的序列为基础合成序列号21和序列号22的碱基序列作为克隆用的引物，用含上述引物各50pmol、dNTP 200nmol、Ogataea minuta var nonfermentans IFO1473株的cDNA 1μL、KOD-DNA polymerase用10×缓冲液(东洋纺社制)5μL、KOD-DNA polymerase 2.5U(东洋纺社制)的50μL反应液，用PTC-200Peltier Thermal Cycler(MJ Research社制)，进行变性(96℃、30秒)、退火(54℃、30秒)、延长(74℃、1分)30个循环。取PCR反应液的一部分进行琼脂糖凝胶电泳分析，结果可检测出被视为特异性的条带。
用QIAGEN Gel Extraction试剂盒(キアゲン社制)回收上述检测出的条带部分。用限制酶HindIII和EcoRI消化回收的DNA片段，进行琼脂糖凝胶电泳，切出部分目的条带，再度用Qiagen Gel Extraction试剂盒(キアゲン社制)纯化后回收。用Takara Ligation Kit连接所得DNA片段与用EcoRI和HindIII消化的pKK223-3(Pharmacia公司)，转化大肠杆菌JM109。
在含氨苄青霉素(50μg/mL)的LB培养基平板上培养转化体，用几个集落，用从载体序列合成的序列号23所示的引物序列和序列号24所示的引物序列进行集落直接PCR，确认插入片段的大小。
用含氨苄青霉素50μg/mL的LB液体培养基培养认为插入了目的DNA片段的转化体，用Qiagen 500(QIAGEN社制)纯化质粒，命名为pKK223-3OCR1。
用双终止子法分析插入到质粒中的DNA的碱基序列，结果表明，所插入的DNA片段具有由如下碱基序列组成的核苷酸序列：其5’上游添加了用于克隆的6个碱基的序列2所示碱基序列、Ogataea minuta var nonfermentansIFO1473来源的双终止密码子(TAGTAAT)以及其3’下游用于克隆的6个碱基。
插入到PKK233-3OCR1的DNA片段的碱基序列示于序列号25中，该DNA片段编码的蛋白质的氨基酸序列示于序列号1中。
<实施例5>用本发明DNA转化的大肠杆菌由DOXE制备DOLE
用含氨苄青霉素(50μg/mL)、0.1mM异丙醇、β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的LB培养基，在37℃将实施例4中所得的转化体培养17小时，将2mL所得细胞培养液(cell broth)通过离心分离收集细胞，然后悬浮到180μL100mM磷酸钾缓冲液(pH 7.0)中后，通过下述方法，以(E)-7-[2-环丙基-4-(4-氟苯基)-喹啉-3-基]-3，5-二氧代庚-6-烯酸酯(DOXE)为底物，确认还原活性。
向上述细胞悬浮液中添加2g/L NADP+(オリエンタル酵母社制)10μL、甲苯1μL后，用涡流搅拌机搅拌5分钟。添加50％葡萄糖10μL、葡萄糖脱氢酶溶液(天野制药社制；25U/mL)10μL、将上述底物以20g/L溶解到DMSO中的产物50μL(底物1mg的份量)后，在40℃振荡反应20小时。向反应终止后的反应混悬液中添加乙腈1.75mL稀释后离心，用高效液相色谱(HPLC)测定上清中的生成物。HPLC的条件如下：
柱：MCIGEL CHP2MGM(三菱化学社制)
洗脱液：甲醇/乙腈/水/磷酸＝800/100/100/1
流速：0.6ml/min
检测：UV254nm
温度：60℃
结果收量为319μg，收率为31.9％。
另外，为了测定光学纯度，向反应终止后的反应液中添加0.5mL醋酸乙酯并剧烈混合，离心分离成有机层和水层，将有机层转移到别的容器中，用浓缩离心机馏去溶剂，用醋酸乙酯0.01mL溶解干固的生成物，进行薄层层析(TLC)。TLC用硅胶板(メルク社制silica gel 60 F254)，展开剂为己烷/醋酸乙酯＝1/1。
展开终止后，用UV灯确认生成物。化合物(I)的Rf＝0.76～0.86，化合物(II)和化合物(III)的Rf＝0.54～0.61，化合物(IV)(式中，R＝乙基的化合物：以下略作DOLE)的Rf＝0.33。刮取TLC上DOLE的点，用异丙醇0.25mL洗脱，离心分离后用高效液相色谱(HPLC)对上清进行光学纯度和TLC刮取样品的浓度分析。
HPLC的条件如下：
柱：ダイセルCHIRALCEL AD
洗脱液：己烷/乙醇/三氟醋酸＝900/100/1
流速：1ml/min
检测：UV 254nm
温度：室温
结果，光学纯度为100％e.e.，反式体异构体为0.6％。
另外，用添加了0.1mM IPTG的LB培养基整夜培养持有不含该基因的质粒pKK223-3的大肠杆菌，对细胞进行同样地反应，但未见到上述生成物。
<实施例6>用本发明DNA转化的大肠杆菌由5S-MOLE制备DOLE
用含氨苄青霉素(50μg/mL)、0.1mM异丙醇、β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的LB培养基将实施例4中所得的转化体在37℃培养17小时，将2mL所得细胞培养液通过离心分离收集细胞后，悬浮到180μL100mM磷酸钾缓冲液(pH 7.0)中，然后通过下述方法，以5S-(E)-7-[2-环丙基-4-(4-氟苯基)-喹啉-3-基]-5-羟基-3-氧代-庚-6-烯酸酯(5S-MOLE)为底物，确认还原活性。
向上述细胞悬浊液中添加2g/L NADP+(オリエンタル酵母社制)10μL、甲苯1μL后，用涡流搅拌机搅拌5分钟。添加50％葡萄糖10μL、葡萄糖脱氢酶溶液(天野制药社制；25U/mL)10μL、将上述底物以20g/L溶解到DMSO中的产物50μL(底物1mg的份量)后，在40℃振荡反应20小时。用乙腈稀释反应终止后的反应混悬液后离心，用高效液相色谱(HPLC)测定上清中的生成物。HPLC的条件如下：
柱：コスモシル5C18MS-II 4.6×250mm(ナカライ社制)
洗脱液：甲醇/乙腈/水/磷酸＝350/150/500/1
流速：0.6ml/min
检测：UV254nm
温度：60℃
结果收量为807μg，收率为80.7％，反式异构体为15.3％。
另外，为了测定光学纯度，向反应终止后的反应液中添加0.5mL醋酸乙酯并剧烈混合，离心分离成有机层和水层。将有机层转移到别的容器中，用浓缩离心机馏去溶剂，用醋酸乙酯0.01mL溶解干固的生成物，进行薄层层析(TLC)。TLC用硅胶板(メルク社制silica gel 60 F254)，展开剂为己烷/醋酸乙酯＝1/1。
展开终止后，用UV灯确认生成物。化合物(I)的Rf＝0.76～0.86，化合物(II)和化合物(III)的Rf＝0.54～0.61，化合物(IV)(式中，R＝乙基的化合物：以下略作DOLE)的Rf＝0.33。刮取TLC上的DOLE点，用异丙醇0.25mL洗脱，离心后用高效液相色谱(HPLC)对上清进行光学纯度和TLC刮取样品的浓度分析。
HPLC的条件如下：
柱：ダイセルCHIRALCEL AD
洗脱液：己烷/乙醇＝95/5
流速：1ml/min
检测：UV254nm
温度：50℃
结果光学纯度为97％e.e.，反式异构体为15.2％。
另外，用添加了0.1mM IPTG的LB培养基整夜培养持有不含该基因的质粒pKK223-3的大肠杆菌，对细胞进行同样地反应，但未见到上述生成物。
产业实用性
本发明提供可高光学纯度且高收率地得到光学活性醇类的制备方法，该物质是作为医药、农药等中间体原料而在产业上有用的化合物。
序列表
<110>三菱化学株式会社(Mitsubishi Chemical Corp.)
日产化学工业株式会社(Nissan Chemical Industries，LTD)
<120>新型羰基还原酶及其编码基因、以及利用它们制备光学活性醇的方法
<130>A30120P1525
<150>JP 2002-075921
<151>2002-03-19
<160>25
<210>1
<211>251
<212>PRT
<213>Ogataea minuta var nonfermentans
<400>1
Met Ala Lys Thr Val Tyr Phe Ile Ala Gly Ala Ser Arg Gly Ile Gly
1 5 10 15
Leu Glu Val Ala Ser Gln Leu Ser Ala Asn Pro Asp Asn Tyr Val Ile
20 25 30
Ala Ser Tyr Arg Ser Glu Lys Ser Ala Ser Gly Leu Leu Glu Leu Ala
35 40 45
Lys Lys Asp Asn Val Asp Thr Ile Val Leu Asp Ile Ala Ser Gln Glu
50 55 60
Ser Ile Asp Ala Val Pro Ala Gln Ile Ser Lys Leu Thr Asp Gly Ile
65 70 75 80
Asp Val Ala Leu Ile Asn Ala Gly Ile Ala Asn Ala Met Cys Pro Ile
85 90 95
Leu Glu Cys Ser Arg Glu Ser Tyr Thr Asp His Trp Thr Thr Asn Ala
100 105 110
Leu Gly Pro Ile Met Leu Tyr Gln Ala Ile His Lys Phe Met Leu Gln
115 120 125
Arg Glu Thr Arg Lys Val Phe Phe Thr Thr Ser Ala Gly Gly Ser Ile
130 135 140
Gln Ala Lys Ile Pro Val Pro Val Ser Gly Tyr Gly Met Ser Lys Ala
145 150 155 160
Ala Leu Asn Tyr Ala Val Arg Lys Leu Ala Asp Glu Cys Tyr Lys Asp
165 170 175
Asn Phe Thr Ile Val Leu Leu His Pro Gly Phe Val Lys Thr Asp Met
180 185 190
Gly Gln Ser Ala Ile Gln Lys Met Ser Asn Gly Asn Ala Glu Leu Leu
195 200 205
Ala Tyr Ile Asp Ser Met Thr Ile Asp Val Pro Thr Ser Ala Gly Gln
210 215 220
Ile Val Gly Ala Ile Met Thr Leu Asp Lys Gln Ser Ser Gly Arg Phe
225 230 235 240
Ile Asn Ala Ala Asp Gln Phe Asp Met Pro Phe
245 250
<210>2
<211>753
<212>DNA
<213>Ogataea minuta var nonfermentans
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(753)
<400>2
atg gct aaa act gtt tac ttc atc gca ggt gct tcc aga ggt atc ggt 48
Met Ala Lys Thr Val Tyr Phe Ile Ala Gly Ala Ser Arg Gly Ile Gly
1 5 10 15
ctc gag gtt gct tcc cag ctg agt gca aac cca gac aat tat gtt att 96
Leu Glu Val Ala Ser Gln Leu Ser Ala Asn Pro Asp Asn Tyr Val Ile
20 25 30
gca tcc tat aga tct gaa aag tct gct tca gga ctt ttg gag ctg gca 144
Ala Ser Tyr Arg Ser Glu Lys Ser Ala Ser Gly Leu Leu Glu Leu Ala
35 40 45
aag aag gat aat gtc gac aca att gtg ttg gat att gca agc cag gaa 192
Lys Lys Asp Asn Val Asp Thr Ile Val Leu Asp Ile Ala Ser Gln Glu
50 55 60
tcg att gat gct gtt cca gca cag att tcc aag ctg act gat gga atc 240
Ser Ile Asp Ala Val Pro Ala Gln Ile Ser Lys Leu Thr Asp Gly Ile
65 70 75 80
gat gtt gcc ttg atc aac gct gga att gcc aac gct atg tgt ccg att 288
Asp Val Ala Leu Ile Asn Ala Gly Ile Ala Asn Ala Met Cys Pro Ile
85 90 95
ctc gaa tgt tct aga gag tec tac act gat cac tgg aca acc aat gcc 336
Leu Glu Cys Ser Arg Glu Ser Tyr Thr Asp His Trp Thr Thr Asn Ala
100 105 110
ttg ggt cca atc atg ctc tac caa gct att cat aag ttc atg ctc cag 384
Leu Gly Pro Ile Met Leu Tyr Gln Ala Ile His Lys Phe Met Leu Gln
115 120 125
aga gag acc aga aaa gtg ttc ttt acc acg agt gct ggt ggt tcc att 432
Arg Glu Thr Arg Lys Val Phe Phe Thr Thr Ser Ala Gly Gly Ser Ile
130 135 140
cag gct aag ata ccc gtg cct gtg agt ggt tac ggt atg tcc aag gct 480
Gln Ala Lys Ile Pro Val Pro Val Ser Gly Tyr Gly Met Ser Lys Ala
145 150 155 160
gcg ctt aat tat gct gtg aga aaa ctt gct gac gag tgc tac aag gac 528
Ala Leu Asn Tyr Ala Val Arg Lys Leu Ala Asp Glu Cys Tyr Lys Asp
165 170 175
aac ttc act att gtg ttg ctg cat cct ggt ttt gtt aag acg gac atg 576
Asn Phe Thr Ile Val Leu Leu His Pro Gly Phe Val Lys Thr Asp Met
180 185 190
ggt caa agc gcc att cag aag atg tca aat gga aat get gag ctt ctt 624
Gly Gln Ser Ala Ile Gln Lys Met Ser Asn Gly Asn Ala Glu Leu Leu
195 200 205
gct tac att gac tca atg act att gat gtt cct acc agt gct ggc caa 672
Ala Tyr Ile Asp Ser Met Thr Ile Asp Val Pro Thr Ser Ala Gly Gln
210 215 220
atc gtc ggt gcc att atg acc ttg gac aag cag agc agc ggt aga ttt 720
Ile Val Gly Ala Ile Met Thr Leu Asp Lys Gln Ser Ser Gly Arg Phe
225 230 235 240
atc aac gct gct gac cag ttt gac atg cca ttt 753
Ile Asn Ala Ala Asp Gln Phe Asp Met Pro Phe
245 250
<210>3
<211>14
<212>PRT
<213>Ogataea minuta var nonfermentans
<400>3
Val Phe Phe Thr Thr Ser Ala Gly Gly Ser Ile Gln Ala Lys
1 5 10
<210>4
<211>16
<212>PRT
<213>Ogataea minuta var nonfermentans
<400>4
Gln Ser Ser Gly Arg Phe Ile Asn Ala Ala Asp Gln Phe Asp Met Pro
1 5 10 15
<210>5
<211>13
<212>PRT
<213>Ogataea minuta var nonfermentans
<400>5
Asp Asn Phe Thr Ile Val Leu Leu His Pro Gly Phe Val
1 5 10
<210>6
<211>20
<212>PRT
<213>Ogataea minuta var nonfermentans
<400>6
Ala Lys Thr Val Tyr Phe Ile Ala Gly Ala Ser Arg Gly Ile Gly Leu
1 5 10 15
Glu Val Ala Ser
20
<210>7
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<220>
<221>modified_base
<222>(3，9，12，24)
<223>n＝肌苷
<400>7
gcnaaracng tntayttyat hgcngg 26
<210>8
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<220>
<221>modified_base
<222>(4，13，16，19，22，25，28)
<223>n＝肌苷
<400>8
yttngcytgd atnswnccnc cngcnswng 29
<210>9
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<220>
<221>modified_base
<222>(1，19，22)
<223>n＝肌苷
<400>9
nggcatrtcr aaytgrtcng cngcrttdat ra 32
<210>10
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<220>
<221>modified_base
<222>(1，7，10，16，19，22，28)
<223>n＝肌苷
<400>10
nacraanccn ggrtgnarna rnacdatngt raa 33
<210>11
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>11
tatttaggtg acactatag 19
<210>12
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>12
taatacgact cactataggg 20
<210>13
<211>438
<212>DNA
<213>Ogataea minuta var nonfermentans
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(438)
<400>13
gcg aaa acg gtg tat ttc atc gcg ggt gct tcc aga ggt atc ggt ctc 48
Ala Lys Thr Val Tyr Phe Ile Ala Gly Ala Ser Arg Gly Ile Gly Leu
1 5 10 15
gag gtt gct tcc cag ctg agt gca aac cca gac aat tat gtt att gca 96
Glu Val Ala Ser Gln Leu Ser Ala Asn Pro Asp Asn Tyr Val Ile Ala
20 25 30
tcc tat aga tct gaa aag tct gct tca gga ctt ttg gag ctg gca aag 144
Ser Tyr Arg Ser Glu Lys Ser Ala Ser Gly Leu Leu Glu Leu Ala Lys
35 40 45
aag gat aat gtc gac aca att gtg ttg gat att gca agc cag gaa tcg 192
Lys Asp Asn Val Asp Thr Ile Val Leu Asp Ile Ala Ser Gln Glu Ser
50 55 60
att gat gct gtt cca gca cag att tcc aag ctg act gat gga atc gat 240
Ile Asp Ala Val Pro Ala Gln Ile Ser Lys Leu Thr Asp Gly Ile Asp
65 70 75 80
gtt gcc ttg atc aac gct gga att gcc aac gct atg tgt ccg att ctc 288
Val Ala Leu Ile Asn Ala Gly Ile Ala Asn Ala Met Cys Pro Ile Leu
85 90 95
gaa tgt tct aga gag tcc tac act gat cac tgg aca acc aat gcc ttg 336
Glu Cys Ser Arg Glu Ser Tyr Thr Asp His Trp Thr Thr Asn Ala Leu
100 105 110
ggt cca atc atg ctc tac caa gct att cat aag ttc atg ctc cag aga 384
Gly Pro Ile Met Leu Tyr Gln Ala Ile His Lys Phe Met Leu Gln Arg
115 120 125
gag acc aga aaa gtg ttc ttt acc acc acc gcc ggc ggc acc att cag 432
Glu Thr Arg Lys Val Phe Phe Thr Thr Thr Ala Gly Gly Thr Ile Gln
130 135 140
gcc aag 438
Ala Lys
145
<210>14
<211>747
<212>DNA
<213>Ogataea minuta var nonfermentans
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(747)
<400>14
gcg aaa acg gtg tat ttc atc gcg ggt gct tcc aga ggt atc ggt ctc 48
Ala Lys Thr Val Tyr Phe Ile Ala Gly Ala Ser Arg Gly Ile Gly Leu
1 5 10 15
gag gtt gct tcc cag ctg agt gca aac cca gac aat tat gtt att gca 96
Glu Val Ala Ser Gln Leu Ser Ala Asn Pro Asp Asn Tyr Val Ile Ala
20 25 30
tcc tat aga tct gaa aag tct gct tca gga ctt ttg gag ctg gca aag 144
Ser Tyr Arg Ser Glu Lys Ser Ala Ser Gly Leu Leu Glu Leu Ala Lys
35 40 45
aag gat aat gtc gac aca att gtg ttg gat att gca agc cag gaa tcg 192
Lys Asp Asn Val Asp Thr Ile Val Leu Asp Ile Ala Ser Gln Glu Ser
50 55 60
att gat gct gtt cca gca cag att tcc aag ctg act gat gga atc gat 240
Ile Asp Ala Val Pro Ala Gln Ile Ser Lys Leu Thr Asp Gly Ile Asp
65 70 75 80
gtt gcc tta atc aac gct gga att gcc aac gct atg tgt ccg att ctc 288
Val Ala Leu Ile Asn Ala Gly Ile Ala Asn Ala Met Cys Pro Ile Leu
85 90 95
gaa tgt tct aga gag tcc tac act gat cac tgg aca acc aat gcc ttg 336
Glu Cys Ser Arg Glu Ser Tyr Thr Asp His Trp Thr Thr Asn Ala Leu
100 105 110
ggt cca atc atg ctc tac caa gct att cat aag ttc atg ctc cag aga 384
Gly Pro Ile Met Leu Tyr Gln Ala Ile His Lys Phe Met Leu Gln Arg
115 120 125
gag acc aga aaa gtg ttc ttt acc acg agt gct ggt ggt tcc att cag 432
Glu Thr Arg Lys Val Phe Phe Thr Thr Ser Ala Gly Gly Ser Ile Gln
130 135 140
gct aag ata ccc gtg cct gtg agt ggt tac ggt atg tcc aag gct gcg 480
Ala Lys Ile Pro Val Pro Val Ser Gly Tyr Gly Met Ser Lys Ala Ala
145 150 155 160
ctt aat tat gct gtg aga aaa ctt gct gac gag tgc tac aag gac aac 528
Leu Asn Tyr Ala Val Arg Lys Leu Ala Asp Glu Cys Tyr Lys Asp Asn
165 170 175
ttc act att gtg ttg ctg cat cct ggt ttt gtt aag acg gac atg ggt 576
Phe Thr Ile Val Leu Leu His Pro Gly Phe Val Lys Thr Asp Met Gly
180 185 190
caa agc gcc att cag aag atg tca aat gga aat gct gag ctt ctt gct 624
Gln Ser Ala Ile Gln Lys Met Ser Asn Gly Asn Ala Glu Leu Leu Ala
195 200 205
tac att gac tca atg act att gat gtt cct acc agt gct ggc caa atc 672
Tyr Ile Asp Ser Met Thr Ile Asp Val Pro Thr Ser Ala Gly Gln Ile
210 215 220
gtc ggt gcc att atg acc ttg gac aag cag agc agc ggt aga ttc atc 720
Val Gly Ala Ile Met Thr Leu Asp Lys Gln Ser Ser Gly Arg Phe Ile
225 230 235 240
aac gcc gcc gac caa ttt gac atg ccc 747
Asn Ala Ala Asp Gln Phe Asp Met Pro
245
<210>15
<211>561
<212>DNA
<213>Ogataea minuta var nonfermentans
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(561)
<400>15
gcg aag acg gtg tac ttc atc gcg ggt gct tcc aga ggt atc ggt ctc 48
Ala Lys Thr Val Tyr Phe Ile Ala Gly Ala Ser Arg Gly Ile Gly Leu
1 5 10 15
gag gtt gct tcc cag ctg agt gca aac cca gac aat tat gtt att gca 96
Glu Val Ala Ser Gln Leu Ser Ala Asn Pro Asp Asn Tyr Val Ile Ala
20 25 30
tcc tat aga tct gaa aag tct gct tca gga ctt ttg gag ctg gca aag 144
Ser Tyr Arg Ser Glu Lys Ser Ala Ser Gly Leu Leu Glu Leu Ala Lys
35 40 45
aag gat aat gtc gac aca att gtg ttg gat att gca agc cag gaa tcg 192
Lys Asp Asn Val Asp Thr Ile Val Leu Asp Ile Ala Ser Gln Glu Ser
50 55 60
att gat gct gtt cca gca cag att tcc aag ctg act gat gga atc gat 240
Ile Asp Ala Val Pro Ala Gln Ile Ser Lys Leu Thr Asp Gly Ile Asp
65 70 75 80
gtt gcc ttg atc aac gct gga att gcc aac gct atg tgt ccg att ctc 288
Val Ala Leu Ile Asn Ala Gly Ile Ala Asn Ala Met Cys Pro Ile Leu
85 90 95
gaa tgt tct aga gag tcc tac act gat cac tgg aca acc aat gcc ttg 336
Glu Cys Ser Arg Glu Ser Tyr Thr Asp His Trp Thr Thr Asn Ala Leu
100 105 110
ggt cca atc atg ctc tac caa gct att cat aag ttc atg ctc cag aga 384
Gly Pro Ile Met Leu Tyr Gln Ala Ile His Lys Phe Met Leu Gln Arg
115 120 125
gag acc aga aaa gtg ttc ttt acc acg agt gct ggt ggt tcc att cag 432
Glu Thr Arg Lys Val Phe Phe Thr Thr Ser Ala Gly Gly Ser Ile Gln
130 135 140
gct aag ata ccc gtg cct gtg agt ggt tac ggt atg tcc aag gct gcg 480
Ala Lys Ile Pro Val Pro Val Ser Gly Tyr Gly Met Ser Lys Ala Ala
145 150 155 160
ctt aat tat gct gtg aga aaa ctt gct gac gag tgc tac aag gac aac 528
Leu Asn Tyr Ala Val Arg Lys Leu Ala Asp Glu Cys Tyr Lys Asp Asn
165 170 175
ttc acc att gtc ctc ttc cac ccc ggc ttc gtc 561
Phe Thr Ile Val Leu Phe His Pro Gly Phe Val
180 185
<210>16
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>16
agcagggccc ataacgttag caattcctgc 30
<210>17
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>17
gtgatgtcga tcccatccgt cagctgggag 30
<210>18
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>18
atttgggaac gcacaccctc aattgactcc 30
<210>19
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>19
cttgctgacg agtgctacaa ggac 24
<210>20
<211>1158
<212>DNA
<213>Ogataea minuta var nonfermentans
<220>
<221>CDS
<222>(114)..(876)
<400>20
aactccgtgt aagaattcag atctaggggc ctagaatttg aaatttcttg aaagatcgat 60
atgactgaaa tactataaaa gaagctgggt ttccgggtat atctcatagc atc atg 116
Met
1
gct aaa act gtt tac ttc att gct ggt gct tct aga ggt atc ggc ctc 164
Ala Lys Thr Val Tyr Phe Ile Ala Gly Ala Ser Arg Gly Ile Gly Leu
5 10 15
gag gtt gcc acc caa ttg agt tcc aac cct gat aat tat gtt ata gga 212
Glu Val Ala Thr Gln Leu Ser Ser Asn Pro Asp Asn Tyr Val Ile Gly
20 25 30
tcg tac aga tct aaa aag agc gct tcc gct cta atg gaa tta gcc aag 260
Ser Tyr Arg Ser Lys Lys Ser Ala Ser Ala Leu Met Glu Leu Ala Lys
35 40 45
aag gaa aat gtg gat acg gtc att ctg gac att gcc agc cag gag tca 308
Lys Glu Asn Val Asp Thr Val Ile Leu Asp Ile Ala Ser Gln Glu Ser
50 55 60 65
att gag ggt gtg cgt tcc caa atc tcc cag ctg acg gat ggg atc gac 356
Ile Glu Gly Val Arg Ser Gln Ile Ser Gln Leu Thr Asp Gly Ile Asp
70 75 80
atc aca ttg atc aat gca gga att gct aac gtt atg ggc cct gct gct 404
Ile Thr Leu Ile Asn Ala Gly Ile Ala Asn Val Met Gly Pro Ala Ala
85 90 95
acc acc tct aga gaa gat tat gtt act cac tgg acc acc aat gct cta 452
Thr Thr Ser Arg Glu Asp Tyr Val Thr His Trp Thr Thr Asn Ala Leu
100 105 110
ggt cca atc atg gtg tac aag gag atc cac gaa ttg atg ttg aag aag 500
Gly Pro Ile Met Val Tyr Lys Glu Ile His Glu Leu Met Leu Lys Lys
115 120 125
gat act aga aag gta ttc ttt act acg agt gct ggt ggt tcc att cag 548
Asp Thr Arg Lys Val Phe Phe Thr Thr Ser Ala Gly Gly Ser Ile Gln
130 135 140 145
gct aag ata ccc gtg cct gtg agt ggt tac ggt atg tcc aag gct gcg 596
Ala Lys Ile Pro Val Pro Val Ser Gly Tyr Gly Met Ser Lys Ala Ala
150 155 160
ctt aat tat gct gtg aga aaa ctt gct gac gag tgc tac aag gac aac 644
Leu Asn Tyr Ala Val Arg Lys Leu Ala Asp Glu Cys Tyr Lys Asp Asn
165 170 175
ttc act att gtg ttg ctg cat cct ggt ttt gtt aag acg gac atg ggt 692
Phe Thr Ile Val Leu Leu His Pro Gly Phe Val Lys Thr Asp Met Gly
180 185 190
caa agc gcc att cag aag atg tca aat gga aat gct gag ctt ctt gct 740
Gln Ser Ala Ile Gln Lys Met Ser Asn Gly Asn Ala Glu Leu Leu Ala
195 200 205
tac att gac tca atg act att gat gtt cct acc agt gct ggc caa atc 788
Tyr Ile Asp Ser Met Thr Ile Asp Val Pro Thr Ser Ala Gly Gln Ile
210 215 220 225
gtc ggt gcc att atg acc ttg gac aag cag agc agc ggt aga ttt atc 836
Val Gly Ala Ile Met Thr Leu Asp Lys Gln Ser Ser Gly Arg Phe Ile
230 235 240
aac gct gct gac cag ttt gac atg cca ttt tag taa cgaagatcta gggatt 888
Asn Ala Ala Asp Gln Phe Asp Met Pro Phe
245 250
gagcagtcag caggagaatc gaacctcatt gcagatttca gacaagtaga ggctacgcta 948
atatggatca gttgtggatt ctctgctcgt ctctactctc ttcggcccta acttggagtt 1008
caggttcaga tttaacaaac ttatttcgat gaaggaaaag agacattgac taacataatt 1068
ccgaggccga taaaagtctt gatagcttga attacttact tattctatag aaataaaacg 1128
cctgcggtgt ggcaaaaaaa aaaaaaaaaa 1158
<210>21
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>21
ggggaattca tggctaaaac tgtttacttc a 31
<210>22
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>22
ccccaagctt attactaaaa tggcatgtca aactggtc 38
<210>23
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>23
gagcggataa caatttcaca cagg 24
<210>24
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>24
cttctctcat ccgccaaaac 20
<210>25
<211>772
<212>DNA
<213>Ogataea minuta var nonfermentans
<220>
<221>CDS
<222>(7)..(759)
<400>25
gaattc atg gct aaa act gtt tac ttc atc gca ggt gct tcc aga ggt 48
Met Ala Lys Thr Val Tyr Phe Ile Ala Gly Ala Ser Arg Gly
1 5 10
atc ggt ctc gag gtt gct tcc cag ctg agt gca aac cca gac aat tat 96
Ile Gly Leu Glu Val Ala Ser Gln Leu Ser Ala Asn Pro Asp Asn Tyr
15 20 25 30
gtt att gca tcc tat aga tct gaa aag tct gct tca gga ctt ttg gag 144
Val Ile Ala Ser Tyr Arg Ser Glu Lys Ser Ala Ser Gly Leu Leu Glu
35 40 45
ctg gca aag aag gat aat gtc gac aca att gtg ttg gat att gca agc 192
Leu Ala Lys Lys Asp Asn Val Asp Thr Ile Val Leu Asp Ile Ala Ser
50 55 60
cag gaa tcg att gat gct gtt cca gca cag att tcc aag ctg act gat 240
Gln Glu Ser Ile Asp Ala Val Pro Ala Gln Ile Ser Lys Leu Thr Asp
65 70 75
gga atc gat gtt gcc ttg atc aac gct gga att gcc aac gct atg tgt 288
Gly Ile Asp Val Ala Leu Ile Asn Ala Gly Ile Ala Asn Ala Met Cys
80 85 90
ccg att ctc gaa tgt tct aga gag tcc tac act gat cac tgg aca acc 336
Pro Ile Leu Glu Cys Ser Arg Glu Ser Tyr Thr Asp His Trp Thr Thr
95 100 105 110
aat gcc ttg ggt cca atc atg ctc tac caa gct att cat aag ttc atg 384
Asn Ala Leu Gly Pro Ile Met Leu Tyr Gln Ala Ile His Lys Phe Met
115 120 125
ctc cag aga gag acc aga aaa gtg ttc ttt acc acg agt gct ggt ggt 432
Leu Gln Arg Glu Thr Arg Lys Val Phe Phe Thr Thr Ser Ala Gly Gly
130 135 140
tcc att cag gct aag ata ccc gtg cct gtg agt ggt tac ggt atg tcc 480
Ser Ile Gln Ala Lys Ile Pro Val Pro Val Ser Gly Tyr Gly Met Ser
145 150 155
aag gct gcg ctt aat tat gct gtg aga aaa ctt gct gac gag tgc tac 528
Lys Ala Ala Leu Asn Tyr Ala Val Arg Lys Leu Ala Asp Glu Cys Tyr
160 165 170
aag gac aac ttc act att gtg ttg ctg cat cct ggt ttt gtt aag acg 576
Lys Asp Asn Phe Thr Ile Val Leu Leu His Pro Gly Phe Val Lys Thr
175 180 185 190
gac atg ggt caa agc gcc att cag aag atg tca aat gga aat gct gag 624
Asp Met Gly Gln Ser Ala Ile Gln Lys Met Ser Asn Gly Asn Ala Glu
195 200 205
ctt ctt gct tac att gac tca atg act att gat gtt cct acc agt gct 672
Leu Leu Ala Tyr Ile Asp Ser Met Thr Ile Asp Val Pro Thr Ser Ala
210 215 220
ggc caa atc gtc ggt gcc att atg acc ttg gac aag cag agc agc ggt 720
Gly Gln Ile Val Gly Ala Ile Met Thr Leu Asp Lys Gln Ser Ser Gly
225 230 235
aga ttt atc aac gct gct gac cag ttt gac atg cca ttt tag taa taa 768
Arg Phe Ile Asn Ala Ala Asp Gln Phe Asp Met Pro Phe
240 245 250
gctt 772
Claims (7)
1、由下述(A)或(B)中任意一项的氨基酸序列组成的多肽：
(A)序列号1中记载的氨基酸序列；
(B)具有羰基还原酶活性的多肽的氨基酸序列，该氨基酸序列是在序列号1的氨基酸序列中有1到5个氨基酸发生缺失、添加或取代的氨基酸序列。
2、由下列(a)～(e)中任意一项的核苷酸序列组成的DNA：
(a)编码由序列号1中记载的氨基酸序列组成的多肽的核苷酸序列；
(b)编码由下述氨基酸序列组成、且具有羰基还原酶活性的多肽的核苷酸序列，所述氨基酸序列是在序列号1的氨基酸序列中有1到5个氨基酸发生缺失、添加或取代的氨基酸序列；
(c)序列号2中记载的核苷酸序列；
(d)编码具有羰基还原酶活性的多肽的核苷酸序列，该核苷酸序列是在序列号2记载的核苷酸序列中有1到10个核苷酸发生缺失、添加或取代的核苷酸序列；
(e)编码具有羰基还原酶活性的多肽的核苷酸序列，该核苷酸序列是在严紧条件下与序列号2中记载的核苷酸序列或其互补序列杂交的核苷酸序列。
3、一种重组DNA，其通过将权利要求2所述的DNA掺入到载体中而得到。
4、一种转化体，其包含权利要求3所述的重组DNA。
5、一种转化体，其通过将权利要求2所述的DNA掺入到染色体DNA中而得到。
6、式(IV)所示化合物的制备方法，其特征在于，使权利要求4或权利要求5所述的转化体细胞、该转化体细胞的培养物或该转化体细胞的处理物作用于选自式(I)所示化合物、式(II)所示化合物或式(III)所示化合物的含羰基化合物，使含羰基化合物进行不对称还原：
式中R表示氢原子、烷基或芳基；
式中R与上述意思相同；
式中R与上述意思相同；
式中R与上述意思相同。
7、权利要求6所述的制备方法，其特征在于，其中式(II)和(III)所示的化合物分别是下式(II’)和下式(III’)所示的光学活性体：
式中R与上述意思相同；
式中R与上述意思相同。
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