JP7458680B2 - 新規加水分解酵素及びそれを利用した(1s,2s)-1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸の製造方法 - Google Patents
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Description
非特許文献1、特許文献1及び特許文献2には、ジメチル 2-ビニルシクロプロパン-1,1-ジカルボン酸を酵素により加水分解し、(1S,2S)-1-メトキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸を得る方法が記載されている。
したがって、C型肝炎治療薬等の製造用中間体として有用な(1S,2S)-1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸を、高純度、高効率、かつ低コストで、工業的に製造する方法が望まれていた。
[1]以下の(a)~(e)のいずれかのポリペプチドを含む加水分解酵素。
(a)配列番号2で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド
(b)配列番号4又は6で表されるアミノ酸配列を有し、かつ式(1)に示す反応を触媒する活性を有するポリペプチド
(d)配列番号2、4又は6に示すアミノ酸配列と60%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ上記式(1)に示す反応を触媒する活性を有するポリペプチド
(e)配列番号2、4又は6に示すアミノ酸配列と60%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、前記アミノ酸配列中に以下の(i)~(iv)のモチーフ配列から選ばれる1以上のモチーフ配列を有するポリペプチド
(i)連続する5残基(アスパラギン酸(D)、アラニン(A)、スレオニン(T)、アルギニン(R)、グリシン(G))からなる配列
(ii)連続する4残基(プロリン(P)、チロシン(Y)、グリシン(G)、フェニルアラニン(F))からなる配列
(iii)連続する4残基(アスパラギン(N)、トリプトファン(W)、プロリン(P)、グリシン(G))からなる配列
(iv)連続する5残基(プロリン(P)、グリシン(G)、トリプトファン(W)、プロリン(P)、グリシン(G))からなる配列
[2]式(1)におけるRがエチル基である、[1]に記載の加水分解酵素。
[3][1]又は[2]に記載の加水分解酵素をコードする核酸。
[4]前記核酸が、以下の(f)、(g)、(h)又は(i)に示す塩基配列を含む、[3]に記載の核酸。
(f)配列番号1、3又は5で表される塩基配列
(g)配列番号1、3又は5で表される塩基配列において、1~複数個の塩基の置換、欠失、及び/又は付加を有する塩基配列であって、かつ式(1)に示す反応を触媒する活性を有するポリペプチドをコードする核酸
(i)配列番号1、3又は5で表される塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、かつ上記式(1)に示す反応を触媒する活性を有するポリペプチドをコードする核酸
[5][1]又は[2]に記載の加水分解酵素、前記酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、前記微生物若しくは細胞の処理物、及び/又は前記微生物若しくは細胞を培養して得られた前記酵素を含む培養液を、式(I)で表されるジアルキル 2-ビニルシクロプロパン-1,1-ジカルボン酸に接触させて、式(II)で表される(1S,2S)-1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸を製造することを含む、(1S,2S)-1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸の製造方法。
[6]前記微生物又は細胞が、[3]又は[4]に記載の核酸で形質転換された微生物又は細胞である、[5]に記載の製造方法。
[7][3]又は[4]に記載の核酸を含む組換えベクター。
[8][7]に記載の組換えベクターを含むことを特徴とする形質転換体。
1.本発明の加水分解酵素
本発明の加水分解酵素は、配列番号2、4又は6で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むもの、又は該アミノ酸配列と高い同一性を有するアミノ酸配列(以下、「アミノ酸配列のホモログ」という場合がある)を有し、ジエチル 2-ビニルシクロプロパン-1,1-ジカルボン酸を加水分解する活性を有するポリペプチドを含むもの(以下、「加水分解酵素のホモログ」という場合がある)である。具体的には、本発明の新規加水分解酵素は、以下の(a)、(b)、(c)、(d)又は(e)に示すポリペプチドを含むものである。
(b)配列番号4又は6で表されるアミノ酸配列を有し、かつ式(1)に示す反応を触媒する活性を有するポリペプチド
(e)配列番号2、4、又は6で表されるアミノ酸配列と60%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、当該アミノ酸配列中に以下の(i)~(iv)のモチーフ配列から選ばれる1以上のモチーフ配列を有するポリペプチド
(i)連続する5残基(アスパラギン酸(D)、アラニン(A)、スレオニン(T)、アルギニン(R)、グリシン(G))からなる配列
(ii)連続する4残基(プロリン(P)、チロシン(Y)、グリシン(G)、フェニルアラニン(F))からなる配列
(iii)連続する4残基(アスパラギン(N)、トリプトファン(W)、プロリン(P)、グリシン(G))からなる配列
(iv)連続する5残基(プロリン(P)、グリシン(G)、トリプトファン(W)、プロリン(P)、グリシン(G))からなる配列
(i)連続する5残基(アスパラギン酸(D)、アラニン(A)、スレオニン(T)、アルギニン(R)、グリシン(G))からなる配列
(ii)連続する4残基(プロリン(P)、チロシン(Y)、グリシン(G)、フェニルアラニン(F))からなる配列
(iii)連続する4残基(アスパラギン(N)、トリプトファン(W)、プロリン(P)、グリシン(G))からなる配列、及び
(iv)連続する5残基(プロリン(P)、グリシン(G)、トリプトファン(W)、プロリン(P)、グリシン(G))からなる配列
(i)連続する5残基(アスパラギン酸(D)、アラニン(A)、スレオニン(T)、アルギニン(R)、グリシン(G))からなる配列
(ii)連続する4残基(プロリン(P)、チロシン(Y)、グリシン(G)、フェニルアラニン(F))からなる配列
(iii)連続する4残基(アスパラギン(N)、トリプトファン(W)、プロリン(P)、グリシン(G))からなる配列
(iv)連続する5残基(プロリン(P)、グリシン(G)、トリプトファン(W)、プロリン(P)、グリシン(G))からなる配列
本発明の加水分解酵素をコードするDNAとしては、合成DNAなどが挙げられる。例えば、ロドコッカス・スピーシーズD32株(Rhodococcus sp.D32株)、シュードノカルディア・ジオキサニボランスCB1190株(Pseudonocardia dioxanivorans CB1190株)又はミクロバクテリウム ココラタム(Microbacterium chocolatum)由来の細胞若しくは組織より調製した全RNA若しくはmRNA画分を鋳型として用い、Reverse Transcriptase-PCRによって直接増幅した全長加水分解酵素 cDNAを、公知のキット、例えば、MutanTM-super Express Km(TAKARA BIO INC.)、MutanTM-K(TAKARA BIO INC.)等を用いて、ODA-LA PCR法、Gapped duplex法、Kunkel法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って変換することによって取得することができる。あるいは、上記した全RNAもしくはmRNAの断片を適当なベクター中に挿入して調製されるcDNAライブラリーから、コロニーもしくはプラークハイブリダイゼーション法またはPCR法などにより、クローニングしたcDNAを、上記の方法に従って変換することによっても取得することができる。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。
(f)配列番号1、3又は5で表される塩基配列を有する核酸
(g)配列番号1、3又は5で表される塩基配列において、1~複数個の塩基が置換、欠失及び/又は付加された塩基配列を有し、かつ上記式(1)に示す反応を触媒する活性を有するポリぺプチドをコードする核酸
(h)配列番号1、3又は5で表される塩基配列と60%以上の配列同一性を有する塩基配列を有し、かつ上記式(1)に示す反応を触媒する活性を有するポリペプチドをコードする核酸
(i)配列番号1、3又は5で表される塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、かつ上記式(1)に示す反応を触媒する活性を有するポリぺプチドをコードする核酸
なお、配列番号1、3又は5で表される塩基配列は、それぞれロドコッカス・スピーシーズ(Rhodococcus sp.)D32株由来の加水分解酵素RsD32Est(配列番号2)、シュードノカルディア・ジオキサニボランスCB1190株(Pseudonocardia dioxanivorans CB1190株)由来の加水分解酵素PdEst(配列番号4)、及びミクロバクテリウム ココラタム(Microbacterium chocolatum)由来の加水分解酵素McEst(配列番号6)の遺伝子を大腸菌発現用にコドンを最適化した塩基配列である。このように形質転換対象の宿主に応じてコドンが最適化されたDNAも当然に本発明に使用し得る上記式(1)に示す反応を触媒する活性を有するポリぺプチドをコードする核酸に包含される。
これらのうち、前記の本発明のポチペプチドをコードするDNAで形質転換された微生物若しくは細胞を用いることが好ましい。
また、本発明のポリペプチド(加水分解酵素)をコードする核酸(DNA)は、前記の通り、ロドコッカス・スピーシーズD32株(Rhodococcus sp.D32株)、シュードノカルディア・ジオキサニボランスCB1190株(Pseudonocardia dioxanivorans CB1190株)又はミクロバクテリウム ココラタム(Microbacterium chocolatum)由来の全RNA若しくはmRNAを鋳型として用い、RT-PCR法によって直接増幅した全長加水分解酵素 cDNAを調製した後、適切なプライマーを用いてPCRを行うことによりクローニングできる。
形質転換体の作製方法としては、具体的には、宿主細胞において安定に存在するプラスミドベクターやファージベクターやウイルスベクター中に、本発明のポリペプチドをコードするDNAを導入し、構築された発現ベクターを該宿主細胞中に導入する方法や直接宿主ゲノム中に該DNAを導入し、その遺伝情報を転写・翻訳させる方法が例示される。この場合、宿主において適当なプロモーターをDNAの5'-側上流に連結させることが好ましく、さらに、ターミネーターを3'-側下流に連結させることがより好ましい。このようなプロモーター及びターミネーターとしては、宿主として利用する細胞中において機能することが知られているプロモーター及びターミネーターであれば特に限定されず、例えば、「微生物学基礎講座8遺伝子工学・共立出版」に詳述されているベクター、プロモーター及びターミネーターを使用することができる。
本発明の組成物(酵素剤)は、本発明の加水分解酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び/又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた前記酵素を含む培養液を含み、ジアルキル 2-ビニルシクロプロパン-1,1-ジカルボン酸を基質とし、(1S,2S)-1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸を生成する反応を触媒するものである。本発明の組成物は、触媒として使用することで、光学純度の高い(1S,2S)-1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸を、高効率、かつ低コストで工業的に製造することができるため、有用である。
本発明によれば、式(2)で表される製造、即ち、本発明の加水分解酵素を下式(I')で表されるジカルボン酸エステルに作用させて、下式(II')で表されるカルボン酸モノエステルを製造することを含む、下式(II')で表されるカルボン酸モノエステルの製造方法が提供される。
なお、式(I')中の2つのR'は、同一でも異なっていてもよいが、同一であることが好ましい。
反応液に添加する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び/又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液の量は、微生物若しくは細胞を添加する場合は、反応液にその微生物若しくは細胞の濃度が、通常、湿菌体重で0.1 w/v%~50 w/v%程度、好ましくは1 w/v%~20 w/v%となるように添加し、処理物や培養液を用いる場合には、酵素の比活性を求め、添加したときに上記細胞濃度になるような量を添加する。ここで、w/v%は、重量(weight)/体積(volume)%を表す。
反応の方法は特に限定されず、本発明の加水分解酵素を含む液体に、基質となる式(I')で表されるジカルボン酸ジエステルを加え、適当な温度や圧力(例えば大気圧程度)で反応させることができる。これにより、式(II')で表されるカルボン酸モノエステルを製造することができる。
反応基質となる式(I')で表されるジカルボン酸ジエステルは、通常、基質濃度が0.01 w/v%~90 w/v%、好ましくは0.1 w/v%~30 w/v%の範囲で用いられる。反応基質は、反応開始時に一括して添加してもよいが、酵素の基質阻害があった場合の影響を減らすという点や生成物の蓄積濃度を向上させるという観点からすると、連続的もしくは間欠的に添加することが望ましい。
反応は、通常、4℃~60℃、好ましくは10℃~45℃の反応温度で、また、通常pH 3~11、好ましくはpH 5~8の条件下で行われる。反応時間は、通常、1時間~72時間程度である。
土壌サンプルから加水分解活性を指標に探索することによって、ロドコッカス・スピーシーズ(Rhodococcus sp.)D32株を得た。本微生物が産生する加水分解酵素の解析と遺伝子情報の解析から、新しい加水分解酵素RsD32Est(配列番号2)を得た。本アミノ酸配列情報を元にRsD32Estをコードする大腸菌発現用にコドン最適化された遺伝子配列(配列番号1)をDNA2.0社にて人工合成し、pJ411RsD32Estを得た。
実施例1で得られた各菌体を用いて、30 g/Lのラセミ体のジエチル 2-ビニルシクロプロパン-1,1-ジカルボン酸(以下、VCPDEという)、及び5%のジメチルスルホキシドを含む、100 mmol/Lリン酸カリウム緩衝液中で、30℃、pH 7の条件で21時間反応させた。各菌体としては、実施例1で作成した培養液0.4 mLから遠心分離によって得られた菌体を用いた。なお、VCPDEは、日本国特許第5657560号の合成例に記載の方法に準じて合成したものである。
カラム:CHIRALPAK AD-3(4.6×250 mm、ダイセル化学社製)
溶離液:ヘキサン:エタノール:トリフルオロ酢酸=95:5:0.1
流速:0.8 ml/min
温度:30℃
検出:UV 210 nm
カラム:COSMOSIL 5C18-MS-II(4.6×250 mm、ナカライテスク社製)
溶離液A:0.1%トリフルオロアセトフェノン含有水溶液
溶離液B:0.1%トリフルオロアセトフェノン含有アセトニトリル
流速:0.8 ml/min
温度:40℃
検出:UV 210 nm
特に、配列番号2(RsD32Est)を有する本発明の加水分解酵素は、生成する1-エトキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸のAnti体の量が極めて多く、Syn体が生成せず、光学純度も極めて高い。
5 Lジャーファーメンターに、1 mol/Lリン酸カリウム緩衝液(pH 7.0)160 mL、脱塩水1332 mL、ジエチル 2-ビニルシクロプロパン-1,1-ジカルボン酸84.2 g及び実施例1で得られた大腸菌クローンBL21(DE3)/pJ411RsD32Estの湿菌体24 gを混合し、反応温度30℃、反応時のpH 7.0として、十分な撹拌速度の下、24時間反応させた。反応終点での(1S,2S)-1-エトキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸の濃度は22.3 g/Lであった。
遺伝子のクローニング
バシラス・サチリス (Bacillus subtilis) NBRC3027を菌株保存機関が指定する液体培地でそれぞれ一晩培養して得られた菌体より、DNeasy Blood & Tissue Kit (キアゲン社製)を用いて、染色体DNAをそれぞれ調製した。
調製した染色体DNAを鋳型とし、pnbA F、pnbA Rをプライマーとして、PCRにより約1.5 kbpのDNA断片を増幅した。
特開2005-34025号公報記載の方法に準じて調整したプラスミドpKV32をテンプレートとし、配列番号15に示すプライマー(pKVXmaIFW)と配列番号16に示すプライマー(pKVXmaIRV)を用いて、PCRにより約4 kbpの断片を増幅した。増幅された断片をXmaIにより消化し、Ligation-Convenience Kit(ニッポンジーン社製)により自己閉環させ、得られたプラスミドをpKW32と命名した。
前記遺伝子のクローニングで得られたDNA断片を、常法に従って、上述の「発現ベクターの調製」で調製したクローニングベクターpKW32に導入した。以下、得られたプラスミドをppnbA3027とする。
参考例1で得たプラスミドppnbA3027を鋳型として、配列表の配列番号17に示すプライマー(L70FW)と配列番号18に示すプライマー(L70RV)を用いて、QuikChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit(ストラタジーン社製)によりアミノ酸番号70番のロイシンをコードする塩基にランダムな変異を導入した。同様に配列表の配列番号19に示すプライマー(L313FW)と配列番号20に示すプライマー(L313RV)を用いて、アミノ酸番号313番のロイシン残基をコードする塩基に対して、また、配列表の配列番号21に示すプライマー(L270L273FW)と配列番号22に示すプライマー(L270L273RV)を用いて、アミノ酸番号270と273番のロイシン残基をコードする塩基に対してランダムな変異を導入し、得られた変異導入プラスミドを用いて大腸菌(Escherichia coli) JM109(タカラバイオ株式会社製)を常法に従って形質転換した。
Claims (2)
- 配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む加水分解酵素、前記酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、前記微生物若しくは細胞の処理物、及び/又は前記微生物若しくは細胞を培養して得られた前記酵素を含む培養液を、式(I)で表されるジアルキル 2-ビニルシクロプロパン-1,1-ジカルボン酸に接触させて、式(II)で表される(1S,2S)-1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸を製造する方法であって、
前記酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞が、配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸で形質転換された微生物又は細胞であり、
式(1)中、Rは、炭素数1~6のアルキル基を示し、かつ
式(II)で表される1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸のAnti体よりも、1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸のSyn体の生成比率が低いことを特徴とする、(1S,2S)-1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸の製造方法。 - 式(II)で表される1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸のAnti体に対する、1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸のSyn体の生成比率が0.2%以下である、請求項1に記載の製造方法。
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