JP6844073B1 - (1r,3r)−3−(トリフルオロメチル)シクロヘキサン−1−オール及びその中間体の製造法 - Google Patents
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Abstract
Description
(1R,3R)−3−(トリフルオロメチル)シクロヘキサン−1−オールの製造方法としては、ラセミ体の3−トリフルオロメチルシクロヘキサノンからの生物学的な方法により製造する方法(非特許文献4)が知られている。
しかしながら、非特許文献4で使用されている微生物では反応が十分進行しておらず収率は34%程度と低く、また得られる(1R,3R)−3−(トリフルオロメチル)シクロヘキサン−1−オールの光学純度も4種類の異性体に対して39%程度と低く光学的選択性が低い(Run14)。そのため、目的とする(1R,3R)−3−(トリフルオロメチル)シクロヘキサン−1−オール以外に、副生物であるエナンチオマー(1S,3S)−3−(トリフルオロメチル)シクロヘキサン−1−オールや2種類のジアステレオマー(1R,3S)−3−(トリフルオロメチル)シクロヘキサン−1−オール及び(1S,3R)−3−(トリフルオロメチル)シクロヘキサン−1−オールの生成量が多いため、目的物を高効率で製造することが難しく、また、工業的に製造する場合には大型の分離装置や精製装置が必要となりコストが高くなり、医薬品の中間体の工業的な製造方法としては不向きであった。
特許文献3及び非特許文献1には、炭素−炭素二重結合還元酵素が記載されているが、本発明化合物に適用した例は記載されていない。
非特許文献2には、3−トリフルオロメチル−2−シクロヘキセン−1−オン(以下、化合物(1)と称する場合がある。)の3位トリフルオロメチル基をメチル基に置き換えた類似化合物とカルボニル基を特定の炭素−炭素二重結合還元酵素を接触させ、(3R)−3−(トリフルオロメチル)シクロヘキサン−1−オン(以下、化合物(2)と称する場合がある。)の類似化合物を得る方法が記載されている。しかし、本発明化合物に特定の酵素を適用した例は記載されていない。さらに、後述する比較例1、2及び6から明らかなように、非特許文献2に記載の酵素で、かつ化合物(1)の類似化合物に対して反応性・光学的選択性が優れていた酵素(YqjM変異体1、2及び15)を化合物(1)と接触させても反応がほとんど進行しなかった。
また、Lactobacillus kefir、Pichia finlandica、及びDevosia riboflavina由来のカルボニル還元酵素(以下、C=O還元酵素と称する場合がある。)が、高い選択性で3−トリフルオロメチル−2−シクロヘキセン−1−オンを還元し、中間体である(1R)−3−トリフルオロメチル−2−シクロヘキセン−1−オール(以下、化合物(4)と称する場合がある)を高効率で得ることが可能であることを見出した。
さらに、該酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び/又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液(以下、これらをまとめて「酵素等」という場合がある)を、3−トリフルオロメチル−2−シクロヘキセン−1−オン、(3R)−3−(トリフルオロメチル)シクロヘキサン−1−オン又は(1R)−3−トリフルオロメチル−2−シクロヘキセン−1−オールに接触させることにより、高光学純度、かつ高濃度の(1R,3R)−3−(トリフルオロメチル)シクロヘキサン−1−オールを低コストで得ることができることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて成し遂げられたものである。
[1] 式(1)
(A)配列番号1で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質
(B)配列番号1で表されるアミノ酸配列において、1〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び/又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ式(I)及び/又は式(II)に示す反応を触媒する活性を有するタンパク質
(i)配列番号1で表されるアミノ酸配列における26番目のシステインが、アスパラギン酸、フェニルアラニン、トリプトファン又はチロシン以外のアミノ酸に置換
(ii)配列番号1で表されるアミノ酸配列における104番目のアラニンが、アラニン以外のアミノ酸に置換
(i’)配列番号1で表されるアミノ酸配列における26番目のシステインが、アラニンに置換
(ii’)配列番号1で表されるアミノ酸配列における104番目のアラニンが、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン又はチロシンに置換
(A)配列番号2、3又は4で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質
(B)配列番号2、3又は4で表されるアミノ酸配列において、1〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び/又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ式(III)及び/又は式(IV)に示す反応を触媒する活性を有するタンパク質
式(2)で表される化合物に、カルボニル還元酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び/又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を接触させて、式(3)
式(4)で表される化合物に、炭素−炭素二重結合還元酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び/又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を接触させて、式(3)
(A)配列番号1で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質
(B)配列番号1で表されるアミノ酸配列において、1〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び/又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ式(I)に示す反応を触媒する活性を有するタンパク質
(i)配列番号1で表されるアミノ酸配列における26番目のシステインが、アスパラギン酸、フェニルアラニン、トリプトファン又はチロシン以外のアミノ酸に置換
(ii)配列番号1で表されるアミノ酸配列における104番目のアラニンが、アラニン以外のアミノ酸に置換
(A)配列番号2、3又は4で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質
(B)配列番号2、3又は4で表されるアミノ酸配列において、1〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び/又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ(IV)に示す反応を触媒する活性を有するタンパク質
本発明の方法により製造される(1R)−3−トリフルオロメチル−2−シクロヘキセン−1−オール又は(3R)−3−(トリフルオロメチル)シクロヘキサン−1−オンや、これを用いて製造される化合物(1R,3R)−3−(トリフルオロメチル)シクロヘキサン−1−オールは、様々な医薬品の合成用原料、合成用中間体として利用することができる。
本明細書において、製造方法1〜3はそれぞれ以下の製造方法を意味する。
製造方法1:工程1及び工程2を有する化合物(3)の製造方法
製造方法2:工程3及び工程4を有する化合物(3)の製造方法
製造方法3:工程5を有する化合物(3)の製造方法
工程1:化合物(1)にC=C還元酵素等を接触させて化合物(2)を得る工程
工程2:化合物(2)にC=O還元酵素等を接触させて化合物(3)を得る工程
工程3:化合物(1)にC=O還元酵素等を接触させて化合物(4)を得る工程
工程4:化合物(4)にC=C還元酵素等を接触させて化合物(3)を得る工程
工程5:化合物(1)にC=C還元酵素等及びC=O還元酵素等を接触させて化合物(3)を得る工程
1.本発明の製造方法に用いられる酵素
[C=C還元酵素]
本発明の製造方法は、式(1)で表される化合物に、炭素−炭素二重結合還元酵素(C=C還元酵素)、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び/又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液、並びにカルボニル還元酵素(C=O還元酵素)、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び/又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を接触させて、式(3)で表される化合物を得ることを特徴とする。本明細書において、該酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び/又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を「酵素等」と称する場合がある。以下、C=C還元酵素に関して説明する。
C=C還元酵素をコードするDNAとしては、例えば、Bacillus subtilis由来のyqjm遺伝子の塩基配列(配列番号5)(GeneBank Accession No.P54550)が挙げられる。
また、C=C還元酵素をコードするDNAとしては、合成DNAなどが挙げられる。例えば、Bacillus subtilis由来のC=C還元酵素をコードするDNAの場合、Bacillus subtilis由来の全RNA若しくはmRNA画分を鋳型として用い、Reverse Transcriptase-PCRによって直接増幅した全長C=C還元酵素 cDNAを、公知のキット、例えば、MutanTM-super Express Km(TAKARA BIO INC.)、MutanTM-K(TAKARA BIO INC.)等を用いて、ODA-LA PCR法、Gapped duplex法、Kunkel法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って変換することによって取得することができる。あるいは、上記した全RNAもしくはmRNAの断片を適当なベクター中に挿入して調製されるcDNAライブラリーから、コロニーもしくはプラークハイブリダイゼーション法又はPCR法などにより、クローニングしたcDNAを、上記の方法に従って変換することによっても取得することができる。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。
本明細書において「発現ベクター」とは、所望の機能を有するタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドを組み込み宿主生物へ導入することにより、所望の機能を有するタンパク質を前記宿主生物において複製及び発現させるために用いられる遺伝因子である。例えば、プラスミド、ウイルス、ファージ、コスミド等が挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、発現ベクターはプラスミドである。
本明細書において、「形質転換体」とは、前記発現ベクター等を用いて目的の遺伝子が導入され、所望の機能を有するタンパク質に関連する所望の形質を表すことができるようになった微生物又は細胞を意味する。
形質転換体の作製方法としては、具体的には、宿主細胞において安定に存在するプラスミドベクターやファージベクターやウイルスベクター中に、C=C還元酵素をコードするDNAを導入し、構築された発現ベクターを該宿主細胞中に導入する方法や直接宿主ゲノム中に該DNAを導入し、その遺伝情報を転写・翻訳させる方法が例示される。この場合、宿主において適当なプロモーターをDNAの5'−側上流に連結させることが好ましく、さらに、ターミネーターを3'−側下流に連結させることがより好ましい。このようなプロモーター及びターミネーターとしては、宿主として利用する細胞中において機能することが知られているプロモーター及びターミネーターであれば特に限定されず、例えば、「微生物学基礎講座8遺伝子工学・共立出版」に詳述されているベクター、プロモーター及びターミネーターを使用することができる。
C=C還元酵素を発現させるための形質転換の対象となる宿主微生物としては、宿主自体が化合物(1)、化合物(2)、化合物(4)及び化合物(3)に悪影響を与えない限り特に限定されることはなく、例えば、以下に示すような微生物を挙げることができる。
エシェリヒア(Escherichia)属、バチルス(Bacillus)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、セラチア(Serratia)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、ストレプトコッカス(Streptococcus)属、ラクトバチルス(Lactobacillus)属等に属する宿主ベクター系の確立されている細菌。
ロドコッカス(Rhodococcus)属、ストレプトマイセス(Streptomyces)属等に属する宿主ベクター系の確立されている放線菌。
サッカロマイセス(Saccharomyces)属、クルイベロマイセス(Kluyveromyces)属、シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属、チゴサッカロマイセス(Zygosaccharomyces)属、ヤロウイア(Yarrowia)属、トリコスポロン(Trichosporon)属、ロドスポリジウム(Rhodosporidium)属、ハンゼヌラ(Hansenula)属、ピキア(Pichia)属、キャンディダ(Candida)属等に属する宿主ベクター系の確立されている酵母。
ノイロスポラ(Neurospora)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、セファロスポリウム(Cephalosporium)属、トリコデルマ(Trichoderma)属等に属する宿主ベクター系の確立されているカビ。
形質転換体作製のための手順、宿主に適合した組換えベクターの構築及び宿主の培養方法は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができる(例えば、Molecular Cloningに記載の方法)。
エシェリヒア属、特にエシェリヒア・コリ(Escherichia coli)においては、プラスミドベクターとしては、例えば、pKV32、pKW32、pBR、pUC系プラスミド等が挙げられ、lac(β−ガラクトシダーゼ)、trp(トリプトファンオペロン)、tac、trc(lac、trpの融合)、λファージPL、PR等に由来するプロモーター等が挙げられる。また、ターミネーターとしては、trpA由来、ファージ由来、rrnBリボソーマルRNA由来のターミネーター等が挙げられる。
バチルス属においては、ベクターとしては、pUB110系プラスミド、pC194系プラスミド等を挙げることができ、また、染色体にインテグレートすることもできる。プロモーター及びターミネーターとしては、アルカリプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、α−アミラーゼ等の酵素遺伝子のプロモーターやターミネーター等が利用できる。
シュードモナス属においては、ベクターとしては、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)、シュードモナス・セパシア(Pseudomonas cepacia)等で確立されている一般的な宿主ベクター系や、トルエン化合物の分解に関与するプラスミド、TOLプラスミドを基本にした広宿主域ベクター(RSF1010等に由来する自律的複製に必要な遺伝子を含む)pKT240(Gene,26,273-82(1983))等を挙げることができる。
ブレビバクテリウム属、特にブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム(Brevibacterium lactofermentum)においては、ベクターとしては、pAJ43(Gene 39,281(1985))等のプラスミドベクターを挙げることができる。プロモーター及びターミネーターとしては、大腸菌で使用されている各種プロモーター及びターミネーターが利用可能である。
コリネバクテリウム属、特にコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)においては、ベクターとしては、pCS11(特開昭57−183799号公報)、pCB101(Mol.Gen.Genet.196,175(1984))等のプラスミドベクターが挙げられる。
サッカロマイセス(Saccharomyces)属、特にサッカロマイセス・セレビジエ(Saccharomyces cerevisiae)においては、ベクターとしては、YRp系、YEp系、YCp系、YIp系プラスミド等が挙げられる。また、アルコール脱水素酵素、グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素、酸性フォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ホスホグリセレートキナーゼ、エノラーゼといった各種酵素遺伝子のプロモーター、ターミネーターが利用可能である。
シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属においては、ベクターとしては、Mol.Cell.Biol.6,80 (1986)に記載のシゾサッカロマイセス・ポンベ由来のプラスミドベクター等を挙げることができる。特に、pAUR224は、タカラバイオ株式会社から市販されており容易に利用できる。
アスペルギルス(Aspergillus)属においては、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、アスペルギルス・オリジー(Aspergillus oryzae)等がカビの中で最もよく研究されており、プラスミドや染色体へのインテグレーションが利用可能であり、菌体外プロテアーゼやアミラーゼ由来のプロモーターが利用可能である(Trendsin Biotechnology 7,283-287(1989))。
また、上記以外でも、各種微生物に応じた宿主ベクター系が確立されており、それらを適宜使用することができる。
また、微生物以外でも、植物細胞、動物細胞において様々な宿主・ベクター系が確立されており、特に昆虫(例えば、蚕)等の動物細胞中(Nature 315,592-594(1985))や、菜種、トウモロコシ、ジャガイモ等の植物細胞中に大量に異種タンパク質を発現させる系、及び大腸菌無細胞抽出液や小麦胚芽等の無細胞タンパク質合成系を用いた系が確立されており、好適に利用できる。
(A)配列番号1で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質;
(B)配列番号1で表されるアミノ酸配列において、1〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び/又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ式(I)及び/又は式(II)に示す反応を触媒する活性を有するタンパク質;
(i)配列番号1で表されるアミノ酸配列における26番目のシステインが、アスパラギン酸、フェニルアラニン、トリプトファン又はチロシン以外のアミノ酸に置換。
(ii)配列番号1で表されるアミノ酸配列における104番目のアラニンが、アラニン以外のアミノ酸に置換。
(i’)配列番号1で表されるアミノ酸配列における26番目のシステインが、アラニンに置換。
(ii’)配列番号1で表されるアミノ酸配列における104番目のアラニンが、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン又はチロシンに置換。
(ii’’)配列番号1で表されるアミノ酸配列における104番目のアラニンが、ヒスチジン、トリプトファン又はチロシンに置換。
(ii’’’)配列番号1で表されるアミノ酸配列における104番目のアラニンが、トリプトファンに置換。
(C)に示すタンパク質において、上述のアミノ酸置換を行うことにより野生型に対する相対活性、変換率及び光学純度を向上させることができる。
本明細書におけるアミノ酸配列の同一性(適宜、相同性又は類似性と言い換えてもよい)は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)を用い、例えば、以下の条件(期待値=10;ギャップを許す;マトリクス=BLOSUM62;フィルタリング=OFF)にて計算することができる。アミノ酸配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、例えば、Karlinら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877 (1993)に記載のアルゴリズム[該アルゴリズムはNBLAST及びXBLASTプログラム(version 2.0)に組み込まれている(Altschulら, Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402 (1997))]、Needlemanら,J. Mol. Biol., 48: 444-453 (1970)に記載のアルゴリズム[該アルゴリズムはGCGソフトウェアパッケージ中のGAPプログラムに組み込まれている]、Myers及びMiller, CABIOS, 4: 11-17 (1988)に記載のアルゴリズム[該アルゴリズムはCGC配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム(version2.0)に組み込まれている]、Pearsonら,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444-2448 (1988)に記載のアルゴリズム[該アルゴリズムはGCGソフトウェアパッケージ中のFASTAプログラムに組み込まれている]等が挙げられ、それらも同様に好ましく用いられ得る。
式(I)に示す反応における選択性は、C=C還元により生成する化合物(2)の(3R)体と(3S)体の比率を指標として確認することができる。(3R)体の生成量に比して(3S)体の生成量が低いものほど化合物(2)の収率が向上し、工業化において有利である。
式(II)に示す反応における選択性は、還元により生成する化合物(3)の(1R,3R)体と(1R,3S)体の比率を指標として確認することができる。(1R,3R)体の生成量に比して(1R,3S)体の生成量が低いものほど化合物(3)の収率が向上し、工業化において有利である。
(1R,3R)体と(1R,3S)体の生成比率は、生成するTrans体とCis体の比率を指標として比較可能である。Trans体、Cis体は幾何異性体を意味しており、(1R,3R)体と(1S,3S)体がTrans体であり、(1R,3S)体と(1S,3R)体がCis体である。本発明においては、C=C還元による生成物は(1R,3R)体が主成分であるため、生成物を定量する際に(1R,3R)体単独で定量する評価系だけでなく、Trans体とCis体を分離できる評価系を用いて生成量を定量することが可能である。すなわち、(1R,3R)体を定量する場合に、Trans体の生成量を定量することで代用できる。同様に、(1R,3S)体を定量する場合に、Cis体の生成量を定量することで代用できる。Cis体の生成比率が低いものほど、化合物(3)の収率が向上し、工業化において有利である。
これらの選択性は、化合物(4)に、対象とするC=C還元酵素等を接触させて化合物(3)を生成させ、生成した化合物(3)の(1R,3R)体と(1R,3S)体の生成量を測定すること又はTrans体とCis体の生成量を測定することにより確認することができる。
後述する本発明の製造方法においては、化合物(1)又は化合物(4)に、上述したC=C還元酵素を直接反応に使用してもよいが、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び/又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を用いることが好ましい。
本発明の製造方法は、式(1)で表される化合物に、炭素−炭素二重結合還元酵素(C=C還元酵素)、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び/又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液、並びにカルボニル還元酵素(C=O還元酵素)、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び/又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を接触させて、式(3)で表される化合物を得ることを特徴とする。該酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び/又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を「酵素等」と称する場合がある。以下、C=O還元酵素に関して説明する。
C=O還元酵素をコードする核酸(DNA)としては、例えば、Lactobacillus kefir由来のlkadh遺伝子の塩基配列(配列番号6)(GeneBank Accession No.AY267012)、Pichia finlandica由来のpfodh1遺伝子の塩基配列(配列番号7)(GeneBank Accession No.AB259114.1)、Devosia riboflavina由来のdrcr1遺伝子の塩基配列(配列番号8)(GeneBank Accession No.BD450088.1)が挙げられる。
また、C=O還元酵素をコードするDNAとしては、合成DNAなどが挙げられる。例えば、Lactobacillus kefir、Pichia finlandica又はDevosia riboflavina由来のC=O還元酵素をコードするDNAの場合、Lactobacillus kefir、Pichia finlandica又はDevosia riboflavina由来の全RNA若しくはmRNA画分を鋳型として用い、Reverse Transcriptase-PCRによって直接増幅した全長C=C還元酵素 cDNAを、公知のキット、例えば、MutanTM-super Express Km(TAKARA BIO INC.)、MutanTM-K(TAKARA BIO INC.)等を用いて、ODA-LA PCR法、Gapped duplex法、Kunkel法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って変換することによって取得することができる。あるいは、上記した全RNAもしくはmRNAの断片を適当なベクター中に挿入して調製されるcDNAライブラリーから、コロニーもしくはプラークハイブリダイゼーション法又はPCR法などにより、クローニングしたcDNAを、上記の方法に従って変換することによっても取得することができる。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。
(A)配列番号2、3又は4で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質
(B)配列番号2、3又は4で表されるアミノ酸配列において、1〜複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換及び/又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ式(III)及び/又は(IV)に示す反応を触媒する活性を有するタンパク質
(B)に示すタンパク質において、「1〜複数個のアミノ酸」とは、通常1個〜100個、好ましくは1個〜50個、より好ましくは1個〜20個、さらに好ましくは1個〜10個、さらにより好ましくは1個〜5個、いっそう好ましくは1個〜3個、特に好ましくは1個又は2個のアミノ酸である。置換の場合、アミノ酸が保守的に置換されたものが好ましい。
本発明において、式(III)に示す反応における選択性は、C=O還元により生成する化合物(3)の(1R,3R)体と(1S,3R)体の比率を指標として確認することができる。(1R,3R)体の生成量に比して(1S,3R)体の生成量が低いものほど化合物(3)の収率が向上し、工業化において有利である。
化合物(3)の(1R,3R)体と(1S,3R)体の生成比率は、生成するTrans体とCis体の比率を指標として比較可能である。Trans体、Cis体は幾何異性体を意味しており、(1R,3R)体と(1S,3S)体がTrans体であり、(1R,3S)体と(1S,3R)体がCis体である。本発明においては、C=O還元による生成物は(1R,3R)体が主成分であるため、生成物を定量する際に(1R,3R)体単独で定量する評価系だけでなく、Trans体とCis体を分離できる評価系を用いて生成量を定量することが可能である。すなわち、(1R,3R)体を定量する場合に、Trans体の生成量を定量することで代用できる。同様に、(1S,3R)体を定量する場合に、Cis体の生成量を定量することで代用できる。Cis体の生成比率が低いものほど、化合物(3)の収率が向上し、工業化において有利である。
これらの選択性は、化合物(2)に、対象とするC=O還元酵素等を接触させて化合物(3)を生成させ、生成した化合物(3)の(1R,3R)体と(1S,3R)体の生成量を測定すること又はTrans体とCis体の生成量を測定することにより確認することができる。
式(IV)に示す反応における選択性は、還元により生成する化合物(4)の(1R)体と(1S)体の比率を指標として確認することができる。(1R)体の生成量に比して(1S)体の生成量が低いものほど化合物(4)の収率が向上し、工業化において有利である。
後述する本発明の製造方法においては、化合物(1)又は化合物(2)に、上述したC=O還元酵素を直接反応に使用してもよいが、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び/又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を用いることが好ましい。
C=C還元酵素等を用いた下式(I)に示す反応による化合物(2)の製造
本発明によれば、式(I)に示す反応、即ち、C=C還元酵素等を化合物(1)に作用させて、化合物(2)を製造する方法が提供される。
C=C還元酵素は、直接反応に使用してもよいが、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び/又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を用いることが好ましく、これらの中でも、タンパク質をコードするDNAを有する形質転換体を用いることが好ましい。
反応液に添加する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び/又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液の量は、微生物若しくは細胞を添加する場合は、反応液にその微生物若しくは細胞の濃度が、通常、湿菌体重で0.1w/v%〜50w/v%程度、好ましくは1w/v%〜20w/v%となるように添加し、処理物や培養液を用いる場合には、酵素の比活性を求め、添加したときに上記細胞濃度になるような量を添加する。なお、本明細書においてw/v%は、重量(weight)/体積(volume)%を表す。
反応基質となる化合物(1)は、通常、基質濃度が0.01w/v%〜90w/v%、好ましくは0.1w/v%〜30w/v%の範囲で用いられる。反応基質は、反応開始時に一括して添加してもよいが、酵素の基質阻害があった場合の影響を減らすという点や生成物の蓄積濃度を向上させるという観点からすると、連続的もしくは間欠的に添加することが望ましい。
反応は、通常、水性媒体中、又は水性媒体と有機溶媒との混合物中で行われる。水性媒体としては、例えば、水又は緩衝液が挙げられる。有機溶媒としては、メタノール、エタノール、1−プロパノール、2−プロパノール、1−ブタノール、tert−ブタノール、アセトン、ジメチルスルホキシド等、反応基質である化合物(1)の溶解度が高いものを使用することができる。また、有機溶媒としては、反応副産物の除去等に効果のある、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、n−ヘキサン等を使用することもできる。
反応は、通常、4℃〜60℃、好ましくは10℃〜45℃の反応温度で、また、通常pH3〜11、好ましくはpH5〜8の条件下で行われる。反応時間は、通常、1時間〜72時間程度である。
本発明で得られた化合物(2)を用いることにより、高効率、低コストで、光学純度の高い化合物(3)や様々な医薬品の合成用原料、合成用中間体の製造に有用な中間体を製造することができる。
C=O還元酵素等を用いた下式(III)に示す反応による化合物(3)の製造
本発明によれば、式(III)に示す反応、即ち、C=O還元酵素等を化合物(2)に作用させて、化合物(3)を製造する方法が提供される。
C=O還元酵素は、直接反応に使用してもよいが、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び/又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を用いることが好ましく、これらの中でも、タンパク質をコードするDNAを有する形質転換体を用いることが好ましい。
反応液に添加する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び/又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液の量は、微生物若しくは細胞を添加する場合は、反応液にその微生物若しくは細胞の濃度が、通常、湿菌体重で0.1w/v%〜50w/v%程度、好ましくは1w/v%〜20w/v%となるように添加し、処理物や培養液を用いる場合には、酵素の比活性を求め、添加したときに上記細胞濃度になるような量を添加する。
C=O還元酵素の反応基質である3−(トリフルオロメチル)シクロヘキサン−1−オンとしては、通常、(3R)体が用いられる。
反応基質となる化合物(2)は、通常、基質濃度が0.01w/v%〜90w/v%、好ましくは0.1w/v%〜30w/v%の範囲で用いられる。反応基質は、反応開始時に一括して添加してもよいが、酵素の基質阻害があった場合の影響を減らすという点や生成物の蓄積濃度を向上させるという観点からすると、連続的もしくは間欠的に添加することが望ましい。
反応は、通常、水性媒体中、又は水性媒体と有機溶媒との混合物中で行われる。水性媒体としては、例えば、水又は緩衝液が挙げられる。有機溶媒としては、メタノール、エタノール、1−プロパノール、2−プロパノール、1−ブタノール、tert−ブタノール、アセトン、ジメチルスルホキシド等、反応基質である化合物(2)の溶解度が高いものを使用することができる。また、有機溶媒としては、反応副産物の除去等に効果のある、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、n−ヘキサン等を使用することもできる。
反応は、通常、4℃〜60℃、好ましくは10℃〜45℃の反応温度で、また、通常pH3〜11、好ましくはpH5〜8の条件下で行われる。反応時間は、通常、1時間〜72時間程度である。
得られた化合物(3)には、そのジアステレオマーである下記式(5)
C=O還元酵素等を用いた下式(IV)に示す反応による化合物(4)の製造
本発明によれば、式(IV)に示す反応、即ち、C=O還元酵素等を化合物(1)に作用させて、化合物(4)を製造する方法が提供される。
C=O還元酵素は、直接反応に使用してもよいが、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び/又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を用いることが好ましく、これらの中でも、タンパク質をコードするDNAを有する形質転換体を用いることが好ましい。
反応液に添加する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び/又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液の量は、微生物若しくは細胞を添加する場合は、反応液にその微生物若しくは細胞の濃度が、通常、湿菌体重で0.1w/v%〜50w/v%程度、好ましくは1w/v%〜20w/v%となるように添加し、処理物や培養液を用いる場合には、酵素の比活性を求め、添加したときに上記細胞濃度になるような量を添加する。
反応の方法は特に限定されず、C=O還元酵素を含む液体に、基質となる化合物(1)を加え、適当な温度(例えば、10℃〜45℃程度)や圧力(例えば大気圧程度)で反応させることができる。これにより、化合物(4)を製造することができる。
反応基質となる化合物(1)は、通常、基質濃度が0.01w/v%〜90w/v%、好ましくは0.1w/v%〜30w/v%の範囲で用いられる。反応基質は、反応開始時に一括して添加してもよいが、酵素の基質阻害があった場合の影響を減らすという点や生成物の蓄積濃度を向上させるという観点からすると、連続的もしくは間欠的に添加することが望ましい。
反応は、通常、水性媒体中、又は水性媒体と有機溶媒との混合物中で行われる。水性媒体としては、例えば、水又は緩衝液が挙げられる。有機溶媒としては、メタノール、エタノール、1−プロパノール、2−プロパノール、1−ブタノール、tert−ブタノール、アセトン、ジメチルスルホキシド等、反応基質である化合物(1)の溶解度が高いものを使用することができる。また、有機溶媒としては、反応副産物の除去等に効果のある、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、n−ヘキサン等を使用することもできる。
反応は、通常、4℃〜60℃、好ましくは10℃〜45℃の反応温度で、また、通常pH3〜11、好ましくはpH5〜8の条件下で行われる。反応時間は、通常、1時間〜72時間程度である。
本発明で得られた化合物(4)を用いることにより、高効率、低コストで、光学純度の高い化合物(3)や様々な医薬品の合成用原料、合成用中間体の製造に有用な中間体を製造することができる。
C=C還元酵素等を用いた下式(II)に示す反応による化合物(3)の製造
本発明によれば、式(II)に示す反応、即ち、C=C還元酵素等を化合物(4)に作用させて、化合物(3)を製造する方法が提供される。
C=C還元酵素は、直接反応に使用してもよいが、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び/又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を用いることが好ましく、これらの中でも、タンパク質をコードするDNAを有する形質転換体を用いることが好ましい。
反応液に添加する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び/又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液の量は、微生物若しくは細胞を添加する場合は、反応液にその微生物若しくは細胞の濃度が、通常、湿菌体重で0.1w/v%〜50w/v%程度、好ましくは1w/v%〜20w/v%となるように添加し、処理物や培養液を用いる場合には、酵素の比活性を求め、添加したときに上記細胞濃度になるような量を添加する。
C=C還元酵素の反応基質である3−トリフルオロメチル−2−シクロヘキセン−1−オールとしては、通常、(1R)体が用いられる。
反応基質となる化合物(4)は、通常、基質濃度が0.01w/v%〜90w/v%、好ましくは0.1w/v%〜30w/v%の範囲で用いられる。反応基質は、反応開始時に一括して添加してもよいが、酵素の基質阻害があった場合の影響を減らすという点や生成物の蓄積濃度を向上させるという観点からすると、連続的もしくは間欠的に添加することが望ましい。
反応は、通常、水性媒体中、又は水性媒体と有機溶媒との混合物中で行われる。水性媒体としては、例えば、水又は緩衝液が挙げられる。有機溶媒としては、メタノール、エタノール、1−プロパノール、2−プロパノール、1−ブタノール、tert−ブタノール、アセトン、ジメチルスルホキシド等、反応基質である化合物(4)の溶解度が高いものを使用することができる。また、有機溶媒としては、反応副産物の除去等に効果のある、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、n−ヘキサン等を使用することもできる。
反応は、通常、4℃〜60℃、好ましくは10℃〜45℃の反応温度で、また、通常pH3〜11、好ましくはpH5〜8の条件下で行われる。反応時間は、通常、1時間〜72時間程度である。
得られた化合物(3)には、そのジアステレオマーである化合物(5)又は化合物(6)が含まれる場合があるが、化合物(3)が医薬品の合成用原料や合成用中間体として使用される場合は、これらの化合物の含有量は少ないことが好ましい。上記の製造方法で得られる化合物(3)において、化合物(5)及び/又は化合物(6)の含有量は8mol%以下であることが好ましく、6mol%以下であることがより好ましく、4mol%以下であることがさらに好ましく、2mol%以下であることが特に好ましい。
C=C還元酵素等を用いた下式(V)に示す反応による化合物(3)の製造
本発明によれば、式(V)に示す反応、即ち、C=C還元酵素等を化合物(1)に作用させて、化合物(3)を製造する方法が提供される。
C=C還元酵素及びC=O還元酵素は、直接反応に使用してもよいが、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び/又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を用いることが好ましく、これらの中でも、タンパク質をコードするDNAを有する形質転換体を用いることが好ましい。
反応液に添加する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び/又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液の量は、微生物若しくは細胞を添加する場合は、反応液にその微生物若しくは細胞の濃度が、通常、湿菌体重で0.1w/v%〜50w/v%程度、好ましくは1w/v%〜20w/v%となるように添加し、処理物や培養液を用いる場合には、酵素の比活性を求め、添加したときに上記細胞濃度になるような量を添加する。
反応基質となる化合物(1)は、通常、基質濃度が0.01w/v%〜90w/v%、好ましくは0.1w/v%〜30w/v%の範囲で用いられる。反応基質は、反応開始時に一括して添加してもよいが、酵素の基質阻害があった場合の影響を減らすという点や生成物の蓄積濃度を向上させるという観点からすると、連続的もしくは間欠的に添加することが望ましい。
反応は、通常、水性媒体中、又は水性媒体と有機溶媒との混合物中で行われる。水性媒体としては、例えば、水又は緩衝液が挙げられる。有機溶媒としては、メタノール、エタノール、1−プロパノール、2−プロパノール、1−ブタノール、tert−ブタノール、アセトン、ジメチルスルホキシド等、反応基質である化合物(1)の溶解度が高いものを使用することができる。また、有機溶媒としては、反応副産物の除去等に効果のある、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、n−ヘキサン等を使用することもできる。
反応は、通常、4℃〜60℃、好ましくは10℃〜45℃の反応温度で、また、通常pH3〜11、好ましくはpH5〜8の条件下で行われる。反応時間は、通常、1時間〜72時間程度である。
得られた化合物(3)には、そのジアステレオマーである化合物(5)又は化合物(6)が含まれる場合があるが、化合物(3)が医薬品の合成用原料や合成用中間体として使用される場合は、これらの化合物の含有量は少ないことが好ましい。上記の製造方法で得られる化合物(3)において、化合物(5)及び/又は化合物(6)の含有量は8mol%以下であることが好ましく、6mol%以下であることがより好ましく、4mol%以下であることがさらに好ましく、2mol%以下であることが特に好ましい。
また、本発明の製造方法1〜3は、補酵素の存在下に行うことができる。補酵素としては、還元型ニコチンアミドアデニンヌクレオチド(NADH)、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADPH)、酸化型ニコチンアミドアデニンヌクレオチド(NAD+)又は酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADP+)を等を用いることができ、好ましくはNADPH又はNADP+を用いることができる。
補酵素の使用量は、補酵素として機能する量であれば特に限定されないが、反応系に、通常、0.001mmol/L〜100mmol/L、好ましくは0.01mmol/L〜10mmol/Lの濃度になるように添加するのが好ましい。
補酵素を添加する場合には、NAD(P)Hから生成するNAD(P)+をNAD(P)Hへの再生させることが生産効率向上のため好ましい。再生方法としては、<1>宿主微生物自体のNAD(P)+還元能を利用する方法、<2>NAD(P)+からNAD(P)Hを生成する能力を有する微生物やその処理物、あるいは、グルコース脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素、有機酸脱水素酵素(リンゴ酸脱水素酵素など)などのNAD(P)Hの再生に利用可能な酵素(再生酵素)を反応系内に添加する方法、<3>形質転換体を製造する際に、NAD(P)Hの再生に利用可能な酵素である上記再生酵素類の遺伝子を本発明のDNAと同時に宿主に導入する方法などが挙げられる。
なお、以下に示す表において、Aはアラニン、Cはシステイン、Dはアスパラギン酸、Fはフェニルアラニン、Hはヒスチジン、Wはトリプトファン、Yはチロシンを示す。また、例えば、A104Wは、アミノ酸配列において104番目のアラニンがトリプトファンに置換されている変異を示す。
実施例において、それぞれの略号は以下の化合物を表す。
(R)−TFCH:(3R)−3−(トリフルオロメチル)シクロヘキサン−1−オン
(S)−TFCH:(3S)−3−(トリフルオロメチル)シクロヘキサン−1−オン
TFCL:3−(トリフルオロメチル)シクロヘキサン−1−オール
(1R,3R)−TFCL:(1R,3R)−3−(トリフルオロメチル)シクロヘキサン−1−オール
(1S,3S)−TFCL:(1S,3S)−3−(トリフルオロメチル)シクロヘキサン−1−オール
TFCL−RPPAエステルは、TFCLの(R)−(−)−2−フェニルプロピオン酸エステルを意味する。
[炭素−炭素二重結合還元酵素(以下、「YqjM」という。)発現用プラスミドの調製]
(1)遺伝子のクローニング
常法に従ってPCRを行い、Bacillus subtilis由来のYqjM(GeneBank Accession No.P54550)をコードするyqjm遺伝子約1kbpのDNA断片を得た。このDNA断片を鋳型として、常法に従ってPCRを行い、5’末端に制限酵素EcoRIの制限酵素切断サイト、3’末端に制限酵素XbaIの制限酵素切断サイトをそれぞれ付加したDNA断片を得た。
(2)発現用プラスミドの調製
上記(1)で得られたyqjmのDNA断片を、制限酵素EcoRIとXbaIにより消化したプラスミドpKV32(特許第4270918号公報に記載のもの)にT4 DNA Ligase(タカラバイオ社製)を用いてtrcプロモーターの下流に導入し、pKV32−YqjMを得た。
[カルボニル還元酵素(以下、「Lkadh」という。)発現用プラスミドの調製]
(1)遺伝子のクローニング
常法に従ってPCRを行い、Lactobacillus kefir由来のlkadh遺伝子(GeneBank Accession No.AY267012)約0.75kbpのDNA断片を得た。このDNA断片を常法に従ってPCRを行い、5’末端に制限酵素EcoR1の制限酵素切断サイト、3’末端に制限酵素XbaIの制限酵素切断サイトをそれぞれ付加したDNA断片を得た。
(2)発現用プラスミドの調製
上記(1)で得られたlkadhのDNA断片を、参考例1(2)と同様にプラスミドpKV32のtrcプロモーターの下流に導入し、pKV32−Lkadhを得た。
[グルコースデヒドロゲナーゼ(以下、「BsGDH」という。)発現用プラスミドの調製]
(1)遺伝子のクローニング
特許第6476110号公報に記載の方法に従って、Bacillus subtilis由来BsGDH(GenBank Accession No.NP_388275)において、96番目のアミノ酸をアラニン、252番目のアミノ酸をロイシンに置換したタンパク質をコードする遺伝子配列bsgdh遺伝子約0.8kbpのDNA断片を得た。このDNA断片を常法に従ってPCRを行い、5’末端に制限酵素EcoR1の制限酵素切断サイト、3’末端に制限酵素XbaIの制限酵素切断サイトをそれぞれ付加したDNA断片を得た。
(2)発現用プラスミドの調製
上記(1)で得られたbsgdhのDNA断片を、制限酵素EcoRIとXbaIにより消化したプラスミドpKW32(特許第5613660号公報に記載のもの)にT4 DNA Ligase(タカラバイオ社製)を用いてtrcプロモーターの下流に導入し、pKW32−BsGDHを得た。
参考例1で得たプラスミドpKV32−YqjMを鋳型として、配列番号1で表されるアミノ酸配列において、26番目のアミノ酸であるCをA、D、F、W、Yのいずれか、104番目のアミノ酸AをF、H、W、Yのいずれかに変化させた組み合わせの変異導入プラスミドを作成した。作製した変異導入プラスミドを表3に示した。
炭素‐炭素二重結合還元酵素(以下、「NEMA」という。)発現用プラスミドの調製]
(1)遺伝子のクローニング
常法に従ってPCRを行い、Esherichia coli由来のNEMA(Biol. Pharm. Bull. 20:110−112(1997)に記載のもの)をコードするnemA遺伝子約1kbpのDNA断片を得た。このDNA断片を鋳型として、常法に従ってPCRを行い、5’末端に制限酵素EcoRIの制限酵素切断サイト、3’末端に制限酵素XbaIの制限酵素切断サイトをそれぞれ付加したDNA断片を得た。
(2)発現用プラスミドの調製
上記(1)で得られたnemAのDNA断片を、参考例1(2)と同様にしてプラスミドpKV32のtrcプロモーターの下流に導入し、pKV32−NEMAを得た。
[カルボニル還元酵素(以下、「IsADH」という。)発現用プラスミドの調製]
(1)遺伝子のクローニング
常法に従ってPCRを行い、Issatchankia scutulata var. scutulata JCM1828株由来のisadh遺伝子(特許第4205496号公報に記載のもの)約1kbpのDNA断片を得た。このDNA断片を常法に従ってPCRを行い、5’末端に制限酵素EcoR1の制限酵素切断サイト、3’末端に制限酵素XbaIの制限酵素切断サイトをそれぞれ付加したDNA断片を得た。
(2)発現用プラスミドの調製
上記(1)で得られたisadhのDNA断片を、参考例1(2)と同様にしてプラスミドpKV32のtrcプロモーターの下流に導入し、pKV32−IsADHを得た。
[各種酵素を発現させた大腸菌Escherichia coli JM109の調製]
(1)発現株の調製
参考例1〜6で得られたプラスミドを用いて、大腸菌Escherichia coli JM109 competent cell(タカラバイオ社製)を常法に従い形質転換し、プラスミドを導入した組換え大腸菌を得た。
(2)酵素液の調製
上記(1)で得られた組換え大腸菌をカナマイシン(25μg/mL)、0.2mmol/Lイソプロピル β−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)を含むLB培地で30℃で18時間生育させた。得られた菌体ブロス2mLを遠心分離により集菌後、Bugbuster Master Mix(Merck社製)にBenzonase及びrLysozymeを添加したものを用いて、常法に従い酵素液を得た。
(1)TFCL異性体1の調製
200mLジャーファーメンターに、7mLの1mol/Lリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)、5.6mLの50mmol/L NADP+、10.5mLの1mol/Lグルコース溶液、718mgの化合物(1)、参考例4及び7で得られた大腸菌JM109/pKV32−YqjM(A104W(YqjM変異体13))の酵素液、参考例2及び7で得られた大腸菌JM109/pKV32−Lkadhの酵素液、参考例3及び7で得られた大腸菌JM109/pKW32−BsGDH(E96A、Q252L)の酵素液を混合し、純水を加え70mLの反応液を調製した。この反応液を、反応温度28℃〜30℃、反応時のpH7.0として、十分な撹拌速度の下、一晩反応させた。
反応終了後の液にメチルtert−ブチルエーテル(以下、MTBEという。)を添加し、室温で攪拌した後、MTBE層を取得した。ロータリーエバポレーターを用いてこの抽出液からMTBEを留去し、TFCL異性体1を得た。
30mL試験管(R)−(−)−2−フェニルプロピオン酸(RPPA)15mg(0.1mmol)、N,N−ジメチルアミノピリジン1.2mg(0.01mmol)及び上記(1)で得られたTFCL異性体1 20.2mg(0.12mmol)を仕込み、ジクロロメタン溶媒200μLを加えて室温で撹拌し反応させた。反応液をGC分析条件1により分析し、目的物の生成を確認した。得られた反応液を0℃に冷却し、N,N’−ジシクロヘキシルカルボジイミド24.7mg(0.12mmol)を投入し、室温で3時間反応させた。反応後、水200μLを加えて分液した後、有機層を回収した。有機層を濾過し、得られたろ液をロータリーエバポレーターで減圧濃縮した。濃縮残渣をシリカゲルカラムで精製し、目的物であるTFCL異性体1−RPPAエステルをオイル状物質として得た。
GC−MS(CI:CH4ガス):m/z=301(M+H) 示性式 C16H19F3O2 計算値 300.1337
1H−NMR(CDCl3,400MHz):
(1)TFCL異性体2の調製
実施例1において、大腸菌JM109/pKV32−YqjMの酵素液を参考例5及び7で得られた大腸菌JM109/pKV32−NEMAの酵素液、大腸菌JM109/pKV32−Lkadhの酵素液を参考例6及び7で得られた大腸菌JM109/pKV32−IsADHの酵素液にそれぞれ変更したこと以外は実施例1と同様にして反応を行った。
反応終了後の液にMTBEを添加し、室温で攪拌した後、MTBE層(抽出液)を取得した。ロータリーエバポレーターを用いて、この抽出液からMTBEを留去して、TFCL異性体2を得た。
30mL試験管に(R)−(−)−2−フェニルプロピオン酸(RPPA)15mg(0.1mmol)、N,N−ジメチルアミノピリジン1.2mg(0.01mmol)及び上記(1)で得られたTFCL異性体2 20.2mg(0.12mmol)を仕込み、ジクロロメタン溶媒200μLを加えて室温で撹拌し反応させた。反応液をGC分析条件1により分析し、目的物の生成を確認した。得られた反応液を0℃に冷却し、N,N’−ジシクロヘキシルカルボジイミド24.7mg(0.12mmol)を投入し、室温で3時間反応させた。反応後、水200μLを加えて分液した後、有機層を回収した。有機層を濾過し、得られたろ液をロータリーエバポレーターで減圧濃縮した。濃縮残渣をシリカゲルカラムで精製し、目的物であるTFCL異性体2−RPPAエステルをオイル状物質として得た。
GC−MS(CI:CH4ガス):m/z=301(M+H)、示性式 C16H19F3O2 計算値 300.1337
1H−NMR(CDCl3,400MHz):
一般的に改良Mocsher法は、ベンゼン環に近いプロトンが高磁場にシフトする現象を確認することで立体配置を決定することができる。
3位プロトンの化学シフトを比較すると、TFCL異性体1−RPPAエステルの方がTFCL異性体2−RPPAエステルよりも0.4ppm〜0.5ppm高磁場にシフトしており、TFCL異性体1−RPPAエステルのベンゼン環が3位プロトンに近いことを確認した(TFCL異性体1−RPPAエステル:1.8ppm、TFCL異性体2−RPPAエステル:2.2ppm〜2.3ppm)。
以上から、実施例1の(1)で得られたTFCL異性体1は(1R,3R)体、参考例8の(1)で得られたTFCL異性体2は(1S,3S)体であると決定した。
YqjM変異体の初期活性測定活性は、化合物(1)添加時のNADPHの減少量を340nmの波長で測定することで確認した。10μLの酵素液(実施例2:参考例1および7で得られた酵素液を使用、実施例3〜11及び比較例1〜8:参考例4および7で得られた酵素液を使用)、25μLの1mol/L リン酸カリウムバッファー(pH7)、10μLの8mmol/L NADPH、200μLの水、及び5μLの0.1mol/L 化合物(1)のDMSO溶液を混合した。混合したものを96ウェルプレート(コーニング社製)に入れ、30℃に温めたマイクロプレートリーダー(モレキュラーバイオ社製)を用いて、340nmの吸光度変化を2分間測定した。単位時間当たりの吸光度変化の平均値(mOD/分)を算出し、吸光度変化の傾きから下記式により単位時間・単位タンパク質当たりの活性値を算出した。NADPHのモル吸光係数は6.3mL/μmol・cmとして計算した。
活性値(μmol/min/mg−タンパク質)=(−1)×吸光度変化の傾き×250μL/10μL/6300/0.55/タンパク質濃度
野生型に対する各変異体の相対活性を表7に示した。なお、相対活性が15%より少ない場合を“−”として示した。
一方、26番目のCをW、D、F又はYに置換したもの(比較例1〜5:YqjM変異体1〜5、比較例6〜8:YqjM変異体15〜17)では、野生型に対する相対活性が著しく低下することが分かった。特にC26W/A104F(比較例1:YqjM変異体1)、C26W/A104Y(比較例2:YqjM変異体2)、C26D/A104W(比較例6:YqjM変異体15)については、非特許文献2に記載の化合物に対する反応性と本発明の化合物(1)に対する反応性が大きく異なることが分かった。
2mLのマイクロチューブに、参考例1及び7の方法で調製したpKV32−YqjM導入組換え大腸菌の酵素液、又は、参考例4及び7の方法で変異を導入したpKV32−YqjM導入組換え大腸菌の酵素液を100μL、50g/L KRED mix N(Codexis社製)を400μL、化合物(1)を4.1mg添加し、30℃で1時間撹拌し、反応させた。得られた反応液にヘプタン1mLを添加し、常温下で撹拌した。静置後に得られた上層をGC分析条件2により分析した。化合物(1)からTFCHへの変換率、及び得られた(R)−TFCH(化合物(2))の光学純度を表8に示した。なお、変換率及び光学純度は下記式により算出した。
200mLジャーファーメンターに、7mLの1mol/Lリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)、0.7mLの50mmol/L NADP+、10.5mLの4mol/Lグルコース溶液、33mLの純水、2873mgの化合物(1)、参考例4及び7で得られた大腸菌JM109/pKV32−YqjM(A104W(YqjM変異体13))の湿菌体0.84g分の酵素液8.4mL、参考例2及び7、で得られた大腸菌JM109/pKV32−Lkadhの湿菌体0.42g分の酵素液4.2mL、参考例3及び7で得られた大腸菌JM109/pKW32−BsGDH(E96A、Q252L)の湿菌体0.61g分の酵素液6.1mLを混合し、反応温度28℃〜30℃、25wt%NaOH水溶性を用いて反応時のpHを7.0に保ちながら、十分な撹拌速度の下、17時間反応させた。
反応終了後の液にメチルtert−ブチルエーテル(以下、MTBEという。)を35mL添加し、室温で攪拌した後、(1R,3R)−TFCLを含むMTBE層を取得した。得られた水層に対し再度MTBEを35mL添加し、室温で攪拌した後、(1R,3R)−TFCLを含むMTBE層を取得した。得られたMTBE層のGC分析条件2による純度分析及び光学純度分析の結果、(1R,3R)−TFCLの純分は2348mgであり、収率は81.8%であった。光学純度は99.8%e.e.であった。ジアステレオマー存在比は1.6%であった。なお、光学純度及びジアステレオマー存在比は下記式により算出した。
(1)(R)−TFCH(化合物(2))の製造
2mLのマイクロチューブに、50μLの1mol/Lリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)、20μLの50mmol/L NAD+、20μLの50mmol/L NADP+、75μLの1mol/Lグルコース溶液、8.2mgの化合物(1)、参考例1及び7で得られた大腸菌JM109/pKV32−YqjMの酵素液、参考例3及び7で得られた大腸菌JM109/pKW32−BsGDH(E96A、Q252L)の酵素液を混合し、純水を加え500μLの反応液Aを調製した。反応液Aと同様にして分析用に反応液Bを調整し、反応液A及びBを、反応温度30℃、十分な撹拌速度の下、16時間反応させた。
反応後、反応液Bにヘプタン1mLを添加し、常温下で1分間撹拌した。静置後に得られた上層をGC分析条件2により分析した。化合物(1)から化合物(2)への変換率は43.1%であり、得られた化合物(2)の光学純度は67.8%eeであった。なお、変換率及び光学純度は下記式により算出した。
上記(1)で得られた反応液Aを反応温度30℃、十分な撹拌速度の下、さらに8時間反応させた後、反応液Aに20μLの50mmol/L NAD+、20μLの50mmol/L NADP+、75μLの1mol/Lグルコース溶液、100μLの参考例2及び7で得られた大腸菌JM109/pKV32−Lkadhの酵素液を添加し、さらに16時間反応させた。得られた反応液にヘプタン1mLを添加し、常温下で1分間撹拌した。静置後に得られた上層をGC分析条件2により分析した。得られた(1R,3R)−TFCL(化合物(3))の光学純度は75.8%eeであった。ジアステレオマー存在比は23.8%であった。なお、光学純度及びジアステレオマー存在比は下記式により算出した。
2mLのマイクロチューブに、50μLの1mol/Lリン酸カリウム緩衝液(pH 7.0)、20μLの50mmol/L NAD+、20μLの50mmol/L NADP+、75μLの1mol/Lグルコース溶液、8.2mg化合物(1)、参考例2及び7で得られた大腸菌JM109/pKV32−Lkadhの酵素液、参考例3及び7で得られた大腸菌JM109/pKW32−BsGDH(E96A、Q252L)の酵素液を混合し、純水を加え500μLの反応液を調製した。この反応液を、反応温度30℃、十分な撹拌速度の下、23時間反応させた。得られた反応液にヘプタン1mLを添加し、常温下で1分間撹拌した。静置後に得られた上層をGC−MS分析し、(1R)−3−トリフルオロメチル−2−シクロヘキセン−1−オール(化合物(4))の生成を確認した。生成物は実施例1、22及び23(2)の結果から(1R)体と推定した。化合物(1)から化合物(4)への変換率は43.6%であった。なお、変換率は下記式により算出した。
Claims (5)
- 式(1)
で表される化合物に、炭素−炭素二重結合還元酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び/又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液、並びにカルボニル還元酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び/又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を接触させて、式(3)
で表される化合物を得ることを特徴とする、式(3)で表される化合物の製造方法であって、
炭素−炭素二重結合還元酵素は、以下の(A)、(B)又は(C)に示すタンパク質を含み、
(A)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(B)配列番号1で表されるアミノ酸配列において、1〜5個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び/又は付加されたアミノ酸配列であって、かつ式(I)及び/又は式(II)に示す反応を触媒する活性を有するタンパク質
(i)配列番号1で表されるアミノ酸配列における26番目のシステインが、アラニンに置換
(ii)配列番号1で表されるアミノ酸配列における104番目のアラニンが、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン又はチロシンに置換
カルボニル還元酵素は、以下の(A)、(B)又は(C)に示すタンパク質を含む、製造方法。
(A)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(B)配列番号2で表されるアミノ酸配列において、1〜5個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び/又は付加されたアミノ酸配列であって、かつ式(III)及び/又は式(IV)に示す反応を触媒する活性を有するタンパク質
- 式(1)
で表される化合物に、炭素−炭素二重結合還元酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び/又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を接触させて、式(2)
で表される化合物を得た後に、さらに
式(2)で表される化合物に、カルボニル還元酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び/又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を接触させて、式(3)
で表される化合物を得ることを特徴とする、請求項1に記載の製造方法。 - 化合物(3)に含まれる、式(5)
で表される化合物及び/又は式(6)
で表される化合物の含有量が8mol%以下であることを特徴とする、請求項1又は2に記載の製造方法。 - 式(1)
で表される化合物に、炭素−炭素二重結合還元酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び/又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を接触させて、式(2)
で表される化合物を得ることを特徴とする、式(2)で表される化合物の製造方法であって、
炭素−炭素二重結合還元酵素は、以下の(A)、(B)又は(C)に示すタンパク質を含む、製造方法。
(A)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(B)配列番号1で表されるアミノ酸配列において、1〜5個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び/又は付加されたアミノ酸配列であって、かつ式(I)に示す反応を触媒する活性を有するタンパク質
(i)配列番号1で表されるアミノ酸配列における26番目のシステインが、アラニンに置換
(ii)配列番号1で表されるアミノ酸配列における104番目のアラニンが、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン又はチロシンに置換 - 式(1)
で表される化合物に、カルボニル還元酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び/又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を接触させて、式(4)
で表される化合物を得ることを特徴とする、式(4)で表される化合物の製造方法であって、
カルボニル還元酵素は、以下の(A)、(B)又は(C)に示すタンパク質を含む、製造方法。
(A)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(B)配列番号2で表されるアミノ酸配列において、1〜5個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び/又は付加されたアミノ酸配列であって、かつ(IV)に示す反応を触媒する活性を有するタンパク質
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