WO2020213731A1 - （１ｒ，３ｒ）－３－（トリフルオロメチル）シクロヘキサン－１－オール及びその中間体の製造法 - Google Patents

（１ｒ，３ｒ）－３－（トリフルオロメチル）シクロヘキサン－１－オール及びその中間体の製造法 Download PDF

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cell
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晴花 佐々野
崇敦 井浦
健二 大木
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株式会社エーピーアイ コーポレーション
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    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
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    • C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
    • C12Y401/02—Aldehyde-lyases (4.1.2)

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing (1R, 3R) -3- (trifluoromethyl) cyclohexane-1-ol, which is a cyclohexane derivative useful as a raw material for synthesis of pharmaceuticals and an intermediate for synthesis, and an intermediate thereof.
  • (1R, 3R) -3- (trifluoromethyl) cyclohexane-1-ol and its intermediates and derivatives are useful as raw materials for synthesis and intermediates for synthesis of various pharmaceutical products.
  • a method for producing (1R, 3R) -3- (trifluoromethyl) cyclohexane-1-ol a method for producing racemic 3-trifluoromethylcyclohexanone by a biological method (Non-Patent Document 4). It has been known.
  • Patent Documents 1 and 2 and Non-Patent Document 3 describe an enzyme that converts a carbonyl group into a hydroxyl group, but do not describe an example applied to the compound of the present invention.
  • Patent Document 3 and Non-Patent Document 1 describe a carbon-carbon double bond reductase, but do not describe an example applied to the compound of the present invention.
  • Non-Patent Document 2 describes a similar compound in which the 3-position trifluoromethyl group of 3-trifluoromethyl-2-cyclohexene-1-one (hereinafter, may be referred to as compound (1)) is replaced with a methyl group.
  • a similar compound of (3R) -3- (trifluoromethyl) cyclohexane-1-one (hereinafter, may be referred to as compound (2)) by contacting a carbonyl group with a specific carbon-carbon double bond reducing enzyme. How to obtain is described. However, no example is described in which a specific enzyme is applied to the compound of the present invention. Further, as is clear from Comparative Examples 1, 2 and 6 described later, an enzyme described in Non-Patent Document 2 and having excellent reactivity and optical selectivity with respect to a compound similar to compound (1). Even when (YqjM mutants 1, 2 and 15) were brought into contact with compound (1), the reaction hardly proceeded.
  • (1R, 3R) -3- (trifluoromethyl) cyclohexane-1-ol (hereinafter, may be referred to as compound (3)), which is useful as an intermediate for pharmaceutical products, is produced with high purity and high efficiency. Moreover, a method of industrially manufacturing at low cost is desired.
  • the present invention is a novel method for industrially producing (1R, 3R) -3- (trifluoromethyl) cyclohexane-1-ol and its intermediates at high optical purity, high selectivity, high efficiency, and low cost. It is an issue to be solved to provide.
  • C C reductase
  • the enzyme a microorganism or cell capable of producing the enzyme, a processed product of the microorganism or cell, and / or a culture solution containing the enzyme obtained by culturing the microorganism or cell (hereinafter, these).
  • enzyme etc.
  • a carbon-carbon double bond reducing enzyme an ability to produce the enzyme.
  • the cell, the processed product of the microorganism or the cell, and / or the culture solution containing the enzyme obtained by culturing the microorganism or the cell are brought into contact with each other to formula (3).
  • Formula (3) which comprises obtaining the compound represented by ((1R, 3R) -3- (trifluoromethyl) cyclohexane-1-ol (hereinafter, may be referred to as compound (3))).
  • At least one amino acid substitution selected from the following groups (i) to (ii) having an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is introduced.
  • the 26th cysteine in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is aspartic acid, phenylalanine, a protein having an activity of catalyzing the reaction represented by the formula (I) and / or the formula (II). Substituted with an amino acid other than tryptophan or tyrosine
  • the 104th alanine in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is replaced with an amino acid other than alanine.
  • compound (4) After obtaining the compound represented by ((1R) -3-trifluoromethyl-2-cyclohexene-1-ol (hereinafter, may be referred to as compound (4))), it is further represented by the formula (4).
  • the containing culture solution is brought into contact with the formula (3).
  • a method for producing a compound represented by the formula (2) which comprises obtaining the compound represented by.
  • At least one amino acid substitution selected from the following groups (i) to (ii) having an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is introduced.
  • the 26th cysteine in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is aspartic acid, phenylalanine, a protein having an activity of catalyzing the reaction represented by the formula (I) and / or the formula (II). Substituted with an amino acid other than tryptophan or tyrosine
  • the 104th alanine in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is replaced with an amino acid other than alanine.
  • a method for producing a compound represented by the formula (4) which comprises obtaining the compound represented by.
  • (1R) -3-trifluoromethyl-2-cyclohexene-1-ol or (3R) -3- (trifluoromethyl) useful as raw materials for synthesis of various pharmaceutical products and intermediates for synthesis. It is possible to provide a novel method for industrially producing cyclohexane-1-one with high optical purity, high selectivity, high efficiency and low cost. Further, high efficiency is achieved by using (1R) -3-trifluoromethyl-2-cyclohexene-1-ol or (3R) -3- (trifluoromethyl) cyclohexane-1-one thus obtained.
  • the manufacturing methods 1 to 3 mean the following manufacturing methods, respectively.
  • Production method 1 Production method of compound (3) having steps 1 and 2
  • Production method 2 Production method of compound (3) having steps 3 and 4
  • Production method 3 Production of compound (3) having step 5 Method
  • steps 1 to 5 mean the following steps, respectively.
  • a processed product of a microorganism or a cell and / or a culture solution containing the enzyme obtained by culturing the microorganism or the cell is brought into contact with each other to obtain a compound represented by the formula (3).
  • the enzyme, a microorganism or cell capable of producing the enzyme, a processed product of the microorganism or cell, and / or a culture solution containing the enzyme obtained by culturing the microorganism or cell is referred to as ". It may be called "enzyme, etc.”
  • C C reductase will be described.
  • C C reductase is not particularly limited.
  • examples of the purification method include solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, recrystallization, and combinations thereof.
  • the nucleic acid may be double-stranded or single-stranded. In the case of double strand, it may be double-stranded DNA, double-stranded RNA or a hybrid of DNA: RNA.
  • a single strand it may be either a sense strand (ie, coding strand) or an antisense strand (ie, non-coding strand).
  • SEQ ID NO: 5 the base sequence of the yqjm gene derived from Bacillus subtilis
  • synthetic DNA and the like can be mentioned.
  • C C reductase derived from Bacillus subtilis
  • known kits such as Mutan TM- super Express Km (TAKARA BIO INC.) And Mutan TM- K (TAKARA BIO INC.)
  • the ODA-LA PCR method, Gapped duplex method, Kunkel method, etc. are known. It can be obtained by converting according to the method of or a method similar thereto.
  • the cloned cDNA is converted according to the above-mentioned method by colony or plaque hybridization method, PCR method, or the like. It can also be obtained by.
  • the vector used for the library may be bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid or the like.
  • the term "expression vector" is used to replicate and express a protein having a desired function in the host organism by introducing a polynucleotide encoding a protein having the desired function into the host organism. Is a genetic factor. Examples include, but are not limited to, plasmids, viruses, phages, cosmids and the like.
  • the expression vector is a plasmid.
  • the term "transformant” refers to a microorganism or a microorganism into which a gene of interest has been introduced using the expression vector or the like so that a desired trait related to a protein having a desired function can be expressed.
  • promoters and terminators are not particularly limited as long as they are promoters and terminators known to function in cells used as hosts. For example, in "Basic Microbiology Course 8 Genetic Engineering / Kyoritsu Shuppan". Vectors, promoters and terminators described in detail can be used.
  • C C reductase
  • the present invention is not limited, and examples thereof include the following microorganisms.
  • Saccharomyces, Kluyveromyces, Schizosaccharomyces, Zygosaccharomyces, Yarrowia, Trichosporon, Rodosporon, Rhodosporon A yeast with an established host vector system belonging to the genus Hansenula, Pichia, Candida, etc.
  • the procedure for preparing a transformant, the construction of a recombinant vector suitable for the host, and the method for culturing the host can be performed according to the techniques commonly used in the fields of molecular biology, biological engineering, and genetic engineering (). For example, the method described in Molecular Cloning).
  • examples of preferred host microorganisms, preferred transformation methods in each microorganism, vectors, promoters, terminators and the like will be specifically given, but the present invention is not limited to these examples.
  • examples of the plasmid vector include pKV32, pKW32, pBR, pUC-based plasmids, and lac ( ⁇ -galactosidase), trp (tryptophan operon), tac, and the like.
  • examples include promoters derived from trc (fusion of lac and trp), ⁇ phage PL, PR and the like.
  • Examples of the terminator include terminators derived from trpA, phages, and rrnB ribosomal RNA.
  • examples of the vector include a pUB110-based plasmid, a pC194-based plasmid, and the like, and can also be integrated into a chromosome.
  • promoters and terminators of enzyme genes such as alkaline protease, neutral protease and ⁇ -amylase can be used.
  • plasmids involved in the degradation of toluene compounds and TOL plasmids are used.
  • Examples include the basic broad host range vector (containing genes required for autonomous replication derived from RSF1010, etc.) pKT240 (Gene, 26,273-82 (1983)).
  • examples of the vector include plasmid vectors such as pAJ43 (Gene 39,281 (1985)).
  • promoter and terminator various promoters and terminators used in Escherichia coli can be used.
  • plasmids such as pCS11 (Japanese Patent Laid-Open No. 57-183779) and pCB101 (Mol.Gen.Genet.196,175 (1984)) Vectors can be mentioned.
  • Saccharomyces particularly Saccharomyces cerevisiae
  • examples of the vector include YRp-based, YEp-based, YCp-based, and YIp-based plasmids.
  • promoters and terminators of various enzyme genes such as alcohol dehydrogenase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, acidic phosphatase, ⁇ -galactosidase, phosphoglycerate kinase, and enolase can be used.
  • examples of the vector include a plasmid vector derived from Schizosaccharomyces pombe described in Mol.Cell.Biol.6,80 (1986).
  • pAUR224 is commercially available from Takara Bio Inc. and can be easily used.
  • Aspergillus In the genus Aspergillus, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, etc. are the most well-studied molds, and integration into plasmids and chromosomes is available, and bacterial cells. Promoters derived from external proteases and amylases are available (Trendsin Biotechnology 7,283-287 (1989)).
  • host vector systems corresponding to various microorganisms have been established, and they can be used as appropriate.
  • various host-vector systems In addition to microorganisms, various host-vector systems have been established in plant cells and animal cells, especially in animal cells such as insects (for example, silkworms) (Nature 315,592-594 (1985)), rapeseed, and corn.
  • a system that expresses a large amount of heterologous protein in plant cells such as potatoes, and a system that uses a cell-free protein synthesis system such as Escherichia coli cell-free extract and wheat germ have been established and can be preferably used.
  • C C reductase (activity capable of stereoselectively reducing a carbon-carbon double bond)
  • a method such as reducing the expression of can be used.
  • microorganism or cell having the ability to produce the enzyme in the production method of the present invention is not limited to the living microorganism or cell, but also includes a dead living body having enzyme activity. It also includes the frozen microorganisms or cells.
  • the "processed product of the microorganism or cell” in the production method of the present invention means that the microorganism or cell is cultured, and the microorganism or cell is 1) an organic solvent (acetone, dimethyl sulfoxide (DMSO), toluene, etc.) or an interface. From those destroyed by an activator, 2) freeze-dried, 3) immobilized on a carrier, 4) physically or enzymatically destroyed, or 5) treated products 1) to 4) above.
  • the enzyme fraction is taken out as a crude product or a purified product, and these are immobilized on a carrier (polyacrylamide gel, carrageenan gel, etc.) and contain a protein having a desired function. Etc.
  • the processed product may be, for example, a protein obtained by destroying the cultured microorganism or cell.
  • the protein can be obtained, for example, by using a commercially available kit (eg, Bugbuster Master Mix (manufactured by Merck)).
  • Bugbuster Master Mix manufactured by Merck
  • the processed product may be referred to as an “enzyme solution”.
  • the "culture solution containing the enzyme obtained by culturing the microorganism or cell” in the production method of the present invention is 1) a culture solution of the microorganism or cell (for example, a suspension of the cell and a liquid medium). , If the cell is a secretory-expressing cell, the supernatant or its concentrate obtained by removing the cell by centrifugation or the like), 2) the culture medium of the microorganism or the cell treated with an organic solvent or the like, 3) The cell membrane of the microorganism or cell may be physically or enzymatically destroyed, or an enzyme obtained by crudely purifying or purifying 2) or 3).
  • B In the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, one to a plurality of amino acids have an amino acid sequence deleted, substituted, inserted and / or added, and the formula (I) and / or the formula (II) ) With activity to catalyze the reaction;
  • At least one amino acid substitution selected from the following groups (i) to (ii) having an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is introduced. And / or a protein having an activity of catalyzing the reaction represented by the formula (I) and / or the formula (II):
  • the 26th cysteine in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is replaced with an amino acid other than aspartic acid, phenylalanine, tryptophan or tyrosine.
  • the 104th alanine in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is replaced with an amino acid other than alanine.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is the amino acid sequence of the carbon-carbon double bond reductase YqjM derived from Bacillus subtilis.
  • amino acid usually means 1 to 100, preferably 1 to 50, more preferably 1 to 20, and even more preferably 1 to 10. , Even more preferably 1 to 5, even more preferably 1 to 3, and particularly preferably 1 or 2 amino acids. In the case of substitution, the amino acid is preferably substituted conservatively.
  • the amino acid substitution of (i) is preferably the following amino acid substitution of (i'), and the amino acid substitution of (ii) is preferably the following amino acid of (ii'). Substitutions, more preferably (ii'') amino acid substitutions, particularly preferably (iii'') amino acid substitutions.
  • the 26th cysteine in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is replaced with alanine.
  • the 104th alanine in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is replaced with histidine, phenylalanine, tryptophan or tyrosine.
  • the 26th cysteine in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is replaced with alanine
  • the 104th alanine is replaced with phenylalanine, tyrosine, tryptophan or histidine.
  • Substitutions (C26A and A104F, C26A and A104Y, C26A and A104W, or C26A and A104H) can be mentioned.
  • the 26th cysteine in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is replaced with alanine (C26A).
  • the 104th alanine in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is replaced with phenylalanine, tyrosine, tryptophan or histidine (A104F, A104Y, A104W, or A104H).
  • phenylalanine, tyrosine, tryptophan or histidine A104F, A104Y, A104W, or A104H.
  • C26A and A104F, C26A and A104Y, C26A and A104W, C26A and A104H, C26A, A104F, A104Y, A104W, or A104H are preferable, and C26A and A104Y, C26A and A104W, C26A and A104H, A104Y, A104W or A104H is more preferable, and C26A and A104W or A104W are particularly preferable.
  • the relative activity, conversion rate and optical purity with respect to the wild type can be improved by performing the above-mentioned amino acid substitution.
  • the identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, and even more preferably. Is 98% or more, particularly preferably 99% or more.
  • Other algorithms for determining amino acid sequence homology include, for example, the algorithm described in Karlin et al., Proc.
  • the activity of catalyzing the reaction represented by the formula (I) is the activity of catalyzing the reaction of reducing the compound (1) to produce the compound (2). ..
  • the activity of catalyzing the reaction represented by the formula (II) is the activity of catalyzing the reaction of reducing the compound (4) to produce the compound (3). ..
  • the selectivity in the reaction represented by the formula (II) can be confirmed by using the ratio of the (1R, 3R) form and the (1R, 3S) form of the compound (3) produced by reduction as an index.
  • the production ratio of the (1R, 3R) body and the (1R, 3S) body can be compared using the ratio of the generated Trans body and the Cis body as an index.
  • the Trans and Cis isomers mean geometric isomers, the (1R, 3R) and (1S, 3S) isomers are Trans isomers, and the (1R, 3S) and (1S, 3R) isomers are Cis isomers. Is.
  • Quantitatively equivalent to the included C C reductase, but within an acceptable range (eg, about 0.1 to about 20 times, preferably about 0.3 to about 15 times, more preferably about. It may be different by 0.5 times to about 10 times).
  • a processed product of the microorganism or cell, and / or a culture solution containing the enzyme obtained by culturing the microorganism or cell is preferably used.
  • a processed product of a microorganism or a cell and / or a culture solution containing the enzyme obtained by culturing the microorganism or the cell is brought into contact with each other to obtain a compound represented by the formula (3).
  • the enzyme, a microorganism or cell capable of producing the enzyme, a processed product of the microorganism or cell, and / or a culture solution containing the enzyme obtained by culturing the microorganism or cell is referred to as "enzyme or the like".
  • Enzyme or the like O reductase will be described.
  • C O reductase is not particularly limited.
  • examples of the purification method include solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, recrystallization, and combinations thereof.
  • the nucleic acid may be double-stranded or single-stranded. In the case of double strand, it may be double-stranded DNA, double-stranded RNA or a hybrid of DNA: RNA.
  • a single strand it may be either a sense strand (ie, coding strand) or an antisense strand (ie, non-coding strand).
  • C O reductase derived from Lactobacillus kefil, Pichia finlandica or Devosia riboflavina, Lactobacillus kefil, Pichia finlandica or Devosa using the whole Tlybana or Devoa vector
  • Directly amplified full-length C C reductase cDNA using ODA-LA PCR using known kits such as Mutan TM- super Express Km (TAKARA BIO INC.), Mutan TM- K (TAKARA BIO INC.), Etc. It can be obtained by conversion according to a method known per se, such as the method, Gapped duplex method, Kunkel method, or a method similar thereto.
  • the cloned cDNA is converted according to the above-mentioned method by colony or plaque hybridization method, PCR method, or the like. It can also be obtained by.
  • the vector used for the library may be bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid or the like.
  • C O reductase (activity capable of stereoselectively reducing a carbonyl group)
  • it is a cell, there is no particular limitation, and it may be a microorganism or a cell that has the ability internally, or a microorganism or a cell that has been endowed with the ability by breeding.
  • a method such as reduction can be used.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is the amino acid sequence of the carbonyl reductase Lkadh derived from Lactobacillus kefil, and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 is derived from Pichia finlandica.
  • the amino acid sequence of the carbonyl reductase PfODH, and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 is the amino acid sequence of the carbonyl reductase DrCR derived from Devosia riboflavina.
  • "1 to a plurality of amino acids” usually means 1 to 100, preferably 1 to 50, more preferably 1 to 20, and even more preferably 1 to 10.
  • the number of amino acids is even more preferably 1 to 5, even more preferably 1 to 3, and particularly preferably 1 or 2 amino acids.
  • the amino acid is preferably substituted conservatively.
  • the identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 3 or 4 is 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more. It is even more preferably 98% or more, and particularly preferably 99% or more.
  • the production ratio of the (1R, 3R) form and the (1S, 3R) form of the compound (3) can be compared using the ratio of the produced Trans form and the Cis form as an index.
  • the Trans and Cis isomers mean geometric isomers, the (1R, 3R) and (1S, 3S) isomers are Trans isomers, and the (1R, 3S) and (1S, 3R) isomers are Cis isomers. Is.
  • the activity of catalyzing the reaction represented by the formula (IV) is the activity of catalyzing the reaction of reducing the compound (1) to produce the compound (4). ..
  • the selectivity in the reaction represented by the formula (IV) can be confirmed by using the ratio of the (1R) form and the (1S) form of the compound (4) produced by reduction as an index. The lower the amount of (1S) produced than the amount of (1R) produced, the higher the yield of compound (4), which is advantageous in industrialization.
  • C O reductase containing a protein, but within an acceptable range (for example, about 0.1 to about 20 times, preferably about 0.3 to about 15 times, more preferably. May differ by about 0.5 times to about 10 times).
  • C O reductase containing the protein shown in (A), (B) or (C)
  • a processed product of the microorganism or cell, and / or a culture solution containing the enzyme obtained by culturing the microorganism or cell is preferably used.
  • the composition of the present invention is useful because it can be used as a catalyst to industrially produce a compound (2) or a compound (3) having high optical purity with high efficiency and low cost.
  • the composition of the present invention is useful because it can be used as a catalyst to industrially produce a compound (3) or a compound (4) having high optical purity with high efficiency and low cost.
  • composition of the present invention may contain excipients, buffers, suspending agents, stabilizers, preservatives, preservatives, physiological saline, etc., in addition to active ingredients (enzymes, etc.).
  • excipient lactose, sorbitol, D-mannitol, sucrose and the like can be used.
  • buffer phosphate, citrate, acetate and the like can be used.
  • Propylene glycol, ascorbic acid and the like can be used as the stabilizer.
  • phenol, benzalkonium chloride, benzyl alcohol, chlorobutanol, methylparaben and the like can be used.
  • benzalkonium chloride, paraoxybenzoic acid, chlorobutanol and the like can be used.
  • the treated product is added to the reaction solution so that the concentration of the microorganism or cells is usually about 0.1 w / v% to 50 w / v%, preferably 1 w / v% to 20 w / v% based on the body weight of the wet bacteria. Or, when using a culture solution, determine the specific activity of the enzyme, and add an amount so as to reach the above cell concentration when added.
  • w / v% represents weight / volume%.
  • the compound (1) serving as a reaction substrate is usually used in a substrate concentration of 0.01 w / v% to 90 w / v%, preferably 0.1 w / v% to 30 w / v%.
  • the reaction substrate may be added all at once at the start of the reaction, but it is continuous or intermittent from the viewpoint of reducing the influence of the enzyme substrate inhibition and improving the accumulated concentration of the product. It is desirable to add to.
  • the reaction is usually carried out in an aqueous medium or in a mixture of an aqueous medium and an organic solvent.
  • the aqueous medium include water or a buffer solution.
  • the organic solvent a solvent having high solubility of the reaction substrate compound (1) such as methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, 1-butanol, tert-butanol, acetone and dimethyl sulfoxide can be used. ..
  • the organic solvent ethyl acetate, butyl acetate, toluene, chloroform, n-hexane and the like, which are effective in removing reaction by-products and the like, can also be used.
  • the reaction is usually carried out at a reaction temperature of 4 ° C. to 60 ° C., preferably 10 ° C. to 45 ° C., and usually under conditions of pH 3 to 11, preferably pH 5 to 8.
  • the reaction time is usually about 1 hour to 72 hours.
  • the compound (2) produced by the production method of the present invention is prepared after the reaction is completed, the cells and proteins in the reaction solution are separated by a separation or purification method known to those skilled in the art such as centrifugation and membrane treatment, and then 1-. Extraction with organic solvents such as butanol and tert-butanol, distillation, column chromatography using ion exchange resin, silica gel, etc., crystallization at isoelectric point, crystallization with monohydrochloride, dihydrochloride, calcium salt, etc. Can be purified by appropriately combining the above.
  • a compound (3) having high efficiency, low cost, and high optical purity a raw material for synthesis of various pharmaceuticals, and an intermediate useful for producing a synthetic intermediate are used. Can be manufactured.
  • a culture solution containing the enzyme obtained by culturing the microorganism or cell, and / or the processed product of the microorganism or cell such as a transformant having the encoding DNA).
  • Compound (3) can be produced.
  • the treated product is added to the reaction solution so that the concentration of the microorganism or cells is usually about 0.1 w / v% to 50 w / v%, preferably 1 w / v% to 20 w / v% based on the body weight of the wet bacteria. Or, when using a culture solution, determine the specific activity of the enzyme, and add an amount so as to reach the above cell concentration when added.
  • the reaction substrate of C O reductase, 3- (trifluoromethyl) cyclohexane-1-one, the (3R) form is usually used.
  • the compound (2) serving as a reaction substrate is usually used in a substrate concentration of 0.01 w / v% to 90 w / v%, preferably 0.1 w / v% to 30 w / v%.
  • the reaction substrate may be added all at once at the start of the reaction, but it is continuous or intermittent from the viewpoint of reducing the influence of the enzyme substrate inhibition and improving the accumulated concentration of the product. It is desirable to add to.
  • the reaction is usually carried out in an aqueous medium or in a mixture of an aqueous medium and an organic solvent.
  • the aqueous medium include water or a buffer solution.
  • the organic solvent a solvent having high solubility of the reaction substrate compound (2) such as methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, 1-butanol, tert-butanol, acetone and dimethyl sulfoxide can be used. ..
  • the organic solvent ethyl acetate, butyl acetate, toluene, chloroform, n-hexane and the like, which are effective in removing reaction by-products and the like, can also be used.
  • the reaction is usually carried out at a reaction temperature of 4 ° C. to 60 ° C., preferably 10 ° C. to 45 ° C., and usually under conditions of pH 3 to 11, preferably pH 5 to 8.
  • the reaction time is usually about 1 hour to 72 hours.
  • the compound (3) produced by the production method of the present invention is prepared after the reaction is completed, the cells and proteins in the reaction solution are separated by a separation or purification method known to those skilled in the art such as centrifugation and membrane treatment, and then 1-. Extraction with organic solvents such as butanol and tert-butanol, distillation, column chromatography using ion exchange resin, silica gel, etc., crystallization at isoelectric point, crystallization with monohydrochloride, dihydrochloride, calcium salt, etc. Can be purified by appropriately combining the above.
  • the obtained compound (3) has a diastereomer of the following formula (5).
  • the compound represented by (hereinafter, may be referred to as compound (6)) may be contained, but when compound (3) is used as a raw material for synthesis of a pharmaceutical product or an intermediate for synthesis, these may be included.
  • the content of the compound of is preferably small.
  • the content of the compound (5) and / or the compound (6) is preferably 8 mol% or less, more preferably 6 mol% or less, and 4 mol% or less. Is more preferable, and 2 mol% or less is particularly preferable.
  • the compound (3) obtained in the present invention By using the compound (3) obtained in the present invention, it is possible to produce synthetic raw materials and synthetic intermediates for various pharmaceuticals with high efficiency, low cost, and high optical purity. Since the compound (3) obtained in the present invention has a small amount of impurities, it can be used for the production of synthetic raw materials and synthetic intermediates for various pharmaceuticals without purification, so that the production cost is low. Yes, which is preferable for industrial production.
  • the treated product is added to the reaction solution so that the concentration of the microorganism or cells is usually about 0.1 w / v% to 50 w / v%, preferably 1 w / v% to 20 w / v% based on the body weight of the wet bacteria. Or, when using a culture solution, determine the specific activity of the enzyme, and add an amount so as to reach the above cell concentration when added.
  • the compound (1) serving as a reaction substrate is usually used in a substrate concentration of 0.01 w / v% to 90 w / v%, preferably 0.1 w / v% to 30 w / v%.
  • the reaction substrate may be added all at once at the start of the reaction, but it is continuous or intermittent from the viewpoint of reducing the influence of the enzyme substrate inhibition and improving the accumulated concentration of the product. It is desirable to add to.
  • the reaction is usually carried out in an aqueous medium or in a mixture of an aqueous medium and an organic solvent.
  • the aqueous medium include water or a buffer solution.
  • the organic solvent a solvent having high solubility of the reaction substrate compound (1) such as methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, 1-butanol, tert-butanol, acetone and dimethyl sulfoxide can be used. ..
  • the organic solvent ethyl acetate, butyl acetate, toluene, chloroform, n-hexane and the like, which are effective in removing reaction by-products and the like, can also be used.
  • the reaction is usually carried out at a reaction temperature of 4 ° C. to 60 ° C., preferably 10 ° C. to 45 ° C., and usually under conditions of pH 3 to 11, preferably pH 5 to 8.
  • the reaction time is usually about 1 hour to 72 hours.
  • the compound (4) produced by the production method of the present invention is prepared after the reaction is completed, the cells and proteins in the reaction solution are separated by a separation or purification method known to those skilled in the art such as centrifugation and membrane treatment, and then 1-. Extraction with organic solvents such as butanol and tert-butanol, distillation, column chromatography using ion exchange resin, silica gel, etc., crystallization at isoelectric point, crystallization with monohydrochloride, dihydrochloride, calcium salt, etc. Can be purified by appropriately combining the above.
  • an intermediate useful for producing a compound (3) having high optical purity with high efficiency and low cost a raw material for synthesis of various pharmaceuticals, and an intermediate for synthesis. Can be manufactured.
  • a culture solution containing the enzyme obtained by culturing the microorganism or cell, and / or the processed product of the microorganism or cell such as a transformant having the encoding DNA).
  • Compound (3) can be produced.
  • the treated product is added to the reaction solution so that the concentration of the microorganism or cells is usually about 0.1 w / v% to 50 w / v%, preferably 1 w / v% to 20 w / v% based on the body weight of the wet bacteria. Or, when using a culture solution, determine the specific activity of the enzyme, and add an amount so as to reach the above cell concentration when added.
  • the reaction substrate of C C reductase, 3-trifluoromethyl-2-cyclohexene-1-ol, the (1R) form is usually used.
  • the compound (4) serving as a reaction substrate is usually used in a substrate concentration of 0.01 w / v% to 90 w / v%, preferably 0.1 w / v% to 30 w / v%.
  • the reaction substrate may be added all at once at the start of the reaction, but it is continuous or intermittent from the viewpoint of reducing the influence of the enzyme substrate inhibition and improving the accumulated concentration of the product.
  • the reaction is usually carried out in an aqueous medium or in a mixture of an aqueous medium and an organic solvent.
  • the aqueous medium include water or a buffer solution.
  • the organic solvent a solvent having high solubility of the reaction substrate compound (4) such as methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, 1-butanol, tert-butanol, acetone and dimethyl sulfoxide can be used. ..
  • the organic solvent ethyl acetate, butyl acetate, toluene, chloroform, n-hexane and the like, which are effective in removing reaction by-products and the like, can also be used.
  • the reaction is usually carried out at a reaction temperature of 4 ° C. to 60 ° C., preferably 10 ° C. to 45 ° C., and usually under conditions of pH 3 to 11, preferably pH 5 to 8.
  • the reaction time is usually about 1 hour to 72 hours.
  • the compound (3) produced by the production method of the present invention is prepared after the reaction is completed, the cells and proteins in the reaction solution are separated by a separation or purification method known to those skilled in the art such as centrifugation and membrane treatment, and then 1-. Extraction with organic solvents such as butanol and tert-butanol, distillation, column chromatography using ion exchange resin, silica gel, etc., crystallization at isoelectric point, crystallization with monohydrochloride, dihydrochloride, calcium salt, etc. Can be purified by appropriately combining the above.
  • the obtained compound (3) may contain the diastereomeric compound (5) or compound (6), and the compound (3) is used as a raw material for synthesis of a pharmaceutical product or an intermediate for synthesis.
  • the content of these compounds is preferably low.
  • the content of the compound (5) and / or the compound (6) is preferably 8 mol% or less, more preferably 6 mol% or less, and 4 mol% or less. Is more preferable, and 2 mol% or less is particularly preferable.
  • the compound (3) obtained in the present invention By using the compound (3) obtained in the present invention, it is possible to produce synthetic raw materials and synthetic intermediates for various pharmaceuticals with high efficiency, low cost, and high optical purity. Since the compound (3) obtained in the present invention has a small amount of impurities, it can be used for the production of synthetic raw materials and synthetic intermediates for various pharmaceuticals without purification, so that the production cost is low. Yes, which is preferable for industrial production.
  • the compound (3) can be produced by contacting the culture solution containing the enzyme thus obtained with the compound (1).
  • a culture solution containing the enzyme obtained by culturing the above it is preferable to use a transformant having a DNA encoding a protein.
  • the amount of the microorganism or cell added to the reaction solution, the processed product of the microorganism or cell, and / or the culture solution containing the enzyme obtained by culturing the microorganism or cell is determined when the microorganism or cell is added.
  • the treated product is added to the reaction solution so that the concentration of the microorganism or cells is usually about 0.1 w / v% to 50 w / v%, preferably 1 w / v% to 20 w / v% based on the body weight of the wet bacteria.
  • determine the specific activity of the enzyme and add an amount so as to reach the above cell concentration when added.
  • the compound (1) serving as a reaction substrate is usually used in a substrate concentration of 0.01 w / v% to 90 w / v%, preferably 0.1 w / v% to 30 w / v%.
  • the reaction substrate may be added all at once at the start of the reaction, but it is continuous or intermittent from the viewpoint of reducing the influence of the enzyme substrate inhibition and improving the accumulated concentration of the product.
  • the reaction is usually carried out in an aqueous medium or in a mixture of an aqueous medium and an organic solvent.
  • the aqueous medium include water or a buffer solution.
  • the organic solvent a solvent having high solubility of the reaction substrate compound (1) such as methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, 1-butanol, tert-butanol, acetone and dimethyl sulfoxide can be used. ..
  • the organic solvent ethyl acetate, butyl acetate, toluene, chloroform, n-hexane and the like, which are effective in removing reaction by-products and the like, can also be used.
  • the reaction is usually carried out at a reaction temperature of 4 ° C. to 60 ° C., preferably 10 ° C. to 45 ° C., and usually under conditions of pH 3 to 11, preferably pH 5 to 8.
  • the reaction time is usually about 1 hour to 72 hours.
  • the compound (3) produced by the production method of the present invention is prepared after the reaction is completed, the cells and proteins in the reaction solution are separated by a separation or purification method known to those skilled in the art such as centrifugation and membrane treatment, and then 1-. Extraction with organic solvents such as butanol and tert-butanol, distillation, column chromatography using ion exchange resin, silica gel, etc., crystallization at isoelectric point, crystallization with monohydrochloride, dihydrochloride, calcium salt, etc. Can be purified by appropriately combining the above.
  • the obtained compound (3) may contain the diastereomeric compound (5) or compound (6), and the compound (3) is used as a raw material for synthesis of a pharmaceutical product or an intermediate for synthesis.
  • the content of these compounds is preferably low.
  • the content of the compound (5) and / or the compound (6) is preferably 8 mol% or less, more preferably 6 mol% or less, and 4 mol% or less. Is more preferable, and 2 mol% or less is particularly preferable.
  • the compound (3) obtained in the present invention By using the compound (3) obtained in the present invention, it is possible to produce a compound having high optical purity, a raw material for synthesis of various pharmaceuticals, and an intermediate for synthesis with high efficiency and low cost. Since the compound (3) obtained in the present invention has a small amount of impurities, it can be used for producing raw materials for synthesis and intermediates for synthesis of various pharmaceuticals without purification, so that the production cost is low. Yes, which is preferable for industrial production. In addition, the production methods 1 to 3 of the present invention can be carried out in the presence of a coenzyme.
  • Co-enzymes include reduced nicotinamide adenine nucleotide (NADH), reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH), oxidized nicotinamide adenine nucleotide (NAD + ) or oxidized nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP). + ) Etc. can be used, and NADPH or NADP + can be preferably used.
  • the amount of the coenzyme used is not particularly limited as long as it functions as a coenzyme, but the reaction system usually has a concentration of 0.001 mmol / L to 100 mmol / L, preferably 0.01 mmol / L to 10 mmol / L. It is preferable to add so that When a coenzyme is added, it is preferable to regenerate NAD (P) + produced from NAD (P) H into NAD (P) H in order to improve production efficiency.
  • Examples of the regeneration method include ⁇ 1> a method utilizing the NAD (P) + reducing ability of the host microorganism itself, ⁇ 2> a microorganism having the ability to generate NAD (P) H from NAD (P) +, and a processed product thereof.
  • enzymes that can be used to regenerate NAD (P) H such as glucose dehydrogenase, formate dehydrogenase, alcohol dehydrogenase, amino acid dehydrogenase, and organic acid dehydrogenase (such as malic acid dehydrogenase).
  • A is alanine
  • C is cysteine
  • D is aspartic acid
  • F is phenylalanine
  • H is histidine
  • W is tryptophan
  • Y tyrosine
  • A104W shows a mutation in which the 104th alanine in the amino acid sequence is replaced with tryptophan.
  • each abbreviation represents the following compound.
  • the amount of the target product produced, the purity, and the like were measured by a gas chromatography method under GC analysis condition 1 and GC analysis condition 2 shown below.
  • the elution times of (R) -TFCH and (S) -TFCH were assigned from the peaks obtained as reaction intermediates of Example 1 and Reference Example 8 described later, respectively.
  • the elution times of (1R, 3R) -TFCL and (1S, 3S) -TFCL are the elution times of (1R, 3R) -TFCL of Example 1 and (1S, 3S) -TFCL of Reference Example 8 described later, respectively. is there.
  • TFCL isomer 1 was (1R, 3R) -TFCL (compound (3). )
  • TFCL isomer 2 is (1S, 3S) -TFCL
  • these diastereomers TFCL isomer 3 or TFCL isomer 4
  • TFCL-RPPA ester means (R)-(-)-2-phenylpropionic acid ester of TFCL.
  • Reference Example 1 (Preparation of plasmid for expression) [Preparation of plasmid for expressing carbon-carbon double bond reductase (hereinafter referred to as "YqjM”)]
  • YqjM carbon-carbon double bond reductase
  • PCR was performed according to a conventional method to obtain a DNA fragment in which a restriction enzyme cleavage site of the restriction enzyme EcoRI was added to the 5'end and a restriction enzyme cleavage site of the restriction enzyme XbaI was added to the 3'end.
  • (2) Preparation of plasmid for expression The DNA fragment of yqjm obtained in (1) above was digested with restriction enzymes EcoRI and XbaI into a plasmid pKV32 (described in Japanese Patent No. 4270918) with T4 DNA Ligase (Takarabio). It was introduced downstream of the trc promoter using (manufactured by the same company) to obtain pKV32-YqjM.
  • BsGDH glucose dehydrogenase
  • This DNA fragment was PCRed according to a conventional method to obtain a DNA fragment in which a restriction enzyme cleavage site of the restriction enzyme EcoR1 was added to the 5'end and a restriction enzyme cleavage site of the restriction enzyme XbaI was added to the 3'end.
  • T4 DNA Ligase (Takarabio) was added to the plasmid pKW32 (described in Japanese Patent No. 5613660) obtained by digesting the DNA fragment of bsgdh obtained in (1) above with restriction enzymes EcoRI and XbaI. It was introduced downstream of the trc promoter using (manufactured by) to obtain pKW32-BsGDH.
  • Reference Example 4 (Preparation of plasmid for expression) Using the plasmid pKV32-YqjM obtained in Reference Example 1 as a template, in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, the 26th amino acid C is the 104th amino acid of any of A, D, F, W, and Y. A mutagenesis plasmid of a combination in which A was changed to F, H, W, or Y was prepared. The prepared mutagenesis plasmid is shown in Table 3.
  • NEMA carbon-carbon double bond reductase
  • This DNA fragment was PCRed according to a conventional method to obtain a DNA fragment in which a restriction enzyme cleavage site of the restriction enzyme EcoR1 was added to the 5'end and a restriction enzyme cleavage site of the restriction enzyme XbaI was added to the 3'end.
  • (2) Preparation of plasmid for expression The DNA fragment of isad obtained in (1) above was introduced downstream of the trc promoter of plasmid pKV32 in the same manner as in Reference Example 1 (2) to obtain pKV32-IsADH.
  • Reference Example 7 (Preparation of bacterial cells) [Preparation of Escherichia coli JM109 expressing various enzymes] (1) Preparation of expression strain Using the plasmids obtained in Reference Examples 1 to 6, Escherichia coli JM109 competent cell (manufactured by Takara Bio Co., Ltd.) was transformed according to a conventional method to obtain recombinant Escherichia coli into which the plasmid was introduced. It was.
  • Example 1 Preparation of TFCL (TFCL isomer 1) (Compound (3)) (1) Preparation of TFCL isomer 1 In a 200 mL jar fermenter, 7 mL of 1 mol / L potassium phosphate buffer (pH 7.0), 5.6 mL of 50 mmol / L NADP + , 10.5 mL of 1 mol / L glucose solution, 718 mg of compound (1), Escherichia coli JM109 / pKV32-YqjM (A104W (YqjM variant 13)) obtained in Reference Examples 4 and 7.
  • MTBE Methyl tert-butyl ether
  • the obtained reaction solution was cooled to 0 ° C., 24.7 mg (0.12 mmol) of N, N'-dicyclohexylcarbodiimide was added, and the mixture was reacted at room temperature for 3 hours. After the reaction, 200 ⁇ L of water was added to separate the liquids, and then the organic layer was recovered. The organic layer was filtered, and the obtained filtrate was concentrated under reduced pressure using a rotary evaporator. The concentrated residue was purified on a silica gel column to obtain the target TFCL isomer 1-RPPA ester as an oily substance.
  • Example 8 Preparation of TFCL (TFCL isomer 2) (1) Preparation of TFCL isomer 2
  • the enzyme solution of Escherichia coli JM109 / pKV32-YqjM was obtained from Escherichia coli JM109 / pKV32 obtained in Reference Examples 5 and 7.
  • the reaction was carried out in the same manner as in Example 1 except that the enzyme solution of NEMA and the enzyme solution of Escherichia coli JM109 / pKV32-Lkadh were changed to the enzyme solution of Escherichia coli JM109 / pKV32-IsADH obtained in Reference Examples 6 and 7, respectively. went.
  • MTBE was added to the solution after completion of the reaction, and the mixture was stirred at room temperature to obtain an MTBE layer (extract). MTBE was distilled off from this extract using a rotary evaporator to obtain TFCL isomer 2.
  • the obtained reaction solution was cooled to 0 ° C., 24.7 mg (0.12 mmol) of N, N'-dicyclohexylcarbodiimide was added, and the mixture was reacted at room temperature for 3 hours. After the reaction, 200 ⁇ L of water was added to separate the liquids, and then the organic layer was recovered. The organic layer was filtered, and the obtained filtrate was concentrated under reduced pressure using a rotary evaporator. The concentrated residue was purified on a silica gel column to obtain the target TFCL isomer 2-RPPA ester as an oily substance.
  • the TFCL isomer 1-RPPA ester shifts to a higher magnetic field of 0.4 ppm to 0.5 ppm than the TFCL isomer 2-RPPA ester, and the TFCL isomer 1-RPPA is shifted. It was confirmed that the benzene ring of the ester was close to the 3-position proton (TFCL isomer 1-RPPA ester: 1.8 ppm, TFCL isomer 2-RPPA ester: 2.2 ppm to 2.3 ppm). From the above, the TFCL isomer 1 obtained in (1) of Example 1 is a (1R, 3R) isomer, and the TFCL isomer 2 obtained in (1) of Reference Example 8 is a (1S, 3S) isomer. I decided.
  • Examples 2 to 11 and Comparative Examples 1 to 8 Measurement of initial activity of YqjM mutant The activity of measuring initial activity of YqjM mutant was confirmed by measuring the amount of decrease in NADPH when compound (1) was added at a wavelength of 340 nm. did. 10 ⁇ L of enzyme solution (Example 2: using the enzyme solution obtained in Reference Examples 1 and 7, Examples 3 to 11 and Comparative Examples 1 to 8: using the enzyme solution obtained in Reference Examples 4 and 7), 25 ⁇ L of 1 mol / L potassium phosphate buffer (pH 7), 10 ⁇ L of 8 mmol / L NADPH, 200 ⁇ L of water, and 5 ⁇ L of 0.1 mol / L compound (1) in DMSO were mixed.
  • the mixture was placed in a 96-well plate (manufactured by Corning Inc.), and the change in absorbance at 340 nm was measured for 2 minutes using a microplate reader (manufactured by Molecular Bio Inc.) heated to 30 ° C.
  • the average value (mOD / min) of the absorbance change per unit time was calculated, and the activity value per unit time / unit protein was calculated from the slope of the absorbance change by the following formula.
  • the molar extinction coefficient of NADPH was calculated as 6.3 mL / ⁇ mol ⁇ cm.
  • the 26th C is replaced with A (Example 7: YqjM mutant 10) or the 104th A is replaced with F, Y, W or H (Examples 8 to 8).
  • 11: YqjM mutants 11-14) were found to have significantly improved relative activity against the wild type.
  • those in which the 26th C is replaced with A and the 104th A is replaced with F, Y, W or H (Examples 3 to 6: YqjM mutants 6 to 9) also have relative activity against the wild type. It turned out to be a significant improvement.
  • Examples 12-21 Production of (R) -TFCH (Compound (2)) Enzyme solution of pKV32-YqjM-introduced recombinant Escherichia coli prepared by the methods of Reference Examples 1 and 7 in a 2 mL microtube, or Reference Example. Add 100 ⁇ L of the enzyme solution of pKV32-YqjM-introduced recombinant Escherichia coli into which the mutation was introduced by the methods 4 and 7, 400 ⁇ L of 50 g / L KRED mix N (manufactured by Codexis), and 4.1 mg of compound (1), and add 30 ° C. Was stirred for 1 hour and reacted.
  • Example 22 Production of (1R, 3R) -TFCL (Compound (3)) In a 200 mL jar fermenter, 7 mL of 1 mol / L potassium phosphate buffer (pH 7.0), 0.7 mL of 50 mmol / L NADP +. , 10.5 mL of 4 mol / L glucose solution, 33 mL of pure water, 2873 mg of compound (1), and wet bacteria of Escherichia coli JM109 / pKV32-YqjM (A104W (YqjM mutant 13)) obtained in Reference Examples 4 and 7.
  • MTBE methyl tert-butyl ether
  • the pure content of (1R, 3R) -TFCL was 2348 mg, and the yield was 81.8%.
  • the optical purity is 99.8% e. e. Met.
  • the abundance ratio of diastereomers was 1.6%.
  • the optical purity and the abundance ratio of diastereomers were calculated by the following formulas.
  • Example 23 Production of (1R, 3R) -TFCL (Compound (3)) Production of (1) (R) -TFCH (Compound (2)) 50 ⁇ L of 1 mol / L potassium phosphate buffer in a 2 mL microtube. Liquid (pH 7.0), 20 ⁇ L of 50 mmol / L NAD + , 20 ⁇ L of 50 mmol / L NADP + , 75 ⁇ L of 1 mol / L glucose solution, 8.2 mg of compound (1), E. coli obtained in Reference Examples 1 and 7.
  • the enzyme solution of JM109 / pKV32-YqjM and the enzyme solution of Escherichia coli JM109 / pKW32-BsGDH (E96A, Q252L) obtained in Reference Examples 3 and 7 were mixed, and pure water was added to prepare 500 ⁇ L of reaction solution A.
  • the reaction solution B was prepared for analysis in the same manner as the reaction solution A, and the reaction solutions A and B were reacted at a reaction temperature of 30 ° C. and a sufficient stirring speed for 16 hours. After the reaction, 1 mL of heptane was added to the reaction solution B, and the mixture was stirred at room temperature for 1 minute.
  • the upper layer obtained after standing was analyzed under GC analysis condition 2.
  • the conversion rate from compound (1) to compound (2) was 43.1%, and the optical purity of the obtained compound (2) was 67.8% ee.
  • the conversion rate and optical purity were calculated by the following formulas.
  • Example 24 Preparation of (1R) -3-trifluoromethyl-2-cyclohexene-1-ol (Compound (4)) 50 ⁇ L of 1 mol / L potassium phosphate buffer (pH 7.0 ) in a 2 mL microtube. ), 20 ⁇ L of 50 mmol / L NAD + , 20 ⁇ L of 50 mmol / L NADP + , 75 ⁇ L of 1 mol / L glucose solution, 8.2 mg compound (1), Escherichia coli JM109 / pKV32-Lkadh obtained in Reference Examples 2 and 7.
  • the enzyme solution and the enzyme solution of Escherichia coli JM109 / pKW32-BsGDH (E96A, Q252L) obtained in Reference Examples 3 and 7 were mixed, and pure water was added to prepare a reaction solution of 500 ⁇ L. This reaction solution was reacted for 23 hours at a reaction temperature of 30 ° C. and a sufficient stirring speed. 1 mL of heptane was added to the obtained reaction solution, and the mixture was stirred at room temperature for 1 minute. The upper layer obtained after standing was analyzed by GC-MS to confirm the formation of (1R) -3-trifluoromethyl-2-cyclohexene-1-ol (compound (4)). The product was estimated to be the (1R) form from the results of Examples 1, 22 and 23 (2). The conversion rate from compound (1) to compound (4) was 43.6%. The conversion rate was calculated by the following formula.
  • (1R) -3-trifluoromethyl-2-cyclohexene-1-ol or (3R) -3- (trifluoromethyl) useful as raw materials for synthesis of various pharmaceutical products and intermediates for synthesis. It is possible to provide a novel method for industrially producing cyclohexane-1-one with high optical purity, high selectivity, high efficiency and low cost. Further, high efficiency is achieved by using (1R) -3-trifluoromethyl-2-cyclohexene-1-ol or (3R) -3- (trifluoromethyl) cyclohexane-1-one thus obtained. It is possible to produce (1R, 3R) -3- (trifluoromethyl) cyclohexane-1-ol having high optical purity at low cost.

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Abstract

本発明は、（１Ｒ，３Ｒ）－３－（トリフルオロメチル）シクロヘキサン－１－オール及びその中間体を高光学純度、高選択性、高効率、かつ低コストで工業的に製造する新規な方法を提供することを解決すべき課題とする。　本発明は、式（１）で表される化合物に、炭素－炭素二重結合還元酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液、並びにカルボニル還元酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を接触させて、式（３）で表される化合物を得ることを特徴とする、式（３）で表される化合物の製造方法。

Description

（１Ｒ，３Ｒ）－３－（トリフルオロメチル）シクロヘキサン－１－オール及びその中間体の製造法
　本発明は、医薬品の合成用原料、合成用中間体として有用なシクロヘキサン誘導体である（１Ｒ，３Ｒ）－３－（トリフルオロメチル）シクロヘキサン－１－オール及びその中間体の製造法に関する。
　（１Ｒ，３Ｒ）－３－（トリフルオロメチル）シクロヘキサン－１－オール及びその中間体と誘導体は、様々な医薬品の合成用原料、合成用中間体として有用である。
　（１Ｒ，３Ｒ）－３－（トリフルオロメチル）シクロヘキサン－１－オールの製造方法としては、ラセミ体の３－トリフルオロメチルシクロヘキサノンからの生物学的な方法により製造する方法（非特許文献４）が知られている。
　しかしながら、非特許文献４で使用されている微生物では反応が十分進行しておらず収率は３４％程度と低く、また得られる（１Ｒ，３Ｒ）－３－（トリフルオロメチル）シクロヘキサン－１－オールの光学純度も４種類の異性体に対して３９％程度と低く光学的選択性が低い（Ｒｕｎ１４）。そのため、目的とする（１Ｒ，３Ｒ）－３－（トリフルオロメチル）シクロヘキサン－１－オール以外に、副生物であるエナンチオマー（１Ｓ，３Ｓ）－３－（トリフルオロメチル）シクロヘキサン－１－オールや２種類のジアステレオマー（１Ｒ，３Ｓ）－３－（トリフルオロメチル）シクロヘキサン－１－オール及び（１Ｓ，３Ｒ）－３－（トリフルオロメチル）シクロヘキサン－１－オールの生成量が多いため、目的物を高効率で製造することが難しく、また、工業的に製造する場合には大型の分離装置や精製装置が必要となりコストが高くなり、医薬品の中間体の工業的な製造方法としては不向きであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
　また、特許文献１、２及び非特許文献３には、カルボニル基を水酸基に変換する酵素が記載されているが、本発明化合物に適用した例は記載されていない。
　特許文献３及び非特許文献１には、炭素－炭素二重結合還元酵素が記載されているが、本発明化合物に適用した例は記載されていない。
　非特許文献２には、３－トリフルオロメチル－２－シクロヘキセン－１－オン（以下、化合物（１）と称する場合がある。）の３位トリフルオロメチル基をメチル基に置き換えた類似化合物とカルボニル基を特定の炭素－炭素二重結合還元酵素を接触させ、（３Ｒ）－３－（トリフルオロメチル）シクロヘキサン－１－オン（以下、化合物（２）と称する場合がある。）の類似化合物を得る方法が記載されている。しかし、本発明化合物に特定の酵素を適用した例は記載されていない。さらに、後述する比較例１、２及び６から明らかなように、非特許文献２に記載の酵素で、かつ化合物（１）の類似化合物に対して反応性・光学的選択性が優れていた酵素（ＹｑｊＭ変異体１、２及び１５）を化合物（１）と接触させても反応がほとんど進行しなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
　したがって、医薬品の中間体として有用な（１Ｒ，３Ｒ）－３－（トリフルオロメチル）シクロヘキサン－１－オール（以下、化合物（３）と称する場合がある。）を、高純度、高効率で、かつ低コストで、工業的に製造する方法が望まれている。
ＷＯ２００８／０４２８７６ ＷＯ２００４／０２７０５５ ＷＯ２０１１／０５２７１８
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２７８，Ｎｏ．２２，Ｉｓｓｕｅ　ｏｆ　Ｍａｙ　３０，ｐｐ１９８９１－１９８９７ Ａｄｖ．Ｓｙｎｔｈ．Ｃａｔａｌ．２００９，３５１，ｐｐ３２８７－３３０５ Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９２，５７（５），ｐｐ１５３２－１５３６ Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（１９９８），５４（１２），ｐｐ８０９－２８１８
　本発明は、（１Ｒ，３Ｒ）－３－（トリフルオロメチル）シクロヘキサン－１－オール及びその中間体を高光学純度、高選択性、高効率、かつ低コストで工業的に製造する新規な方法を提供することを解決すべき課題とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来の炭素－炭素二重結合還元酵素（以下、Ｃ＝Ｃ還元酵素と称する場合がある。）が、高い選択性で３－トリフルオロメチル－２－シクロヘキセン－１－オンを還元し、中間体である（３Ｒ）－３－（トリフルオロメチル）シクロヘキサン－１－オンを高効率で得ることが可能であることを見出した。
　また、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｋｅｆｉｒ、Ｐｉｃｈｉａ　ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、及びＤｅｖｏｓｉａ　ｒｉｂｏｆｌａｖｉｎａ由来のカルボニル還元酵素（以下、Ｃ＝Ｏ還元酵素と称する場合がある。）が、高い選択性で３－トリフルオロメチル－２－シクロヘキセン－１－オンを還元し、中間体である（１Ｒ）－３－トリフルオロメチル－２－シクロヘキセン－１－オール（以下、化合物（４）と称する場合がある）を高効率で得ることが可能であることを見出した。
　さらに、該酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液（以下、これらをまとめて「酵素等」という場合がある）を、３－トリフルオロメチル－２－シクロヘキセン－１－オン、（３Ｒ）－３－（トリフルオロメチル）シクロヘキサン－１－オン又は（１Ｒ）－３－トリフルオロメチル－２－シクロヘキセン－１－オールに接触させることにより、高光学純度、かつ高濃度の（１Ｒ，３Ｒ）－３－（トリフルオロメチル）シクロヘキサン－１－オールを低コストで得ることができることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて成し遂げられたものである。
　すなわち、本発明の要旨は以下の通りである。
［１］　式（１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
で表される化合物（３－トリフルオロメチル－２－シクロヘキセン－１－オン（以下、化合物（１）と称する場合がある））に、炭素－炭素二重結合還元酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液、並びにカルボニル還元酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を接触させて、式（３）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
で表される化合物（（１Ｒ，３Ｒ）－３－（トリフルオロメチル）シクロヘキサン－１－オール（以下、化合物（３）と称する場合がある））を得ることを特徴とする、式（３）で表される化合物の製造方法。
［２］　前記炭素－炭素二重結合還元酵素が、以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）に示すタンパク質を含む、上記［１］に記載の製造方法。
　（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質
　（Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１～複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ式（Ｉ）及び／又は式（ＩＩ）に示す反応を触媒する活性を有するタンパク質
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
　（Ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ以下の（ｉ）～（ｉｉ）の群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換が導入されており、かつ式（Ｉ）及び／又は式（ＩＩ）に示す反応を触媒する活性を有するタンパク質
　（ｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列における２６番目のシステインが、アスパラギン酸、フェニルアラニン、トリプトファン又はチロシン以外のアミノ酸に置換
　（ｉｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列における１０４番目のアラニンが、アラニン以外のアミノ酸に置換
［３］　前記（ｉ）のアミノ酸置換が以下の（ｉ’）である、上記［２］に記載の製造方法。
　（ｉ’）配列番号１で表されるアミノ酸配列における２６番目のシステインが、アラニンに置換
［４］　前記（ｉｉ）のアミノ酸置換が以下の（ｉｉ’）である、上記［２］又は［３］に記載の製造方法。
　（ｉｉ’）配列番号１で表されるアミノ酸配列における１０４番目のアラニンが、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン又はチロシンに置換
［５］　前記カルボニル還元酵素が、以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）に示すタンパク質を含む、上記［１］又は［２］に記載の製造方法。
　（Ａ）配列番号２、３又は４で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質
　（Ｂ）配列番号２、３又は４で表されるアミノ酸配列において、１～複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ式（ＩＩＩ）及び／又は式（ＩＶ）に示す反応を触媒する活性を有するタンパク質
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
　（Ｃ）配列番号２、３又は４で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ式（ＩＩＩ）及び／又は式（ＩＶ）に示す反応を触媒する活性を有するタンパク質
［６］　式（１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
で表される化合物に、炭素－炭素二重結合還元酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を接触させて、式（２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
で表される化合物（（３Ｒ）－３－（トリフルオロメチル）シクロヘキサン－１－オン（以下、化合物（２）と称する場合がある））を得た後に、さらに
式（２）で表される化合物に、カルボニル還元酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を接触させて、式（３）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
で表される化合物を得ることを特徴とする、上記［１］～［５］のいずれかに記載の製造方法。
［７］　式（１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
で表される化合物に、カルボニル還元酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を接触させて、式（４）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
で表される化合物（（１Ｒ）－３－トリフルオロメチル－２－シクロヘキセン－１－オール（以下、化合物（４）と称する場合がある））を得た後に、さらに
式（４）で表される化合物に、炭素－炭素二重結合還元酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を接触させて、式（３）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
で表される化合物を得ることを特徴とする、上記［１］～［５］のいずれかに記載の製造方法。
［８］　化合物（３）に含まれる、式（５）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
で表される化合物（以下、化合物（５）と称する場合がある）及び／又は式（６）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
で表される化合物（以下、化合物（６）と称する場合がある）の含有量が８ｍｏｌ％以下であることを特徴とする、上記［１］～［７］のいずれかに記載の製造方法。
［９］　式（１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
で表される化合物に、炭素－炭素二重結合還元酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を接触させて、式（２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
で表される化合物を得ることを特徴とする、式（２）で表される化合物の製造方法。
［１０］　前記炭素－炭素二重結合還元酵素が、以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）に示すタンパク質を含む、上記［９］に記載の製造方法。
　（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質
　（Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１～複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ式（Ｉ）に示す反応を触媒する活性を有するタンパク質
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
　（Ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ以下の（ｉ）～（ｉｉ）の群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換が導入されており、かつ式（Ｉ）及び／又は式（ＩＩ）に示す反応を触媒する活性を有するタンパク質
　（ｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列における２６番目のシステインが、アスパラギン酸、フェニルアラニン、トリプトファン又はチロシン以外のアミノ酸に置換
　（ｉｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列における１０４番目のアラニンが、アラニン以外のアミノ酸に置換
［１１］　式（１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
で表される化合物に、カルボニル還元酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を接触させて、式（４）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
で表される化合物を得ることを特徴とする、式（４）で表される化合物の製造方法。
［１２］　前記カルボニル還元酵素が、以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）に示すタンパク質を含む、上記［１１］に記載の製造方法。
　（Ａ）配列番号２、３又は４で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質
　（Ｂ）配列番号２、３又は４で表されるアミノ酸配列において、１～複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ（ＩＶ）に示す反応を触媒する活性を有するタンパク質
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
　（Ｃ）配列番号２、３又は４で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ式（ＩＶ）に示す反応を触媒する活性を有するタンパク質
　本発明によれば、様々な医薬品の合成用原料、合成用中間体として有用な（１Ｒ）－３－トリフルオロメチル－２－シクロヘキセン－１－オール又は（３Ｒ）－３－（トリフルオロメチル）シクロヘキサン－１－オンを高光学純度、高選択性で、高効率かつ低コストで工業的に製造する新規な方法を提供することができる。さらに、このようにして得られた（１Ｒ）－３－トリフルオロメチル－２－シクロヘキセン－１－オール又は（３Ｒ）－３－（トリフルオロメチル）シクロヘキサン－１－オンを用いることにより、高効率、かつ低コストで、光学純度の高い（１Ｒ，３Ｒ）－３－（トリフルオロメチル）シクロヘキサン－１－オールを製造することができる。
　本発明の方法により製造される（１Ｒ）－３－トリフルオロメチル－２－シクロヘキセン－１－オール又は（３Ｒ）－３－（トリフルオロメチル）シクロヘキサン－１－オンや、これを用いて製造される化合物（１Ｒ，３Ｒ）－３－（トリフルオロメチル）シクロヘキサン－１－オールは、様々な医薬品の合成用原料、合成用中間体として利用することができる。
　以下に、本発明を詳細に説明する。
＜本発明の製造方法＞
　本明細書において、製造方法１～３はそれぞれ以下の製造方法を意味する。
製造方法１：工程１及び工程２を有する化合物（３）の製造方法
製造方法２：工程３及び工程４を有する化合物（３）の製造方法
製造方法３：工程５を有する化合物（３）の製造方法
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000039
　本明細書において、工程１～５はそれぞれ以下の工程を意味する。
工程１：化合物（１）にＣ＝Ｃ還元酵素等を接触させて化合物（２）を得る工程
工程２：化合物（２）にＣ＝Ｏ還元酵素等を接触させて化合物（３）を得る工程
工程３：化合物（１）にＣ＝Ｏ還元酵素等を接触させて化合物（４）を得る工程
工程４：化合物（４）にＣ＝Ｃ還元酵素等を接触させて化合物（３）を得る工程
工程５：化合物（１）にＣ＝Ｃ還元酵素等及びＣ＝Ｏ還元酵素等を接触させて化合物（３）を得る工程
　以下、本発明を詳細に説明する。
１．本発明の製造方法に用いられる酵素
［Ｃ＝Ｃ還元酵素］
　本発明の製造方法は、式（１）で表される化合物に、炭素－炭素二重結合還元酵素（Ｃ＝Ｃ還元酵素）、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液、並びにカルボニル還元酵素（Ｃ＝Ｏ還元酵素）、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を接触させて、式（３）で表される化合物を得ることを特徴とする。本明細書において、該酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を「酵素等」と称する場合がある。以下、Ｃ＝Ｃ還元酵素に関して説明する。
　本発明の製造方法において、Ｃ＝Ｃ還元酵素は特に限定されない。Ｃ＝Ｃ還元酵素は、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓから公知の方法により精製、単離して得ることもできる。ここで、精製法としては、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、再結晶、これらの組み合わせなどが挙げられる。
　また、Ｃ＝Ｃ還元酵素は、それをコードする核酸を含有する形質転換体を培養し、得られる培養物から該Ｃ＝Ｃ還元酵素を分離精製することによって製造することもできる。Ｃ＝Ｃ還元酵素をコードする核酸はDNAであってもRNAであってもよく、あるいはDNA/RNAキメラであってもよい。好ましくはDNAが挙げられる。また、該核酸は二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖DNA、二本鎖RNA又はDNA：RNAのハイブリッドでもよい。一本鎖の場合は、センス鎖（すなわち、コード鎖）であっても、アンチセンス鎖（すなわち、非コード鎖）であってもよい。
　Ｃ＝Ｃ還元酵素をコードするDNAとしては、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のｙｑｊｍ遺伝子の塩基配列（配列番号５）（ＧｅｎｅＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｐ５４５５０）が挙げられる。
　また、Ｃ＝Ｃ還元酵素をコードするDNAとしては、合成DNAなどが挙げられる。例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のＣ＝Ｃ還元酵素をコードするDNAの場合、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来の全RNA若しくはmRNA画分を鋳型として用い、Reverse Transcriptase-PCRによって直接増幅した全長Ｃ＝Ｃ還元酵素 cDNAを、公知のキット、例えば、MutanTM-super Express Km（TAKARA BIO INC.）、MutanTM-K（TAKARA BIO INC.）等を用いて、ODA-LA PCR法、Gapped duplex法、Kunkel法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って変換することによって取得することができる。あるいは、上記した全RNAもしくはmRNAの断片を適当なベクター中に挿入して調製されるcDNAライブラリーから、コロニーもしくはプラークハイブリダイゼーション法又はPCR法などにより、クローニングしたcDNAを、上記の方法に従って変換することによっても取得することができる。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。
　また、Ｃ＝Ｃ還元酵素をコードする核酸（DNA）は、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来の染色体DNAを鋳型として用い、適切なプライマーを用いてPCRを行うことでクローニングできる。例えば、上記のようにして得たＣ＝Ｃ還元酵素をコードするDNAを公知の発現ベクターに発現可能な配置で挿入することにより、Ｃ＝Ｃ還元酵素遺伝子発現ベクターが提供される。そして、該発現ベクターで宿主細胞を形質転換することにより、Ｃ＝Ｃ還元酵素をコードするDNAが導入された形質転換体を得ることができる。形質転換体は、宿主の染色体DNAにＣ＝Ｃ還元酵素をコードするDNAを相同組み換え等の手法によって発現可能に組み込むことによっても得ることができる。
　本明細書において「発現ベクター」とは、所望の機能を有するタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドを組み込み宿主生物へ導入することにより、所望の機能を有するタンパク質を前記宿主生物において複製及び発現させるために用いられる遺伝因子である。例えば、プラスミド、ウイルス、ファージ、コスミド等が挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、発現ベクターはプラスミドである。
　本明細書において、「形質転換体」とは、前記発現ベクター等を用いて目的の遺伝子が導入され、所望の機能を有するタンパク質に関連する所望の形質を表すことができるようになった微生物又は細胞を意味する。
　形質転換体の作製方法としては、具体的には、宿主細胞において安定に存在するプラスミドベクターやファージベクターやウイルスベクター中に、Ｃ＝Ｃ還元酵素をコードするDNAを導入し、構築された発現ベクターを該宿主細胞中に導入する方法や直接宿主ゲノム中に該DNAを導入し、その遺伝情報を転写・翻訳させる方法が例示される。この場合、宿主において適当なプロモーターをDNAの5'－側上流に連結させることが好ましく、さらに、ターミネーターを3'－側下流に連結させることがより好ましい。このようなプロモーター及びターミネーターとしては、宿主として利用する細胞中において機能することが知られているプロモーター及びターミネーターであれば特に限定されず、例えば、「微生物学基礎講座8遺伝子工学・共立出版」に詳述されているベクター、プロモーター及びターミネーターを使用することができる。
　Ｃ＝Ｃ還元酵素を発現させるための形質転換の対象となる宿主微生物としては、宿主自体が化合物（１）、化合物（２）、化合物（４）及び化合物（３）に悪影響を与えない限り特に限定されることはなく、例えば、以下に示すような微生物を挙げることができる。
　エシェリヒア（Escherichia）属、バチルス（Bacillus）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、セラチア（Serratia）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、コリネバクテリウム（Corynebacteriuｍ）属、ストレプトコッカス（Streptococcus）属、ラクトバチルス（Lactobacillus）属等に属する宿主ベクター系の確立されている細菌。
　ロドコッカス（Rhodococcus）属、ストレプトマイセス（Streptomyces）属等に属する宿主ベクター系の確立されている放線菌。
　サッカロマイセス（Saccharomyces）属、クルイベロマイセス（Kluyveromyces）属、シゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）属、チゴサッカロマイセス（Zygosaccharomyces）属、ヤロウイア（Yarrowia）属、トリコスポロン（Trichosporon）属、ロドスポリジウム（Rhodosporidium）属、ハンゼヌラ（Hansenula）属、ピキア（Pichia）属、キャンディダ（Candida）属等に属する宿主ベクター系の確立されている酵母。
　ノイロスポラ（Neurospora）属、アスペルギルス（Aspergillus）属、セファロスポリウム（Cephalosporium）属、トリコデルマ（Trichoderma）属等に属する宿主ベクター系の確立されているカビ。
　形質転換体作製のための手順、宿主に適合した組換えベクターの構築及び宿主の培養方法は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができる（例えば、Molecular Cloningに記載の方法）。
　以下、具体的に、好ましい宿主微生物、各微生物における好ましい形質転換の手法、ベクター、プロモーター、ターミネーター等の例を挙げるが、本発明はこれらの例に限定されない。
　エシェリヒア属、特にエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）においては、プラスミドベクターとしては、例えば、pKV32、pKW32、pBR、pUC系プラスミド等が挙げられ、lac（β－ガラクトシダーゼ）、trp（トリプトファンオペロン）、tac、trc（lac、trpの融合）、λファージPL、PR等に由来するプロモーター等が挙げられる。また、ターミネーターとしては、trpA由来、ファージ由来、rrnBリボソーマルRNA由来のターミネーター等が挙げられる。
　バチルス属においては、ベクターとしては、pUB110系プラスミド、pC194系プラスミド等を挙げることができ、また、染色体にインテグレートすることもできる。プロモーター及びターミネーターとしては、アルカリプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、α－アミラーゼ等の酵素遺伝子のプロモーターやターミネーター等が利用できる。
　シュードモナス属においては、ベクターとしては、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、シュードモナス・セパシア（Pseudomonas cepacia）等で確立されている一般的な宿主ベクター系や、トルエン化合物の分解に関与するプラスミド、TOLプラスミドを基本にした広宿主域ベクター（RSF1010等に由来する自律的複製に必要な遺伝子を含む）pKT240（Gene,26,273-82(1983)）等を挙げることができる。
　ブレビバクテリウム属、特にブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）においては、ベクターとしては、pAJ43（Gene 39,281(1985)）等のプラスミドベクターを挙げることができる。プロモーター及びターミネーターとしては、大腸菌で使用されている各種プロモーター及びターミネーターが利用可能である。
　コリネバクテリウム属、特にコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）においては、ベクターとしては、pCS11（特開昭５７－１８３７９９号公報）、pCB101（Mol.Gen.Genet.196,175(1984)）等のプラスミドベクターが挙げられる。
　サッカロマイセス（Saccharomyces）属、特にサッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）においては、ベクターとしては、YRp系、YEp系、YCp系、YIp系プラスミド等が挙げられる。また、アルコール脱水素酵素、グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素、酸性フォスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、ホスホグリセレートキナーゼ、エノラーゼといった各種酵素遺伝子のプロモーター、ターミネーターが利用可能である。
　シゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）属においては、ベクターとしては、Mol.Cell.Biol.6,80 (1986)に記載のシゾサッカロマイセス・ポンベ由来のプラスミドベクター等を挙げることができる。特に、pAUR224は、タカラバイオ株式会社から市販されており容易に利用できる。
　アスペルギルス（Aspergillus）属においては、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・オリジー（Aspergillus oryzae）等がカビの中で最もよく研究されており、プラスミドや染色体へのインテグレーションが利用可能であり、菌体外プロテアーゼやアミラーゼ由来のプロモーターが利用可能である（Trendsin Biotechnology 7,283-287(1989)）。
　また、上記以外でも、各種微生物に応じた宿主ベクター系が確立されており、それらを適宜使用することができる。
　また、微生物以外でも、植物細胞、動物細胞において様々な宿主・ベクター系が確立されており、特に昆虫（例えば、蚕）等の動物細胞中（Nature 315,592-594(1985)）や、菜種、トウモロコシ、ジャガイモ等の植物細胞中に大量に異種タンパク質を発現させる系、及び大腸菌無細胞抽出液や小麦胚芽等の無細胞タンパク質合成系を用いた系が確立されており、好適に利用できる。
　本発明の製造方法における「該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞」とは、「Ｃ＝Ｃ還元酵素（炭素－炭素二重結合を立体選択的に還元しうる活性）」を生産する能力を有する微生物若しくは細胞であれば特に制限はなく、内在的に当該能力を有する微生物若しくは細胞であってもよいし、育種により当該能力を付与した微生物若しくは細胞であってもよい。育種により当該能力を付与する手段としては、遺伝子組換え処理（形質転換）や変異処理など、公知の方法を採用することができる。これらのうち、Ｃ＝Ｃ還元酵素をコードするDNAで形質転換された微生物若しくは細胞が好ましい。形質転換の方法としては、例えば、Ｃ＝Ｃ還元酵素遺伝子を導入する、有機化合物の生合成経路におけるＣ＝Ｃ還元酵素遺伝子の発現を強化する、副生物生合成経路におけるＣ＝Ｃ還元酵素遺伝子の発現を低減するなどの方法を用いることができる。具体的な形質転換体の作製方法は、上述のＣ＝Ｃ還元酵素において説明した内容を援用できる。
　本発明の製造方法における「該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞」としては、生きている該微生物若しくは細胞に限られず、生体としては死んでいるが酵素活性を有するものも含まれる。また、凍結された該微生物若しくは細胞も含まれる。
　本発明の製造方法における「該微生物若しくは細胞の処理物」とは、該微生物若しくは細胞を培養し、該微生物若しくは細胞を、１）有機溶媒（アセトン、ジメチルスルホキシド（DMSO）、トルエン等）や界面活性剤等により破壊したもの、２）凍結乾燥したもの、３）担体などに固定化したもの、４）物理的又は酵素的に破壊したもの、又は５）前述１）～４）の処理物から酵素画分を粗生成物又は精製物として取り出したもの、さらには、これらを担体（ポリアクリルアミドゲル、カラギーナンゲル等）に固定化したものであり、かつ、所望の機能を有するタンパク質を含有するもの等を意味する。当該処理物は、例えば、培養した該微生物又は細胞を破壊して得られたタンパク質であってもよい。当該タンパク質は、例えば、市販のキット（例、Bugbuster Master Mix（Merck社製）等を用いて得られる。以下、当該処理物のことを「酵素液」と称する場合がある。
　本発明の製造方法における「該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液」とは、１）該微生物若しくは細胞の培養液（例えば、該細胞と液体培地の懸濁液や、該細胞が分泌発現型細胞である場合は該細胞を遠心分離等で除去した上清やその濃縮物）、２）該微生物若しくは細胞の培養液を有機溶媒等により処理をしたもの、３）該微生物若しくは細胞の細胞膜を物理的又は酵素的に破壊したもの、さらには２）もしくは３）を粗精製、又は精製した酵素でもよい。
　Ｃ＝Ｃ還元酵素としては、また、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質（（Ａ）に示すタンパク質）を含むもの、又は該アミノ酸配列と高い同一性を有するアミノ酸配列（以下、「アミノ酸配列のホモログ」という場合がある）を有し、化合物（１）及び／又は化合物（４）を還元する活性を有するタンパク質（（Ｂ）又は（Ｃ）に示すタンパク質）を含むもの（以下、「Ｃ＝Ｃ還元酵素のホモログ」という場合がある）等が挙げられる。具体的には、Ｃ＝Ｃ還元酵素としては、以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）に示すタンパク質を含むものが挙げられる。
　（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質；
　（Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１～複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ式（Ｉ）及び／又は式（ＩＩ）に示す反応を触媒する活性を有するタンパク質；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000040
　（Ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ以下の（ｉ）～（ｉｉ）の群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換が導入されており、かつ式（Ｉ）及び／又は式（ＩＩ）に示す反応を触媒する活性を有するタンパク質：
　（ｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列における２６番目のシステインが、アスパラギン酸、フェニルアラニン、トリプトファン又はチロシン以外のアミノ酸に置換。
　（ｉｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列における１０４番目のアラニンが、アラニン以外のアミノ酸に置換。
　（Ａ）に示すタンパク質において、配列番号１で表されるアミノ酸配列は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来の炭素－炭素二重結合還元酵素ＹｑｊＭのアミノ酸配列である。
　本発明において、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するＣ＝Ｃ還元酵素のホモログは、前記（Ｂ）又は（Ｃ）に示すタンパク質を含むものである。
　（Ｂ）に示すタンパク質において、「１～複数個のアミノ酸」とは、通常１～１００個、好ましくは１個～５０個、より好ましくは１個～２０個、さらに好ましくは１個～１０個、さらにより好ましくは１個～５個、いっそう好ましくは１個～３個、特に好ましくは１個又は２個のアミノ酸である。置換の場合、アミノ酸が保守的に置換されたものが好ましい。
　（Ｃ）に示すタンパク質において、前記（ｉ）のアミノ酸置換は、好ましくは以下の（ｉ’）のアミノ酸置換であり、前記（ｉｉ）のアミノ酸置換は、好ましくは以下の（ｉｉ’）のアミノ酸置換、より好ましくは（ｉｉ’’）のアミノ酸置換、特に好ましくは（ｉｉ’’’）のアミノ酸置換である。
　（ｉ’）配列番号１で表されるアミノ酸配列における２６番目のシステインが、アラニンに置換。
　（ｉｉ’）配列番号１で表されるアミノ酸配列における１０４番目のアラニンが、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン又はチロシンに置換。
（ｉｉ’’）配列番号１で表されるアミノ酸配列における１０４番目のアラニンが、ヒスチジン、トリプトファン又はチロシンに置換。
（ｉｉ’’’）配列番号１で表されるアミノ酸配列における１０４番目のアラニンが、トリプトファンに置換。
　また、（Ｃ）に示すタンパク質において、アミノ酸置換としては、例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列における２６番目のシステインがアラニンに置換、かつ１０４番目のアラニンがフェニルアラニン、チロシン、トリプトファン又はヒスチジンに置換（Ｃ２６ＡかつＡ１０４Ｆ、Ｃ２６ＡかつＡ１０４Ｙ、Ｃ２６ＡかつＡ１０４Ｗ、又はＣ２６ＡかつＡ１０４Ｈ）が挙げられる。また、配列番号１で表されるアミノ酸配列における２６番目のシステインがアラニンに置換（Ｃ２６Ａ）が挙げられる。さらに、配列番号１で表されるアミノ酸配列における１０４番目のアラニンがフェニルアラニン、チロシン、トリプトファン又はヒスチジンに置換（Ａ１０４Ｆ、Ａ１０４Ｙ、Ａ１０４Ｗ、又はＡ１０４Ｈ）が挙げられる。これらのアミノ酸置換の中でも、Ｃ２６ＡかつＡ１０４Ｆ、Ｃ２６ＡかつＡ１０４Ｙ、Ｃ２６ＡかつＡ１０４Ｗ、Ｃ２６ＡかつＡ１０４Ｈ、Ｃ２６Ａ、Ａ１０４Ｆ、Ａ１０４Ｙ、Ａ１０４Ｗ、又はＡ１０４Ｈが好ましく、Ｃ２６ＡかつＡ１０４Ｙ、Ｃ２６ＡかつＡ１０４Ｗ、Ｃ２６ＡかつＡ１０４Ｈ、Ａ１０４Ｙ、Ａ１０４Ｗ、又はＡ１０４Ｈがより好ましく、Ｃ２６ＡかつＡ１０４Ｗ、又はＡ１０４Ｗが特に好ましい。
（Ｃ）に示すタンパク質において、上述のアミノ酸置換を行うことにより野生型に対する相対活性、変換率及び光学純度を向上させることができる。
　（Ｃ）に示すタンパク質において、配列番号１で表されるアミノ酸配列との同一性は、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、なお一層好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上である。
　本明細書におけるアミノ酸配列の同一性（適宜、相同性又は類似性と言い換えてもよい）は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)を用い、例えば、以下の条件（期待値＝10；ギャップを許す；マトリクス＝BLOSUM62；フィルタリング＝OFF）にて計算することができる。アミノ酸配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、例えば、Karlinら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877 (1993)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはNBLAST及びXBLASTプログラム(version 2.0)に組み込まれている(Altschulら, Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402 (1997))]、Needlemanら,J. Mol. Biol., 48: 444-453 (1970)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはGCGソフトウェアパッケージ中のGAPプログラムに組み込まれている］、Myers及びMiller, CABIOS, 4: 11-17 (1988)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはCGC配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム(version2.0)に組み込まれている］、Pearsonら,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444-2448 (1988)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはGCGソフトウェアパッケージ中のFASTAプログラムに組み込まれている］等が挙げられ、それらも同様に好ましく用いられ得る。
　（Ｂ）又は（Ｃ）に示すタンパク質において、式（Ｉ）に示す反応を触媒する活性とは、化合物（１）を還元して化合物（２）を生成する反応を触媒する活性のことである。
　式（Ｉ）に示す反応における選択性は、Ｃ＝Ｃ還元により生成する化合物（２）の（３Ｒ）体と（３Ｓ）体の比率を指標として確認することができる。（３Ｒ）体の生成量に比して（３Ｓ）体の生成量が低いものほど化合物（２）の収率が向上し、工業化において有利である。
　（Ｂ）又は（Ｃ）に示すタンパク質において、式（ＩＩ）に示す反応を触媒する活性とは、化合物（４）を還元して化合物（３）を生成する反応を触媒する活性のことである。
　式（ＩＩ）に示す反応における選択性は、還元により生成する化合物（３）の（１Ｒ，３Ｒ）体と（１Ｒ，３Ｓ）体の比率を指標として確認することができる。（１Ｒ，３Ｒ）体の生成量に比して（１Ｒ，３Ｓ）体の生成量が低いものほど化合物（３）の収率が向上し、工業化において有利である。
　（１Ｒ，３Ｒ）体と（１Ｒ，３Ｓ）体の生成比率は、生成するＴｒａｎｓ体とＣｉｓ体の比率を指標として比較可能である。Ｔｒａｎｓ体、Ｃｉｓ体は幾何異性体を意味しており、（１Ｒ，３Ｒ）体と（１Ｓ，３Ｓ）体がＴｒａｎｓ体であり、（１Ｒ，３Ｓ）体と（１Ｓ，３Ｒ）体がＣｉｓ体である。本発明においては、Ｃ＝Ｃ還元による生成物は（１Ｒ，３Ｒ）体が主成分であるため、生成物を定量する際に（１Ｒ，３Ｒ）体単独で定量する評価系だけでなく、Ｔｒａｎｓ体とＣｉｓ体を分離できる評価系を用いて生成量を定量することが可能である。すなわち、（１Ｒ，３Ｒ）体を定量する場合に、Ｔｒａｎｓ体の生成量を定量することで代用できる。同様に、（１Ｒ，３Ｓ）体を定量する場合に、Ｃｉｓ体の生成量を定量することで代用できる。Ｃｉｓ体の生成比率が低いものほど、化合物（３）の収率が向上し、工業化において有利である。
　これらの選択性は、化合物（４）に、対象とするＣ＝Ｃ還元酵素等を接触させて化合物（３）を生成させ、生成した化合物（３）の（１Ｒ，３Ｒ）体と（１Ｒ，３Ｓ）体の生成量を測定すること又はＴｒａｎｓ体とＣｉｓ体の生成量を測定することにより確認することができる。
　接触方法は特に限定されず、例えば、対象とする前記Ｃ＝Ｃ還元酵素を含む液体に、化合物（１）又は化合物（４）を加え、適当な温度（例えば、１０℃～４５℃程度）や圧力（例えば大気圧程度）で反応させること等が挙げられる。
　上述のとおり、Ｃ＝Ｃ還元酵素としては、例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質（（Ａ）に示すタンパク質）を含むもの、又は該アミノ酸配列のホモログであって化合物（１）及び／又は化合物（４）のＣ＝Ｃ還元活性を有するタンパク質（（Ｂ）又は（Ｃ）に示すタンパク質）を含むもの等が挙げられる。該アミノ酸配列のホモログを有するタンパク質を含むＣ＝Ｃ還元酵素の化合物（１）及び／又は化合物（４）のＣ＝Ｃ還元活性の程度は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質を含むＣ＝Ｃ還元酵素と定量的に同等であり得るが、許容し得る範囲（例えば、約０．１倍～約２０倍、好ましくは、約０．３倍～約１５倍、さらに好ましくは約０．５倍～約１０倍）で異なっていてもよい。
　（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）に示すタンパク質を含むＣ＝Ｃ還元酵素を得る方法は、上述のＣ＝Ｃ還元酵素を得る方法、Ｃ＝Ｃ還元酵素を含有する形質転換体から製造する方法等の説明を援用できる
　Ｃ＝Ｃ還元酵素（（Ｂ）又は（Ｃ）に示すタンパク質）は、上記式（Ｉ）及び／又は（ＩＩ）に示す反応を、従来公知の配列番号１に示すタンパク質（（Ａ）に示すタンパク質）を含むＣ＝Ｃ還元酵素より、高い選択性で触媒する活性を有するものである。
　後述する本発明の製造方法においては、化合物（１）又は化合物（４）に、上述したＣ＝Ｃ還元酵素を直接反応に使用してもよいが、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を用いることが好ましい。
［Ｃ＝Ｏ還元酵素］
　本発明の製造方法は、式（１）で表される化合物に、炭素－炭素二重結合還元酵素（Ｃ＝Ｃ還元酵素）、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液、並びにカルボニル還元酵素（Ｃ＝Ｏ還元酵素）、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を接触させて、式（３）で表される化合物を得ることを特徴とする。該酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を「酵素等」と称する場合がある。以下、Ｃ＝Ｏ還元酵素に関して説明する。
　本発明の製造方法において、Ｃ＝Ｏ還元酵素は特に限定されない。Ｃ＝Ｏ還元酵素は、例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｋｅｆｉｒ、Ｐｉｃｈｉａ　ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ又はＤｅｖｏｓｉａ　ｒｉｂｏｆｌａｖｉｎａから公知の方法により精製、単離して得ることもできる。ここで、精製法としては、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、再結晶、これらの組み合わせなどが挙げられる。
　また、Ｃ＝Ｏ還元酵素は、それをコードする核酸を含有する形質転換体を培養し、得られる培養物から該Ｃ＝Ｏ還元酵素を分離精製することによって製造することもできる。Ｃ＝Ｏ還元酵素をコードする核酸はDNAであってもRNAであってもよく、あるいはDNA/RNAキメラであってもよい。好ましくはDNAが挙げられる。また、該核酸は二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖DNA、二本鎖RNA又はDNA：RNAのハイブリッドでもよい。一本鎖の場合は、センス鎖（すなわち、コード鎖）であっても、アンチセンス鎖（すなわち、非コード鎖）であってもよい。
　Ｃ＝Ｏ還元酵素をコードする核酸（DNA）としては、例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｋｅｆｉｒ由来のｌｋａｄｈ遺伝子の塩基配列（配列番号６）（ＧｅｎｅＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＹ２６７０１２）、Ｐｉｃｈｉａ　ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ由来のｐｆｏｄｈ１遺伝子の塩基配列（配列番号７）（ＧｅｎｅＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＢ２５９１１４．１）、Ｄｅｖｏｓｉａ　ｒｉｂｏｆｌａｖｉｎａ由来のｄｒｃｒ１遺伝子の塩基配列（配列番号８）（ＧｅｎｅＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＢＤ４５００８８．１）が挙げられる。
　また、Ｃ＝Ｏ還元酵素をコードするDNAとしては、合成DNAなどが挙げられる。例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｋｅｆｉｒ、Ｐｉｃｈｉａ　ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ又はＤｅｖｏｓｉａ　ｒｉｂｏｆｌａｖｉｎａ由来のＣ＝Ｏ還元酵素をコードするDNAの場合、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｋｅｆｉｒ、Ｐｉｃｈｉａ　ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ又はＤｅｖｏｓｉａ　ｒｉｂｏｆｌａｖｉｎａ由来の全RNA若しくはmRNA画分を鋳型として用い、Reverse Transcriptase-PCRによって直接増幅した全長Ｃ＝Ｃ還元酵素 cDNAを、公知のキット、例えば、MutanTM-super Express Km（TAKARA BIO INC.）、MutanTM-K（TAKARA BIO INC.）等を用いて、ODA-LA PCR法、Gapped duplex法、Kunkel法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って変換することによって取得することができる。あるいは、上記した全RNAもしくはmRNAの断片を適当なベクター中に挿入して調製されるcDNAライブラリーから、コロニーもしくはプラークハイブリダイゼーション法又はPCR法などにより、クローニングしたcDNAを、上記の方法に従って変換することによっても取得することができる。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。
　また、Ｃ＝Ｏ還元酵素をコードする核酸（DNA）は、例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｋｅｆｉｒ、Ｐｉｃｈｉａ　ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ又はＤｅｖｏｓｉａ　ｒｉｂｏｆｌａｖｉｎａ由来の染色体DNAを鋳型として用い、適切なプライマーを用いてPCRを行うことでクローニングできる。
　発現ベクターの作製方法、形質転換体の作製方法、形質転換の対象となる宿主微生物等は、Ｃ＝Ｃ還元酵素において説明した内容を援用できる。
　本発明の製造方法における「該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞」とは、「Ｃ＝Ｏ還元酵素（カルボニル基を立体選択的に還元しうる活性）」を生産する能力を有する微生物若しくは細胞であれば特に制限はなく、内在的に当該能力を有する微生物若しくは細胞であってもよいし、育種により当該能力を付与した微生物若しくは細胞であってもよい。育種により当該能力を付与する手段としては、遺伝子組換え処理（形質転換）や変異処理など、公知の方法を採用することができる。これらのうち、Ｃ＝Ｏ還元酵素をコードするDNAで形質転換された微生物若しくは細胞が好ましい。形質転換の方法としては、例えば、Ｃ＝Ｏ還元酵素遺伝子を導入する、有機化合物の生合成経路におけるＣ＝Ｏ還元酵素酵素遺伝子の発現を強化する、副生物生合成経路における酵素遺伝子の発現を低減するなどの方法を用いることができる。具体的な形質転換体の作製方法は、Ｃ＝Ｃ還元酵素において説明した内容を援用できる。
　本発明の製造方法における「該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞」、「該微生物若しくは細胞の処理物」及び「該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液」は、Ｃ＝Ｃ還元酵素において説明した内容を援用できる。
　Ｃ＝Ｏ還元酵素としては、また、配列番号２、３又は４で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質（（Ａ）に示すタンパク質）を含むもの、又は該アミノ酸配列と高い同一性を有するアミノ酸配列（以下、「アミノ酸配列のホモログ」という場合がある）を有し、化合物（１）及び／又は化合物（２）を還元する活性を有するタンパク質（（Ｂ）又は（Ｃ）に示すタンパク質）を含むもの（以下、「Ｃ＝Ｏ還元酵素のホモログ」という場合がある）等が挙げられる。具体的には、Ｃ＝Ｏ還元酵素としては、以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）に示すタンパク質を含むものが挙げられる。
　（Ａ）配列番号２、３又は４で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質
　（Ｂ）配列番号２、３又は４で表されるアミノ酸配列において、１～複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ式（ＩＩＩ）及び／又は（ＩＶ）に示す反応を触媒する活性を有するタンパク質
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000041
　（Ｃ）配列番号２、３又は４で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ上記式（ＩＩＩ）及び／又は（ＩＶ）に示す反応を触媒する活性を有するタンパク質
　（Ａ）に示すタンパク質において、配列番号２で表されるアミノ酸配列とは、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｋｅｆｉｒ由来のカルボニル還元酵素Ｌｋａｄｈのアミノ酸配列であり、配列番号３で表されるアミノ酸配列とは、Ｐｉｃｈｉａ　ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ由来のカルボニル還元酵素ＰｆＯＤＨのアミノ酸配列であり、配列番号４で表されるアミノ酸配列とは、Ｄｅｖｏｓｉａ　ｒｉｂｏｆｌａｖｉｎａ由来のカルボニル還元酵素ＤｒＣＲのアミノ酸配列である。これらのアミノ酸配列は、本発明者らにより、化合物（１）又は化合物（２）のＣ＝Ｏ還元酵素であると同定されたものである。
　本発明において、配列番号２、３又は４で表されるアミノ酸配列を有するＣ＝Ｏ還元酵素のホモログは、前記（Ｂ）又は（Ｃ）に示すタンパク質を含むものである。
　（Ｂ）に示すタンパク質において、「１～複数個のアミノ酸」とは、通常１個～１００個、好ましくは１個～５０個、より好ましくは１個～２０個、さらに好ましくは１個～１０個、さらにより好ましくは１個～５個、いっそう好ましくは１個～３個、特に好ましくは１個又は２個のアミノ酸である。置換の場合、アミノ酸が保守的に置換されたものが好ましい。
　（Ｃ）に示すタンパク質において、配列番号２、３又は４で表されるアミノ酸配列との同一性は、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、なお一層好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上である。
　アミノ酸配列の同一性（適宜、相同性又は類似性と言い換えてもよい）は、Ｃ＝Ｃ還元酵素において説明した内容を援用できる。
　（Ｂ）又は（Ｃ）に示すタンパク質において、式（ＩＩＩ）に示す反応を触媒する活性とは、化合物（２）をＣ＝Ｏ還元して化合物（３）を生成する反応を触媒する活性のことである。
　本発明において、式（ＩＩＩ）に示す反応における選択性は、Ｃ＝Ｏ還元により生成する化合物（３）の（１Ｒ，３Ｒ）体と（１Ｓ，３Ｒ）体の比率を指標として確認することができる。（１Ｒ，３Ｒ）体の生成量に比して（１Ｓ，３Ｒ）体の生成量が低いものほど化合物（３）の収率が向上し、工業化において有利である。
　化合物（３）の（１Ｒ，３Ｒ）体と（１Ｓ，３Ｒ）体の生成比率は、生成するＴｒａｎｓ体とＣｉｓ体の比率を指標として比較可能である。Ｔｒａｎｓ体、Ｃｉｓ体は幾何異性体を意味しており、（１Ｒ，３Ｒ）体と（１Ｓ，３Ｓ）体がＴｒａｎｓ体であり、（１Ｒ，３Ｓ）体と（１Ｓ，３Ｒ）体がＣｉｓ体である。本発明においては、Ｃ＝Ｏ還元による生成物は（１Ｒ，３Ｒ）体が主成分であるため、生成物を定量する際に（１Ｒ，３Ｒ）体単独で定量する評価系だけでなく、Ｔｒａｎｓ体とＣｉｓ体を分離できる評価系を用いて生成量を定量することが可能である。すなわち、（１Ｒ，３Ｒ）体を定量する場合に、Ｔｒａｎｓ体の生成量を定量することで代用できる。同様に、（１Ｓ，３Ｒ）体を定量する場合に、Ｃｉｓ体の生成量を定量することで代用できる。Ｃｉｓ体の生成比率が低いものほど、化合物（３）の収率が向上し、工業化において有利である。
　これらの選択性は、化合物（２）に、対象とするＣ＝Ｏ還元酵素等を接触させて化合物（３）を生成させ、生成した化合物（３）の（１Ｒ，３Ｒ）体と（１Ｓ，３Ｒ）体の生成量を測定すること又はＴｒａｎｓ体とＣｉｓ体の生成量を測定することにより確認することができる。
　（Ｂ）又は（Ｃ）に示すタンパク質において、式（ＩＶ）に示す反応を触媒する活性とは、化合物（１）を還元して化合物（４）を生成する反応を触媒する活性のことである。
　式（ＩＶ）に示す反応における選択性は、還元により生成する化合物（４）の（１Ｒ）体と（１Ｓ）体の比率を指標として確認することができる。（１Ｒ）体の生成量に比して（１Ｓ）体の生成量が低いものほど化合物（４）の収率が向上し、工業化において有利である。
　接触方法は特に限定されず、例えば、対象とする前記Ｃ＝Ｏ還元酵素を含む液体に、化合物（１）又は化合物（２）を加え、適当な温度（例えば、１０℃～４５℃程度）や圧力（例えば大気圧程度）で反応させること等が挙げられる。
　上述のとおり、Ｃ＝Ｏ還元酵素としては、例えば、配列番号２、３又は４で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質（（Ａ）に示すタンパク質）を含むもの、又は該アミノ酸配列のホモログであって化合物（１）及び／又は化合物（２）のＣ＝Ｏ還元活性を有するタンパク質（（Ｂ）又は（Ｃ）に示すタンパク質）を含むもの等が挙げられる。該アミノ酸配列のホモログを有するタンパク質を含むＣ＝Ｏ還元酵素の化合物（１）及び／又は化合物（２）のカルボニル還元活性の程度は、配列番号２、３又は４で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質を含むＣ＝Ｏ還元酵素と定量的に同等であり得るが、許容し得る範囲（例えば、約０．１倍～約２０倍、好ましくは、約０．３倍～約１５倍、さらに好ましくは約０．５倍～約１０倍）で異なっていてもよい。
　（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）に示すタンパク質を含むＣ＝Ｏ還元酵素を得る方法は、Ｃ＝Ｃ還元酵素において説明した内容を援用できる。
　Ｃ＝Ｏ還元酵素（（Ｂ）又は（Ｃ）に示すタンパク質）は、上記式（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）に示す反応を、従来公知の配列番号２、３又は４で表されるタンパク質（（Ａ）に示すタンパク質）を含むＣ＝Ｏ還元酵素より、高い選択性で触媒する活性を有するものである。
　後述する本発明の製造方法においては、化合物（１）又は化合物（２）に、上述したＣ＝Ｏ還元酵素を直接反応に使用してもよいが、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を用いることが好ましい。
２．本発明の組成物
　本発明の組成物（酵素剤）は、Ｃ＝Ｃ還元酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を含み、化合物（１）を基質とし、化合物（２）を生成する反応、及び化合物（４）を基質として化合物（３）を生成する反応を触媒するものである。本発明の組成物は、触媒として使用することで、光学純度の高い化合物（２）又は化合物（３）を、高効率、かつ低コストで工業的に製造することができるため、有用である。
　また、本発明の組成物（酵素剤）は、Ｃ＝Ｏ還元酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を含み、化合物（１）を基質とし、化合物（４）を生成する反応、及び化合物（２）を基質とし、化合物（３）を生成する反応を触媒するものである。本発明の組成物は、触媒として使用することで、光学純度の高い化合物（３）又は化合物（４）を、高効率、かつ低コストで工業的に製造することができるため、有用である。
　本発明の組成物は、有効成分（酵素等）の他、賦形剤、緩衝剤、懸濁剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水などを含有していてもよい。賦形剤としては乳糖、ソルビトール、Ｄ－マンニトール、白糖等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としては塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等と用いることができる。
３．本発明の製造方法
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000042
［工程１］
　Ｃ＝Ｃ還元酵素等を用いた下式（Ｉ）に示す反応による化合物（２）の製造
　本発明によれば、式（Ｉ）に示す反応、即ち、Ｃ＝Ｃ還元酵素等を化合物（１）に作用させて、化合物（２）を製造する方法が提供される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000043
　Ｃ＝Ｃ還元酵素を化合物（１）に接触させる際には、精製又は粗精製したＣ＝Ｃ還元酵素、Ｃ＝Ｃ還元酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞（例えば、タンパク質をコードするＤＮＡを有する形質転換体等）、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を、化合物（１）に接触させることによって、化合物（２）を製造することができる。
　Ｃ＝Ｃ還元酵素は、直接反応に使用してもよいが、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を用いることが好ましく、これらの中でも、タンパク質をコードするＤＮＡを有する形質転換体を用いることが好ましい。
　反応液に添加する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液の量は、微生物若しくは細胞を添加する場合は、反応液にその微生物若しくは細胞の濃度が、通常、湿菌体重で０．１ｗ／ｖ％～５０ｗ／ｖ％程度、好ましくは１ｗ／ｖ％～２０ｗ／ｖ％となるように添加し、処理物や培養液を用いる場合には、酵素の比活性を求め、添加したときに上記細胞濃度になるような量を添加する。なお、本明細書においてｗ／ｖ％は、重量（ｗｅｉｇｈｔ）／体積（ｖｏｌｕｍｅ）％を表す。
　反応の方法は特に限定されず、Ｃ＝Ｃ還元酵素を含む液体に、基質となる化合物（１）を加え、適当な温度（例えば、１０℃～４５℃程度）や圧力（例えば大気圧程度）で反応させることができる。これにより、化合物（２）を製造することができる。
　反応基質となる化合物（１）は、通常、基質濃度が０．０１ｗ／ｖ％～９０ｗ／ｖ％、好ましくは０．１ｗ／ｖ％～３０ｗ／ｖ％の範囲で用いられる。反応基質は、反応開始時に一括して添加してもよいが、酵素の基質阻害があった場合の影響を減らすという点や生成物の蓄積濃度を向上させるという観点からすると、連続的もしくは間欠的に添加することが望ましい。
　反応は、通常、水性媒体中、又は水性媒体と有機溶媒との混合物中で行われる。水性媒体としては、例えば、水又は緩衝液が挙げられる。有機溶媒としては、メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、ｔｅｒｔ－ブタノール、アセトン、ジメチルスルホキシド等、反応基質である化合物（１）の溶解度が高いものを使用することができる。また、有機溶媒としては、反応副産物の除去等に効果のある、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、ｎ－ヘキサン等を使用することもできる。
　反応は、通常、４℃～６０℃、好ましくは１０℃～４５℃の反応温度で、また、通常ｐＨ３～１１、好ましくはｐＨ５～８の条件下で行われる。反応時間は、通常、１時間～７２時間程度である。
　本発明の製造方法により生成する化合物（２）は、反応終了後、反応液中の菌体やタンパク質等を遠心分離、膜処理等当業者に公知の分離又は精製方法により分離した後に、１－ブタノール、ｔｅｒｔ－ブタノール等の有機溶媒による抽出、蒸留、イオン交換樹脂やシリカゲル等を用いたカラムクロマトグラフィー、等電点における晶析や一塩酸塩、二塩酸塩、カルシウム塩等での晶析等を適宜組み合わせることにより精製を行うことができる。
　本発明で得られた化合物（２）を用いることにより、高効率、低コストで、光学純度の高い化合物（３）や様々な医薬品の合成用原料、合成用中間体の製造に有用な中間体を製造することができる。
［工程２］
　Ｃ＝Ｏ還元酵素等を用いた下式（ＩＩＩ）に示す反応による化合物（３）の製造
　本発明によれば、式（ＩＩＩ）に示す反応、即ち、Ｃ＝Ｏ還元酵素等を化合物（２）に作用させて、化合物（３）を製造する方法が提供される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000044
　Ｃ＝Ｏ還元酵素を化合物（２）に接触させる際には、精製又は粗精製したＣ＝Ｏ還元酵素、本発明のＣ＝Ｏ還元酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞（例えば、タンパク質をコードするＤＮＡを有する形質転換体等）、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を、化合物（２）に接触させることによって、化合物（３）を製造することができる。
　Ｃ＝Ｏ還元酵素は、直接反応に使用してもよいが、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を用いることが好ましく、これらの中でも、タンパク質をコードするＤＮＡを有する形質転換体を用いることが好ましい。
　反応液に添加する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液の量は、微生物若しくは細胞を添加する場合は、反応液にその微生物若しくは細胞の濃度が、通常、湿菌体重で０．１ｗ／ｖ％～５０ｗ／ｖ％程度、好ましくは１ｗ／ｖ％～２０ｗ／ｖ％となるように添加し、処理物や培養液を用いる場合には、酵素の比活性を求め、添加したときに上記細胞濃度になるような量を添加する。
　Ｃ＝Ｏ還元酵素の反応基質である３－（トリフルオロメチル）シクロヘキサン－１－オンとしては、通常、（３Ｒ）体が用いられる。
　反応の方法は特に限定されず、Ｃ＝Ｏ還元酵素を含む液体に、基質となる化合物（２）を加え、適当な温度（例えば、１０℃～４５℃程度）や圧力（例えば大気圧程度）で反応させることができる。これにより、化合物（３）を製造することができる。
　反応基質となる化合物（２）は、通常、基質濃度が０．０１ｗ／ｖ％～９０ｗ／ｖ％、好ましくは０．１ｗ／ｖ％～３０ｗ／ｖ％の範囲で用いられる。反応基質は、反応開始時に一括して添加してもよいが、酵素の基質阻害があった場合の影響を減らすという点や生成物の蓄積濃度を向上させるという観点からすると、連続的もしくは間欠的に添加することが望ましい。
　反応は、通常、水性媒体中、又は水性媒体と有機溶媒との混合物中で行われる。水性媒体としては、例えば、水又は緩衝液が挙げられる。有機溶媒としては、メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、ｔｅｒｔ－ブタノール、アセトン、ジメチルスルホキシド等、反応基質である化合物（２）の溶解度が高いものを使用することができる。また、有機溶媒としては、反応副産物の除去等に効果のある、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、ｎ－ヘキサン等を使用することもできる。
　反応は、通常、４℃～６０℃、好ましくは１０℃～４５℃の反応温度で、また、通常ｐＨ３～１１、好ましくはｐＨ５～８の条件下で行われる。反応時間は、通常、１時間～７２時間程度である。
　本発明の製造方法により生成する化合物（３）は、反応終了後、反応液中の菌体やタンパク質等を遠心分離、膜処理等当業者に公知の分離又は精製方法により分離した後に、１－ブタノール、ｔｅｒｔ－ブタノール等の有機溶媒による抽出、蒸留、イオン交換樹脂やシリカゲル等を用いたカラムクロマトグラフィー、等電点における晶析や一塩酸塩、二塩酸塩、カルシウム塩等での晶析等を適宜組み合わせることにより精製を行うことができる。
　得られた化合物（３）には、そのジアステレオマーである下記式（５）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000045
で表される化合物（以下、化合物（５）と称する場合がある。）又は下記式（６）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000046
で表される化合物（以下、化合物（６）と称する場合がある。）が含まれる場合があるが、化合物（３）が医薬品の合成用原料や合成用中間体として使用される場合は、これらの化合物の含有量は少ないことが好ましい。上記の製造方法で得られる化合物（３）において、化合物（５）及び／又は化合物（６）の含有量は８ｍｏｌ％以下であることが好ましく、６ｍｏｌ％以下であることがより好ましく、４ｍｏｌ％以下であることがさらに好ましく、２ｍｏｌ％以下であることが特に好ましい。
　本発明で得られた化合物（３）を用いることにより、高効率、低コストで、光学純度の高い化合物様々な医薬品の合成用原料、合成用中間体を製造することができる。本発明で得られる化合物（３）は不純物の量が少ないので、精製等を行うことなく、様々な医薬品の合成用原料、合成用中間体の製造に用いることができるため、製造コストが安価であり、工業的製造に好ましい。
［工程３］
　Ｃ＝Ｏ還元酵素等を用いた下式（ＩＶ）に示す反応による化合物（４）の製造
　本発明によれば、式（ＩＶ）に示す反応、即ち、Ｃ＝Ｏ還元酵素等を化合物（１）に作用させて、化合物（４）を製造する方法が提供される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000047
　Ｃ＝Ｏ還元酵素を化合物（１）に接触させる際には、精製又は粗精製したＣ＝Ｏ還元酵素、Ｃ＝Ｏ還元酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞（例えば、タンパク質をコードするＤＮＡを有する形質転換体等）、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を、化合物（１）に接触させることによって、化合物（４）を製造することができる。
　Ｃ＝Ｏ還元酵素は、直接反応に使用してもよいが、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を用いることが好ましく、これらの中でも、タンパク質をコードするＤＮＡを有する形質転換体を用いることが好ましい。
　反応液に添加する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液の量は、微生物若しくは細胞を添加する場合は、反応液にその微生物若しくは細胞の濃度が、通常、湿菌体重で０．１ｗ／ｖ％～５０ｗ／ｖ％程度、好ましくは１ｗ／ｖ％～２０ｗ／ｖ％となるように添加し、処理物や培養液を用いる場合には、酵素の比活性を求め、添加したときに上記細胞濃度になるような量を添加する。
　Ｃ＝Ｏ還元酵素の反応基質である化合物（１）としては、通常、市販品が用いられる。
　反応の方法は特に限定されず、Ｃ＝Ｏ還元酵素を含む液体に、基質となる化合物（１）を加え、適当な温度（例えば、１０℃～４５℃程度）や圧力（例えば大気圧程度）で反応させることができる。これにより、化合物（４）を製造することができる。
　反応基質となる化合物（１）は、通常、基質濃度が０．０１ｗ／ｖ％～９０ｗ／ｖ％、好ましくは０．１ｗ／ｖ％～３０ｗ／ｖ％の範囲で用いられる。反応基質は、反応開始時に一括して添加してもよいが、酵素の基質阻害があった場合の影響を減らすという点や生成物の蓄積濃度を向上させるという観点からすると、連続的もしくは間欠的に添加することが望ましい。
　反応は、通常、水性媒体中、又は水性媒体と有機溶媒との混合物中で行われる。水性媒体としては、例えば、水又は緩衝液が挙げられる。有機溶媒としては、メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、ｔｅｒｔ－ブタノール、アセトン、ジメチルスルホキシド等、反応基質である化合物（１）の溶解度が高いものを使用することができる。また、有機溶媒としては、反応副産物の除去等に効果のある、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、ｎ－ヘキサン等を使用することもできる。
　反応は、通常、４℃～６０℃、好ましくは１０℃～４５℃の反応温度で、また、通常ｐＨ３～１１、好ましくはｐＨ５～８の条件下で行われる。反応時間は、通常、１時間～７２時間程度である。
　本発明の製造方法により生成する化合物（４）は、反応終了後、反応液中の菌体やタンパク質等を遠心分離、膜処理等当業者に公知の分離又は精製方法により分離した後に、１－ブタノール、ｔｅｒｔ－ブタノール等の有機溶媒による抽出、蒸留、イオン交換樹脂やシリカゲル等を用いたカラムクロマトグラフィー、等電点における晶析や一塩酸塩、二塩酸塩、カルシウム塩等での晶析等を適宜組み合わせることにより精製を行うことができる。
　本発明で得られた化合物（４）を用いることにより、高効率、低コストで、光学純度の高い化合物（３）や様々な医薬品の合成用原料、合成用中間体の製造に有用な中間体を製造することができる。
［工程４］
　Ｃ＝Ｃ還元酵素等を用いた下式（ＩＩ）に示す反応による化合物（３）の製造
　本発明によれば、式（ＩＩ）に示す反応、即ち、Ｃ＝Ｃ還元酵素等を化合物（４）に作用させて、化合物（３）を製造する方法が提供される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000048
　Ｃ＝Ｃ還元酵素を化合物（４）に接触させる際には、精製又は粗精製したＣ＝Ｃ還元酵素、本発明のＣ＝Ｃ還元酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞（例えば、タンパク質をコードするＤＮＡを有する形質転換体等）、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を、化合物（４）に接触させることによって、化合物（３）を製造することができる。
　Ｃ＝Ｃ還元酵素は、直接反応に使用してもよいが、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を用いることが好ましく、これらの中でも、タンパク質をコードするＤＮＡを有する形質転換体を用いることが好ましい。
　反応液に添加する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液の量は、微生物若しくは細胞を添加する場合は、反応液にその微生物若しくは細胞の濃度が、通常、湿菌体重で０．１ｗ／ｖ％～５０ｗ／ｖ％程度、好ましくは１ｗ／ｖ％～２０ｗ／ｖ％となるように添加し、処理物や培養液を用いる場合には、酵素の比活性を求め、添加したときに上記細胞濃度になるような量を添加する。
　Ｃ＝Ｃ還元酵素の反応基質である３－トリフルオロメチル－２－シクロヘキセン－１－オールとしては、通常、（１Ｒ）体が用いられる。
　反応の方法は特に限定されず、Ｃ＝Ｃ還元酵素を含む液体に、基質となる化合物（４）を加え、適当な温度（例えば、１０℃～４５℃程度）や圧力（例えば大気圧程度）で反応させることができる。これにより、化合物（３）を製造することができる。
　反応基質となる化合物（４）は、通常、基質濃度が０．０１ｗ／ｖ％～９０ｗ／ｖ％、好ましくは０．１ｗ／ｖ％～３０ｗ／ｖ％の範囲で用いられる。反応基質は、反応開始時に一括して添加してもよいが、酵素の基質阻害があった場合の影響を減らすという点や生成物の蓄積濃度を向上させるという観点からすると、連続的もしくは間欠的に添加することが望ましい。
　反応は、通常、水性媒体中、又は水性媒体と有機溶媒との混合物中で行われる。水性媒体としては、例えば、水又は緩衝液が挙げられる。有機溶媒としては、メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、ｔｅｒｔ－ブタノール、アセトン、ジメチルスルホキシド等、反応基質である化合物（４）の溶解度が高いものを使用することができる。また、有機溶媒としては、反応副産物の除去等に効果のある、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、ｎ－ヘキサン等を使用することもできる。
　反応は、通常、４℃～６０℃、好ましくは１０℃～４５℃の反応温度で、また、通常ｐＨ３～１１、好ましくはｐＨ５～８の条件下で行われる。反応時間は、通常、１時間～７２時間程度である。
　本発明の製造方法により生成する化合物（３）は、反応終了後、反応液中の菌体やタンパク質等を遠心分離、膜処理等当業者に公知の分離又は精製方法により分離した後に、１－ブタノール、ｔｅｒｔ－ブタノール等の有機溶媒による抽出、蒸留、イオン交換樹脂やシリカゲル等を用いたカラムクロマトグラフィー、等電点における晶析や一塩酸塩、二塩酸塩、カルシウム塩等での晶析等を適宜組み合わせることにより精製を行うことができる。
　得られた化合物（３）には、そのジアステレオマーである化合物（５）又は化合物（６）が含まれる場合があるが、化合物（３）が医薬品の合成用原料や合成用中間体として使用される場合は、これらの化合物の含有量は少ないことが好ましい。上記の製造方法で得られる化合物（３）において、化合物（５）及び／又は化合物（６）の含有量は８ｍｏｌ％以下であることが好ましく、６ｍｏｌ％以下であることがより好ましく、４ｍｏｌ％以下であることがさらに好ましく、２ｍｏｌ％以下であることが特に好ましい。
　本発明で得られた化合物（３）を用いることにより、高効率、低コストで、光学純度の高い化合物様々な医薬品の合成用原料、合成用中間体を製造することができる。本発明で得られる化合物（３）は不純物の量が少ないので、精製等を行うことなく、様々な医薬品の合成用原料、合成用中間体の製造に用いることができるため、製造コストが安価であり、工業的製造に好ましい。
［工程５］
　Ｃ＝Ｃ還元酵素等を用いた下式（Ｖ）に示す反応による化合物（３）の製造
　本発明によれば、式（Ｖ）に示す反応、即ち、Ｃ＝Ｃ還元酵素等を化合物（１）に作用させて、化合物（３）を製造する方法が提供される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000049
　Ｃ＝Ｃ還元酵素及びＣ＝Ｏ還元酵素を化合物（１）に接触させる際には、精製又は粗精製した本発明のＣ＝Ｃ還元酵素、Ｃ＝Ｃ還元酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞（例えば、タンパク質をコードするＤＮＡを有する形質転換体等）、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液、並びにＣ＝Ｏ還元酵素、Ｃ＝Ｏ還元酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞（例えば、タンパク質をコードするＤＮＡを有する形質転換体等）、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を、化合物（１）に接触させることによって、化合物（３）を製造することができる。
　Ｃ＝Ｃ還元酵素及びＣ＝Ｏ還元酵素は、直接反応に使用してもよいが、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を用いることが好ましく、これらの中でも、タンパク質をコードするＤＮＡを有する形質転換体を用いることが好ましい。
　反応液に添加する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液の量は、微生物若しくは細胞を添加する場合は、反応液にその微生物若しくは細胞の濃度が、通常、湿菌体重で０．１ｗ／ｖ％～５０ｗ／ｖ％程度、好ましくは１ｗ／ｖ％～２０ｗ／ｖ％となるように添加し、処理物や培養液を用いる場合には、酵素の比活性を求め、添加したときに上記細胞濃度になるような量を添加する。
　反応の方法は特に限定されず、Ｃ＝Ｃ還元酵素及びＣ＝Ｏ還元酵素を含む液体に、基質となる化合物（１）を加え、適当な温度（例えば、１０℃～４５℃程度）や圧力（例えば大気圧程度）で反応させることができる。これにより、化合物（３）を製造することができる。
　反応基質となる化合物（１）は、通常、基質濃度が０．０１ｗ／ｖ％～９０ｗ／ｖ％、好ましくは０．１ｗ／ｖ％～３０ｗ／ｖ％の範囲で用いられる。反応基質は、反応開始時に一括して添加してもよいが、酵素の基質阻害があった場合の影響を減らすという点や生成物の蓄積濃度を向上させるという観点からすると、連続的もしくは間欠的に添加することが望ましい。
　反応は、通常、水性媒体中、又は水性媒体と有機溶媒との混合物中で行われる。水性媒体としては、例えば、水又は緩衝液が挙げられる。有機溶媒としては、メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、ｔｅｒｔ－ブタノール、アセトン、ジメチルスルホキシド等、反応基質である化合物（１）の溶解度が高いものを使用することができる。また、有機溶媒としては、反応副産物の除去等に効果のある、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、ｎ－ヘキサン等を使用することもできる。
　反応は、通常、４℃～６０℃、好ましくは１０℃～４５℃の反応温度で、また、通常ｐＨ３～１１、好ましくはｐＨ５～８の条件下で行われる。反応時間は、通常、１時間～７２時間程度である。
　本発明の製造方法により生成する化合物（３）は、反応終了後、反応液中の菌体やタンパク質等を遠心分離、膜処理等当業者に公知の分離又は精製方法により分離した後に、１－ブタノール、ｔｅｒｔ－ブタノール等の有機溶媒による抽出、蒸留、イオン交換樹脂やシリカゲル等を用いたカラムクロマトグラフィー、等電点における晶析や一塩酸塩、二塩酸塩、カルシウム塩等での晶析等を適宜組み合わせることにより精製を行うことができる。
　得られた化合物（３）には、そのジアステレオマーである化合物（５）又は化合物（６）が含まれる場合があるが、化合物（３）が医薬品の合成用原料や合成用中間体として使用される場合は、これらの化合物の含有量は少ないことが好ましい。上記の製造方法で得られる化合物（３）において、化合物（５）及び／又は化合物（６）の含有量は８ｍｏｌ％以下であることが好ましく、６ｍｏｌ％以下であることがより好ましく、４ｍｏｌ％以下であることがさらに好ましく、２ｍｏｌ％以下であることが特に好ましい。
　本発明で得られた化合物（３）を用いることにより、高効率、低コストで、光学純度の高い化合物、様々な医薬品の合成用原料、合成用中間体を製造することができる。本発明で得られる化合物（３）は不純物の量が少ないので、精製等を行うことなく、様々な医薬品の合成用原料、合成用中間体の製造に用いることができるため、製造コストが安価であり、工業的製造に好ましい。
　また、本発明の製造方法１～３は、補酵素の存在下に行うことができる。補酵素としては、還元型ニコチンアミドアデニンヌクレオチド（ＮＡＤＨ）、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）、酸化型ニコチンアミドアデニンヌクレオチド（ＮＡＤ＋）又は酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ＋）を等を用いることができ、好ましくはＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＰ＋を用いることができる。
　補酵素の使用量は、補酵素として機能する量であれば特に限定されないが、反応系に、通常、０．００１ｍｍｏｌ／Ｌ～１００ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ～１０ｍｍｏｌ／Ｌの濃度になるように添加するのが好ましい。
　補酵素を添加する場合には、ＮＡＤ(Ｐ)Ｈから生成するＮＡＤ(Ｐ)＋をＮＡＤ(Ｐ)Ｈへの再生させることが生産効率向上のため好ましい。再生方法としては、＜１＞宿主微生物自体のＮＡＤ(Ｐ)＋還元能を利用する方法、＜２＞ＮＡＤ(Ｐ)＋からＮＡＤ(Ｐ)Ｈを生成する能力を有する微生物やその処理物、あるいは、グルコース脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素、有機酸脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素など）などのＮＡＤ(Ｐ)Ｈの再生に利用可能な酵素（再生酵素）を反応系内に添加する方法、＜３＞形質転換体を製造する際に、ＮＡＤ(Ｐ)Ｈの再生に利用可能な酵素である上記再生酵素類の遺伝子を本発明のＤＮＡと同時に宿主に導入する方法などが挙げられる。
　以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明はその要旨を越えない限りこれらの実施例により制限されるものではない。
　なお、以下に示す表において、Ａはアラニン、Ｃはシステイン、Ｄはアスパラギン酸、Ｆはフェニルアラニン、Ｈはヒスチジン、Ｗはトリプトファン、Ｙはチロシンを示す。また、例えば、Ａ１０４Ｗは、アミノ酸配列において１０４番目のアラニンがトリプトファンに置換されている変異を示す。
　実施例において、それぞれの略号は以下の化合物を表す。
（Ｒ）－ＴＦＣＨ：（３Ｒ）－３－（トリフルオロメチル）シクロヘキサン－１－オン
（Ｓ）－ＴＦＣＨ：（３Ｓ）－３－（トリフルオロメチル）シクロヘキサン－１－オン
ＴＦＣＬ：３－（トリフルオロメチル）シクロヘキサン－１－オール
（１Ｒ，３Ｒ）－ＴＦＣＬ：（１Ｒ，３Ｒ）－３－（トリフルオロメチル）シクロヘキサン－１－オール
（１Ｓ，３Ｓ）－ＴＦＣＬ：（１Ｓ，３Ｓ）－３－（トリフルオロメチル）シクロヘキサン－１－オール
　目的物の生成量、純度等は、以下に示すＧＣ分析条件１及びＧＣ分析条件２によりガスクロマトグラフィー法で測定した。なお、（Ｒ）－ＴＦＣＨ及び（Ｓ）－ＴＦＣＨの溶出時間はそれぞれ、後述する実施例１及び参考例８の反応中間体として得られるピークより帰属した。（１Ｒ，３Ｒ）－ＴＦＣＬ及び（１Ｓ，３Ｓ）－ＴＦＣＬの溶出時間はそれぞれ、後述する実施例１の（１Ｒ，３Ｒ）－ＴＦＣＬ、参考例８の（１Ｓ，３Ｓ）－ＴＦＣＬの溶出時間である。また、ＴＦＣＬの４異性体（ＴＦＣＬ異性体１～４）の混合物を分析に供した際に検出される４本のピークのうち、ＴＦＣＬ異性体１は（１Ｒ，３Ｒ）－ＴＦＣＬ（化合物（３））、ＴＦＣＬ異性体２は（１Ｓ，３Ｓ）－ＴＦＣＬであり、これらのジアステレオマーであるＴＦＣＬ異性体３又はＴＦＣＬ異性体４は化合物（５）又は化合物（６）で表される２つの異なるジアステレオマーである。
　ＴＦＣＬ－ＲＰＰＡエステルは、ＴＦＣＬの（Ｒ）－（－）－２－フェニルプロピオン酸エステルを意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000050
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000051
参考例１（発現用プラスミドの調製）
［炭素－炭素二重結合還元酵素（以下、「ＹｑｊＭ」という。）発現用プラスミドの調製］   
（１）遺伝子のクローニング   
　常法に従ってＰＣＲを行い、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のＹｑｊＭ（ＧｅｎｅＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｐ５４５５０）をコードするｙｑｊｍ遺伝子約１ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片を鋳型として、常法に従ってＰＣＲを行い、５’末端に制限酵素ＥｃｏＲＩの制限酵素切断サイト、３’末端に制限酵素ＸｂａＩの制限酵素切断サイトをそれぞれ付加したＤＮＡ断片を得た。
（２）発現用プラスミドの調製
　上記（１）で得られたｙｑｊｍのＤＮＡ断片を、制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｂａＩにより消化したプラスミドｐＫＶ３２（特許第４２７０９１８号公報に記載のもの）にＴ４　ＤＮＡ　Ｌｉｇａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いてｔｒｃプロモーターの下流に導入し、ｐＫＶ３２－ＹｑｊＭを得た。
参考例２（発現用プラスミドの調製）
［カルボニル還元酵素（以下、「Ｌｋａｄｈ」という。）発現用プラスミドの調製］
（１）遺伝子のクローニング
　常法に従ってＰＣＲを行い、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｋｅｆｉｒ由来のｌｋａｄｈ遺伝子（ＧｅｎｅＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＹ２６７０１２）約０．７５ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片を常法に従ってＰＣＲを行い、５’末端に制限酵素ＥｃｏＲ１の制限酵素切断サイト、３’末端に制限酵素ＸｂａＩの制限酵素切断サイトをそれぞれ付加したＤＮＡ断片を得た。
（２）発現用プラスミドの調製
　上記（１）で得られたｌｋａｄｈのＤＮＡ断片を、参考例１（２）と同様にプラスミドｐＫＶ３２のｔｒｃプロモーターの下流に導入し、ｐＫＶ３２－Ｌｋａｄｈを得た。
参考例３（発現用プラスミドの調製）
[グルコースデヒドロゲナーゼ（以下、「ＢｓＧＤＨ」という。）発現用プラスミドの調製］
（１）遺伝子のクローニング
　特許第６４７６１１０号公報に記載の方法に従って、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来ＢｓＧＤＨ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿３８８２７５）において、９６番目のアミノ酸をアラニン、２５２番目のアミノ酸をロイシンに置換したタンパク質をコードする遺伝子配列ｂｓｇｄｈ遺伝子約０．８ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片を常法に従ってＰＣＲを行い、５’末端に制限酵素ＥｃｏＲ１の制限酵素切断サイト、３’末端に制限酵素ＸｂａＩの制限酵素切断サイトをそれぞれ付加したＤＮＡ断片を得た。
（２）発現用プラスミドの調製
　上記（１）で得られたｂｓｇｄｈのＤＮＡ断片を、制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｂａＩにより消化したプラスミドｐＫＷ３２（特許第５６１３６６０号公報に記載のもの）にＴ４　ＤＮＡ　Ｌｉｇａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いてｔｒｃプロモーターの下流に導入し、ｐＫＷ３２－ＢｓＧＤＨを得た。
参考例４（発現用プラスミドの調製）
　参考例１で得たプラスミドｐＫＶ３２－ＹｑｊＭを鋳型として、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、２６番目のアミノ酸であるＣをＡ、Ｄ、Ｆ、Ｗ、Ｙのいずれか、１０４番目のアミノ酸ＡをＦ、Ｈ、Ｗ、Ｙのいずれかに変化させた組み合わせの変異導入プラスミドを作成した。作製した変異導入プラスミドを表３に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000052
参考例５（発現用プラスミドの調製）
炭素‐炭素二重結合還元酵素（以下、「ＮＥＭＡ」という。）発現用プラスミドの調製］
（１）遺伝子のクローニング
　常法に従ってＰＣＲを行い、Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ由来のＮＥＭＡ（Ｂｉｏｌ．　Ｐｈａｒｍ．　Ｂｕｌｌ．　２０：１１０－１１２（１９９７）に記載のもの）をコードするｎｅｍＡ遺伝子約１ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片を鋳型として、常法に従ってＰＣＲを行い、５’末端に制限酵素ＥｃｏＲＩの制限酵素切断サイト、３’末端に制限酵素ＸｂａＩの制限酵素切断サイトをそれぞれ付加したＤＮＡ断片を得た。
（２）発現用プラスミドの調製
　上記（１）で得られたｎｅｍＡのＤＮＡ断片を、参考例１（２）と同様にしてプラスミドｐＫＶ３２のｔｒｃプロモーターの下流に導入し、ｐＫＶ３２－ＮＥＭＡを得た。
参考例６（発現用プラスミドの調製）
［カルボニル還元酵素（以下、「ＩｓＡＤＨ」という。）発現用プラスミドの調製］
（１）遺伝子のクローニング
　常法に従ってＰＣＲを行い、Ｉｓｓａｔｃｈａｎｋｉａ　ｓｃｕｔｕｌａｔａ　ｖａｒ．　ｓｃｕｔｕｌａｔａ　ＪＣＭ１８２８株由来のｉｓａｄｈ遺伝子（特許第４２０５４９６号公報に記載のもの）約１ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片を常法に従ってＰＣＲを行い、５’末端に制限酵素ＥｃｏＲ１の制限酵素切断サイト、３’末端に制限酵素ＸｂａＩの制限酵素切断サイトをそれぞれ付加したＤＮＡ断片を得た。
（２）発現用プラスミドの調製
　上記（１）で得られたｉｓａｄｈのＤＮＡ断片を、参考例１（２）と同様にしてプラスミドｐＫＶ３２のｔｒｃプロモーターの下流に導入し、ｐＫＶ３２－ＩｓＡＤＨを得た。
参考例７（菌体の調製）
［各種酵素を発現させた大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９の調製］
（１）発現株の調製
　参考例１～６で得られたプラスミドを用いて、大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９　ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　ｃｅｌｌ（タカラバイオ社製）を常法に従い形質転換し、プラスミドを導入した組換え大腸菌を得た。
（２）酵素液の調製
　上記（１）で得られた組換え大腸菌をカナマイシン（２５μｇ／ｍＬ）、０．２ｍｍｏｌ／Ｌイソプロピル　β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含むＬＢ培地で３０℃で１８時間生育させた。得られた菌体ブロス２ｍＬを遠心分離により集菌後、Ｂｕｇｂｕｓｔｅｒ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（Ｍｅｒｃｋ社製）にＢｅｎｚｏｎａｓｅ及びｒＬｙｓｏｚｙｍｅを添加したものを用いて、常法に従い酵素液を得た。
実施例１：ＴＦＣＬ（ＴＦＣＬ異性体１）（化合物（３））の調製
（１）ＴＦＣＬ異性体１の調製
　２００ｍＬジャーファーメンターに、７ｍＬの１ｍｏｌ／Ｌリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、５．６ｍＬの５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮＡＤＰ＋、１０．５ｍＬの１ｍｏｌ／Ｌグルコース溶液、７１８ｍｇの化合物（１）、参考例４及び７で得られた大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＶ３２－ＹｑｊＭ（Ａ１０４Ｗ（ＹｑｊＭ変異体１３））の酵素液、参考例２及び７で得られた大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＶ３２－Ｌｋａｄｈの酵素液、参考例３及び７で得られた大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＷ３２－ＢｓＧＤＨ（Ｅ９６Ａ、Ｑ２５２Ｌ）の酵素液を混合し、純水を加え７０ｍＬの反応液を調製した。この反応液を、反応温度２８℃～３０℃、反応時のｐＨ７．０として、十分な撹拌速度の下、一晩反応させた。
　反応終了後の液にメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（以下、ＭＴＢＥという。）を添加し、室温で攪拌した後、ＭＴＢＥ層を取得した。ロータリーエバポレーターを用いてこの抽出液からＭＴＢＥを留去し、ＴＦＣＬ異性体１を得た。
（２）改良Ｍｏｓｃｈｅｒ法によるＴＦＣＬ異性体１－ＲＰＰＡエステルの調製
　３０ｍＬ試験管（Ｒ）－（－）－２－フェニルプロピオン酸（ＲＰＰＡ）１５ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノピリジン１．２ｍｇ（０．０１ｍｍｏｌ）及び上記（１）で得られたＴＦＣＬ異性体１　２０．２ｍｇ（０．１２ｍｍｏｌ）を仕込み、ジクロロメタン溶媒２００μＬを加えて室温で撹拌し反応させた。反応液をＧＣ分析条件１により分析し、目的物の生成を確認した。得られた反応液を０℃に冷却し、Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド２４．７ｍｇ（０．１２ｍｍｏｌ）を投入し、室温で３時間反応させた。反応後、水２００μＬを加えて分液した後、有機層を回収した。有機層を濾過し、得られたろ液をロータリーエバポレーターで減圧濃縮した。濃縮残渣をシリカゲルカラムで精製し、目的物であるＴＦＣＬ異性体１－ＲＰＰＡエステルをオイル状物質として得た。
ＴＦＣＬ異性体１－ＲＰＰＡエステル
　ＧＣ－ＭＳ（ＣＩ：ＣＨ４ガス）：ｍ／ｚ＝３０１（Ｍ＋Ｈ）　示性式　Ｃ１６Ｈ１９Ｆ３Ｏ２　計算値　３００．１３３７
　１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000053
参考例８：ＴＦＣＬ（ＴＦＣＬ異性体２）の調製
（１）ＴＦＣＬ異性体２の調製
　実施例１において、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＶ３２－ＹｑｊＭの酵素液を参考例５及び７で得られた大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＶ３２－ＮＥＭＡの酵素液、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＶ３２－Ｌｋａｄｈの酵素液を参考例６及び７で得られた大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＶ３２－ＩｓＡＤＨの酵素液にそれぞれ変更したこと以外は実施例１と同様にして反応を行った。
　反応終了後の液にＭＴＢＥを添加し、室温で攪拌した後、ＭＴＢＥ層（抽出液）を取得した。ロータリーエバポレーターを用いて、この抽出液からＭＴＢＥを留去して、ＴＦＣＬ異性体２を得た。
（２）改良Ｍｏｓｃｈｅｒ法によるＴＦＣＬ異性体２－ＲＰＰＡエステルの調製
　３０ｍＬ試験管に（Ｒ）－（－）－２－フェニルプロピオン酸（ＲＰＰＡ）１５ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノピリジン１．２ｍｇ（０．０１ｍｍｏｌ）及び上記（１）で得られたＴＦＣＬ異性体２　２０．２ｍｇ（０．１２ｍｍｏｌ）を仕込み、ジクロロメタン溶媒２００μＬを加えて室温で撹拌し反応させた。反応液をＧＣ分析条件１により分析し、目的物の生成を確認した。得られた反応液を０℃に冷却し、Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド２４．７ｍｇ（０．１２ｍｍｏｌ）を投入し、室温で３時間反応させた。反応後、水２００μＬを加えて分液した後、有機層を回収した。有機層を濾過し、得られたろ液をロータリーエバポレーターで減圧濃縮した。濃縮残渣をシリカゲルカラムで精製し、目的物であるＴＦＣＬ異性体２－ＲＰＰＡエステルをオイル状物質として得た。
ＴＦＣＬ異性体２－ＲＰＰＡエステル
　ＧＣ－ＭＳ（ＣＩ：ＣＨ４ガス）：ｍ／ｚ＝３０１（Ｍ＋Ｈ）、示性式　Ｃ１６Ｈ１９Ｆ３Ｏ２　計算値　３００．１３３７
　１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000054
　実施例１の（２）で得られたＴＦＣＬ異性体１－ＲＰＰＡエステル及び参考例８の（２）で得られたＴＦＣＬ異性体２－ＲＰＰＡエステルについて、その１Ｈ－ＮＭＲとＧＣ－ＭＳとの分析データから、以下の構造が支持された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000055
　実施例１の（２）で得られたＴＦＣＬ異性体１－ＲＰＰＡエステル及び参考例８の（２）で得られたＴＦＣＬ異性体２－ＲＰＰＡエステルの１Ｈ－ＮＭＲから、１位プロトンのＪ値が２．７Ｈｚもしくはブロードであり、その値が小さいことから１位の水素はｅｑｕａｔｏｒｉａｌ位であると決定した。
　一般的に改良Ｍｏｃｓｈｅｒ法は、ベンゼン環に近いプロトンが高磁場にシフトする現象を確認することで立体配置を決定することができる。
　３位プロトンの化学シフトを比較すると、ＴＦＣＬ異性体１－ＲＰＰＡエステルの方がＴＦＣＬ異性体２－ＲＰＰＡエステルよりも０．４ｐｐｍ～０．５ｐｐｍ高磁場にシフトしており、ＴＦＣＬ異性体１－ＲＰＰＡエステルのベンゼン環が３位プロトンに近いことを確認した（ＴＦＣＬ異性体１－ＲＰＰＡエステル：１．８ｐｐｍ、ＴＦＣＬ異性体２－ＲＰＰＡエステル：２．２ｐｐｍ～２．３ｐｐｍ）。
　以上から、実施例１の（１）で得られたＴＦＣＬ異性体１は（１Ｒ，３Ｒ）体、参考例８の（１）で得られたＴＦＣＬ異性体２は（１Ｓ，３Ｓ）体であると決定した。
実施例２～１１及び比較例１～８：ＹｑｊＭ変異体の初期活性測定
　ＹｑｊＭ変異体の初期活性測定活性は、化合物（１）添加時のＮＡＤＰＨの減少量を３４０ｎｍの波長で測定することで確認した。１０μＬの酵素液（実施例２：参考例１および７で得られた酵素液を使用、実施例３～１１及び比較例１～８：参考例４および７で得られた酵素液を使用）、２５μＬの１ｍｏｌ／Ｌ　リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７）、１０μＬの８ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮＡＤＰＨ、２００μＬの水、及び５μＬの０．１ｍｏｌ／Ｌ　化合物（１）のＤＭＳＯ溶液を混合した。混合したものを９６ウェルプレート（コーニング社製）に入れ、３０℃に温めたマイクロプレートリーダー（モレキュラーバイオ社製）を用いて、３４０ｎｍの吸光度変化を２分間測定した。単位時間当たりの吸光度変化の平均値（ｍＯＤ／分）を算出し、吸光度変化の傾きから下記式により単位時間・単位タンパク質当たりの活性値を算出した。ＮＡＤＰＨのモル吸光係数は６．３ｍＬ／μｍｏｌ・ｃｍとして計算した。
　活性値（μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ－タンパク質）＝（－１）×吸光度変化の傾き×２５０μＬ／１０μＬ／６３００／０．５５／タンパク質濃度
　野生型に対する各変異体の相対活性を表７に示した。なお、相対活性が１５％より少ない場合を“－”として示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000056
　表２から明らかなように、２６番目のＣをＡに置換したもの（実施例７：ＹｑｊＭ変異体１０）又は１０４番目のＡをＦ、Ｙ、Ｗ又はＨに置換したもの（実施例８～１１：ＹｑｊＭ変異体１１～１４）は、野生型に対する相対活性が著しく向上することが分かった。また、２６番目のＣをＡに置換し且つ１０４番目のＡをＦ、Ｙ、Ｗ又はＨに置換したもの（実施例３～６：ＹｑｊＭ変異体６～９）も、野生型に対する相対活性が著しく向上することが分かった。
　一方、２６番目のＣをＷ、Ｄ、Ｆ又はＹに置換したもの（比較例１～５：ＹｑｊＭ変異体１～５、比較例６～８：ＹｑｊＭ変異体１５～１７）では、野生型に対する相対活性が著しく低下することが分かった。特にＣ２６Ｗ／Ａ１０４Ｆ（比較例１：ＹｑｊＭ変異体１）、Ｃ２６Ｗ／Ａ１０４Ｙ（比較例２：ＹｑｊＭ変異体２）、Ｃ２６Ｄ／Ａ１０４Ｗ（比較例６：ＹｑｊＭ変異体１５）については、非特許文献２に記載の化合物に対する反応性と本発明の化合物（１）に対する反応性が大きく異なることが分かった。
実施例１２～２１：（Ｒ）－ＴＦＣＨ（化合物（２））の製造
　２ｍＬのマイクロチューブに、参考例１及び７の方法で調製したｐＫＶ３２－ＹｑｊＭ導入組換え大腸菌の酵素液、又は、参考例４及び７の方法で変異を導入したｐＫＶ３２－ＹｑｊＭ導入組換え大腸菌の酵素液を１００μＬ、５０ｇ／Ｌ　ＫＲＥＤ　ｍｉｘ　Ｎ（Ｃｏｄｅｘｉｓ社製）を４００μＬ、化合物（１）を４．１ｍｇ添加し、３０℃で１時間撹拌し、反応させた。得られた反応液にヘプタン１ｍＬを添加し、常温下で撹拌した。静置後に得られた上層をＧＣ分析条件２により分析した。化合物（１）からＴＦＣＨへの変換率、及び得られた（Ｒ）－ＴＦＣＨ（化合物（２））の光学純度を表８に示した。なお、変換率及び光学純度は下記式により算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000057
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000058
　表８から明らかなように、２６番目のＣをＡに置換したＹｑｊＭ変異体６～１０（実施例１３～１７）は、野生型に対して変換率及び光学純度が大きく向上することが分かった。さらに、１０４番目のＡをＦ、Ｙ、Ｗ又はＨに置換したＹｑｊＭ変異体（実施例１３～１６）６～９では、変換率及び光学純度がより向上することが分かった。
実施例２２：（１Ｒ，３Ｒ）－ＴＦＣＬ（化合物（３））の製造
　２００ｍＬジャーファーメンターに、７ｍＬの１ｍｏｌ／Ｌリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、０．７ｍＬの５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮＡＤＰ＋、１０．５ｍＬの４ｍｏｌ／Ｌグルコース溶液、３３ｍＬの純水、２８７３ｍｇの化合物（１）、参考例４及び７で得られた大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＶ３２－ＹｑｊＭ（Ａ１０４Ｗ（ＹｑｊＭ変異体１３））の湿菌体０．８４ｇ分の酵素液８．４ｍＬ、参考例２及び７、で得られた大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＶ３２－Ｌｋａｄｈの湿菌体０．４２ｇ分の酵素液４．２ｍＬ、参考例３及び７で得られた大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＷ３２－ＢｓＧＤＨ（Ｅ９６Ａ、Ｑ２５２Ｌ）の湿菌体０．６１ｇ分の酵素液６．１ｍＬを混合し、反応温度２８℃～３０℃、２５ｗｔ％ＮａＯＨ水溶性を用いて反応時のｐＨを７．０に保ちながら、十分な撹拌速度の下、１７時間反応させた。
　反応終了後の液にメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（以下、ＭＴＢＥという。）を３５ｍＬ添加し、室温で攪拌した後、（１Ｒ，３Ｒ）－ＴＦＣＬを含むＭＴＢＥ層を取得した。得られた水層に対し再度ＭＴＢＥを３５ｍＬ添加し、室温で攪拌した後、（１Ｒ，３Ｒ）－ＴＦＣＬを含むＭＴＢＥ層を取得した。得られたＭＴＢＥ層のＧＣ分析条件２による純度分析及び光学純度分析の結果、（１Ｒ，３Ｒ）－ＴＦＣＬの純分は２３４８ｍｇであり、収率は８１．８％であった。光学純度は９９．８％ｅ．ｅ．であった。ジアステレオマー存在比は１．６％であった。なお、光学純度及びジアステレオマー存在比は下記式により算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000059
実施例２３：（１Ｒ，３Ｒ）－ＴＦＣＬ（化合物（３））の製造
（１）（Ｒ）－ＴＦＣＨ（化合物（２））の製造
　２ｍＬのマイクロチューブに、５０μＬの１ｍｏｌ／Ｌリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、２０μＬの５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮＡＤ＋、２０μＬの５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮＡＤＰ＋、７５μＬの１ｍｏｌ／Ｌグルコース溶液、８．２ｍｇの化合物（１）、参考例１及び７で得られた大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＶ３２－ＹｑｊＭの酵素液、参考例３及び７で得られた大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＷ３２－ＢｓＧＤＨ（Ｅ９６Ａ、Ｑ２５２Ｌ）の酵素液を混合し、純水を加え５００μＬの反応液Ａを調製した。反応液Ａと同様にして分析用に反応液Ｂを調整し、反応液Ａ及びＢを、反応温度３０℃、十分な撹拌速度の下、１６時間反応させた。
　反応後、反応液Ｂにヘプタン１ｍＬを添加し、常温下で１分間撹拌した。静置後に得られた上層をＧＣ分析条件２により分析した。化合物（１）から化合物（２）への変換率は４３．１％であり、得られた化合物（２）の光学純度は６７．８％ｅｅであった。なお、変換率及び光学純度は下記式により算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000060
（２）（１Ｒ，３Ｒ）－ＴＦＣＬ（化合物（３））の製造
　上記（１）で得られた反応液Ａを反応温度３０℃、十分な撹拌速度の下、さらに８時間反応させた後、反応液Ａに２０μＬの５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮＡＤ＋、２０μＬの５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮＡＤＰ＋、７５μＬの１ｍｏｌ／Ｌグルコース溶液、１００μＬの参考例２及び７で得られた大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＶ３２－Ｌｋａｄｈの酵素液を添加し、さらに１６時間反応させた。得られた反応液にヘプタン１ｍＬを添加し、常温下で１分間撹拌した。静置後に得られた上層をＧＣ分析条件２により分析した。得られた（１Ｒ，３Ｒ）－ＴＦＣＬ（化合物（３））の光学純度は７５．８％ｅｅであった。ジアステレオマー存在比は２３．８％であった。なお、光学純度及びジアステレオマー存在比は下記式により算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000061
実施例２４：（１Ｒ）－３－トリフルオロメチル－２－シクロヘキセン－１－オール（化合物（４））の製造
　２ｍＬのマイクロチューブに、５０μＬの１ｍｏｌ／Ｌリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ　７．０）、２０μＬの５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮＡＤ＋、２０μＬの５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮＡＤＰ＋、７５μＬの１ｍｏｌ／Ｌグルコース溶液、８．２ｍｇ化合物（１）、参考例２及び７で得られた大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＶ３２－Ｌｋａｄｈの酵素液、参考例３及び７で得られた大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＷ３２－ＢｓＧＤＨ（Ｅ９６Ａ、Ｑ２５２Ｌ）の酵素液を混合し、純水を加え５００μＬの反応液を調製した。この反応液を、反応温度３０℃、十分な撹拌速度の下、２３時間反応させた。得られた反応液にヘプタン１ｍＬを添加し、常温下で１分間撹拌した。静置後に得られた上層をＧＣ－ＭＳ分析し、（１Ｒ）－３－トリフルオロメチル－２－シクロヘキセン－１－オール（化合物（４））の生成を確認した。生成物は実施例１、２２及び２３（２）の結果から（１Ｒ）体と推定した。化合物（１）から化合物（４）への変換率は４３．６％であった。なお、変換率は下記式により算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000062
　本発明によれば、様々な医薬品の合成用原料、合成用中間体として有用な（１Ｒ）－３－トリフルオロメチル－２－シクロヘキセン－１－オール又は（３Ｒ）－３－（トリフルオロメチル）シクロヘキサン－１－オンを高光学純度、高選択性で、高効率かつ低コストで工業的に製造する新規な方法を提供することができる。さらに、このようにして得られた（１Ｒ）－３－トリフルオロメチル－２－シクロヘキセン－１－オール又は（３Ｒ）－３－（トリフルオロメチル）シクロヘキサン－１－オンを用いることにより、高効率、かつ低コストで、光学純度の高い（１Ｒ，３Ｒ）－３－（トリフルオロメチル）シクロヘキサン－１－オールを製造することができる。

Claims (12)

  1. 　式（１）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     で表される化合物に、炭素－炭素二重結合還元酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液、並びにカルボニル還元酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を接触させて、式（３）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     で表される化合物を得ることを特徴とする、式（３）で表される化合物の製造方法。
  2. 　前記炭素－炭素二重結合還元酵素が、以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）に示すタンパク質を含む、請求項１に記載の製造方法。
    　（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質
    　（Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１～複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ式（Ｉ）及び／又は式（ＩＩ）に示す反応を触媒する活性を有するタンパク質
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     　（Ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ以下の（ｉ）～（ｉｉ）の群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換が導入されており、かつ式（Ｉ）及び／又は式（ＩＩ）に示す反応を触媒する活性を有するタンパク質
    　（ｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列における２６番目のシステインが、アスパラギン酸、フェニルアラニン、トリプトファン又はチロシン以外のアミノ酸に置換
    　（ｉｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列における１０４番目のアラニンが、アラニン以外のアミノ酸に置換
  3. 　前記（ｉ）のアミノ酸置換が以下の（ｉ’）である、請求項２に記載の製造方法。
    　（ｉ’）配列番号１で表されるアミノ酸配列における２６番目のシステインが、アラニンに置換
  4. 　前記（ｉｉ）のアミノ酸置換が以下の（ｉｉ’）である、請求項２又は３に記載の製造方法。
    　（ｉｉ’）配列番号１で表されるアミノ酸配列における１０４番目のアラニンが、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン又はチロシンに置換
  5. 　前記カルボニル還元酵素が、以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）に示すタンパク質を含む、請求項１又は２に記載の製造方法。
    　（Ａ）配列番号２、３又は４で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質
    　（Ｂ）配列番号２、３又は４で表されるアミノ酸配列において、１～複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ式（ＩＩＩ）及び／又は式（ＩＶ）に示す反応を触媒する活性を有するタンパク質
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     　（Ｃ）配列番号２、３又は４で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ式（ＩＩＩ）及び／又は式（ＩＶ）に示す反応を触媒する活性を有するタンパク質
  6. 　式（１）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     で表される化合物に、炭素－炭素二重結合還元酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を接触させて、式（２）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     で表される化合物を得た後に、さらに
    式（２）で表される化合物に、カルボニル還元酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を接触させて、式（３）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
     で表される化合物を得ることを特徴とする、請求項１～５のいずれかに記載の製造方法。
  7. 　式（１）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
     で表される化合物に、カルボニル還元酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を接触させて、式（４）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
     で表される化合物を得た後に、さらに
    式（４）で表される化合物に、炭素－炭素二重結合還元酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を接触させて、式（３）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
     で表される化合物を得ることを特徴とする、請求項１～５のいずれかに記載の製造方法。
  8. 　化合物（３）に含まれる、式（５）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
     で表される化合物及び／又は式（６）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
     で表される化合物の含有量が８ｍｏｌ％以下であることを特徴とする、請求項１～７のいずれかに記載の製造方法。
  9. 　式（１）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
     で表される化合物に、炭素－炭素二重結合還元酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を接触させて、式（２）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
     で表される化合物を得ることを特徴とする、式（２）で表される化合物の製造方法。
  10. 　前記炭素－炭素二重結合還元酵素が、以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）に示すタンパク質を含む、請求項９に記載の製造方法。
    　（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質
    　（Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１～複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ式（Ｉ）に示す反応を触媒する活性を有するタンパク質
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
     　（Ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ以下の（ｉ）～（ｉｉ）の群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換が導入されており、かつ式（Ｉ）及び／又は式（ＩＩ）に示す反応を触媒する活性を有するタンパク質
    　（ｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列における２６番目のシステインが、アスパラギン酸、フェニルアラニン、トリプトファン又はチロシン以外のアミノ酸に置換
    　（ｉｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列における１０４番目のアラニンが、アラニン以外のアミノ酸に置換
  11. 　式（１）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
     で表される化合物に、カルボニル還元酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を接触させて、式（４）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
     で表される化合物を得ることを特徴とする、式（４）で表される化合物の製造方法。
  12. 　前記カルボニル還元酵素が、以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）に示すタンパク質を含む、請求項１１に記載の製造方法。
    　（Ａ）配列番号２、３又は４で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質
    　（Ｂ）配列番号２、３又は４で表されるアミノ酸配列において、１～複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ（ＩＶ）に示す反応を触媒する活性を有するタンパク質
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
     　（Ｃ）配列番号２、３又は４で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ式（ＩＶ）に示す反応を触媒する活性を有するタンパク質
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