CN116286698A - 一种l-泛解酸内酯脱氢酶、其表达载体以及其共表达工程菌在d-泛解酸内酯合成中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种来源于Skermania sp.ID1734的L‑泛解酸内酯脱氢酶、编码该L‑泛解酸内酯脱氢酶的核酸分子、用于在宿主细胞中表达该L‑泛解酸内酯脱氢酶的载体以及表达该酶的工程菌。本发明还进一步提供一种共表达所述L‑泛解酸内酯脱氢酶以及选自以下组中的任意一种或多种的工程菌：酮基泛解酸内酯还原酶以及葡萄糖脱氢酶。本发明进一步提供一种D‑泛解酸内酯的生产方法，其使用表达所述来源于Skermania sp.ID1734的L‑泛解酸内酯脱氢酶的工程菌。本发明提供的技术方案之一，是提供一种重组载体或重组载体组合，所述重组载体或重组载体组合包含表达所述L‑泛解酸内酯脱氢酶的基因。本发明还提供了所述的L‑泛解酸内酯脱氢酶、所述的核酸分子、所述的工程菌，所述的载体或载体组合在D‑泛解酸内酯的合成中的应用或用途。

Description

一种L-泛解酸内酯脱氢酶、其表达载体以及其共表达工程菌 在D-泛解酸内酯合成中的应用

技术领域

属于生物酶催化合成领域，具体涉及从L-泛解酸内酯到酮基泛解酸内酯的制备及D-泛解酸内酯的合成。

背景技术

泛酸(Pantothenica acid,PA)又称维生素B5或D-泛酸钙，是一种水溶性维生素，由泛解酸和β-丙氨酸组成，仅D－型(D-PA)具有生物活性。在活细胞体内，泛酸作为辅酶A(CoA)和酰基载体蛋白(ACP)的重要前体物质，参与生物体内碳水化合物、脂肪酸、蛋白质和能量代谢。目前，泛酸广泛应用于医药、食品、饲料及化妆品等行业。工业生产上，D-泛酸钙的合成先是通过化学法合成DL-泛解酸内酯混合物，接着进行拆分分离环化，环化后的D-泛解酸内酯再与3-氨基丙酸钙反应，合成D-泛酸钙。该工艺路线较为繁琐，能耗较高。通过酶法对L-泛解酸内酯进行氧化还原合成D-泛解酸内酯，可以降低工艺难度，节约成本，且更环保绿色。

生物酶法通过多酶协同作用，将L-泛解酸内酯进行脱氢氧化，获得的产物酮基泛解酸内酯再经过酮基泛解酸内酯还原酶的作用，得到目的产物D-泛解酸内酯，相比较于目前工业上制备D-泛解酸内酯的方法，省去分离、环化、消旋等环节，具有节能降耗等优点，具体路径图如下：

生物酶法路径

L-泛解酸内酯脱氢酶可将L-泛解酸内酯氧化成酮基泛解酸内酯，酮基泛解酸内酯在酮基泛解酸内酯还原酶的作用下进一步还原生成D-泛解酸内酯。L-泛解酸内酯脱氢酶作为氧化还原法制备D-泛解酸内酯的关键一环，目前关于它的研究不多。Si,D等对Rhodococcus erythropolis来源的L-泛解酸内酯脱氢酶LPLDH基因进行了表达，在底物浓度0.768和1.15M的条件下，分别实现了92％和80％的转化率(Rhodococcus erythropolis(Si,D.,Urano,N.,Nozaki,S.et al.L-Pantoyl lactone dehydrogenase fromRhodococcus erythropolis:genetic analyses and application to thestereospecific oxidation of L-pantoyl lactone.Appl Microbiol Biotechnol 95,431–440(2012).)。杭州鑫富科技有限公司对nocardia farcinica(CN201910366852.5)及Cnuibacter physcomitrellae(CN201910366923.1)等来源的L-泛解酸内酯脱氢酶进行了过表达和酶催化体系的搭建，均显示出一定催化活性，说明该路线具有一定可行性。目前尚未见报道Skermania sp.ID1734来源的L-泛解酸内酯羟基氧化酶的相关研究。

发明内容

为了获得新的L-泛解酸内酯羟基氧化酶，本发明人通过使用基因数据库Uniprot，对大量的基因进行了筛选，最终发现，来源于Skermania sp.ID1734(斯科曼氏菌属)的黄素脱氢酶的基因(A0A554V9U8)，以下简称为MsfDH基因，所表达的蛋白具有L-泛解酸内酯羟基氧化酶活性，从而完成了本发明。在现有技术中，MsfDH的功能尚有争议，例如在Uniprot数据库中，该基因仅被注释为血红素/黄素脱氢酶(无实际试验)，而在NCBI(WP_143768573.1)上则有人注释为脱氨氧化酶，对其用于还原辅因子Mycofactocin的生物合成的功能进行了研究(Ayikpoe,R.S.,&Latham,J.A.(2019).MftD Catalyzes the Formation of aBiologically Active Redox Center in the Biosynthesis of the RibosomallySynthesized and Post-translationally Modified Redox Cofactor,Mycofactocin.Journal of the American Chemical Society.doi:10.1021/jacs.9b06102)。

本发明的发明人通过对包括MsfDH基因在内的大量基因进行分析、筛选以及验证，发现在被注释为黄素脱氢酶的基因中，并非都有L-泛解酸内酯脱氢酶活性，仅筛选出MsfDH基因编码的蛋白质(MsfDH蛋白在以下有时也以MsfDH表示)具有L-泛解酸内酯脱氢酶的活性。本发明的发明人还对使用的载体、宿主细胞进行了筛选，并根据筛选的结果对MsfDH基因的表达序列进行了改良，获得了一种能够稳定表现出L-泛解酸内酯脱氢酶活性的工程菌。本发明的发明人还对所述工程菌进一步进行了改良，通过在L-泛解酸内酯脱氢酶的基础上使工程菌进一步表达酮基泛解酸内酯还原酶和葡萄糖脱氢酶，能够获得一种D-泛解酸内酯合成反应效率更高的多酶共表达工程菌。此外，L-泛解酸内酯在水相反应体系中，随着pH的变化，也会自发部分水解产生L-泛解酸，这会导致目标产物D-泛解酸内酯产率降低，而本发明的发明人意外发现MsfDH不仅对于L-泛解酸内酯有氧化脱氢能力，对于L-泛解酸也具有氧化能力(即具有对L-泛解酸及L-泛解酸内酯的双重氧化能力)，这对最终提高D-型泛解酸/内酯合成反应的效率和减少产物杂质，都是有利的。

本发明提供了一种来源于Skermania sp.ID1734的L-泛解酸内酯脱氢酶、编码该L-泛解酸内酯脱氢酶的核酸分子、用于在宿主细胞中表达该L-泛解酸内酯脱氢酶的载体以及表达该酶的工程菌。本发明还进一步提供一种共表达所述L-泛解酸内酯脱氢酶以及选自以下组中的任意一种或多种的工程菌：酮基泛解酸内酯还原酶以及葡萄糖脱氢酶。本发明进一步提供一种D-泛解酸内酯的生产方法，其使用表达所述来源于Skermania sp.ID1734的L-泛解酸内酯脱氢酶的工程菌。本发明提供的技术方案之一，是提供一种重组载体或重组载体组合，所述重组载体或重组载体组合包含表达所述L-泛解酸内酯脱氢酶的基因。本发明还提供了所述的L-泛解酸内酯脱氢酶、所述的核酸分子、所述的工程菌，所述的载体或载体组合在D-泛解酸内酯的合成中的应用或用途。

具体而言，本发明包含以下的方面：

1一种L-泛解酸内酯脱氢酶，其包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或与所述序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％同一性的氨基酸序列。

2一种核酸分子，其中，所述核酸分子包含编码项1所述的L-泛解酸内酯脱氢酶的核酸序列。

3如项2所述的核酸分子，其中，所述核酸分子包含如SEQ ID NO:1所示的核酸序列或与所述序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％同一性的核酸序列。

4如项2或3所述的核酸分子，其为一种载体或载体的组合。

5如项2～4中任一项所述的核酸分子，其进一步包含表达酮基泛解酸内酯还原酶的核酸序列和/或编码葡萄糖脱氢酶的核酸序列。

6如项2～5中任一项所述的核酸分子，其为一种载体的组合，其包含：

(a)第一载体：其包含编码项1所述的L-泛解酸内酯脱氢酶的核酸序列；以及

(b)第二载体：其包含编码酮基泛解酸内酯还原酶的核酸序列和/或编码葡萄糖脱氢酶的核酸序列。

7如项4～6中任一项所述的核酸分子，其中：

所述载体或所述载体组合中的第一载体和第二载体是通过对选自以下载体中的任意一种进行编辑而得到的：pET28a、pCDFDuet1、pACYCDuet-1、pETDuet-1、pRSFDuet-1。

8如项5～7中任一项所述的核酸分子，其中，所述编码酮基泛解酸内酯还原酶的核酸序列为SEQ ID NO:3所示的核酸序列或与所述序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％同一性的核酸序列；和/或

所述编码葡萄糖脱氢酶的核酸序列为SEQ ID NO:5所示的核酸序列或与所述序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％同一性的核酸序列。

9如项6～8中任一项所述的核酸分子，其中，第一载体包含如SEQ IDNO:7所示的核酸序列或与所述序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％同一性的核酸序列。

10如项6～9中任一项所述的核酸分子，其中，第二载体包含如SEQ ID NO:20所示的核酸序列或与所述序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％同一性的核酸序列。

11一种工程菌，其中，所述工程菌表达如项1所述的L-泛解酸内酯脱氢酶；或包含如项2～10中任一项所述的核酸分子。

12如项11所述的工程菌，其中，所述工程菌是通过对选自以下组中的任意一种或多种宿主细胞进行加工而得到的：大肠杆菌、枯草杆菌、酵母细胞或曲霉菌。

13如项11或12所述的工程菌，其中，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21。

14一种生产D-泛解酸内酯的方法，其包含：

(a)通过如项1所述的L-泛解酸内酯脱氢酶催化L-泛解酸内酯生成酮基泛解酸内酯的步骤；

(b)由酮基泛解酸内酯形成D-泛解酸内酯的步骤。

15如项14所述的方法，其中，所述(a)步骤；或(a)步骤以及(b)步骤是通过使用如项11～13中任一项所述的工程菌进行的。

16如项15所述的方法，其中，所述(a)步骤；或(a)步骤以及(b)步骤的具体实施步骤包括：

(i)使如项11～13中任一项所述的工程菌在包含终浓度为10-65g/L的L-泛解酸内酯的反应环境中进行反应的步骤，L-泛解酸内酯的终浓度优选为40-65g/L。

17如项16所述的方法，其中，所述反应环境进一步包含：葡萄糖和/或NADP⁺，

葡萄糖的终浓度为10-100g/L，优选为16-100g/L，NADP⁺的终浓度为5-20g/L，优选为10g/L。

18如项16或17所述的方法，其中，所述(i)步骤在25-35℃、200-350rpm的条件下进行，优选在30℃、200rpm的条件下进行。

19如项1所述的L-泛解酸内酯脱氢酶、如项2～10中任一项所述的核酸分子或如项11～13中任一项所述的工程菌在D-泛解酸内酯的合成中的用途。

在本说明书中，除非另外定义，否则使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。当术语以单数形式提供时，除非另有说明，否则也包括该术语的复数形式。除非另有说明，否则本说明书的正文中的核酸序列相对于启动子以5'至3'的方向给出。除非另有说明，否则本说明书的正文中氨基酸序列以N端至C端的方向给出。

在本说明书中，“包含”不仅具有“将…包含在内”的意义，还具有“由…构成”的意义。

在本说明书中，术语“酶”是指催化或促进一个或多个化学或生化反应的任何物质，其通常包括完全或部分由多肽构成的酶，但也可以包括由包括多核苷酸的不同分子构成的酶。在本发明中，只要特定催化活性不受到显著的抑制，则酶的氨基酸序列可以在一定范围内进行变更，例如可以是与本发明所公开的具体序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％同一性的氨基酸序列。

在本说明书中，术语“L-泛解酸内酯脱氢酶”通常是指具有将L-泛解酸内酯进行脱氢氧化而形成酮基泛解酸内酯的活性的蛋白质酶。

在本说明书中，术语“核酸”或“核酸分子”通常是指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物。核酸分子可由为天然存在的核苷酸(诸如DNA和RNA)，或天然存在的核苷酸的类似物(例如，天然存在的核苷酸的对应体形式)的单体或这两者的组合组成。经修饰的核苷酸可在糖部分和/或嘧啶或嘌呤碱部分具有改变。糖修饰包括，例如，用卤素、烷基、胺和叠氮基对一个或多个羟基替换，或糖类可被官能化为醚或酯。此外，整个糖部分可被立体化学和电子方面相似的结构诸如氮杂-糖类和碳环糖类似物替换。碱基部分的修饰的实例包括烷基化嘌呤和嘧啶、酰化嘌呤或嘧啶，或其它公知的杂环取代基。核酸单体可以通过磷酸二酯键或此种键联的类似物连接。磷酸二酯键联的类似物包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺基硫代磷酸酯、苯胺磷酸酯(phosphoranilidate)、磷酰胺酯等。

在本说明书中，“分离的核酸分子”通常是指未被整合在生物的基因组DNA中的核酸分子。例如，编码已从细胞的基因组DNA分离的受体的DNA分子是分离的DNA分子。分离的核酸分子的另一非限制性实例是未被整合在生物的基因组中的化学合成的核酸分子。分离的核酸分子的另一个非限制性实例是已从特定物种分离的比来自该物种的染色体的完整DNA分子小的核酸分子。

在本说明书中，术语“分离的蛋白”通常是指，体是已经与它的天然环境中的组分分离的蛋白。在某些实施方式中，将蛋白纯化至大于95％或99％纯度，所述纯度通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱(例如，离子交换或反相HPLC)确定。关于评价蛋白纯度的方法的综述可参见Flatman，S.等，J.Chrom.B 848(2007)79-87。

在本说明书中，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌(例如，经过改造商业化株E.coli BL21)或枯草杆菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞。

在本说明书中，术语“工程菌”是指用基因工程的方法，使外源基因在宿主细胞中得到高效表达的菌类细胞株。

在本申请中，术语“载体”通常是指能够在合适的宿主中自我复制的核酸分子，用以将插入的核酸分子转移到宿主细胞中和/或宿主细胞之间；或将目标序列导入宿主细胞中和/或宿主细胞之间以作为编辑的模板的核酸分子。所述载体可包括主要用于将DNA或RNA插入细胞中的载体、主要用于复制DNA或RNA的载体，以及主要用于DNA或RNA的转录和/或翻译的表达的载体。所述载体还包括具有多种上述功能的载体。所述载体可以是当引入合适的宿主细胞时能够转录并翻译成多肽的多核苷酸。通常，通过培养包含所述载体的合适的宿主细胞，所述载体可以产生期望的表达产物。在本申请中，所述载体中可包含一种或多种所述核酸分子。此外，所述载体中还可包含其他基因，例如允许在适当的宿主细胞中和在适当的条件下选择该载体的标记基因。此外，所述载体还可包含允许编码区在适当宿主中正确表达的表达控制元件。这样的控制元件为本领域技术人员所熟知的，例如，可包括启动子、核糖体结合位点、增强子和调节基因转录或mRNA翻译的其他控制元件等。在某些实施方式中，所述表达控制序列为可调的元件。所述表达控制序列的具体结构可根据物种或细胞类型的功能而变化，但通常包含分别参与转录和翻译起始的5’非转录序列和5’及3’非翻译序列，例如TATA盒、加帽序列、CAAT序列等。例如，5’非转录表达控制序列可包含启动子区，启动子区可包含用于转录控制功能性连接核酸的启动子序列。本申请所述载体可选自质粒、逆转录病毒载体和慢病毒载体。

在本说明书中，术语“转化”通常是指细胞中遗传特性的改变，当细胞被修饰成含有新DNA或RNA时，所述细胞就被转化。例如，当通过经由转染、转导或其它技术引入新遗传物质来对细胞天然状态进行遗传修饰时，细胞被转化。在细菌中，“感受态”是指能够吸收DNA的状态。感受态细胞可通过本领域已知的实验室程序产生，例如在二价阳离子(例如CaCl₂)存在下冷却细胞，使细胞壁变得可透过质粒DNA；或者将细胞与质粒—起培育，并随后短暂热激，以使质粒进入细胞。另外，电穿孔也是使质粒进入细胞的另一种方式。

在本说明书中，MsfDH可以代指MsfDH基因本身，或MsfDH基因表达的蛋白质。所谓MsfDH基因包括天然状态下的MsfDH基因，也包括加工后用于表达MsfDH蛋白的mRNA或cDNA序列。具体指代的内容根据上下文的内容应当能够毫无疑义的确定。

附图说明

图1.显示MsfDH等蛋白的SDS-PAGE电泳图。

图2.显示表达MsfDH蛋白的工程菌的L-泛解酸/内酯氧化脱氢活性表征图。

图3显示对原料DL混合内酯进行提纯，并通过萃取液相色谱对L-泛解酸内酯纯度进行分析的结果。

图4显示表达三酶组合的工程菌的L-泛解酸内酯转化活性表征图。

具体实施方式

以下将通过具体的实施例对本发明进行进一步的阐述，但是需要说明的是，以下的实施例、比较例仅用于说明本发明的技术效果，对本发明并没有任何限定作用。

在没有特别说明的情况下，以下未说明的实验步骤均按照本领域技术人员应当理解的常规实验条件进行，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

本发明提供了一种来源于Skermania sp.ID1734的L-泛解酸内酯脱氢酶(MsfDH)、编码该L-泛解酸内酯脱氢酶的核酸分子、用于在宿主细胞中表达该L-泛解酸内酯脱氢酶的载体以及表达该酶的工程菌。本发明还进一步提供一种共表达所述L-泛解酸内酯脱氢酶以及选自以下组中的任意一种或多种的工程菌：酮基泛解酸内酯还原酶以及葡萄糖脱氢酶。本发明进一步提供一种D-泛解酸内酯的生产方法，其使用表达所述来源于Skermaniasp.ID1734的L-泛解酸内酯脱氢酶的工程菌。本发明提供的技术方案之一，是提供一种重组载体或重组载体组合，所述重组载体或重组载体组合包含表达所述L-泛解酸内酯脱氢酶的基因。本发明还提供了所述的L-泛解酸内酯脱氢酶、所述的核酸分子、所述的工程菌，所述的载体或载体组合在D-泛解酸内酯的合成中的应用或用途。在一个实施方式中所述L-泛解酸内酯脱氢酶在D-泛解酸内酯的合成中的应用可以是通过表达所述L-泛解酸内酯脱氢酶的工程菌而进行，也可以是通过分离了的所述L-泛解酸内酯脱氢酶的蛋白、所述蛋白的衍生物、所述蛋白的制剂(例如酶制剂)而进行。在本发明中，酶制剂是指酶经过提纯和/或加工后的具有催化功能的各种生物制品。

所述的一种L-泛解酸内酯脱氢酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。编码所述L-泛解酸内酯脱氢酶的核酸序列如SEQ ID NO:1所示。

进一步而言，本领域技术人员应当理解，当上述的氨基酸序列或核酸序列经过一个或几个残基的取代和/或缺失和/或添加而依然具有本发明所述的技术效果时，也在本申请所意图的保护范围之内。在本发明的一个实施方式中，提供一种重组载体或重组载体组合，所述重组载体或重组载体组合包含表达所述L-泛解酸内酯脱氢酶的核酸序列。所述重组载体或重组载体组合也可以任选包含表达酮基泛解酸内酯还原酶和/或葡萄糖脱氢酶的核酸序列。在一个实施方式中，表达所述L-泛解酸内酯脱氢酶的核酸序列和表达酮基泛解酸内酯还原酶和/或葡萄糖脱氢酶的核酸序列可以包含在一个重组载体中，也可以分别包含在多个重组载体中而作为一个重组载体组合。所述重组载体可以是能够在宿主细胞中正常表达的任意载体，从可以人为地控制基因表达的时间点,以有效的避免基因表达产物对宿主前期生长造成不利影响角度出发，优选重组载体是具有诱导表达型启动子的载体，优选重组载体是通过对选自以下载体中的任意一种进行编辑而得到的：pET28a、pCDFDuet1、pACYCDuet-1、pETDuet-1、pRSFDuet-1。更优选的，选取pET28a作为表达L-泛解酸内酯脱氢酶的重组载体，pCDFDuet1作为表达酮基泛解酸内酯还原酶和/或葡萄糖脱氢酶的重组载体。

在一种具体实施方式中，本发明提供了一种所述L-泛解酸内酯脱氢酶、编码所述L-泛解酸内酯脱氢酶的核酸分子、载体、载体组合以及表达所述L-泛解酸内酯脱氢酶的工程菌在D-泛解酸内酯的合成中的应用，具体而言，提供了一种所述L-泛解酸内酯脱氢酶、编码所述L-泛解酸内酯脱氢酶的核酸分子、载体、载体组合以及表达所述L-泛解酸内酯脱氢酶的工程菌用于催化L-泛解酸内酯生成酮基泛解酸内酯的应用。在一种更优选的具体实施方式中，本发明提供了一种所述L-泛解酸内酯脱氢酶、编码所述L-泛解酸内酯脱氢酶的核酸分子、载体、载体组合以及表达所述L-泛解酸内酯脱氢酶的工程菌在D-泛解酸内酯的生物合成中的应用。

在一种具体实施方式中，本发明还构建了一种用于D-泛解酸内酯合成的工程菌，所述工程菌表达所述L-泛解酸内酯脱氢酶，在一个实施方式中，所述L-泛解酸内酯脱氢酶是通过对宿主细胞进行人工加工而在宿主细胞中表达的。在一个优选的实施方式中，通过将包含所述L-泛解酸内酯脱氢酶在内的多酶体系同时表达在单个工程菌中，能够实现通过单一工程菌由L-泛解酸内酯直接生成手性纯的D-泛解酸内酯，步骤简洁。所述工程菌的宿主细胞无特别限制，例如可以使用本领域常用的原核细菌或真核细菌，例如大肠杆菌、枯草杆菌、酵母细胞或曲霉菌。从生产效率、成本以及合成生物学上的操作性的角度出发所述工程菌的宿主细胞优选为大肠杆菌，更优选为大肠杆菌BL21(DE3)。

具体而言，为降低大规模工业化生产中使用NADPH的成本，本发明构建的单一工程菌多酶级联催化体系进一步包含葡萄糖脱氢酶用于辅酶再生。在一个优选的实施方式中，所述的单一工程菌多酶级联催化体系包含：所述L-泛解酸内酯脱氢酶、酮基泛解酸内酯还原酶与葡萄糖脱氢酶。表达所述多酶级联催化体系的单一工程菌催化生成D-泛解酸内酯的具体方法可以为：将表达所述L-泛解酸内酯脱氢酶(MsfDH)；以及酮基泛解酸内酯还原酶和/或葡萄糖脱氢酶的工程菌进行诱导培养，诱导温度在22-28℃，优选25℃。诱导20h后，收集湿菌体作为催化剂。接下来，将诱导表达后的湿菌体(工程菌)以L-泛解酸内酯为底物，任选葡萄糖作为辅酶循环的底物，例如在50mM pH 8.0Tris buffer的缓冲溶液中进行反应，反应条件可以为25-35℃、200-350rpm，从使用以大肠杆菌为宿主细胞所构建的本发明的工程菌的角度出发，反应条件优选为30℃、200rpm。

在所述例示的反应体系中，L-泛解酸内酯的投料量可以为10-65g/L，在使用以大肠杆菌为宿主细胞所构建的本发明的工程菌的角度出发，优选为40-65g/L，葡萄糖的终浓度为10-100g/L，在使用以大肠杆菌为宿主细胞所构建的本发明的工程菌的角度出发，优选为16-100g/L，更优选为40g/L，NADP⁺的终浓度为5-20g/L，从使用以大肠杆菌为宿主细胞所构建的本发明的工程菌的角度出发，优选为10g/L，表达有L-泛解酸内酯脱氢酶(MsfDH)、酮基泛解酸内酯还原酶、葡萄糖脱氢酶和/或分子伴侣的湿菌体终浓度为5-40g/L，优选为10g/L。只要能够在工程菌中正常表达并发挥活性，所述酮基泛解酸内酯还原酶、葡萄糖脱氢酶可以来源于任何物种，在使用以大肠杆菌为宿主细胞所构建的本发明的工程菌的角度出发，所述酮基泛解酸内酯还原酶的核酸序列优选来源于光滑假丝酵母Candida glabata，所述葡萄糖脱氢酶优选来源于巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium IWG3。在一个优选的实施方式中，所述来源于Bacillus megaterium IWG3葡萄糖脱氢酶的核酸序列如SEQ ID NO:5所示。所述来源于Candida glabata的酮基泛解酸内酯还原酶的核酸序列如SEQ ID NO:3所示。

实施例1：L-泛解酸内酯脱氢酶的筛选及活性表征

1.1通过文献调研以及BRENDA数据库提供的酶学信息，进行多序列比对及生信分析。从Uniprot、NCBI等数据库挖掘了6条候选基因序列，并将来源于专利(CN110423717B)的AmHao序列作为阳性对照，基因简称如表1所示，由Genscript公司经密码子优化后合成至pET28a载体上，序列如附件所示。

将以上带有候选基因、阳性对照基因的pET-28a质粒、阴性对照的空pET-28a质粒转化至BL21宿主中，37℃过夜培养，挑选3-4个单菌落进行PCR验证，将PCR验证正确的单菌落接种至5ml含50mg/mL(下同)的卡那霉素LB液体种子培养基中，37℃，200rpm培养过夜；接种2％的种子液至50ml带有卡那霉素的LB液体培养基中，培养OD₆₀₀至0.6-0.8，添加终浓度0.1mM IPTG(异丙基硫代半乳糖苷,Isopropylβ-D-Thiogalactoside，下同)，25℃，200rpm诱导20h。8000rpm,4℃离心10min，弃上清；添加适量10mL buffer重悬清洗两遍，8000rpm,4℃离心10min，弃上清，取部分沉淀重悬、破碎，其余湿菌体保藏备用。破碎后的菌液离心，取上清进行SDS-PAGE验证，结果如图1所示。

1.2不同基因来源的L-泛解酸内酯氧化脱氢酶活性表征：

反应条件：50mM pH 8.0Tris buffer，10g/L的DL-泛解酸内酯混合物原料(各组分含量如表1中的Control所示),10g/L的上述不同基因来源的备用湿菌体，以不加菌体的反应作为对照，30℃200rpm反应20h。反应完成后8000rpm,离心10min，取上清，检测D,L-泛解酸及其内酯的含量面积百分比，结果如表1所示；

色谱检测条件：

色谱柱：Daicel CHIRALPAK IG；4.6mm×250mm×5μm

流动相A：0.1％甲酸水溶液

流动相B：甲醇

流速：0.5mL/minute

检测波长：214nm

柱温：30℃

进样量：1uL

运行时间：20min

洗脱梯度：A:B＝60:40，等梯度洗脱

结果计算公式：

ee％＝(A_D-A_L)/(A_D+A_L)

式中：

ee％:D-泛解酸内酯对映体过量值(enantiomeric excess)，下同

A_D：D-泛酸内酯峰面积百分比，％；

A_L：L-泛酸内酯峰面积百分比，％。

表1.不同基因来源的L-泛解酸内酯氧化脱氢酶活性比较

来源基因	D-acid％	L-acid％	D-lactone％	L-lactone％
					Control	8.04％	8.07％	41.70％	42.20％
HMD	7.53％	6.72％	43.43％	42.32％
					SLD	6.96％	7.48％	42.34％	43.22％
AmHao	2.34％	4.37％	65.21％	28.08％
					MsfDH	9.77％	2.51％	68.69％	23.04％
PmLLDH	5.59％	4.86％	49.33％	40.23％
					SpoLao	6.76％	5.27％	46.68％	41.28％
RanHao-1	5.60％	5.16％	45.94％	43.31％

所筛选的基因的活性数据如表1所示，与阴性对照Control相比，只有AmHao和MsfDH反应液中L-泛解酸和L-泛解酸内酯明显减少。再对比Amhao和MsfDH的泛解酸氧化数据，发现MsfDH比AmHao在氧化L-泛解酸底物更具有特异性。

图2为MsfDH反应液的液相色谱图，与空白对照(Con)相比，可以看到L-泛解酸内酯占比显著减少，L-泛解酸也有较明显的降低，而D-泛解酸内酯及D-泛解酸占比几乎无变化，说明MsfDH属于L型特异性的脱氢氧化酶，其对L型泛解酸及L泛解酸内酯均有氧化脱氢作用。由于工厂来源的原料通常不是单一纯净物，不仅含有DL混合内酯，还含有部分DL混合酸，当含有相对较多L酸情形下，这种针对L-内酯和L-酸的L型特异性对原料的高转化率及获得D型产品最终高纯度就尤为重要。

实施例2：多酶共表达工程菌的搭建及L-泛解酸内酯转化为D-泛解酸内酯的活性表征

2.1为了进一步评价表达该MsfDH的工程菌转化L-泛解酸内酯的能力，需要获得相对纯度较高的L-泛解酸内酯作为原料。本发明人利用乙酸乙酯对来源于广安摩珈生物科技有限公司的DL内酯混合物中的L-泛解酸内酯进行了简单的萃取提纯，并通过液相色谱分析法对L-泛解酸内酯的纯度进行了分析。

萃取液相结果如图3所示，L-泛解酸内酯的ee(对映体过量值(enantiomericexcess))为93.27％，已成为绝对主要组份，可视为较纯的L-泛解酸内酯物料，用于评估工程菌对其的转化活性。

2.2酶催化L-泛解酸内酯一步形成D-泛解酸内酯需要泛解酸内酯脱氢氧化酶、酮基泛解酸内酯还原酶以及NADP/NADPH协同作用，基于此，有必要搭建一个多酶协同体系来实现该方案，搭建过程如下：

根据Candida glabata来源(GenBank ID:CAG61069.1)的酮基泛解酸内酯还原酶基因CgCPR和Bacillus megaterium IWG3来源(WP_028407571)的葡萄糖脱氢酶编码基因BmGDH，经过密码子优化后，设计了编码Candida glabata来源(GenBank ID:CAG61069.1)的酮基泛解酸内酯还原酶的核酸序列(序列如附件所示)以及编码Bacillus megateriumIWG3来源(WP_028407571)的葡萄糖脱氢酶的核酸序列(序列如附件所示)，并由Genscript公司将它们合成至指定pCDFDuet-1载体上。

将pCDFDuet-1-CgCPR-BmGDH质粒与pET-28a-MsfDH质粒一同共转化至E.coliBL21(DE3)宿主细胞中，挑单菌落接种至5ml含50mg/mL(下同)的链霉素和卡那霉素的双抗LB液体种子培养基中，在37℃，200rpm培养过夜；接种2％的种子液至50mL LB液体培养基中，培养至OD₆₀₀至0.6-0.8，添加终浓度0.1mM IPTG，在25℃，200rpm诱导20h。菌液8000rpm,4℃下离心10min，弃上清，用缓冲液清洗两次，再同上离心弃上清，获得湿菌体，-80℃保藏备用。

2.3对获得的多酶共表达工程菌的活性进行表征

反应条件：50mM pH 8.0Tris buffer，40g/L的萃取后的L-泛解酸内酯(ee值93.27％),40g/L的葡萄糖，10g/L的E.coli BL21(DE3)pET28a-MsfDH/pCDFDuet-1-CgCPR-BmGDH的湿菌体，10g/LNADP⁺,30℃200rpm反应20h。反应完成后8000rpm，离心10min，取上清，检测D,L-泛解酸内酯的含量面积百分比，结果如图4所示。根据图4所示结果表明，D-泛解酸内酯明显增多，L-泛解酸内酯明显变少，几乎消耗殆尽，说明搭建的MsfDH/CgCPR-BmGDH多酶反应体系，可成功地将L-泛解酸内酯一步转化成D-泛解酸内酯，转化率可达99％。

序列表

以下将记载本发明中使用的主要序列：

MsfDH核酸序列(SEQ ID NO:1)

ATGGCAAAAAATGCTTGGTTTGAATCAGTAGCGGAAGCACAGCGTCGTGCTAAGAAACGCCTCCCGAAATCCGTTTATGGCGCCCTGATAGCGGGCTCCGAGCGCGGTACGACCCTGGACGACAACACCGGTGCATTTGCCGAGTTGGGCTTCGCGCCGCACGTGGCAGGCCTGTCTGCGAAGCGCGAACTGGCGACGACTGTATTAGGACAAAACATTTCTATGCCGGTTCTGATTAGCCCGACTGGTGTGCAAGCGGTGCACCCGGATGGTGAGGTGGCGGTGGCCCGTGCCGCTGCCGCGCGCGGTGTTGCCATGGGTCTGAGCAGCTTCGCTAGCAAACCGGTTGAAGAGGTTATCGCAGCCAACCCGCAGACCTTCTACCAGATTTATTGGCTGGGTGATCGTGATAGCATTACCAAACGTCTTGAGCGGGCGCGTGCTGCGGGTGCCGTTGGTATCATCCTGACCCTGGACTGGAGCTTTAGCCATGGTCGTGATTGGGGTTCCCCGGTGATCCCGGAACGTATGAATCTGCGCACCATGGTTCAGTTCGCACCGGAAGCGATTACCCGTCCACGTTGGGCAGCGCAATTCGCCAAGGCCAGATCCATCCCGGACCTGACCGCACCGAATTTAGTGGAGCCGGGTGAGCAGGCTCCAACGTTCTTTGGTGCGTACGGCCAATGGATGGCAACCCCGCCTCCGAGCTGGGATGACGTGGCATGGGTCTGCAGCCAGTGGGATGGCCCTGTCATGCTGAAAGGTGTTATGCGTTTGGACGACGCAAAGCGCGCAGTCGATGCTGGCGTTTCTGCAATCTCAGTTAGCAATCATGGCGGAAACAACCTAGACGGCACCCCGGCATCCATTCGTGCGCTTCCGGCGGTGGCGAAGGCGGTGGGTAACGATATTGAAGTTTTGCTGGACGGTGGCATTCGCCGTGGCTCGGATGTTGTTAAAGCCGTGGCGCTGGGTGCGCGTGCGGTGATGATCGGTAGAGCGTACCTGTGGGGCTTGGCTGCGAATGGCCAAGCTGGCGTCGAGAACGTGTTGGATATCCTGCGTGGTGGCATCGACAGCGCCCTGCTGGGCCTGGGTCACAGCAGTGTCGCGGATCTGAGCCCGGCGGACGTATTGGTTCCGTCTGGTTTTGAACGTGTTCTGGGCGCGTAACTCGAG

MsfDH氨基酸序列(SEQ ID NO:2)

MAKNAWFESVAEAQRRAKKRLPKSVYGALIAGSERGTTLDDNTGAFAELGFAPHVAGLSAKRELATTVLGQNISMPVLISPTGVQAVHPDGEVAVARAAAARGVAMGLSSFASKPVEEVIAANPQTFYQIYWLGDRDSITKRLERARAAGAVGIILTLDWSFSHGRDWGSPVIPERMNLRTMVQFAPEAITRPRWAAQFAKARSIPDLTAPNLVEPGEQAPTFFGAYGQWMATPPPSWDDVAWVCSQWDGPVMLKGVMRLDDAKRAVDAGVSAISVSNHGGNNLDGTPASIRALPAVAKAVGNDIEVLLDGGIRRGSDVVKAVALGARAVMIGRAYLWGLAANGQAGVENVLDILRGGIDSALLGLGHSSVADLSPADVLVPSGFERVLGA

AmHao核酸序列

ATGTCAAATGGATGGTTTGAAACAGTAGCTGAGGCACAACGCCGTGCGCGCAAGCGCCTGCCGAAGTCCGTGTACGGTGCATTGGTCGCTGGCTCTGAACGCGGCATCACTGTTGACGACAATATTGCGGCGTTTGCGGAACTGGGTTTTGCGCCTCATGTGGCGGGTCTTTCCGATAAACGTGAGCTGGGTACGACCGTTATGGGCCAACCGATTAGCCTGCCGGTTGTCATCTCTCCGACCGGTGTCCAAGCGGTGCACCCGGATGGTGAGGTTGCCGTGGCGCGTGCGGCAGCGGCGCGTGGAACCGCTATGGGTTTAAGCAGCTTCGCTAGCAAAAGTATTGAAGAAGTGGCGGCGGCCAACCCGCAGACCTTTTTCCAGATGTATTGGGTTGGGAGCCGTGATGTTCTGGTGCAGCGTATGGAGAGAGCTCGGGCGGCTGGCGCGGTCGGTTTAATCATGACCCTGGATTGGTCGTTCAGCACCGGCCGCGATTGGGGCTCACCGGTTATTCCGGAAAAACTGGACCTGAAAGCTATGGCACGTTTCGCGCCGGAAGGTATTACCCGTCCGAAGTGGCTGTGGGACTTCGCAAAGACCCGCAAGCTCCCGGATTTGACGACCCCAAATTTGACCCCGCCAGGTGGTACTGCCCCGACGTTCTTTGGTGCGTACGGCGAGTGGATGCAAACCCCGCTGCCTACGTGGGAAGACGTAGCATGGTTGCGTGAGCAGTGGGGCGGTCCGTTTATGCTGAAGGGTGTGATGCGTGTTGACGACGCTAAGCGCGCGGTCGACGCCGGTGTAACTGCCATCTCCGTTAGCAATCATGGTGGAAACAACCTGGACGGCACCCCGGCACCGATTCGCGCGCTTCCGGCGATCGCTGATGCGGTCGGCGGCGATGTGGAAGTGCTGCTGGACGGCGGCATCCGTCGTGGGTCCGACGTGGTTAAAGCGATCGCTCTCGGCGCAAAAGCTGTTCTGATTGGTCGTGCGTATCTGTGGGGTCTGGCAGCCAACGGTCAGGCAGGCGTGGAGAACGTTCTGGACATCCTGCGCGGCGGCATCGATAGCGCAGTGTTGGGTTTGGGCAAAACCAGCATTCACGAGTTGACGCGTGATGATGTGGTGATCCCGCCGGGTTTCGAGCGTGCGCTGGGTGTTCCGAAATCGTAACTCGAG

AmHao氨基酸序列

MSNGWFETVAEAQRRARKRLPKSVYGALVAGSERGITVDDNIAAFAELGFAPHVAGLSDKRELGTTVMGQPISLPVVISPTGVQAVHPDGEVAVARAAAARGTAMGLSSFASKSIEEVAAANPQTFFQMYWVGSRDVLVQRMERARAAGAVGLIMTLDWSFSTGRDWGSPVIPEKLDLKAMARFAPEGITRPKWLWDFAKTRKLPDLTTPNLTPPGGTAPTFFGAYGEWMQTPLPTWEDVAWLREQWGGPFMLKGVMRVDDAKRAVDAGVTAISVSNHGGNNLDGTPAPIRALPAIADAVGGDVEVLLDGGIRRGSDVVKAIALGAKAVLIGRAYLWGLAANGQAGVENVLDILRGGIDS AVLGLGKTSIHELTRDDVVIPPGFERALGVPKS

HMD核酸序列

ATGCACATAGAGAGGCTAGCTGTAGATGAATCCGTGGGCCGCGCAATGCCACCACAACGTTTCATCGAGGCGCTGAGCGATCTCGGGGTGCCGGTGGAGTTCGCTGGCGAGGACGAGCAGTTTGGTCCGGGTGACGCGGTTGCGAGCTTCGGTCATCGTGACGCGTTTCTGGATGCGGATTGGGTTCACTGCATTCGTGCAGGTTACGACGAATTCCCGGTTGGCGTCTACGAGGAAGCGGGCACGTACCTGACCAACAGCACCGGTATTCATGGTACAACCGTTGGTGAGACGGTGGCGGGCTATATGCTGACCTTCGCCCGCCGCCTGCACGCATATCGTGATGCACAGCACGATCACGCGTGGGATTTACCGCGTTATGAAGAGCCGTTTACCCTGGCGGGCGAGCGCGTCTGTGTTGTCGGCCTGGGTACGTTGGGACGTGGTGTGGTGGATCGTGCCGCTGCGTTGGGCATGGAAGTTGTAGGCGTTCGTCGTTCCGGTGACCCGGTTGACAACGTGTCGACCGTGTACACCCCGGATCGTCTGCACGAGGCGATTGCGGATGCTCGCTTCGTGGTGCTGGCAACCCCTTTGACCGATGAGACTGAAGGTATGGTTGCCGCACCGGAGTTCGAGACTATGCGTGAGGACGCTAGCCTGGTTAATGTTGCGAGAGGTCCGGTGGTGGTGGAATCTGATCTGGTAGCCGCTTTGGACTCCGGCGACATCGCCGGCGCTGCGTTGGACGTCTTTAGCGAAGAACCGCTGCCGGAAGACTCTCCGCTTTGGGATTTTGAAGACGTGCTGATCACCCCGCATGTTAGCGCGGCTACCAGCAAGTACCATGAAGATGTGGCCGCGCTTATCCGCGAAAATATTGAAAAAATCGCGACCGGTGACGAGCTGACGAACCGTGTTGTT

HMD氨基酸序列

MHIERLAVDESVGRAMPPQRFIEALSDLGVPVEFAGEDEQFGPGDAVASFGHRDAFLDADWVHCIRAGYDEFPVGVYEEAGTYLTNSTGIHGTTVGETVAGYMLTFARRLHAYRDAQHDHAWDLPRYEEPFTLAGERVCVVGLGTLGRGVVDRAAALGMEVVGVRRSGDPVDNVSTVYTPDRLHEAIADARFVVLATPLTDETEGMVAAPEFETMREDASLVNVARGPVVVESDLVAALDSGDIAGAALDVFSEEPLPEDSPLWDFEDVLITPHVSAATSKYHEDVAALIRENIEKIATGDELTNRVV

SLD核酸序列

ATGGCAGAACTATTTTATGACGCTGATGCGGACCTGTCTATCATTCAGGGCCGTAAAGTTGCTGTGATCGGATACGGTAGCCAGGGCCACGCGCACGCGCTGTCTCTGCGTGATAGCGGTGTGGACGTGCGTGTTGGTCTGCATGAAGGCTCGAAGTCCAAAGCCAAGGCTGAGGAACAAGGTCTGAGAGTTGTTCCGGTAGCGGAGGCTGCCGCGGAGGCGGATGTCATCATGGTGTTGATCCCGGATCCGATTCAAGGCGACGTTTACGAGAAAGATATCAAAGACAACCTGAAGGACGGCGACGCGCTTTTCTTCGGTCACGGCTTGAACATCCGCTACGGCTTCGTGAAGCCACCGGCAGGTGTTGATGTGTGCATGGTCGCTCCGAAAGGTCCGGGTCACCTGGTACGCCGTCAGTATGAGGAGGGCCGTGGTGTCCCGTGTTTAGTGGCAGTTGAACAAGATGCCACCGGTAATGCATTTGCACTGGCGTTGTCCTATGCAAAGGGCATTGGCGGCACCCGTGCCGGCGTTATCCGCACCACATTTACCGAAGAGACTGAGACGGACTTGTTTGGCGAACAGGCAGTGCTGGCTGGTGGCGTCACCGCGCTGGTGAAAGCGGGTTTCGAAACGCTGACCGAAGCTGGTTATCAGCCGGAAATCGCGTATTTCGAGTGCCTGCACGAATTGAAGCTGATTGTTGACCTGATGTACGAGGGCGGTTTGGAGAAAATGCGTTGGAGCATCAGCGAAACGGCTGAGTGGGGTGACTATGTTACCGGTCCGCGTATTATTACCGACGCGACCAAAGCGGAGATGCGTAAGGTGCTGGCAGAGATTCAAGATGGTACGTTTGCGAAGAACTGGATGGATGAGTACCATGGTGGTCTTAAGAAGTACAATGAATACAAAAAACAGGACAGCGAACATTTGCTGGAAACCACCGGCAAAGAACTCCGCAAGCTGATGAGCTGGGTTGATGAAGAGGCG

SLD氨基酸序列

MAELFYDADADLSIIQGRKVAVIGYGSQGHAHALSLRDSGVDVRVGLHEGSKSKAKAEEQGLRVVPVAEAAAEADVIMVLIPDPIQGDVYEKDIKDNLKDGDALFFGHGLNIRYGFVKPPAGVDVCMVAPKGPGHLVRRQYEEGRGVPCLVAVEQDATGNAFALALSYAKGIGGTRAGVIRTTFTEETETDLFGEQAVLAGGVTALVKAGFETLTEAGYQPEIAYFECLHELKLIVDLMYEGGLEKMRWSISETAEWGDYVTGPRIITDATKAEMRKVLAEIQDGTFAKNWMDEYHGGLKKYNEYKKQDSEHLLETTGKELRKLMSWVDEEA

PmLLDH核酸序列ATGTCAAATGGATGGTTTGAAACAGTAGCTGAGGCACAGCGCCGTGCCAAGAGACGTTTGCCACGTAGCGTGTATGGCGCGCTTGTTGCGGGCTCGGAACGTGGCCAAACGATCGAGGATAATATGGGTGCGTTTGCTGAGCTCGGCTTCGCCCCACATGTTGCTGGCCTGAGCGATCAGAGAGACTTAGCGACCACCGTTATGGGTCAGCCGGTAAGCATGCCGGTGCTTATCTCTCCGACGGGTGTTCAAGCAGTTCACCCGGAGGGCGAAGTCGCAGTGGCGCGTGCAGCGGCTGCGCGTGGCGTTGCAATGGGCTTGTCCAGCTTCGCGAGCAAAAGCGTCGAAGAAGTTGCGGCCGCGAACCCGCAGACCTTTTTCCAGATGTATTGGGTTGGTAGCCGTGATGTGCTGGTGCAACGCATGGAACGTGCAAAGGCCGCTGGCGCTGTTGGTTTGATCATGACCCTGGACTGGTCGTTCAGCAACGGTCGCGACTGGGGTAGCCCGAATATTCCGGAAAAAATGGACTTCAAAACCATGGTTAAGTTCGCTCCGGAGGGTGTGACGCGTCCGAAATGGCTGTGGGATTTTGCGAAGACCCGTCGCCTGCCGGATCTGACCACTCCGAACCTGACCCCGCCGGGTGGCACCGCACCGACTTTCTTTGGTGCGTACGGCGAGTGGATCCAAACCCCGCTGCCAACGTGGGATGACGTTGCGTGGCTCCGTCAACAATGGGACGGTCCGTTTATGCTGAAAGGTGTTACCCGTGTGGACGACGCCAAGCGCGCGGTGGATGCGGGCGTGTCTGCGATTTCTGTGTCCAACCATGGTGGAAACAACTTGGACGGCACCCCGGCGACCATCCGTGCCCTGCCGCCCATCGCGGATGCGGTCGGTGAGCAGATTGAGGTCTTGCTGGACGGCGGTGTGCGTCGCGGTTCCGACGTGGTCAAAGCGTTAGCGCTGGGTGCTAAGGCAGTTATGATTGGCCGTGCTTACCTGTGGGGTCTGGCGGCGAATGGTCAGGCAGGCGTCGAAAATGTTTTGGATATCCTGCGCGGCGGCATTGACAGCGCTGTGCTGGGTTTGGGCCTGACATCAGTGCACGATATCAGTCGCGGGGATGTTGTTATTCCGCCTGGTTTTATCCGGGAACTGGGTGTACACGAAGCCGCGGAGCTC

PmLLDH氨基酸序列

MSNGWFETVAEAQRRAKRRLPRSVYGALVAGSERGQTIEDNMGAFAELGFAPHVAGLSDQRDLATTVMGQPVSMPVLISPTGVQAVHPEGEVAVARAAAARGVAMGLSSFASKSVEEVAAANPQTFFQMYWVGSRDVLVQRMERAKAAGAVGLIMTLDWSFSNGRDWGSPNIPEKMDFKTMVKFAPEGVTRPKWLWDFAKTRRLPDLTTPNLTPPGGTAPTFFGAYGEWIQTPLPTWDDVAWLRQQWDGPFMLKGVTRVDDAKRAVDAGVSAISVSNHGGNNLDGTPATIRALPPIADAVGEQIEVLLDGGVRRGSDVVKALALGAKAVMIGRAYLWGLAANGQAGVENVLDILRGGIDSAVLGLGLTSVHDISRGDVVIPPGFIRELGVHEAAEL

SpoLao核酸序列

ATGGAAATAACAAACGTAAATGAATATGAGGCGATCGCGAAACAGAAGCTGCCGAAAATGGTTTACGACTACTACGCAAGCGGTGCAGAGGACCAGTGGACCCTCGCTGAGAACCGTAACGCCTTTTCCCGTATTTTGTTTCGTCCAAGAATCCTGATTGACGTGACCAATATTGACATGACCACTACGATCCTTGGCTTCAAGATCAGCATGCCGATTATGATTGCTCCGACAGCTATGCAGAAAATGGCACACCCGGAAGGTGAATATGCGACCGCACGCGCAGCGTCCGCCGCGGGCACCATAATGACCTTGTCCAGCTGGGCGACCAGCAGCGTTGAAGAGGTCGCGTCGACCGGTCCGGGTATCCGTTTTTTCCAGCTGTATGTTTACAAAGACCGCAACGTGGTTGCGCAACTGGTTCGTAGAGCGGAGCGCGCGGGCTTTAAGGCGATTGCGTTGACCGTTGATACCCCGCGTCTGGGTCGTCGTGAAGCAGACATCAAAAACCGCTTCGTGCTGCCTCCGTTTTTGACTCTGAAGAACTTTGAAGGCATCGACCTGGGCAAAATGGATAAAGCCAATGATAGCGGTCTGTCTAGCTATGTCGCAGGCCAAATCGATCGTTCGTTGTCTTGGAAAGACGTGGCGTGGCTGCAAACCATCACCTCTTTGCCGATTCTAGTGAAGGGTGTCATCACGGCCGAGGATGCTCGTCTGGCTGTTCAGCATGGTGCGGCGGGTATCATTGTGAGCAATCATGGTGCGCGCCAGCTGGACTACGTTCCGGCAACGATCATGGCACTGGAAGAAGTTGTTAAGGCCGCCCAAGGTCGCATCCCGGTGTTCCTGGACGGCGGTGTACGCCGCGGTACGGATGTGTTCAAGGCGCTTGCGCTGGGCGCGGCGGGCGTGTTCATTGGTCGTCCGGTTGTCTTCTCTCTGGCTGCGGAGGGCGAGGCCGGTGTGAAGAAGGTGCTGCAAATGATGCGTGATGAATTCGAGCTGACCATGGCTTTGTCCGGGTGCCGTAGCCTGAAAGAAATTAGCCGTAGTCACATTGCTGCGGATTGGGATGGCCCAAGCTCACGCGCGGTGGCCCGTCTG

SpoLao氨基酸序列

MEITNVNEYEAIAKQKLPKMVYDYYASGAEDQWTLAENRNAFSRILFRPRILIDVTNIDMTTTILGFKISMPIMIAPTAMQKMAHPEGEYATARAASAAGTIMTLSSWATSSVEEVASTGPGIRFFQLYVYKDRNVVAQLVRRAERAGFKAIALTVDTPRLGRREADIKNRFVLPPFLTLKNFEGIDLGKMDKANDSGLSSYVAGQIDRSLSWKDVAWLQTITSLPILVKGVITAEDARLAVQHGAAGIIVSNHGARQLDYVPATIMALEEVVKAAQGRIPVFLDGGVRRGTDVFKALALGAAGVFIGRPVVFSLAAEGEAGVKKVLQMMRDEFELTMALSGCRSLKEISRSHIAADWDGPSSRAVARL

RanHao-1核酸序列

ATGCCCCTAGTATGTTTAGCTGATTTTAAAGCGCATGCACAAAAACAACTGAGCAAAACCAGCTGGGACTTCATCGAGGGTGAGGCGGATGATGGCATCACGTACAGCGAAAACATCGCGGCGTTTAAGCGCATTCGTCTGCGTCCGCGTTATCTGAGAGACATGAGCAAGGTGGATACCCGCACCACCATCCAGGGTCAAGAAATCAGCGCGCCTATTTGTATTTCGCCGACGGCCTTCCACTCAATTGCATGGCCAGACGGCGAAAAGTCCACCGCACGTGCCGCGCAAGAAGCGAACATCTGCTACGTCATCTCCAGCTACGCATCCTACTCCCTGGAAGACATCGTCGCTGCCGCTCCGGAAGGTTTTCGTTGGTTCCAGCTGTATATGAAGTCTGATTGGGATTTCAACAAACAGATGGTTCAGCGTGCTGAGGCGTTGGGCTTTAAAGCGTTGGTTATTACCATCGACACCCCGGTTCTGGGTAATCGTCGCCGTGACAAACGTAACCAGTTGAATCTGGAAGCCAACATTCTGCTGAAGGACCTCCGCGCGCTTAAGGAGGAAAAACCGACCCAGAGCGTTCCGGTTTCGTTCCCGAAAGCGAGCTTCTGCTGGAATGATCTGAGCCTGCTGCAGTCTATCACTCGCCTTCCGATCATTCTCAAGGGCATCCTAACGAAAGAGGACGCGGAGCTGGCTATGAAGCACAACGTGCAAGGTATCGTGGTGAGCAATCATGGTGGTCGTCAGCTGGACGAGGTATCTGCAAGTATTGACGCTTTGAGAGAAGTTGTTGCTGCGGTTAAAGGTAAAATCGAAGTGTATATGGATGGTGGCGTGCGTACCGGTACAGATGTTTTGAAGGCGTTAGCCCTGGGCGCACGCTGCATTTTTCTGGGCCGCCCGATCTTGTGGGGTTTGGCGTGTAAAGGCGAGGATGGCGTGAAGGAGGTCCTGGATATTCTGACCGCGGAGTTACACAGGTGCATGACTCTGTCTGGGTGCCAGTCCGTGGCTGAGATTTCCCCGGACCTGATTCAATTTAGCCGTCTG

RanHao-1氨基酸序列

MPLVCLADFKAHAQKQLSKTSWDFIEGEADDGITYSENIAAFKRIRLRPRYLRDMSKVDTRTTIQGQEISAPICISPTAFHSIAWPDGEKSTARAAQEANICYVISSYASYSLEDIVAAAPEGFRWFQLYMKSDWDFNKQMVQRAEALGFKALVITIDTPVLGNRRRDKRNQLNLEANILLKDLRALKEEKPTQSVPVSFPKASFCWNDLSLLQSITRLPIILKGILTKEDAELAMKHNVQGIVVSNHGGRQLDEVSASIDALREVVAAVKGKIEVYMDGGVRTGTDVLKALALGARCIFLGRPILWGLACKGEDGVKEVLDILTAELHRCMTLSGCQSVAEISPDLIQFSRL

CgCPR核酸序列(SEQ ID NO:3)

ATGGTGAAACAAGAATTTTTTAAACTGAACAACGGCCATGAAATGCCGGGCGTGGCGATTGTGGGCACCGGCACCAAATGGCATAAAGTGAACGAAACCGATGAAAACTTTAGTCAGACCCTGGTGGATCAGCTGAAATATGCGCTGAGCCTGCCGGGCGTGGTGCATCTGGATGCGGCGGAATTTTATATGACCTATCGCGAAGTGGGCCGCGCGCTGGCGGAAACGAGCAAACCGCGCGATGAAATTTTTATTACCGATAAATATTGGACCCTGAGCAAAGTGACCGAGAACCCGATTGTGGGCCTGGAAACCGGCCTGAAACGCCTGGGCCTGGAATATGTGGATCTGTATCTGCTGCATAGCCCGTTTATTAGCAAAGAAACCAACGGCTTTAGCCTGGAAGAAGCGTGGGGCATGATGGAAGAACTGTATCATAGCGGCAAAGCGAAAAACATTGGCGTGAGCAACTTTGCGAAAGAAGATCTGGAACGCGTGCTGAAAGTGTGCAAAGTGAAACCGCAAGTGAATCAGATTGAATTTAACGCGTTTCTGCAGAATCAGACCCCGGGCATTTATAACTTTTGCAAACAGAACGATATTCAGCTGGCGGCGTATAGCCCGCTGGGCCCGCTGCAGAAAAAACCGGCGGATGGCAACAGTCAGCCGTTTTATAGCTATATTAACAAACTGGCGCAGCATTATAACAAAACCCCGGGCCAAGTGCTGCTGCGCTGGGTGACCAAACGCGGCGTGGTGGCGGTGACCACGAGCGAAAAAAAAGAACGCATTAAACAAGCGCAAGAAATTTTTGAATTTGATCTGAAAGATGATGAAGTGACCGAAATCACGAAACTGGGCCTGGATCATGAACCGCTGCGCCTGTATTGGCATGATCAGTATAACAAATATAACAGCGAAAGTCAGAAAGCGTAA

CgCPR氨基酸序列(SEQ ID NO:4)

MVKQEFFKLNNGHEMPGVAIVGTGTKWHKVNETDENFSQTLVDQLKYALSLPGVVHLDAAEFYMTYREVGRALAETSKPRDEIFITDKYWTLSKVTENPIVGLETGLKRLGLEYVDLYLLHSPFISKETNGFSLEEAWGMMEELYHSGKAKNIGVSNFAKEDLERVLKVCKVKPQVNQIEFNAFLQNQTPGIYNFCKQNDIQLAAYSPLGPLQKKPADGNSQPFYSYINKLAQHYNKTPGQVLLRWVTKRGVVAVTTSEKKERIKQAQEIFEFDLKDDEVTEITKLGLDHEPLRLYWHDQYNKYNSESQKA

BmGDH核酸序列(SEQ ID NO:5)

ATGTATAAAGATCTGGAAGGCAAAGTGGTTGTGATTACCGGCAGCAGCACCGGCCTGGGCAAAAGCATGGCGATTCGCTTTGCGACCGAAAAAGCGAAAGTTGTGGTTAATTATCGCAGCAAAGAAGATGAAGCGAACAGCGTGCTGGAAGAAATTAAAAAAGTGGGCGGCGAAGCGATTGCGGTGAAAGGCGATGTGACCGTGGAAAGCGATATTATTAACCTGGTGCAGAGCGCGATTAAAGAATTTGGCAAACTGGATGTGATGATTAACAACGCGGGCCTGGAAAACCCGGTGCCGAGCCATGAAATGAGCCTGAGCGATTGGAACAAAGTGATTGATACCAACCTGACCGGCGCGTTTCTGGGCAGCCGCGAAGCGATTAAATATTTTGTGGAAAACGATATTCGCGGCACCGTGATTAACATGAGCAGCGTGCATGAAAAAATTCCGTGGCCGCTGTTTGTGCATTATGCGGCGAGCAAAGGCGGCATGCGCCTGATGACCAAAACCCTGGCGCTGGAATATGCGCCGAAAGGCATTCGCGTGAACAACATTGGCCCGGGCGCGATTAACACCCCGATTAACGCGGAAAAATTTGCCGATCCGGAACAGCGCGCGGATGTGGAAAGCATGATTCCGATGGGCTATATTGGCGAACCGGAAGAAATTGCGGCGGTGGCGGCGTGGCTGGCGAGCAGCGAAGCGAGCTATGTGACCGGCATTACCCTGTTTGCGGATGGCGGCATGACCCTGTATCCGAGCTTTCAAGCGGGCCGCGGCTAA

BmGDH氨基酸序列(SEQ ID NO:6)

MYKDLEGKVVVITGSSTGLGKSMAIRFATEKAKVVVNYRSKEDEANSVLEEIKKVGGEAIAVKGDVTVESDIINLVQSAIKEFGKLDVMINNAGLENPVPSHEMSLSDWNKVIDTNLTGAFLGSREAIKYFVENDIRGTVINMSSVHEKIPWPLFVHYAASKGGMRLMTKTLALEYAPKGIRVNNIGPGAINTPINAEKFADPEQRADVESMIPMGYIGEPEEIAAVAAWLASSEASYVTGITLFADGGMTLYPSFQAGRG*

pET-28a-MsfDH载体序列(SEQ ID NO:7)

TGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAATTAATTCTTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGTTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTAGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATAACACCCCTTGTATTACTGTTTATGTAAGCAGACAGTTTTATTGTTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATACACTCCGCTATCGCTACGTGACTGGGTCATGGCTGCGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGGCAGCTGCGGTAAAGCTCATCAGCGTGGTCGTGAAGCGATTCACAGATGTCTGCCTGTTCATCCGCGTCCAGCTCGTTGAGTTTCTCCAGAAGCGTTAATGTCTGGCTTCTGATAAAGCGGGCCATGTTAAGGGCGGTTTTTTCCTGTTTGGTCACTGATGCCTCCGTGTAAGGGGGATTTCTGTTCATGGGGGTAATGATACCGATGAAACGAGAGAGGATGCTCACGATACGGGTTACTGATGATGAACATGCCCGGTTACTGGAACGTTGTGAGGGTAAACAACTGGCGGTATGGATGCGGCGGGACCAGAGAAAAATCACTCAGGGTCAATGCCAGCGCTTCGTTAATACAGATGTAGGTGTTCCACAGGGTAGCCAGCAGCATCCTGCGATGCAGATCCGGAACATAATGGTGCAGGGCGCTGACTTCCGCGTTTCCAGACTTTACGAAACACGGAAACCGAAGACCATTCATGTTGTTGCTCAGGTCGCAGACGTTTTGCAGCAGCAGTCGCTTCACGTTCGCTCGCGTATCGGTGATTCATTCTGCTAACCAGTAAGGCAACCCCGCCAGCCTAGCCGGGTCCTCAACGACAGGAGCACGATCATGCGCACCCGTGGGGCCGCCATGCCGGCGATAATGGCCTGCTTCTCGCCGAAACGTTTGGTGGCGGGACCAGTGACGAAGGCTTGAGCGAGGGCGTGCAAGATTCCGAATACCGCAAGCGACAGGCCGATCATCGTCGCGCTCCAGCGAAAGCGGTCCTCGCCGAAAATGACCCAGAGCGCTGCCGGCACCTGTCCTACGAGTTGCATGATAAAGAAGACAGTCATAAGTGCGGCGACGATAGTCATGCCCCGCGCCCACCGGAAGGAGCTGACTGGGTTGAAGGCTCTCAAGGGCATCGGTCGAGATCCCGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTTACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCCAGGGTGGTTTTTCTTTTCACCAGTGAGACGGGCAACAGCTGATTGCCCTTCACCGCCTGGCCCTGAGAGAGTTGCAGCAAGCGGTCCACGCTGGTTTGCCCCAGCAGGCGAAAATCCTGTTTGATGGTGGTTAACGGCGGGATATAACATGAGCTGTCTTCGGTATCGTCGTATCCCACTACCGAGATATCCGCACCAACGCGCAGCCCGGACTCGGTAATGGCGCGCATTGCGCCCAGCGCCATCTGATCGTTGGCAACCAGCATCGCAGTGGGAACGATGCCCTCATTCAGCATTTGCATGGTTTGTTGAAAACCGGACATGGCACTCCAGTCGCCTTCCCGTTCCGCTATCGGCTGAATTTGATTGCGAGTGAGATATTTATGCCAGCCAGCCAGACGCAGACGCGCCGAGACAGAACTTAATGGGCCCGCTAACAGCGCGATTTGCTGGTGACCCAATGCGACCAGATGCTCCACGCCCAGTCGCGTACCGTCTTCATGGGAGAAAATAATACTGTTGATGGGTGTCTGGTCAGAGACATCAAGAAATAACGCCGGAACATTAGTGCAGGCAGCTTCCACAGCAATGGCATCCTGGTCATCCAGCGGATAGTTAATGATCAGCCCACTGACGCGTTGCGCGAGAAGATTGTGCACCGCCGCTTTACAGGCTTCGACGCCGCTTCGTTCTACCATCGACACCACCACGCTGGCACCCAGTTGATCGGCGCGAGATTTAATCGCCGCGACAATTTGCGACGGCGCGTGCAGGGCCAGACTGGAGGTGGCAACGCCAATCAGCAACGACTGTTTGCCCGCCAGTTGTTGTGCCACGCGGTTGGGAATGTAATTCAGCTCCGCCATCGCCGCTTCCACTTTTTCCCGCGTTTTCGCAGAAACGTGGCTGGCCTGGTTCACCACGCGGGAAACGGTCTGATAAGAGACACCGGCATACTCTGCGACATCGTATAACGTTACTGGTTTCACATTCACCACCCTGAATTGACTCTCTTCCGGGCGCTATCATGCCATACCGCGAAAGGTTTTGCGCCATTCGATGGTGTCCGGGATCTCGACGCTCTCCCTTATGCGACTCCTGCATTAGGAAGCAGCCCAGTAGTAGGTTGAGGCCGTTGAGCACCGCCGCCGCAAGGAATGGTGCATGCAAGGAGATGGCGCCCAACAGTCCCCCGGCCACGGGGCCTGCCACCATACCCACGCCGAAACAAGCGCTCATGAGCCCGAAGTGGCGAGCCCGATCTTCCCCATCGGTGATGTCGGCGATATAGGCGCCAGCAACCGCACCTGTGGCGCCGGTGATGCCGGCCACGATGCGTCCGGCGTAGAGGATCGAGATCTCGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATA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pCDFDuet-1-CgCPR-BmGDH序列(SEQ ID NO:20)

TCCGCCATCGCCGCTTCCACTTTTTCCCGCGTTTTCGCAGAAACGTGGCTGGCCTGGTTCACCACGCGGGAAACGGTCTGATAAGAGACACCGGCATACTCTGCGACATCGTATAACGTTACTGGTTTCACATTCACCACCCTGAATTGACTCTCTTCCGGGCGCTATCATGCCATACCGCGAAAGGTTTTGCGCCATTCGATGGTGTCCGGGATCTCGACGCTCTCCCTTATGCGACTCCTGCATTAGGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTGTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAATAAGGAGATATACCATGGGCAGCAGCCATCACCATCATCACCACATGGTGAAACAAGAATTTTTTAAACTGAACAACGGCCATGAAATGCCGGGCGTGGCGATTGTGGGCACCGGCACCAAATGGCATAAAGTGAACGAAACCGATGAAAACTTTAGTCAGACCCTGGTGGATCAGCTGAAATATGCGCTGAGCCTGCCGGGCGTGGTGCATCTGGATGCGGCGGAATTTTATATGACCTATCGCGAAGTGGGCCGCGCGCTGGCGGAAACGAGCAAACCGCGCGATGAAATTTTTATTACCGATAAATATTGGACCCTGAGCAAAGTGACCGAGAACCCGATTGTGGGCCTGGAAACCGGCCTGAAACGCCTGGGCCTGGAATATGTGGATCTGTATCTGCTGCATAGCCCGTTTATTAGCAAAGAAACCAACGGCTTTAGCCTGGAAGAAGCGTGGGGCATGATGGAAGAACTGTATCATAGCGGCAAAGCGAAAAACATTGGCGTGAGCAACTTTGCGAAAGAAGATCTGGAACGCGTGCTGAAAGTGTGCAAAGTGAAACCGCAAGTGAATCAGATTGAATTTAACGCGTTTCTGCAGAATCAGACCCCGGGCATTTATAACTTTTGCAAACAGAACGATATTCAGCTGGCGGCGTATAGCCCGCTGGGCCCGCTGCAGAAAAAACCGGCGGATGGCAACAGTCAGCCGTTTTATAGCTATATTAACAAACTGGCGCAGCATTATAACAAAACCCCGGGCCAAGTGCTGCTGCGCTGGGTGACCAAACGCGGCGTGGTGGCGGTGACCACGAGCGAAAAAAAAGAACGCATTAAACAAGCGCAAGAAATTTTTGAATTTGATCTGAAAGATGATGAAGTGACCGAAATCACGAAACTGGGCCTGGATCATGAACCGCTGCGCCTGTATTGGCATGATCAGTATAACAAATATAACAGCGAAAGTCAGAAAGCGTAATGCTTAAGTCGAACAGAAAGTAATCGTATTGTACACGGCCGCATAATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCATCTTAGTATATTAGTTAAGTATAAGAAGGAGATATAATGTATAAAGATCTGGAAGGCAAAGTGGTTGTGATTACCGGCAGCAGCACCGGCCTGGGCAAAAGCATGGCGATTCGCTTTGCGACCGAAAAAGCGAAAGTTGTGGTTAATTATCGCAGCAAAGAAGATGAAGCGAACAGCGTGCTGGAAGAAATTAAAAAAGTGGGCGGCGAAGCGATTGCGGTGAAAGGCGATGTGACCGTGGAAAGCGATATTATTAACCTGGTGCAGAGCGCGATTAAAGAATTTGGCAAACTGGATGTGATGATTAACAACGCGGGCCTGGAAAACCCGGTGCCGAGCCATGAAATGAGCCTGAGCGATTGGAACAAAGTGATTGATACCAACCTGACCGGCGCGTTTCTGGGCAGCCGCGAAGCGATTAAATATTTTGTGGAAAACGATATTCGCGGCACCGTGATTAACATGAGCAGCGTGCATGAAAAAATTCCGTGGCCGCTGTTTGTGCATTATGCGGCGAGCAAAGGCGGCATGCGCCTGATGACCAAAACCCTGGCGCTGGAATATGCGCCGAAAGGCATTCGCGTGAACAACATTGGCCCGGGCGCGATTAACACCCCGATTAACGCGGAAAAATTTGCCGATCCGGAACAGCGCGCGGATGTGGAAAGCATGATTCCGATGGGCTATATTGGCGAACCGGAAGAAATTGCGGCGGTGGCGGCGTGGCTGGCGAGCAGCGAAGCGAGCTATGTGACCGGCATTACCCTGTTTGCGGATGGCGGCATGACCCTGTATCCGAGCTTTCAAGCGGGCCGCGGCTAACTGGTAAAGAAACCGCTGCTGCGAAATTTGAACGCCAGCACATGGACTCGTCTACTAGCGCAGCTTAATTAACCTAGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAACCTCAGGCATTTGAGAAGCACACGGTCACACTGCTTCCGGTAGTCAATAAACCGGTAAACCAGCAATAGACATAAGCGGCTATTTAACGACCCTGCCCTGAACCGACGACCGGGTCATCGTGGCCGGATCTTGCGGCCCCTCGGCTTGAACGAATTGTTAGACATTATTTGCCGACTACCTTGGTGATCTCGCCTTTCACGTAGTGGACAAATTCTTCCAACTGATCTGCGCGCGAGGCCAAGCGATCTTCTTCTTGTCCAAGATAAGCCTGTCTAGCTTCAAGTATGACGGGCTGATACTGGGCCGGCAGGCGCTCCATTGCCCAGTCGGCAGCGACATCCTTCGGCGCGATTTTGCCGGTTACTGCGCTGTACCAAATGCGGGACAACGTAAGCACTACATTTCGCTCATCGCCAGCCCAGTCGGGCGGCGAGTTCCATAGCGTTAAGGTTTCATTTAGCGCCTCAAATAGATCCTGTTCAGGAACCGGATCAAAGAGTTCCTCCGCCGCTGGACCTACCAAGGCAACGCTATGTTCTCTTGCTTTTGTCAGCAAGATAGCCAGATCAATGTCGATCGTGGCTGGCTCGAAGATACCTGCAAGAATGTCATTGCGCTGCCATTCTCCAAATTGCAGTTCGCGCTTAGCTGGATAACGCCACGGAATGATGTCGTCGTGCACAACAATGGTGACTTCTACAGCGCGGAGAATCTCGCTCTCTCCAGGGGAAGCCGAAGTTTCCAAAAGGTCGTTGATCAAAGCTCGCCGCGTTGTTTCATCAAGCCTTACGGTCACCGTAACCAGCAAATCAATATCACTGTGTGGCTTCAGGCCGCCATCCACTGCGGAGCCGTACAAATGTACGGCCAGCAACGTCGGTTCGAGATGGCGCTCGATGACGCCAACTACCTCTGATAGTTGAGTCGATACTTCGGCGATCACCGCTTCCCTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGCTAGCTCACTCGGTCGCTACGCTCCGGGCGTGAGACTGCGGCGGGCGCTGCGGACACATACAAAGTTACCCACAGATTCCGTGGATAAGCAGGGGACTAACATGTGAGGCAAAACAGCAGGGCCGCGCCGGTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCTCCTGCCAGAGTTCACATAAACAGACGCTTTTCCGGTGCATCTGTGGGAGCCGTGAGGCTCAACCATGAATCTGACAGTACGGGCGAAACCCGACAGGACTTAAAGATCCCCACCGTTTCCGGCGGGTCGCTCCCTCTTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGTTTACCGGATACCTGTTCCGCCTTTCTCCCTTACGGGAAGTGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACACACTGGTATCTCGGCTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTAAGCAAGAACTCCCCGTTCAGCCCGACTGCTGCGCCTTATCCGGTAACTGTTCACTTGAGTCCAACCCGGAAAAGCACGGTAAAACGCCACTGGCAGCAGCCATTGGTAACTGGGAGTTCGCAGAGGATTTGTTTAGCTAAACACGCGGTTGCTCTTGAAGTGTGCGCCAAAGTCCGGCTACACTGGAAGGACAGATTTGGTTGCTGTGCTCTGCGAAAGCCAGTTACCACGGTTAAGCAGTTCCCCAACTGACTTAACCTTCGATCAAACCACCTCCCCAGGTGGTTTTTTCGTTTACAGGGCAAAAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACTGAACCGCTCTAGATTTCAGTGCAATTTATCTCTTCAAATGTAGCACCTGAAGTCAGCCCCATACGATATAAGTTGTAATTCTCATGTTAGTCATGCCCCGCGCCCACCGGAAGGAGCTGACTGGGTTGAAGGCTCTCAAGGGCATCGGTCGAGATCCCGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTTACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCCAGGGTGGTTTTTCTTTTCACCAGTGAGACGGGCAACAGCTGATTGCCCTTCACCGCCTGGCCCTGAGAGAGTTGCAGCAAGCGGTCCACGCTGGTTTGCCCCAGCAGGCGAAAATCCTGTTTGATGGTGGTTAACGGCGGGATATAACATGAGCTGTCTTCGGTATCGTCGTATCCCACTACCGAGATGTCCGCACCAACGCGCAGCCCGGACTCGGTAATGGCGCGCATTGCGCCCAGCGCCATCTGATCGTTGGCAACCAGCATCGCAGTGGGAACGATGCCCTCATTCAGCATTTGCATGGTTTGTTGAAAACCGGACATGGCACTCCAGTCGCCTTCCCGTTCCGCTATCGGCTGAATTTGATTGCGAGTGAGATATTTATGCCAGCCAGCCAGACGCAGACGCGCCGAGACAGAACTTAATGGGCCCGCTAACAGCGCGATTTGCTGGTGACCCAATGCGACCAGATGCTCCACGCCCAGTCGCGTACCGTCTTCATGGGAGAAAATAATACTGTTGATGGGTGTCTGGTCAGAGACATCAAGAAATAACGCCGGAACATTAGTGCAGGCAGCTTCCACAGCAATGGCATCCTGGTCATCCAGCGGATAGTTAATGATCAGCCCACTGACGCGTTGCGCGAGAAGATTGTGCACCGCCGCTTTACAGGCTTCGACGCCGCTTCGTTCTACCATCGACACCACCACGCTGGCACCCAGTTGATCGGCGCGAGATTTAATCGCCGCGACAATTTGCGACGGCGCGTGCAGGGCCAGACTGGAGGTGGCAACGCCAATCAGCAACGACTGTTTGCCCGCCAGTTGTTGTGCCACGCGGTTGGGAATGTAATTCAGC

Claims (19)

1.一种L-泛解酸内酯脱氢酶，其包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或与所述序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％同一性的氨基酸序列。

2.一种核酸分子，其中，所述核酸分子包含编码权利要求1所述的L-泛解酸内酯脱氢酶的核酸序列。

3.如权利要求2所述的核酸分子，其中，所述核酸分子包含如SEQ ID NO:1所示的核酸序列或与所述序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％同一性的核酸序列。

4.如权利要求2或3所述的核酸分子，其为一种载体或载体的组合。

5.如权利要求2～4中任一项所述的核酸分子，其进一步包含表达酮基泛解酸内酯还原酶的核酸序列和/或编码葡萄糖脱氢酶的核酸序列。

6.如权利要求2～5中任一项所述的核酸分子，其为一种载体的组合，其包含：

(a)第一载体：其包含编码权利要求1所述的L-泛解酸内酯脱氢酶的核酸序列；以及

(b)第二载体：其包含编码酮基泛解酸内酯还原酶的核酸序列和/或编码葡萄糖脱氢酶的核酸序列。

7.如权利要求4～6中任一项所述的核酸分子，其中，所述载体或所述载体组合中的第一载体和第二载体是通过对选自以下载体中的任意一种进行编辑而得到的：pET28a、pCDFDuet1、pACYCDuet-1、pETDuet-1、pRSFDuet-1。

8.如权利要求5～7中任一项所述的核酸分子，其中，所述编码酮基泛解酸内酯还原酶的核酸序列为SEQ ID NO:3所示的核酸序列或与所述序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％同一性的核酸序列；和/或

所述编码葡萄糖脱氢酶的核酸序列为SEQ ID NO:5所示的核酸序列或与所述序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％同一性的核酸序列。

9.如权利要求6～8中任一项所述的核酸分子，其中，第一载体包含如SEQ ID NO:7所示的核酸序列或与所述序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％同一性的核酸序列。

10.如权利要求6～9中任一项所述的核酸分子，其中，第二载体包含如SEQ ID NO:20所示的核酸序列或与所述序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％同一性的核酸序列。

11.一种工程菌，其中，所述工程菌表达如权利要求1所述的L-泛解酸内酯脱氢酶；或包含如权利要求2～10中任一项所述的核酸分子。

12.如权利要求11所述的工程菌，其中，所述工程菌是通过对选自以下组中的任意一种或多种宿主细胞进行加工而得到的：大肠杆菌、枯草杆菌、酵母细胞或曲霉菌。

13.如权利要求11或12所述的工程菌，其中，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21。

14.一种生产D-泛解酸内酯的方法，其包含：

(a)通过如权利要求1所述的L-泛解酸内酯脱氢酶催化L-泛解酸内酯生成酮基泛解酸内酯的步骤；

(b)由酮基泛解酸内酯形成D-泛解酸内酯的步骤。

15.如权利要求14所述的方法，其中，所述(a)步骤；或(a)步骤以及(b)步骤是通过使用如权利要求11～13中任一项所述的工程菌进行的。

16.如权利要求15所述的方法，其中，所述(a)步骤；或(a)步骤以及(b)步骤具体实施步骤包括：

(i)使如权利要求11～13中任一项所述的工程菌在包含终浓度为10-65g/L的L-泛解酸内酯的反应环境中进行反应的步骤，L-泛解酸内酯的终浓度优选为40-65g/L。

17.如权利要求16所述的方法，其中，所述反应环境进一步包含：葡萄糖和/或NADP⁺，

葡萄糖的终浓度为10-100g/L，优选为16-100g/L，NADP⁺的终浓度为5-20g/L，优选为10g/L。

18.如权利要求16或17所述的方法，其中，所述(i)步骤在25-35℃、200-350rpm的条件下进行，优选在30℃、200rpm的条件下进行。

19.如权利要求1所述的L-泛解酸内酯脱氢酶、如权利要求2～10中任一项所述的核酸分子或如权利要求11～13中任一项所述的工程菌在D-泛解酸内酯的合成中的用途。

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