CN116286696A - 一种l-泛解酸内酯脱氢酶及其共表达工程菌在合成d-泛解酸内酯中的应用 - Google Patents

一种l-泛解酸内酯脱氢酶及其共表达工程菌在合成d-泛解酸内酯中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种来源于Rhodococcus erythropolis(红串红球菌)的L‑泛解酸内酯脱氢酶和其突变体、编码该L‑泛解酸内酯脱氢酶或其突变体的核酸分子、用于在宿主细胞中表达该L‑泛解酸内酯脱氢酶或其突变体的载体以及表达该酶或其突变体的工程菌。本发明还进一步提供一种共表达所述L‑泛解酸内酯脱氢酶或其突变体以及选自以下组中的任意一种或多种的工程菌：分子伴侣、D‑酮基泛解酸内酯还原酶以及葡萄糖脱氢酶。本发明进一步提供一种D‑泛解酸内酯的生产方法，其使用表达所述来源于Rhodococcus erythropolis的L‑泛解酸内酯脱氢酶或其突变体的工程菌。

Description

一种L-泛解酸内酯脱氢酶及其共表达工程菌在合成D-泛解酸 内酯中的应用
技术领域
属生物技术领域，具体的是涉及来源于红串红球菌Rhodococcus erythropolis泛解酸内酯脱氢酶的共表达工程菌及其应用。
背景技术
D-泛解酸内酯是合成D-泛酸钙(维生素B5)、D-泛醇和D-泛硫醇的关键手性中间体，这些产品广泛用于食品、饲料添加剂，以及医药和化妆品。
当前，D-泛解酸内酯的主要合成方法由羟醛缩合开始，采用廉价的异丁醛与甲醛合成羟基新戊醛，添加氢氰酸于酸性条件下形成氰醇，再水解环化得到DL-泛解酸内酯。利用生物酶法(D-泛解酸内酯水解酶)选择性开环合成D-泛解酸，经溶剂萃取分离D-泛解酸与L-泛解酸内酯，D-泛解酸化后得到D-泛解酸内酯。尽管生物催化拆分已应用于商业生产，但D-泛解酸内酯的最大理论产率仅为50％，并且需要额外的外消旋步骤来回收未反应的底物，以提高D-泛解酸内酯的产率，因此仍存在重复步骤多、酸碱消耗高等问题。
使用氧化还原酶不对称合成D-泛解酸内酯因其高对映体纯度和高理论产率展现出巨大的应用潜力。即采用L-泛解酸内酯脱氢酶选择性氧化合成酮基泛解酸内酯，再采用D-酮基泛解酸内酯还原酶选择性还原以制备D-泛解酸内酯，另一条可选的方案同样先由L-泛解酸内酯脱氢酶选择性氧化L-泛解酸内酯合成酮基泛解酸内酯，该化合物自发水解为酮基泛解酸，再采用D-酮基泛解酸还原酶催化下生成D-泛解酸，最后加酸使D-泛解酸闭环合成D-泛解酸内酯。第一条路线工艺更为简单，可直接获得手性纯的终产品，通过辅酶再生和工程化改造，只需少量添加或不添加辅因子。
如上所述，L-泛解酸内酯脱氢酶是氧化还原不对称合成D-泛解酸内酯的关键酶，负责催化重要的第一步反应。目前报道的L-泛解酸内酯脱氢酶仍然寥寥，1992年发现的来源于星状诺卡氏菌的L-泛解酸内酯脱氢酶虽然有一定的酶学数据表征，但该酶在大肠杆菌以包涵体表达为主，且编码基因仍不可知(Kataoka M，et al.European Journal ofBiochemistry 1992，204，799-806)。此外，来源于红串红球菌的L-泛解酸内酯脱氢酶在2012年被报道，就其性质而言，如果使来源于红串红球菌的L-泛解酸内酯脱氢酶在其原始宿主中增强表达，以0.768M的L-泛解酸内酯为底物，全细胞反应144h后转化率可以达到91.9％。然而生成的酮基泛解酸内酯会自发水解成酮基泛解酸，需额外表达酮基泛解酸还原酶以转化成D-泛解酸(SiD，Urano N，Nozaki S，et a1.L-Pantoyl lactonedehydrogenase from Rhodococcus erythropolis：genetic analyses and applicationto the stereospecific oxidation of L-pantoyl lactone.Applied Microbiology andBiotechnology，2012，95：431-440)。但是，当在大肠杆菌内表达时，该L-泛解酸内酯脱氢酶的可溶性很低，使得其活性不如野生型红串红球菌，因此，也无法选择使酮基泛解酸还原酶与来源于红串红球菌的L-泛解酸内酯脱氢酶一同在大肠杆菌中表达，需要构建多个工程菌进行分步反应。大肠杆菌作为发酵工程的生物平台，是目前研究最为深入的通用宿主，无法应用于大肠杆菌会导致所述酶的可操作性显著下降。而如果如上所述使用不同的宿主，例如如果分别使用表达酮基泛解酸还原酶的大肠杆菌细胞与红串红球菌细胞来生物转化L-泛解酸内酯，则其转化率会有所降低，且工艺更为复杂，成本更高。这些缺点阻碍了其在生物转化L-泛解酸内酯的进一步应用。
发明内容
鉴于以上的技术问题，本发明的发明人对来源于Rhodococcus erythropolis的L-泛解酸内酯脱氢酶的表达系统进行了优化，显著提升了来源于Rhodococcus erythropolis的L-泛解酸内酯脱氢酶在大肠杆菌中的可溶性，使得该蛋白在大肠杆菌中表现出显著的L-泛解酸内酯脱氢酶活性。本发明的发明人进一步基于大肠杆菌，构建了表达该酶的多种工程菌，并验证了使用所述工程菌的D-泛解酸内酯的生物合成方法的效率，结果发现，所述D-泛解酸内酯的生物合成方法的转化率高，速度快，具有较大的商业应用前景。在此基础上，为了使所述来源于Rhodococcus erythropolis的L-泛解酸内酯脱氢酶在大肠杆菌中应用时的活性进一步提高，本发明的发明人进一步对所述来源于Rhodococcus erythropolis的L-泛解酸内酯脱氢酶进行了突变，筛选出了2种在大肠杆菌中的活性进一步提高的来源于Rhodococcus erythropolis的L-泛解酸内酯脱氢酶的突变体。
如上所述，本发明提供了一种来源于Rhodococcus erythropolis的L-泛解酸内酯脱氢酶或其突变体、编码该L-泛解酸内酯脱氢酶或其突变体的核酸分子、用于在宿主细胞中表达该L-泛解酸内酯脱氢酶或其突变体的载体以及表达该酶或其突变体的工程菌。本发明还进一步提供一种共表达所述L-泛解酸内酯脱氢酶或其突变体以及选自以下组中的任意一种或多种的工程菌：分子伴侣、D-酮基泛解酸内酯还原酶以及葡萄糖脱氢酶。本发明进一步提供一种D-泛解酸内酯的生产方法，其使用表达所述来源于Rhodococcuserythropolis的L-泛解酸内酯脱氢酶或其突变体的工程菌。
具体而言，本发明包含以下的方面：
1.一种分离的L-泛解酸内酯脱氢酶，其包含如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：7或SEQID NO：9中任一项所示的氨基酸序列或与所述序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的氨基酸序列。
2.一种分离的核酸分子，其编码如项1所述的L-泛解酸内酯脱氢酶。
3.如项2所述的核酸分子，其中，所述核酸分子包含如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：10中任一项所示的核酸序列或与所述序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的核酸序列。
4.一种重组载体或重组载体组合，其包含以下的(a)且任选包含以下的(b)：
(a)编码如项1所述的L-泛解酸内酯脱氢酶的核酸序列，所述核酸序列包含如SEQID NO：2、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：10中任一项所示的核酸序列或与所述序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的核酸序列；
(b)编码分子伴侣的核酸序列，所述分子伴侣选自下组中的一种或多种：谷胱甘肽巯基转移酶(GST)、二硫化物氧化还原酶(dsbA)、蛋白质二硫键异构酶(dsbC)、谷胱甘肽还原酶(gor)、硫氧还蛋白-1(trxA)、硫氧还原蛋白还原酶(trxB)、核苷酸交换因子(grpE)。优选dsbA、GST或TrxA。
5.如项4所述的重组载体或重组载体组合，其中，所述分子伴侣具有选自下组的任意序列：SEQ ID NO：11～SEQ ID NO：17中任一项所示的序列或与上述序列中的任一者具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的氨基酸序列。
6.如项4或5所述的重组载体或重组载体组合，其进一步包含：
(c)编码葡萄糖脱氢酶的核酸序列。
7.如项4～6中任一项所述的重组载体或重组载体组合，其中，所述编码葡萄糖脱氢酶的核酸序列包含如SEQ ID NO：4所示的核酸序列或与所述序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的核酸序列。
8.如项4～7中任一项所述的重组载体或重组载体组合，其进一步包含：
(d)编码D-酮基泛解酸内酯还原酶的核酸序列。
9.如项8中所述的重组载体或重组载体组合，其中，所述编码D-酮基泛解酸内酯还原酶的核酸序列包含如SEQ ID NO：6所示的核酸序列或与所述序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的核酸序列。
10.如项4～9中任一项所述的重组载体或重组载体组合，其中，所述重组载体组合包含第一重组载体和第二重组载体，
第一重组载体中包含：
(a)编码如项1所述的L-泛解酸内酯脱氢酶的核酸序列，所述核酸序列包含如SEQID NO：2、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：10中任一项所示的核酸序列或与所述序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的核酸序列；以及
(b)编码分子伴侣的核酸序列，所述分子伴侣具有选自下组的任意序列：SEQ IDNO：11～SEQ ID NO：17中任一项所示的序列或与上述序列中的任一者具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的氨基酸序列。
第二重组载体中包含：
(c)编码葡萄糖脱氢酶的核酸序列；以及
(d)编码D-酮基泛解酸内酯还原酶的核酸序列。
11.如项4～10中任一项所述的重组载体或重组载体组合，其中，所述第一重组载体为对下列载体中的任意载体进行编辑而获得的重组载体：pCDFDuet1、pACYCDuet-1、pETDuet-1、pRSFDuet-1。
12.如项4～11中任一项所述的重组载体或重组载体组合，其中，所述第二重组载体为对pET28a载体进行编辑而获得的重组载体。
13.一种蛋白组合，其包含下列的(a)以及选自(b)、(c)以及(d)中的一种或多种：
(a)如项1所述的L-泛解酸内酯脱氢酶；
(b)选自GST、dsbA、dsbC、gor、TrxA、TrxB或grpE的分子伴侣；
(c)D-酮基泛解酸内酯还原酶；
(d)葡萄糖脱氢酶。
14.如项13所述的蛋白组合，其中，所述分子伴侣为GST、TrxA或dsbA。
15.如项13或14所述的蛋白组合，其中，所述葡萄糖脱氢酶包含如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列或与所述序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的氨基酸序列。
16.如项13～16中任一项所述的蛋白组合，其中，所述D-酮基泛解酸内酯还原酶包含如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列或与所述序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的氨基酸序列。
17.一种工程菌，其表达如项1所述的L-泛解酸内酯脱氢酶，或表达如项13～16中任一项所述的蛋白组合，或包含如项2或3所述的核酸分子，或包含如项4～12中任一项所述的重组载体或重组载体组合。
18.如项17所述的工程菌，其中，所述工程菌是通过对选自以下的宿主细胞中的任意一种进行加工而得到的：大肠杆菌、枯草杆菌、酵母细胞或曲霉菌。
19.如项17或18所述的工程菌，其中，所述宿主细胞是大肠杆菌E.coil BL21(DE3)。
20.一种制备D-泛解酸内酯的方法，其包含以下步骤：
(a)通过如项1所述的L-泛解酸内酯脱氢酶催化L-泛解酸内酯脱氢，生成酮基泛解酸内酯的步骤；
(b)由酮基泛解酸内酯还原，形成D-泛解酸内酯的步骤。
21.如项20所述的制备D-泛解酸内酯的方法，其中，所述步骤(a)通过如项17～19中任一项所述的工程菌进行；或者步骤(a)以及步骤(b)都通过如项17～19中任一项所述的工程菌进行。
22.如项20或21所述的制备D-泛解酸内酯的方法，其中，所述方法的具体实施步骤包括：
(i)对宿主细胞进行加工，并筛选出如项17～19中任一项所述的工程菌的步骤；
(ii)对所述工程菌进行诱导表达，使其表达需要的L-泛解酸内酯脱氢酶、伴侣蛋白、D-酮基泛解酸内酯还原酶、葡萄糖脱氢酶或蛋白组合的步骤；
(iii)将所述工程菌加入至包含L-泛解酸内酯的底物中进行反应的步骤。
23.如项20～22中任一项所述的制备D-泛解酸内酯的方法，其中，所述步骤(ii)在20℃～28℃下进行，优选为25℃。
24.如项20～23中任一项所述的制备D-泛解酸内酯的方法，其中，L-泛解酸内酯的终浓度为10-65g/L，优选为50-65g/L。
25.如项22所述的制备D-泛解酸内酯的方法，其中，步骤(iii)中的底物进一步选自下列中的一种或多种成分：葡萄糖、NADP+或CaCO3。
26.如项25所述的制备D-泛解酸内酯的方法，其中，葡萄糖的终浓度为10-100g/L，优选为16-100g/L。
27.如项25所述的制备D-泛解酸内酯的方法，其中，NADP+的终浓度为0.02-0.15mg/mL，优选为0.05-0.1mg/ml。
28.如项25所述的制备D-泛解酸内酯的方法，其中，CaCO3的终浓度为0.1-0.3g/mL，优选为0.15-0.25g/ml。
29.如项22～28中任一项所述的制备D-泛解酸内酯的方法，其中，步骤(iii)的反应温度为25℃～30℃，优选为30℃。
30.如项22～29中任一项所述的制备D-泛解酸内酯的方法，其中，步骤(a3)在200-350rpm的条件下进行反应，优选为200rpm。
在本说明书中，除非另外定义，否则使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。当术语以单数形式提供时，除非另有说明，否则也包括该术语的复数形式。除非另有说明，否则本说明书的正文中的核酸序列相对于启动子以5′至3′的方向给出。除非另有说明，否则本说明书的正文中氨基酸序列以N端至C端的方向给出。
在本说明书中，“包含”不仅具有“将...包含在内”的意义，还具有“由...构成”的意义。
在本说明书中，术语“酶”是指催化或促进一个或多个化学或生化反应的任何物质，其通常包括完全或部分由多肽构成的酶，但也可以包括由包括多核苷酸的不同分子构成的酶。在本发明中，只要特定催化活性不受到显著的抑制，则酶的氨基酸序列可以在一定范围内进行变更，例如可以是与本发明所公开的具体序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的氨基酸序列。在本说明书中，术语“蛋白”、“蛋白质”或“酶”不仅限于在宿主体内表达的蛋白质，也可以是指纯化了的蛋白质或其衍生物。
在本说明书中，术语“L-泛解酸内酯脱氢酶”通常是指具有催化L-泛解酸内酯进行脱氢氧化而形成酮基泛解酸内酯的活性的蛋白质、多肽或它们的衍生物。
在本说明书中，术语“分子伴侣”(Chaperone)又称为侣伴蛋白(molecularchaperone)，通常是指一类协助细胞内分子组装和协助蛋白质折叠的蛋白质。在肽链的折叠过程中通常发挥重要作用，能够促进蛋白的正确折叠、组装。分子伴侣促进新合成蛋白质的有效折叠，防止其聚集并确保其在细胞中的蛋白质稳态。
在本说明书中，术语“核酸”或“核酸分子”通常是指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物。核酸分子可由为天然存在的核苷酸(诸如DNA和RNA)，或天然存在的核苷酸的类似物(例如，天然存在的核苷酸的对应体形式)的单体或这两者的组合组成。经修饰的核苷酸可在糖部分和/或嘧啶或嘌呤碱部分具有改变。糖修饰包括，例如，用卤素、烷基、胺和叠氮基对一个或多个羟基替换，或糖类可被官能化为醚或酯。此外，整个糖部分可被立体化学和电子方面相似的结构诸如氮杂-糖类和碳环糖类似物替换。碱基部分的修饰的实例包括烷基化嘌呤和嘧啶、酰化嘌呤或嘧啶，或其它公知的杂环取代基。核酸单体可以通过磷酸二酯键或此种键联的类似物连接。磷酸二酯键联的类似物包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺基硫代磷酸酯、苯胺磷酸酯(phosphoranilidate)、磷酰胺酯等。需要说明的是，在本申请中，术语“核酸分子”不仅包括具有单一序列的核酸分子，也包括多种核酸分子的组合。
在本说明书中，“分离的核酸分子”通常是指未被整合在生物的基因组DNA中的核酸分子。例如，编码已从细胞的基因组DNA分离的受体的DNA分子是分离的DNA分子。分离的核酸分子的另一非限制性实例是未被整合在生物的基因组中的化学合成的核酸分子。分离的核酸分子的另一个非限制性实例是已从特定物种分离的比来自该物种的染色体的完整DNA分子小的核酸分子。
在本说明书中，术语“分离的蛋白”通常是指，是已经与它的天然环境中的组分分离的蛋白。在某些实施方式中，将蛋白纯化至大于95％或99％纯度，所述纯度通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱(例如，离子交换或反相HPLC)确定。关于评价蛋白纯度的方法的综述可参见Flatman，S.等，J.Chrom.B848(2007)79-87。
在本说明书中，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草杆菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞。
在本说明书中，术语“工程菌”是指术语“工程菌”是指用基因工程的方法，使外源基因在宿主细胞中得到高效表达的菌类细胞株。
在本申请中，术语“载体”通常是指能够在合适的宿主中自我复制的核酸分子，用以将插入的核酸分子转移到宿主细胞中和/或宿主细胞之间。所述载体可包括主要用于将DNA或RNA插入细胞中的载体、主要用于复制DNA或RNA的载体，以及主要用于DNA或RNA的转录和/或翻译的表达的载体。所述载体还包括具有多种上述功能的载体。所述载体可以是当引入合适的宿主细胞时能够转录并翻译成多肽的多核苷酸。通常，通过培养包含所述载体的合适的宿主细胞，所述载体可以产生期望的表达产物。在本申请中，所述载体中可包含一种或多种所述核酸分子。此外，所述载体中还可包含其他基因，例如允许在适当的宿主细胞中和在适当的条件下选择该载体的标记基因。此外，所述载体还可包含允许编码区在适当宿主中正确表达的表达控制元件。这样的控制元件为本领域技术人员所熟知的，例如，可包括启动子、核糖体结合位点、增强子和调节基因转录或mRNA翻译的其他控制元件等。在某些实施方式中，所述表达控制序列为可调的元件。所述表达控制序列的具体结构可根据物种或细胞类型的功能而变化，但通常包含分别参与转录和翻译起始的5’非转录序列和5’及3’非翻译序列，例如TATA盒、加帽序列、CAAT序列等。例如，5’非转录表达控制序列可包含启动子区，启动子区可包含用于转录控制功能性连接核酸的启动子序列。本申请所述载体可选自质粒、逆转录病毒载体和慢病毒载体。
在本说明书中，术语“转化”通常是指细胞中遗传特性的改变，当细胞被修饰成含有新DNA或RNA时，所述细胞就被转化。例如，当通过经由转染、转导或其它技术引入新遗传物质来对细胞天然状态进行遗传修饰时，细胞被转化。在细菌中，“感受态”是指能够吸收DNA的状态。感受态细胞可通过本领域已知的实验室程序产生，例如在二价阳离子(例如CaCl2)存在下冷却细胞，使细胞壁变得可透过质粒DNA；或者将细胞与质粒一起培育，并随后短暂热激，以使质粒进入细胞。另外，电穿孔也是使质粒进入细胞的另一种方式。
在本说明书中，术语“终浓度”是指反应体系中的浓度。
附图说明
图1.图1为L-泛解酸内酯脱氢酶ReLDH、D-酮基泛解酸内酯还原酶CglCPR和葡萄糖脱氢酶BmGDH三酶偶联反应催化L-泛解酸内酯合成D-泛解酸内酯的反应示意图。
图2.图2为在大肠杆菌中可溶性表达的L-泛解酸脱氢酶的SDS-PAGE电泳图(ReLDH：35.7kDa)。
图3.图3A为L-泛解酸内酯与D-泛解酸内酯的液相色谱图，图3B为L-泛解酸内酯脱氢酶分别偶联CglCPR、BmGDH三酶催化L-泛解酸内酯的反应液的液相色谱图
图4.图4为不同分子伴侣共表达下L-泛解酸内酯脱氢酶ReLDH分别偶联CglCPR、BmGDH多酶催化50g/L L-泛解酸内酯的转化率。
图5.图5为不同表达温度下L-泛解酸内酯脱氢酶ReLDH分别偶联CglCPR、BmGDH多酶催化50g/L L-泛解酸内酯转化的时间进程图。
图6.图6为在分子伴侣GST共表达下L-泛解酸内酯脱氢酶ReLDH野生型与突变体分别偶联CglCPR、BmGDH多酶催化65g/L L-泛解酸内酯的转化率。
具体实施方式
本发明提供了一种来源于Rhodococcus erythropolis的L-泛解酸内酯脱氢酶(ReLDH)及其突变体、编码该L-泛解酸内酯脱氢酶或其突变体的核酸分子、用于在宿主细胞中表达该L-泛解酸内酯脱氢酶或其突变体的载体以及表达该酶或其突变体的工程菌。本发明还进一步提供一种共表达所述L-泛解酸内酯脱氢酶或其突变体以及选自以下组中的任意一种或多种的工程菌：分子伴侣、D-酮基泛解酸内酯还原酶以及葡萄糖脱氢酶。本发明进一步提供一种D-泛解酸内酯的生产方法，其使用表达所述来源于Rhodococcuserythropolis的L-泛解酸内酯脱氢酶或其突变体的工程菌。本发明提供的技术方案之一，是提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含表达所述L-泛解酸内酯脱氢酶或其突变体的基因和任选的分子伴侣的基因。
所述的一种L-泛解酸内酯脱氢酶(ReLDH)，其氨基酸序列如SED ID NO：1所示。所述编码L-泛解酸内酯脱氢酶的核酸序列如SED ID NO：2所示。本发明所筛选的所述L-泛解酸内酯脱氢酶(ReLDH)的突变体的氨基酸序列如SED ID NO：7、SED ID NO：9所示。编码所述本发明所筛选的所述L-泛解酸内酯脱氢酶(ReLDH)的突变体的核酸序列如SED ID NO：8、SED ID NO：10所示。
进一步而言，本领域技术人员应当理解，当上述的氨基酸序列或核酸序列经过一个或几个残基的取代和/或缺失和/或添加而依然具有本发明所述的技术效果时，也在本申请所意图的保护范围之内。
所述分子伴侣为选自以下蛋白中的任意一种或多种：谷胱甘肽巯基转移酶(GST)、二硫化物氧化还原酶(dsbA)、蛋白质二硫键异构酶(dsbC)、谷胱甘肽还原酶(gor)、硫氧还蛋白-1(trxA)、硫氧还原蛋白还原酶(trxB)、核苷酸交换因子(grpE)，其中，从提高L-泛解酸内酯脱氢酶活性催化活性的角度出发，优选所述分子伴侣为选自以下蛋白中的任意一种或多种：dsbA、GST、TrxA。
在一种具体实施方式中，本发明还提供一种表达所述L-泛解酸内酯脱氢酶和所述分子伴侣的共表达载体，就所述共表达载体的构建方法而言，例如可以举出以下的方式：
将GST、dsbA、dsbC、gor、TrxA、TrxB或grpE的核酸序列插入到载体的多克隆位点1中，将所述L-泛解酸内酯脱氢酶的核酸序列插入到同一载体(以下也称为第一载体)的多克隆位点2中，构建重组载体(以下也称为第一重组载体)。
所述第一载体可以是能够在宿主细胞中正常表达的任意载体，从可以人为地控制基因表达的时间点，以有效的避免基因表达产物对宿主前期生长造成不利影响角度出发，优选第一载体是具有诱导表达型启动子的载体，从提高所述L-泛解酸内酯脱氢酶在大肠杆菌中的可溶性的观点出发，优选第一重组载体是通过对选自以下载体中的任意一种进行编辑而得到的：pCDFDuet1、pACYCDuet-1、pETDuet-1、pRSFDuet-1。
在一种具体实施方式中，本发明提供了一种所述L-泛解酸内酯脱氢酶在D-泛解酸内酯的合成中的应用，在一种更优选的具体实施方式中，本发明提供了一种所述L-泛解酸内酯脱氢酶在D-泛解酸内酯的生物合成中的应用。
在一种具体实施方式中，本发明还构建了一种单一工程菌多酶级联催化体系，通过将包含所述L-泛解酸内酯脱氢酶在内的蛋白组合同时表达在单个工程菌中，并使所述蛋白组合保持活性，能够实现通过单一工程菌由L-泛解酸内酯直接生成手性纯的D-泛解酸内酯，步骤简捷。所述工程菌的宿主细胞无特别限制，例如可以使用本领域常用的原核细菌或真核细菌，从生产效率、成本以及合成生物学上的操作性的角度出发所述工程菌的宿主细胞优选为大肠杆菌，更优选为大肠杆菌BL21(DE3)。
具体而言，为降低大规模工业化生产中使用NADPH的成本，本发明构建的单一工程菌多酶级联催化体系进一步包含葡萄糖脱氢酶用于辅酶再生。在一个优选的实施方式中，所述的单一工程菌多酶级联催化体系包含：所述L-泛解酸内酯脱氢酶、D-酮基泛解酸内酯还原酶与葡萄糖脱氢酶。表达所述多酶级联催化体系的单一工程菌催化生成D-泛解酸内酯的具体方法为：将表达所述L-泛解酸内酯脱氢酶(ReLDH)、D-酮基泛解酸内酯还原酶、葡萄糖脱氢酶和/或分子伴侣蛋白的工程菌进行诱导培养，收集湿菌体作为催化剂。接下来，将诱导表达后的湿菌体(工程菌)以L-泛解酸内酯为底物，任选葡萄糖作为辅酶循环的底物，例如在pH 7.0、0.2M KH2PO4 buffer的缓冲溶液中进行反应，加入CaCO3以控制pH不低于5，反应条件可以为25-35℃、200-350rpm，在使用以大肠杆菌为宿主细胞所构建的本发明的工程菌的角度出发，反应条件优选为30℃、200rpm。反应结束后可以对D-泛解酸内酯的纯度和产率进行检测，具体而言，例如可以将反应液稀释至适当浓度，再离心取上清液用于高效液相色谱检测。例如可以采用高效液相色谱手性柱检测L-泛解酸内酯与D-泛解酸内酯。液相色谱条件例如可以为：色谱柱为CHIRALPAK IG柱(250*4.6mm)，有机相为甲醇，水相为含0.1％的甲酸水溶液，等度洗脱(60％的A相，流速为0.5mL/min)，检测波长/UV 210nm；L-泛解酸内酯与D-泛解酸内酯的保留时间分别为15.8min与14.6min(本发明实施例中所采用的检测条件)。
在所述例示的反应体系中，L-泛解酸内酯的投料量可以为10-65g/L，在使用以大肠杆菌为宿主细胞所构建的本发明的工程菌的角度出发，优选为50-65g/L，葡萄糖的终浓度可以为10-100g/L，在使用以大肠杆菌为宿主细胞所构建的本发明的工程菌的角度出发，优选为16-100g/L，CaCO3的浓度可以为0.1-0.3g/ml，从使用以大肠杆菌为宿主细胞所构建的本发明的工程菌的角度出发，优选为0.15-0.25g/ml，NADP+的终浓度可以为0.02-0.15mg/mL，从使用以大肠杆菌为宿主细胞所构建的本发明的工程菌的角度出发，优选为0.05-0.1mg/ml，表达有L-泛解酸内酯脱氢酶(ReLDH)、D-酮基泛解酸内酯还原酶、葡萄糖脱氢酶和/或分子伴侣的湿菌体终浓度可以为20-40g/L。只要能够在工程菌中正常表达并发挥活性，所述D-酮基泛解酸内酯还原酶、葡萄糖脱氢酶可以来源于任何物种，在使用以大肠杆菌为宿主细胞所构建的本发明的工程菌的角度出发，所述D-酮基泛解酸内酯还原酶的核酸序列优选来源于光滑假丝酵母Candida glabata，所述葡萄糖脱氢酶优选来源于巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium IWG3。在一个优选的实施方式中，所述来源于Bacillusmegaterium IWG3葡萄糖脱氢酶的核酸序列如SEQ ID NO.4所示。所述来源于Candidaglabata的D-酮基泛解酸内酯还原酶的核酸序列如SEQ ID NO.6所示。
在一个实施方式中，编码D-酮基泛解酸内酯还原酶与葡萄糖脱氢酶的核酸序列分别被插入第二载体中，从而获得第二重组载体，第二载体可以是能够在宿主细胞中正常表达的任意载体，从操作性的角度出发，优选第二载体是具有诱导表达型启动子的载体，优选所述第二载体为pET28a。
在一个实施方式中，表达所述多酶级联催化体系的重组工程菌通过将第一重组载体与第二重组载体导入宿主菌中进行转化而获得。
在一个实施方式中，所述的湿菌体诱导表达方法如下：将培养的种子液按1％的接种量到含有终浓度50μg/mL卡那霉素和50μg/mL链霉素的溶菌肉汤培养基中37℃、200rpm培养至OD600＝0.6-0.8，然后加入0.1mM异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，28℃培养20h后，4℃、4000rpm离心10min收集湿菌体。从提高多酶级联催化体系效率的观点出发，更优选对所述重组工程菌进行诱导表达时处理温度为25℃。
本发明的有益效果主要为：本发明提供了一种高催化活力的L-泛解酸内酯脱氢酶及突变体，其编码基因、载体及工程菌。值得注意的是，在与分子伴侣共表达时，与未与分子伴侣共表达的工程菌相比，催化50g/L的底物时转化率提高到大于99％。在25℃下进行诱导表达的工程菌与在28度下进行诱导表达的工程菌相比，催化效率更高，10h时达到转化率大于99％。突变体pCDFDuet-GST-ReLDH-F183L反应12h相比野生型的转化率提高了22％，达到99％以上。本发明提供的共表达工程菌可以单一工程菌实现催化L-泛解酸内酯氧化还原不对称合成D-泛解酸内酯，相比手性拆分法，工艺更为简捷，减少了酸碱的使用，催化效率进一步提高。
实施例
以下将通过实施例对本发明进行进一步的阐述，但是需要说明的是，以下的实施例、比较例仅用于说明本发明的技术效果，对本发明并没有任何限定作用。
在没有特别说明的情况下，以下未说明的实验步骤均按照本领域技术人员应当理解的常规实验条件进行，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular cloning：a laboratory manual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
本发明中所采用的表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)购买自上海维地生物科技有限公司；本发明实施例中所采用的质粒pCDFDuet、pET28a购买自美国Novagen公司；LB液体培养基配方为：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L，pH 7.0，于115℃灭菌30min。
实施例一：基于大肠杆菌的L-泛解酸内酯脱氢酶工程菌的构建及表达
根据来源于Rhodococcus erythropolis的L-泛解酸内酯脱氢酶的基因(登录号为AB689131)，经过密码子优化，再送由苏州金唯智生物技术有限公司进行全基因合成得到用于表达来源于Rhodococcus erythropolis的L-泛解酸内酯脱氢酶的核酸片段，核酸序列如SED ID NO：2所示，将其插入到载体pCDFDuet的NdeI与XhoI位点中从而构建重组质粒pCDFDuet-ReLDH。
将重组质粒pCDFDuet-ReLDH导入大肠杆菌感受态BL21(DE3)中进行转化。通过PCR筛选阳性菌株BL21(DE3)/pCDFDuet-ReLDH并进行DNA测序，验证重组质粒是否正确构建。
将阳性菌株接种至5ml含有50μg/mL链霉素的LB液体培养基中，于37℃、200rpm条件下振荡培养过夜，再按百分之一的比例接种到80mL含有50μg/mL链霉素的LB液体培养基中，在37℃、200rpm条件下振荡培养直至OD600在0.6-0.8之间，加入0.1mM IPTG，于28℃、180rpm的条件下诱导培养18h，8000rpm离心5min用以收集菌体，再用磷酸缓冲溶液pH 7.0清洗两次后，即得湿菌体。取部分菌体进行超声破碎，然后将细胞破碎液8000rpm离心5min，得到的裂解液和上清液分别进行SDS-PAGE验证，其SDS-PAGE胶图，如图2所示，实现了来源Rhodococcus erythropolis的L-泛解酸内酯脱氢酶在大肠杆菌中高的可溶性表达。
实施例二：大肠杆菌中L-泛解酸内酯脱氢酶底物特异性的探究
分别以L-泛解酸内酯、D-泛解酸内酯、DL泛解酸为底物，以实施例一中获得的BL21(DE3)/pCDFDuet-ReLDH诱导表达后的湿菌体作为全细胞催化剂，探究了来源于Rhodococcus erythropolis的L-泛解酸内酯脱氢酶的底物特异性。反应在0.2M磷酸盐缓冲溶液(pH 7.0)中进行20h，其中湿菌体和底物的浓度均为20g/L，共10 mL，反应温度及转速分别为28℃、200rpm。反应结束后，稀释至适当浓度后，离心取上清转移到进样瓶中用以高效液相色谱分析。来源于Rhodococcus erythropolis的L-泛解酸内酯脱氢酶的底物特异性结果如表1所示，可以看出，该L-泛解酸内酯脱氢酶对L-泛解酸内酯具有高度特异性。
表1来源于Rhodococcus erythropolis的L-泛解酸内酯脱氢酶的底物特异性
底物 活性
D-泛解酸内酯 无
L-泛解酸内酯 有
DL-泛解酸 无
实施例三：L-泛解酸内酯脱氢酶共表达工程菌的构建与表达
3.1pCDFDuet-分子伴侣-ReLDH重组质粒的构建
将实验室现有的7种来源于大肠杆菌K12(MG1655)中的伴侣蛋白GST(GenBank登录号为945758)、dsbA(GenBank登录号为948353)、dsbC(GenBank登录号为947363)、gor(GenBank登录号为948014)、grpE(GenBank登录号为947097)、TrxA(GenBank登录号为948289)或TrxB(GenBank登录号为949054)的质粒，分别用BamHI与NotI进行双酶切处理，回收酶切片段，分别将它们与同样用BamHI与NotI双酶切处理后的重组质粒pCDFDuet-ReLDH连接，然后将连接产物分别转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，挑选单克隆菌落培养，提取质粒后测序验证，从而构建得到7个重组质粒pCDFDuet-分子伴侣-ReLDH。
3.2pET28a-CglCPR-rbsBmGDH重组质粒的构建
根据已公开的来源于Candida glabata的D-酮基泛解酸内酯还原酶CglCPR(GenBank登录号：KM817194.1)与来源于Bacillus megaterium IWG3葡萄糖脱氢酶BmGDH(NCBI登录号为WP_028407571)，通过密码子优化等，设计了表达序列，送由苏州金唯智生物技术有限公司进行基因合成，并分别重组到pET-28a(+)质粒上；经测序正确后导入表达宿主大肠杆菌E.coil BL21(DE3)。
首先以pET28a-BmGDH重组质粒为模板，设计引物BmGDH-rbs-F1与BmGDH-rbs-R1扩增BmGDH片段，切胶回收；同样以pET28a-CglCPR重组质粒为模板，设计引物pET28a-F1与pET28a-R1扩增质粒骨架，切胶回收，相关引物序列信息见表2。然后用重组酶ExnaseII将以上两个片段进行在37℃连接30min，连接体系见表3所示，获得pET28a-CglCPR-rbsBmGDH重组质粒，并导入表达宿主大肠杆菌E.coil BL21(DE3)中，测序验证。
表2构建pET28a-CglCPR-rbsBmGDH重组质粒的相关引物
名称 引物序列(5’-3’)
BmGDH-rbs-F1 GTCAGAAAGCGTAAtttgtttaactttaagaaggagaATGTATAAAGATCTGGAAGGC
BmGDH-rbs-R1 caactcagcttcctttcggg
pET28a-F1 cgaaaggaagctgagttggc
pET28a-R1 caaaTTACGCTTTCTGACTTTCGCTGTTATATTTG
表3酶连体系
组分 体积(μL)
5xCE buffer 4
目的基因PCR产物 2
线性化pET28a载体 2
重组酶ExnaseII 2
ddH2o 10
3.3共表达工程菌的构建与表达
取构建的7个重组质粒pCDFDuet-分子伴侣-ReLDH与pCDFDuet-ReLDH，分别与重组质粒pET28a-CglCPR-rbsBmGDH按1：1混合，共转化到感受态大肠杆菌BL21(DE3)感受态中，涂板于含50μg/mL卡拉霉素与50μg/mL链霉素的LB固体培养基，37℃下过夜培养。分别挑选单克隆菌落于LB液体培养基中，37℃、200rpm培养过夜，提取质粒，验证两种质粒均已转入。将培养液按1∶100接种LB液体培养基，37℃、200rpm条件下，培养至OD600约为0.6-0.8。加入0.1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导培养约18h，温度为28℃，转速180rpm。4℃，8000rpm离心5min收集菌体，用缓冲溶液洗涤两次，即获得8种诱导的基因工程菌。
实施例四：单一工程菌多酶级联体系催化L-泛解酸内酯合成D-泛解酸内酯
以实施例三方法中制备8种共表达工程菌分别作为生物催化剂，在10mL反应体系中，先用0.2M磷酸盐缓冲溶液(pH7.0)重悬使得终浓度为20g/L，其中底物L-泛解酸内酯、葡萄糖、NADP+与CaCO3的浓度为50g/L、66g/L、0.1mg/mL与0.2g/mL，于30℃、200rpm条件下反应15h。采用高效液相色谱手性柱检测L-泛解酸内酯的转化率，结果表明8种共表达工程菌中，与分子伴侣dsbA、GST或TrxA共表达的工程菌催化反应15h时，L-泛解酸内酯的转化率达到99％以上，产物对映体过量e.e.值大于99％，D-泛解酸内酯产率大于99％。
e.e值计算公式为：(L泛解酸内酯峰面积-D泛解酸内酯峰面积)/(L泛解酸内酯峰面积+D泛解酸内酯峰面积)
实施例五：在不同温度下进行诱导表达的工程菌用于多酶级联体系催化L-泛解酸内酯合成D-泛解酸内酯时的活性评价
按照实施例三的方法对共表达工程菌(pCDFDuet-GST-ReLDH与pET28a-CglCPR-rbsBmGDH)进行诱导表达，区别仅在于将表达时的温度设为25℃或20℃，其余条件不变，收集的湿菌体用于催化L-泛解酸内酯合成D-泛解酸内酯。反应条件为：在10mL反应体系中，先用0.2M磷酸盐缓冲溶液(pH 7.0)重悬使得终浓度为20g/L，其中底物L-泛解酸内酯、葡萄糖、NADP+与CaCO3的浓度为50g/L、66g/L、0.1mg/mL与0.2g/mL，于30℃、200rpm条件下反应，在不同时间段分别取样进行检测。采用高效液相色谱手性柱检测L-泛解酸内酯的减少，结果显示：25℃诱导表达的共表达工程菌在10h时转化率达到99％以上，且已基本完全转化为D-泛解酸内酯(产率大于99％)，而20℃与28℃度表达时的转化率分别为93％与89％，到15h时转化率才达到99％以上。
实施例六：L-泛解酸内酯脱氢酶突变体的构建及与野生型催化活力的比较
6.1L-泛解酸内酯脱氢酶突变体的构建
来源自Rhodococcus erythropolis的L-泛解酸内酯脱氢酶与分子伴侣GST共表达时具有良好的催化活性，为进一步提高其在工业化应用的潜力，本发明人采用EVcouplings(https://v2.evcouplings.org/)共进化序列分析ReLDH的氨基酸序列，获得多重序列比对、结构的从头预测以及突变效应等结果。对显示为有益突变系数大于2.5的取代进行了尝试，结合保守性序列分析，确定了SED ID NO：1的氨基酸序列的第183、156、372与55位为突变靶点。
采用定点突变的方式来实现ReLDH突变体的构建，以实施例三中原始菌株的载体pCDFDuet-GST-ReLDH作为模板，采用表4引物，聚合酶链式反应(PCR)扩增含突变位点的质粒，DpnI消化模板后，转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，挑取单克隆于4mL LB液体培养基中，37℃培养过夜，送由苏州金唯智科技有限公司测序，获得pCDFDuet-GST-ReLDH-F183L、pCDFDuet-GST-ReLDH-I156V、pCDFDuet-GST-ReLDH-T372H与pCDFDuet-GST-ReLDH-A55V四种质粒，保存在-20℃冰箱。
表4
Figure BDA0004069494830000201
Figure BDA0004069494830000211
6.2突变后的L-泛解酸内酯脱氢酶共表达工程菌的诱导表达
取构建的4个突变体质粒，分别与实施例三中重组质粒pET28a-CglCPR-rbsBmGDH按1∶1混合，共转化到感受态大肠杆菌E.coliBL21(DE3)感受态中，涂板于含50μg/mL卡拉霉素与50μg/mL链霉素的LB固体培养基，37℃下过夜培养。分别挑选单克隆菌落于LB液体培养基中，37℃、200rpm培养过夜，提取质粒，验证两种质粒均已转入。将培养液按1∶100接种LB液体培养基，37℃、200rpm条件下，培养至OD600约为0.6-0.8。加入0.1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导培养约18h，温度为25℃，转速180rpm。4℃，8000rpm离心5min收集菌体，用缓冲溶液洗涤两次，即获得4种诱导的基因工程菌。
6.3野生型及突变后的L-泛解酸内酯脱氢酶共表达工程菌的活性比较
以上述制备的含野生型与4种突变体共表达工程菌分别作为生物催化剂，在10mL反应体系中，先用0.2M磷酸盐缓冲溶液(pH 7.0)重悬使得终浓度为20g/L，其中底物L-泛解酸内酯、葡萄糖、NADP+与CaCO3的浓度为65g/L、85.8g/L、0.1mg/mL与0.3g/mL，于30℃、200rpm条件下反应12h。采用实施例三中的方法检测，结果表明野生型pCDFDuet-GST-ReLDH的转化率为77％，相比于野生型，突变体pCDFDuet-GST-ReLDH-F183L反应12h的转化率大于99％，并且经计算，D-泛解酸内酯的产率为98％以上。pCDFDuet-GST-ReLDH-I156V的转化率为91％。可见，通过所述突变，所述工程菌的催化活性进一步增强，即使作为底物的L-泛解酸内酯的浓度上限达到65g/L，也能够在12小时内达到90％以上的转化率。
序列表：
以下将给出本发明中使用的主要序列的信息。
SED ID NO：1∶
Rhodococcus erythropolis L-泛解酸内酯脱氢酶氨基酸序列
MAKNAFFETVAEAQRRAKKRLPKSVYAALVAGSEKGLTVDDNVAAFSELGFAPHAAGLSDKREMSTTIMGQDISLPVMISPTGVQAVHPDGEVAVARAAAARGTAIGLSSFASKSIEEVAAANPQVFFQMYWVGSRDVLLQRMERARAAGAKGLIITTDWSFSYGRDWGSPSIPEKMDLKAMFQFAPEGIMRPKWLLEFAKTGKIPDLTTPNLAAPGQPAPTFFGAYGEWMQTPLPTWEDIAWLREQWGGPFMLKGIMRIDDAKRAVDAGVSAISVSNHGGNNLDGTPAPIRVLPGIAEAVGDQVEVVLDGGIRRGGDVVKALALGAKAVMLGRAYLWGLSANGQAGVENVLDLMRMGIDSGLMGLGHSSITELSPADLVIPEGFTRTLGAS*
SED ID NO：2：
编码Rhodococcus erythropolis L-泛解酸内酯脱氢酶的DNA序列
ATGGCGAAAAACGCGTTTTTTGAAACCGTGGCGGAAGCGCAGCGCCGCGCGAAAAAACGCCTGCCGAAAAGCGTGTATGCGGCGCTGGTGGCGGGCAGCGAAAAAGGCCTGACCGTGGATGATAACGTGGCGGCGTTTAGCGAACTGGGCTTTGCGCCGCATGCGGCGGGCCTGAGCGATAAACGCGAAATGAGCACCACCATTATGGGCCAAGATATTAGCCTGCCGGTGATGATTAGTCCAACGGGCGTGCAAGCCGTGCATCCGGATGGCGAGGTGGCCGTGGCGCGCGCGGCCGCGGCGCGCGGCACCGCGATTGGCCTGAGCAGCTTTGCGAGCAAAAGCATTGAAGAAGTGGCGGCCGCGAACCCGCAAGTGTTTTTTCAGATGTATTGGGTGGGCAGCCGCGATGTGCTGCTGCAGCGCATGGAACGCGCCCGTGCGGCGGGTGCGAAAGGCCTGATTATTACCACCGATTGGAGCTTTAGCTATGGCCGCGATTGGGGCAGCCCGAGCATTCCGGAAAAAATGGATCTGAAAGCGATGTTTCAGTTTGCGCCGGAAGGTATTATGCGCCCGAAATGGCTGCTGGAATTTGCGAAAACCGGCAAAATTCCGGATCTGACCACCCCGAACCTGGCGGCGCCGGGTCAGCCGGCGCCGACCTTTTTTGGCGCGTATGGCGAATGGATGCAGACCCCGCTGCCGACCTGGGAAGATATTGCGTGGCTGCGCGAACAGTGGGGCGGCCCGTTTATGCTGAAGGGCATTATGCGCATTGATGATGCGAAACGCGCGGTGGATGCGGGCGTGAGCGCGATTAGCGTGAGCAACCATGGCGGCAACAACCTGGATGGCACCCCGGCGCCGATTCGCGTGCTGCCGGGCATTGCGGAAGCGGTGGGCGATCAAGTGGAAGTGGTGCTGGATGGCGGCATTCGCCGCGGCGGCGATGTGGTGAAAGCGCTGGCGCTGGGCGCGAAAGCGGTGATGCTGGGCCGCGCGTATCTGTGGGGCCTGAGCGCGAACGGCCAAGCGGGCGTGGAAAACGTGCTGGATCTGATGCGCATGGGCATTGATAGCGGCCTGATGGGCCTGGGCCATAGCAGCATTACCGAACTGAGCCCGGCGGATCTGGTGATTCCGGAAGGCTTTACCCGCACCCTGGGCGCGAGCTAA
SED ID NO：3∶
Bacillus megaterium IWG3葡萄糖脱氢酶氨基酸序列
MYKDLEGKVVVITGSSTGLGKSMAIRFATEKAKVVVNYRSKEDEANSVLEEIKKVGGEAIAVKGDVTVESDIINLVQSAIKEFGKLDVMINNAGLENPVPSHEMSLSDWNKVIDTNLTGAFLGSREAIKYFVENDIRGTVINMSSVHEKIPWPLFVHYAASKGGMRLMTKTLALEYAPKGIRVNNIGPGAINTPINAEKFADPEQRADVESMIPMGYIGEPEEIAAVAAWLASSEASYVTGITLFADGGMTLYPSFQAGRG*
SED ID NO：4：
编码Bacillus megaterium IWG3的DNA序列
ATGTATAAAGATCTGGAAGGCAAAGTGGTTGTGATTACCGGCAGCAGCACCGGCCTGGGCAAAAGCATGGCGATTCGCTTTGCGACCGAAAAAGCGAAAGTTGTGGTTAATTATCGCAGCAAAGAAGATGAAGCGAACAGCGTGCTGGAAGAAATTAAAAAAGTGGGCGGCGAAGCGATTGCGGTGAAAGGCGATGTGACCGTGGAAAGCGATATTATTAACCTGGTGCAGAGCGCGATTAAAGAATTTGGCAAACTGGATGTGATGATTAACAACGCGGGCCTGGAAAACCCGGTGCCGAGCCATGAAATGAGCCTGAGCGATTGGAACAAAGTGATTGATACCAACCTGACCGGCGCGTTTCTGGGCAGCCGCGAAGCGATTAAATATTTTGTGGAAAACGATATTCGCGGCACCGTGATTAACATGAGCAGCGTGCATGAAAAAATTCCGTGGCCGCTGTTTGTGCATTATGCGGCGAGCAAAGGCGGCATGCGCCTGATGACCAAAACCCTGGCGCTGGAATATGCGCCGAAAGGCATTCGCGTGAACAACATTGGCCCGGGCGCGATTAACACCCCGATTAACGCGGAAAAATTTGCCGATCCGGAACAGCGCGCGGATGTGGAAAGCATGATTCCGATGGGCTATATTGGCGAACCGGAAGAAATTGCGGCGGTGGCGGCGTGGCTGGCGAGCAGCGAAGCGAGCTATGTGACCGGCATTACCCTGTTTGCGGATGGCGGCATGACCCTGTATCCGAGCTTTCAAGCGGGCCGCGGCTAA
SED ID NO：5：
Candida glabata D-酮基泛解酸内酯还原酶的氨基酸序列
MVKQEFFKLNNGHEMPGVAIVGTGTKWHKVNETDENFSQTLVDQLKYALSLPGVVHLDAAEFYMTYREVGRALAETSKPRDEIFITDKYWTLSKVTENPIVGLETGLKRLGLEYVDLYLLHSPFISKETNGFSLEEAWGMMEELYHSGKAKNIGVSNFAKEDLERVLKVCKVKPQVNQIEFNAFLQNQTPGIYNFCKQNDIQLAAYSPLGPLQKKPADGNSQPFYSYINKLAQHYNKTPGQVLLRWVTKRGVVAVTTSEKKERIKQAQEIFEFDLKDDEVTEITKLGLDHEPLRLYWHDQYNKYNSESQKA*
SED ID NO：6：
编码Candida glabata D-酮基泛解酸内酯还原酶的DNA序列
ATGGTGAAACAAGAATTTTTTAAACTGAACAACGGCCATGAAATGCCGGGCGTGGCGATTGTGGGCACCGGCACCAAATGGCATAAAGTGAACGAAACCGATGAAAACTTTAGTCAGACCCTGGTGGATCAGCTGAAATATGCGCTGAGCCTGCCGGGCGTGGTGCATCTGGATGCGGCGGAATTTTATATGACCTATCGCGAAGTGGGCCGCGCGCTGGCGGAAACGAGCAAACCGCGCGATGAAATTTTTATTACCGATAAATATTGGACCCTGAGCAAAGTGACCGAGAACCCGATTGTGGGCCTGGAAACCGGCCTGAAACGCCTGGGCCTGGAATATGTGGATCTGTATCTGCTGCATAGCCCGTTTATTAGCAAAGAAACCAACGGCTTTAGCCTGGAAGAAGCGTGGGGCATGATGGAAGAACTGTATCATAGCGGCAAAGCGAAAAACATTGGCGTGAGCAACTTTGCGAAAGAAGATCTGGAACGCGTGCTGAAAGTGTGCAAAGTGAAACCGCAAGTGAATCAGATTGAATTTAACGCGTTTCTGCAGAATCAGACCCCGGGCATTTATAACTTTTGCAAACAGAACGATATTCAGCTGGCGGCGTATAGCCCGCTGGGCCCGCTGCAGAAAAAACCGGCGGATGGCAACAGTCAGCCGTTTTATAGCTATATTAACAAACTGGCGCAGCATTATAACAAAACCCCGGGCCAAGTGCTGCTGCGCTGGGTGACCAAACGCGGCGTGGTGGCGGTGACCACGAGCGAAAAAAAAGAACGCATTAAACAAGCGCAAGAAATTTTTGAATTTGATCTGAAAGATGATGAAGTGACCGAAATCACGAAACTGGGCCTGGATCATGAACCGCTGCGCCTGTATTGGCATGATCAGTATAACAAATATAACAGCGAAAGTCAGAAAGCGTAA
SED ID NO：7：
Rhodococcus erythropolis L-泛解酸内酯脱氢酶突变体F183L的氨基酸序列
MAKNAFFETVAEAQRRAKKRLPKSVYAALVAGSEKGLTVDDNVAAFSELGFAPHAAGLSDKREMSTTIMGQDISLPVMISPTGVQAVHPDGEVAVARAAAARGTAIGLSSFASKSIEEVAAANPQVFFQMYWVGSRDVLLQRMERARAAGAKGLIITTDWSFSYGRDWGSPSIPEKMDLKAMLQFAPEGIMRPKWLLEFAKTGKIPDLTTPNLAAPGQPAPTFFGAYGEWMQTPLPTWEDIAWLREQWGGPFMLKGIMRIDDAKRAVDAGVSAISVSNHGGNNLDGTPAPIRVLPGIAEAVGDQVEVVLDGGIRRGGDVVKALALGAKAVMLGRAYLWGLSANGQAGVENVLDLMRMGIDSGLMGLGHSSITELSPADLVIPEGFTRTLGAS*
SED ID NO：8：
Rhodococcus erythropolis L-泛解酸内酯脱氢酶突变体F183L的碱基序列
ATGGCGAAAAACGCGTTTTTTGAAACCGTGGCGGAAGCGCAGCGCCGCGCGAAAAAACGCCTGCCGAAAAGCGTGTATGCGGCGCTGGTGGCGGGCAGCGAAAAAGGCCTGACCGTGGATGATAACGTGGCGGCGTTTAGCGAACTGGGCTTTGCGCCGCATGCGGCGGGCCTGAGCGATAAACGCGAAATGAGCACCACCATTATGGGCCAAGATATTAGCCTGCCGGTGATGATTAGTCCAACGGGCGTGCAAGCCGTGCATCCGGATGGCGAGGTGGCCGTGGCGCGCGCGGCCGCGGCGCGCGGCACCGCGATTGGCCTGAGCAGCTTTGCGAGCAAAAGCATTGAAGAAGTGGCGGCCGCGAACCCGCAAGTGTTTTTTCAGATGTATTGGGTGGGCAGCCGCGATGTGCTGCTGCAGCGCATGGAACGCGCCCGTGCGGCGGGTGCGAAAGGCCTGATTATTACCACCGATTGGAGCTTTAGCTATGGCCGCGATTGGGGCAGCCCGAGCATTCCGGAAAAAATGGATCTGAAAGCGATGCTGCAGTTTGCGCCGGAAGGTATTATGCGCCCGAAATGGCTGCTGGAATTTGCGAAAACCGGCAAAATTCCGGATCTGACCACCCCGAACCTGGCGGCGCCGGGTCAGCCGGCGCCGACCTTTTTTGGCGCGTATGGCGAATGGATGCAGACCCCGCTGCCGACCTGGGAAGATATTGCGTGGCTGCGCGAACAGTGGGGCGGCCCGTTTATGCTGAAGGGCATTATGCGCATTGATGATGCGAAACGCGCGGTGGATGCGGGCGTGAGCGCGATTAGCGTGAGCAACCATGGCGGCAACAACCTGGATGGCACCCCGGCGCCGATTCGCGTGCTGCCGGGCATTGCGGAAGCGGTGGGCGATCAAGTGGAAGTGGTGCTGGATGGCGGCATTCGCCGCGGCGGCGATGTGGTGAAAGCGCTGGCGCTGGGCGCGAAAGCGGTGATGCTGGGCCGCGCGTATCTGTGGGGCCTGAGCGCGAACGGCCAAGCGGGCGTGGAAAACGTGCTGGATCTGATGCGCATGGGCATTGATAGCGGCCTGATGGGCCTGGGCCATAGCAGCATTACCGAACTGAGCCCGGCGGATCTGGTGATTCCGGAAGGCTTTACCCGCACCCTGGGCGCGAGCTAASED ID NO：9：
Rhodococcus erythropolis L-泛解酸内酯脱氢酶突变体I156V的
氨基酸序列
MAKNAFFETVAEAQRRAKKRLPKSVYAALVAGSEKGLTVDDNVAAFSELGFAPHAAGLSDKREMSTTIMGQDISLPVMISPTGVQAVHPDGEVAVARAAAARGTAIGLSSFASKSIEEVAAANPQVFFQMYWVGSRDVLLQRMERARAAGAKGLIVTTDWSFSYGRDWGSPSIPEKMDLKAMFQFAPEGIMRPKWLLEFAKTGKIPDLTTPNLAAPGQPAPTFFGAYGEWMQTPLPTWEDIAWLREQWGGPFMLKGIMRIDDAKRAVDAGVSAISVSNHGGNNLDGTPAPIRVLPGIAEAVGDQVEVVLDGGIRRGGDVVKALALGAKAVMLGRAYLWGLSANGQAGVENVLDLMRMGIDSGLMGLGHSSITELSPADLVIPEGFTRTLGAS*
SED ID NO：10：
Rhodococcus erythropolis L-泛解酸内酯脱氢酶突变体1156V的碱基序列
ATGGCGAAAAACGCGTTTTTTGAAACCGTGGCGGAAGCGCAGCGCCGCGCGAAAAAACGCCTGCCGAAAAGCGTGTATGCGGCGCTGGTGGCGGGCAGCGAAAAAGGCCTGACCGTGGATGATAACGTGGCGGCGTTTAGCGAACTGGGCTTTGCGCCGCATGCGGCGGGCCTGAGCGATAAACGCGAAATGAGCACCACCATTATGGGCCAAGATATTAGCCTGCCGGTGATGATTAGTCCAACGGGCGTGCAAGCCGTGCATCCGGATGGCGAGGTGGCCGTGGCGCGCGCGGCCGCGGCGCGCGGCACCGCGATTGGCCTGAGCAGCTTTGCGAGCAAAAGCATTGAAGAAGTGGCGGCCGCGAACCCGCAAGTGTTTTTTCAGATGTATTGGGTGGGCAGCCGCGATGTGCTGCTGCAGCGCATGGAACGCGCCCGTGCGGCGGGTGCGAAAGGCCTGATTGTGACCACCGATTGGAGCTTTAGCTATGGCCGCGATTGGGGCAGCCCGAGCATTCCGGAAAAAATGGATCTGAAAGCGATGTTTCAGTTTGCGCCGGAAGGTATTATGCGCCCGAAATGGCTGCTGGAATTTGCGAAAACCGGCAAAATTCCGGATCTGACCACCCCGAACCTGGCGGCGCCGGGTCAGCCGGCGCCGACCTTTTTTGGCGCGTATGGCGAATGGATGCAGACCCCGCTGCCGACCTGGGAAGATATTGCGTGGCTGCGCGAACAGTGGGGCGGCCCGTTTATGCTGAAGGGCATTATGCGCATTGATGATGCGAAACGCGCGGTGGATGCGGGCGTGAGCGCGATTAGCGTGAGCAACCATGGCGGCAACAACCTGGATGGCACCCCGGCGCCGATTCGCGTGCTGCCGGGCATTGCGGAAGCGGTGGGCGATCAAGTGGAAGTGGTGCTGGATGGCGGCATTCGCCGCGGCGGCGATGTGGTGAAAGCGCTGGCGCTGGGCGCGAAAGCGGTGATGCTGGGCCGCGCGTATCTGTGGGGCCTGAGCGCGAACGGCCAAGCGGGCGTGGAAAACGTGCTGGATCTGATGCGCATGGGCATTGATAGCGGCCTGATGGGCCTGGGCCATAGCAGCATTACCGAACTGAGCCCGGCGGATCTGGTGATTCCGGAAGGCTTTACCCGCACCCTGGGCGCGAGCTAA
SED ID NO：11：
GST氨基酸序列
MKLFYKPGACSLASHITLRESGKDFTLVSVDLMKKRLENGDDYFAVNPKGQVPALLLDDGTLLTEGVAIMQYLADSVPDRQLLAPVNSISRYKTIEWLNYIATELHKGFTPLFRPDTPEEYKPTVRAQLEKKLQYVNEALKDEHWICGQRFTIADAYLFTVLRWAYAVKLNLEGLEHIAAFMQRMAERPEVQDALSAEGLK
SED ID NO：12：
DsbA氨基酸序列
MKKIWLALAGLVLAFSASAAQYEDGKQYTTLEKPVAGAPQVLEFFSFFCPHCYQFEEVLHISDNVKKKLPEGVKMTKYHVNFMGGDLGKDLTQAWAVAMALGVEDKVTVPLFEGVQKTQTIRSASDIRDVFINAGIKGEEYDAAWNSFVVKSLVAQQEKAAADVQLRGVPAMFVNGKYQLNPQGMDTSNMDVFVQQYADTVKYLSEKK
SED ID NO：13：
dsbC氨基酸序列
MKKGFMLFTLLAAFSGFAQADDAAIQQTLAKMGIKSSDIQPAPVAGMKTVLTNSGVLYITDDGKHIIQGPMYDVSGTAPVNVTNKMLLKQLNALEKEMIVYKAPQEKHVITVFTDITCGYCHKLHEQMADYNALGITVRYLAFPRQGLDSDAEKEMKAIWCAKDKNKAFDDVMAGKSVAPASCDVDIADHYALGVQLGVSGTPAVVLSNGTLVPGYQPPKEMKEFLDEHQKMTSGK
SED ID NO：14：
Gor氨基酸序列
MTKHYDYIAIGGGSGGIASINRAAMYGQKCALIEAKELGGTCVNVGCVPKKVMWHAAQIREAIHMYGPDYGFDTTINKFNWETLIASRTAYIDRIHTSYENVLGKNNVDVIKGFARFVDAKTLEVNGETITADHILIATGGRPSHPDIPGVEYGIDSDGFFALPALPERVAVVGAGYIAVELAGVINGLGAKTHLFVRKHAPLRSFDPMISETLVEVMNAEGPQLHTNAIPKAVVKNTDGSLTLELEDGRSETVDCLIWAIGREPANDNINLEAAGVKTNEKGYIVVDKYQNTNIEGIYAVGDNTGAVELTPVAVAAGRRLSERLFNNKPDEHLDYSNIPTVVFSHPPIGTVGLTEPQAREQYGDDQVKVYKSSFTAMYTAVTTHRQPCRMKLVCVGSEEKIVGIHGIGFGMDEMLQGFAVALKMGATKKDFDNTVAIHPTAAEEFVTMR
SED ID NO：15：
grpE氨基酸序列
MSSKEQKTPEGQAPEEIIMDQHEEIEAVEPEASAEQVDPRDEKVANLEAQLAEAQTRERDGILRVKAEMENLRRRTELDIEKAHKFALEKFINELLPVIDSLDRALEVADKANPDMSAMVEGIELTLKSMLDVVRKFGVEVIAETNVPLDPNVHQAIAMVESDDVAPGNVLGIMQKGYTLNGRTIRAAMVTVAKAKA
SED ID NO：16：
trxA氨基酸序列
MSDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILVDFWAEWCGPCKMIAPILDEIADEYQGKLTVAKLNIDQNPGTAPKYGIRGIPTLLLFKNGEVAATKVGALSKGQLKEFLDANLA
SED ID NO：17：
trxB氨基酸序列
MGTTKHSKLLILGSGPAGYTAAVYAARANLQPVLITGMEKGGQLTTTTEVENWPGDPNDLTGPLLMERMHEHATKFETEIIFDHINKVDLQNRPFRLNGDNGEYTCDALIIATGASARYLGLPSEEAFKGRGVSACATCDGFFYRNQKVAVIGGGNTAVEEALYLSNIASEVHLIHRRDGFRAEKILIKRLMDKVENGNIILHTNRTLEEVTGDQMGVTGVRLRDTQNSDNIESLDVAGLFVAIGHSPNTAIFEGQLELENGYIKVQSGIHGNATQTSIPGVFAAGDVMDHIYRQAITSAGTGCMAALDAERYLDGLADAK

Claims (19)

1.一种L-泛解酸内酯脱氢酶，其包含如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9中任一项所示的氨基酸序列或与所述序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的氨基酸序列。
2.一种核酸分子，其包含编码如权利要求1所述的L-泛解酸内酯脱氢酶的序列。
3.如权利要求2所述的核酸分子，其包含以下的(a)且任选包含以下的(b)：
(a)编码如权利要求1所述的L-泛解酸内酯脱氢酶的核酸序列；
(b)编码分子伴侣的核酸序列，所述分子伴侣选自下组中的一种或多种：谷胱甘肽巯基转移酶(GST)、二硫化物氧化还原酶(dsbA)、蛋白质二硫键异构酶(dsbC)、谷胱甘肽还原酶(gor)、硫氧还蛋白-1(trxA)、硫氧还原蛋白还原酶(trxB)、核苷酸交换因子(grpE)，优选dsbA、GST或TrxA。
4.如权利要求2或3所述的核酸分子，其中，所述编码如权利要求1所述的L-泛解酸内酯脱氢酶的序列包含如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：10中任一项所示的核酸序列或与所述序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的核酸序列。
5.如权利要求3或4所述的核酸分子，其中，所述分子伴侣具有选自下组的任意序列：SEQ ID NO：11～SEQ ID NO：17中任一项所示的序列或与上述各序列中的任意序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的氨基酸序列。
6.如权利要求3～5中任一项所述的核酸分子，其进一步包含：
(c)编码葡萄糖脱氢酶的核酸序列。
7.如权利要求6所述的核酸分子，其中，所述葡萄糖脱氢酶包含如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列或与所述序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的氨基酸序列。
8.如权利要求3～7中任一项所述的核酸分子，其进一步包含：
(d)编码D-酮基泛解酸内酯还原酶的核酸序列。
9.如权利要求8中所述的核酸分子，其中，所述D-酮基泛解酸内酯还原酶包含如SEQ IDNO：5所示的氨基酸序列或与所述序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的氨基酸序列。
10.如权利要求2～9中任一项所述的核酸分子，其中，所述核酸分子是一种重组载体或重组载体组合。
11.如权利要求2～10中任一项所述的核酸分子，其中，所述核酸分子是一种重组载体或重组载体组合，所述重组载体组合包含第一重组载体和第二重组载体，
第一重组载体中包含：
(a)编码如权利要求1所述的L-泛解酸内酯脱氢酶的核酸序列，所述核酸序列包含如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：10中任一项所示的核酸序列或与所述序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的核酸序列；以及
(b)编码分子伴侣的核酸序列，所述分子伴侣具有选自下组的任意序列：SEQ ID NO：11～SEQ ID NO：17中任一项所示的序列或与上述各序列中的任意序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的氨基酸序列。
第二重组载体中包含：
(c)编码葡萄糖脱氢酶的核酸序列；以及
(d)编码D-酮基泛解酸内酯还原酶的核酸序列。
12.一种工程菌，其表达如权利要求1所述的L-泛解酸内酯脱氢酶，或包含如权利要求2～11中任一项所述的核酸分子。
13.如权利要求12所述的工程菌，其中，所述工程菌是通过对选自以下的宿主细胞中的任意一种进行加工而得到的：大肠杆菌、枯草杆菌、谷氨酸棒状杆菌、酵母细胞或曲霉菌等。
14.如权利要求12或13所述的工程菌，其中，所述宿主细胞是大肠杆菌E.coil BL21(DE3)。
15.一种制备D-泛解酸内酯的方法，其包含以下步骤：
(a)通过如权利要求1所述的L-泛解酸内酯脱氢酶催化L-泛解酸内酯脱氢，生成酮基泛解酸内酯；
(b)由酮基泛解酸内酯还原，形成D-泛解酸内酯。
16.如权利要求15所述的制备D-泛解酸内酯的方法，其中，所述步骤(a)通过如权利要求12～14中任一项所述的工程菌进行；或者，步骤(a)以及步骤(b)都通过如权利要求12～14中任一项所述的工程菌进行。
17.如权利要求15或16所述的制备D-泛解酸内酯的方法，其中，所述方法的具体实施步骤包括：
(i)对宿主细胞进行加工，并筛选出如权利要求12～14中任一项所述的工程菌的步骤；
(ii)对所述工程菌进行诱导培养，使其表达需要的蛋白的步骤；
(iii)将所述工程菌加入至包含L-泛解酸内酯的底物中进行反应的步骤。
18.如权利要求17中所述的制备D-泛解酸内酯的方法，其中，所述步骤(ii)在20℃～28℃下进行诱导培养，优选为25℃。
19.如权利要求17-18中任一项所述的制备D-泛解酸内酯的方法，其中，L-泛解酸内酯的终浓度为10-65g/L，优选为50-65g/L。
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