CN115747183A - 一种酮还原酶突变体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种酮还原酶突变体及其应用，该酮还原酶突变体是由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列发生突变得到的，所述突变至少包括如下突变位点中的一个：第94位由H突变为F或M，第146位由T突变为A、G或V，第161位由Y突变为A或T，第190位由C突变为H、L或Q，第195位由A突变为K或E。该酮还原酶突变体可应用于手性醇化合物的绿色化学合成中，催化活性高，稳定性好。与化学合成方法相比，其所催化的反应简单温和，反应选择性高，制备成本低，具有较好的应用前景。

Description

一种酮还原酶突变体及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说涉及一种酮还原酶突变体及其应用。

背景技术

目前，生物酶化被广泛应用于化学工业中大规模生产药物或其手性中间体。利用生物酶催化的反应具有很多优点，例如，可在良性溶剂中，温和反应条件下进行，具有良好的特异性和立体选择性。然而，利用生物酶的催化反应也有自身的缺点，包括：在生产反应条件下缺乏稳定性，产物抑制，反应需要在水介质中进行，而许多感兴趣的底物的水溶性差，不能进行有效反应。为了克服上述缺陷，人们对生物酶进行了各种技术修饰，如定向进化、随机突变和蛋白质工程，来克服上述缺点，使得生物酶能高效、环保地用于化学分子的合成，如活性药物成分。

酮还原酶(KREDs)(EC 1.1.1)是醛酮还原酶的一部分，它催化羰基还原为手性醇。KRED催化前手性酮(羰基)还原为手性醇的例子已经被报道，包括工业规模上的一些应用。孟鲁司特的合成是一个典型的例子，在该药物的合成过程中，人们利用KRED替代现有的和昂贵的化学还原剂(DIP-Cl)。现有技术还报道了在磺培南，阿托伐他汀，瑞舒伐他汀，替格瑞洛等药物合成过程中利用酮还原酶合成手性醇。酮还原酶作为立体选择性还原催化剂在合成活性药物分子或其中间体中的应用越来越广泛。但是酮还原酶对不同非天然底物的催化活性差异很大，例如，同一种酮还原酶对有些非天然羰基底物来说，将其催化还原为手性醇的效果很好，但是对另外一些特定的非天然羰基底物来说，根本没有催化效果，或者催化效果非常差，而且在稳定性及选择性上差异也比较大。因此，对很多羰基底物来说，利用酮还原酶催化其还原为手性醇的过程中存在的问题是：现有技术中没有合适的酮还原酶，因为这些酮还原酶大多情况下催化效果不佳，需要寻找合适的酮还原酶，或者通过理性设计提高已知酮还原酶的活性和特异性，促进酮还原酶在手性醇的合成及产业化生产上的应用。

发明内容

为了解决化学合成特定手性醇过程中存在的低效率和低选择性，以及现有酮还原酶催化特定羰基底物还原为手性醇的活性低以及稳定性差的问题，本发明一方面的目的是提供一种对特定羰基底物催化活性高、立体选择性好的酮还原酶突变体。为实现本发明的目的，本发明采用以下技术方案：

一种酮还原酶突变体，该酮还原酶突变体的氨基酸序列是由SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列发生突变得到的氨基酸序列，所述突变至少包括如下突变位点中的一个：第94位由H突变为F或M，第146位由T突变为A、G或V，第161位由Y突变为A或T，第190位由C突变为H、L或Q，第195位由A突变为K或E，或者所述酮还原酶突变体的氨基酸序列具有发生突变的氨基酸序列中的突变位点，与发生突变的氨基酸序列具有至少80％以上、或至少85％以上、或至少90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％的以上同源性，且与发生突变的氨基酸序列具有相同的功能。

在本发明的一些优选具体实施例中，上述突变至少包括如下突变位点中的一个：第94位由H突变为F，第146位由T突变为A，第161位由Y突变为T，第190位由C突变为Q，第195位由A突变为K，或者所述酮还原酶突变体的氨基酸序列具有发生突变的氨基酸序列中的突变位点，与发生突变的氨基酸序列具有至少80％以上、或至少85％以上、或至少90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％的以上的同源性，且与发生突变的氨基酸序列具有相同的功能。

在本发明的一些优选具体实施例中，上述酮还原酶突变体包括突变位点：第94位由H突变为F，第146位由T突变为A，以及第161位由Y突变为T。在本发明的一些优选具体实施例中，上述酮还原酶突变体包括突变位点：第94位由H突变为F，第146位由T突变为A，第161位由Y突变为T，以及第190位由C突变为Q。在本发明的一些优选具体实施例中，第94位由H突变为F，第146位由T突变为A，第161位由Y突变为T，第190位由C突变为Q，以及第195位由A突变为K，或者所述酮还原酶突变体的氨基酸序列具有发生突变的氨基酸序列中的突变位点，与发生突变的氨基酸序列具有至少80％以上、或至少85％以上、或至少90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％的以上的同源性，且与发生突变的氨基酸序列具有相同的功能。

本发明另一方面的目的是提供编码上述酮还原酶突变体的基因。

在本发明的一些优选具体实施例中，上述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.6、SEQID NO.7或SEQ ID NO.8所示序列。

在本发明的一些更优选具体实施例中，上述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.8所示序列。

本发明再一方面的目的是提供一种重组表达载体，该重组表达载体包含编码上述酮还原酶突变体的基因。

在本发明的一些优选具体实施例中，所述重组表达载体选自pET-28a、pET-dute1或pRSF-dute1。在本发明的一些更优选具体实施例中，所述重组表达载体选自pET-28a。

本发明再一方面的目的是提供一种基因工程菌，该基因工程菌用于生产上述酮还原酶突变体，其包含上述重组表达载体。

在本发明的一些优选具体实施例中，上述基因工程菌选自大肠杆菌MG1655、大肠杆菌BL21(DE3)或大肠杆菌BL21(DE3)pLysS。

在本发明的一些更优选具体实施例中，上述基因工程菌选自大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明再一方面的目的是提供上述酮还原酶突变体在催化羰基化合物制备手性醇化合物中的应用。

在本发明的一些优选具体实施例中，所述羰基化合物的结构式为

其中，R₁和R₂各自独立地为C₁～C₈烷基、C₅～C₁₀环烷基、C₅～C₁₀芳基、C₅～C₁₀杂芳基或含胺基、醚、硫醚或酯的基团，或者R₁和R₂与羰基上的碳共同形成5～10元环，

所述5～10元环全部由碳构成，或所述5～10元环中除碳原子之外还有杂原子参与构成5～10元环，所述杂原子选自N、O、S，以及

所述5～10元环是未被取代的，或是被卤素、氧、硫、羟基、烷氧基或烷基中的至少一个基团所取代，

所述手性醇化合物的结构式为

在本发明的一些优选具体实施例中，所述羰基化合为式I所示化合物，所述醇类化合物为式II所示化合物：

本发明的上述酮还原酶突变体是在氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示的酮还原酶的基础上，通过定点突变的方法进行突变，从而改变其氨基酸序列，实现蛋白质结构和功能的改变，再通过定向筛选的方法，得到具有上述突变位点的酮还原酶。与野生型酮还原酶相比，本发明的酮还原酶突变体的选择性大幅度提高，同等条件下还原得到的产物的ee值相对于野生型酮还原酶由0提高了99.7％，酶活性也大幅度提高，用于手性醇生产时，大幅度降低了手性醇工业生产中的成本。

附图说明

图1为本发明的酮还原酶重组表达载体图。

图2显示的泳道从左至右分别是Marker、野生型(其氨基酸序列为SEQ ID NO:1)、BL21(DE3)-i的蛋白酶(其氨基酸序列为Seq ID No.3)、BL21(DE3)-ii的蛋白酶(其氨基酸序列为Seq ID No.4)、BL21(DE3)-iii的蛋白酶(其氨基酸序列为Seq ID No.5)的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。

图3为Marker和BL21(DE3)-iii的蛋白酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。

图4为实施例7得到的手性醇产物的液相色谱图谱。

具体实施方式

来源于Arthrobacter sp.TS-15的酮还原酶可以选择性还原羰基化合物，但是其催化上述式I所示化合物还原为手性醇的活性较低，选择性较差。本发明的发明人通过理性设计的方法提高来源于Arthrobacter sp.TS-15的酮还原酶的活性与选择性。通过全质粒PCR的方式在来源于Arthrobactersp.TS-15的酮还原酶上引入突变位点，以及对突变体进行活性和稳定性检测，挑选活性和稳定性提高的突变体。

本发明所提供的酮还原酶突变体基因来源于Arthrobacter sp.TS-15的野生型基因。该野生型基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，针对大肠杆菌进行密码子优化后的基因序列如SEQ ID NO:2所示。其中，“野生型”是指在自然界发现的形式。例如，天然存在的或野生型的多肽或多核苷酸序列是存在于生物体中的序列，能够从自然界来源中分离并且没有被人为操作有意修饰。这些基因表达后得到的酶对于某些底物的催化活力低，热稳定性较差。

来源于Arthrobacter sp.TS-15的酮还原酶的氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示：

MNGRIMLVEGKNGIVTGAAGGIGRASAVAFAREGANVVIGDLQARLEDLEETARQ

VKKAGGEARVLVMDVTALADQEHAVRTVIENFGTLDFAHNNAGIELQKTALETTE

EEWDRVHDVNLKGVFLGMKAQLRAMIDNGGGSIVNTASAAGILGLPGYSGYASSK

HGVVGLTKSVAVEAADTGVRINAVCPASIATPMLLSLPAEEQETLLSWQAIKRLGK

PDEVAQAVVWLASDRASFITGVSLPVDAGYSAF

来源于Arthrobacter sp.TS-15的酮还原酶的cDNA，针对大肠杆菌进行密码子优化后的基因序列如SEQ ID NO.2所示：

ATGAACGGCCGCATTATGCTGGTGGAAGGCAAAAACGGCATTGTGACCGGCGC

GGCGGGCGGTATCGGTCGTGCGAGCGCCGTGGCGTTTGCGCGCGAAGGCGCGA

ACGTGGTGATTGGCGATCTGCAAGCGCGCCTGGAAGATCTGGAAGAAACCGCG

CGCCAAGTGAAAAAAGCGGGCGGCGAAGCGCGCGTGCTGGTGATGGATGTGAC

CGCGCTGGCGGATCAAGAACATGCGGTGCGCACCGTGATTGAAAACTTTGGCAC

CCTGGATTTTGCGCATAACAACGCGGGCATTGAACTGCAGAAAACCGCGCTGGA

AACCACCGAAGAGGAATGGGATCGCGTGCATGATGTGAACCTGAAAGGCGTGT

TTCTGGGCATGAAAGCGCAGCTGCGCGCGATGATTGATAACGGCGGTGGCAGC

ATTGTGAACACCGCGAGCGCGGCGGGCATTCTGGGCCTGCCGGGCTACAGCGGT

TACGCGAGCAGCAAACATGGCGTGGTGGGCCTGACCAAAAGCGTGGCGGTGGA

AGCGGCGGATACCGGCGTGCGCATTAACGCGGTGTGCCCGGCGAGCATTGCGA

CCCCGATGCTGCTGAGCCTGCCGGCGGAAGAACAAGAAACCCTGCTGAGCTGG

CAAGCGATTAAACGCCTGGGCAAACCGGATGAAGTGGCGCAAGCGGTGGTGTG

GCTGGCGAGCGATCGCGCGAGCTTTATTACCGGCGTGAGCCTGCCGGTGGACGC

CGGTTATAGCGCGTTT

本发明通过在线蛋白结构预测工具获得来源于Arthrobacter sp.TS-15酮还原酶的三维结构，并通过PDB获取与其结构相似度最高的环己醇脱氢酶的三维结构(4ure.1.A，同源性46.75％)做结构比对，然后通过AutoDock进行式I底物与酮还原酶蛋白质三维结构的进行结合模拟，最后通过Pymol分析，选择有可能与底物结合相关的氨基酸作为突变氨基酸。根据Pymol分析结果，设计了多对定点突变(H94F/M，T146A/G/V，Y161A/T，C190H/L/Q，A195K/E)引物，利用定点突变手段，以pET-28a为表达载体，获得带有目的基因的突变质粒。其中，定点突变：是指通过聚合酶链式反应(PCR)等方法向目的DNA片段(可以是基因组，也可以是质粒)中引入所需变化(通常是表征有利方向的变化)，包括碱基的添加、删除、点突变等。定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。

本发明提供的酮还原酶突变体是由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列发生突变得到的氨基酸序列，所述突变至少包括如下突变位点中的一个：第94位由H突变为F或M，第146位由T突变为A、G或V，第161位由Y突变为A或T，第190位由C突变为H、L或Q，第195位由A突变为K或E。在本发明的一个优选具体实施例中，所述突变至少包括如下突变位点中的一个：第94位由H突变为F(H94F)，第146位由T突变为A(T146A)，第161位由Y突变为T(Y161T)，第190位由C突变为Q(C190Q)，第195位由A突变为K(A195K)，或者所述酮还原酶突变体的氨基酸序列具有发生突变的氨基酸序列中的突变位点，与发生突变的氨基酸序列具有至少80％以上、或至少85％以上、或至少90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％的以上同源性，且与发生突变的氨基酸序列具有相同的功能。其中“同源性”是指两个氨基酸序列之间的同一度。本发明用不同程度同源性限定的序列还必须要同时具有改进的酮还原酶活性。其中“相同的功能”是指与所述发生突变的氨基酸序列一样具有催化羰基底物还原为手性醇的功能。本领域技术人员可以在本申请公开内容的教导下获得酮还原酶突变体的氨基酸序列，其具有上述发生突变的氨基酸序列中的突变位点，且与发生突变的氨基酸序列具有至少80％以上、或至少85％以上、或至少90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％的以上同源性。

在本发明的一个更优选具体实施例中，上述酮还原酶突变体包括突变位点H94F，T146A，Y161T，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。在本发明的一个更优选具体实施例中，上述酮还原酶突变体包括突变位点H94F，T146A，Y161T，C190Q，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。在本发明的一个更优选具体实施例中，上述酮还原酶突变体包括突变位点H94F，T146A，Y161T，C190Q和A195K，其氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。

SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列如下：

MNGRIMLVEGKNGIVTGAAGGIGRASAVAFAREGANVVIGDLQARLEDLEETARQ

VKKAGGEARVLVMDVTALADQEHAVRTVIENFGTLDFAFNNAGIELQKTALETTE

EEWDRVHDVNLKGVFLGMKAQLRAMIDNGGGSIVNAASAAGILGLPGYSGTASSK

HGVVGLTKSVAVEAADTGVRINAVCPASIATPMLLSLPAEEQETLLSWQAIKRLGK

PDEVAQAVVWLASDRASFITGVSLPVDAGYSAF

SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列如下：

MNGRIMLVEGKNGIVTGAAGGIGRASAVAFAREGANVVIGDLQARLEDLEETARQ

VKKAGGEARVLVMDVTALADQEHAVRTVIENFGTLDFAFNNAGIELQKTALETTE

EEWDRVHDVNLKGVFLGMKAQLRAMIDNGGGSIVNAASAAGILGLPGYSGTASSK

HGVVGLTKSVAVEAADTGVRINAVQPASIATPMLLSLPAEEQETLLSWQAIKRLGK

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SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列如下：

MNGRIMLVEGKNGIVTGAAGGIGRASAVAFAREGANVVIGDLQARLEDLEETARQ

VKKAGGEARVLVMDVTALADQEHAVRTVIENFGTLDFAFNNAGIELQKTALETTE

EEWDRVHDVNLKGVFLGMKAQLRAMIDNGGGSIVNAASAAGILGLPGYSGTASSK

HGVVGLTKSVAVEAADTGVRINAVQPASIKTPMLLSLPAEEQETLLSWQAIKRLGK

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本发明提供了编码上述酮还原酶突变体的基因。本发明通过理性设计(定点突变或其它方法改变蛋白质分子中的个别氨基酸)以及重叠延伸PCR、无缝克隆等方法对野生型酮还原酶的基因进行突变，获得了上述酮还原酶突变体的目的基因。在本发明的一个优选具体实施例中，该基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.6所示序列。在本发明的一个优选具体实施例中，该基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.7所示序列。在本发明的一个优选具体实施例中，该基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.8所示序列，或者该基因的核苷酸序列为与SEQ IDNO.8所示序列具有至少80％以上、或至少85％以上、或至少90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％的以上的同源性。

SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列如下：

ATGAACGGCCGCATTATGCTGGTGGAAGGCAAAAACGGCATTGTGACGGGCGCGGCGGGT

GGCATTGGTCGCGCGAGTGCGGTGGCGTTTGCGCGCGAAGGCGCGAACGTGGTGATTGGCG

ATCTGCAAGCGCGCCTGGAAGATCTGGAAGAAACCGCGCGCCAAGTGAAAAAAGCGGGCG

GCGAAGCGCGCGTGCTGGTGATGGATGTGACCGCGCTGGCGGATCAAGAACATGCGGTGCG

CACCGTGATTGAAAACTTTGGCACCCTGGATTTTGCGTTTAACAACGCGGGCATTGAACTGC

AGAAAACCGCGCTGGAAACCACCGAAGAGGAATGGGATCGCGTGCATGATGTGAACCTGA

AAGGCGTGTTTCTGGGCATGAAAGCGCAGCTGCGCGCGATGATTGATAACGGTGGCGGTAG

TATTGTGAACGCGGCGAGCGCGGCGGGCATCCTGGGCCTGCCGGGCTACAGCGGCACCGCG

AGCAGCAAACATGGCGTGGTGGGCCTGACCAAAAGCGTGGCGGTGGAAGCGGCGGATACC

GGCGTGCGCATTAACGCGGTGTGTCCGGCGAGCATTGCGACCCCGATGCTGCTGAGCCTGC

CGGCCGAGGAACAAGAAACCCTGCTGAGCTGGCAAGCGATTAAACGCCTGGGCAAACCGG

ATGAAGTGGCGCAAGCGGTGGTGTGGCTGGCGAGCGATCGCGCGAGCTTTATTACCGGCGT

TAGCCTGCCGGTTGATGCGGGCTATAGCGCGTTT

SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列如下：

ATGAACGGCCGCATTATGCTGGTGGAAGGCAAAAACGGCATTGTGACGGGCGC

GGCGGGTGGCATTGGTCGCGCGAGTGCGGTGGCGTTTGCGCGCGAAGGCGCGA

ACGTGGTGATTGGCGATCTGCAAGCGCGCCTGGAAGATCTGGAAGAAACCGCG

CGCCAAGTGAAAAAAGCGGGCGGCGAAGCGCGCGTGCTGGTGATGGATGTGAC

CGCGCTGGCGGATCAAGAACATGCGGTGCGCACCGTGATTGAAAACTTTGGCAC

CCTGGATTTTGCGTTTAACAACGCGGGCATTGAACTGCAGAAAACCGCGCTGGA

AACCACCGAAGAGGAATGGGATCGCGTGCATGATGTGAACCTGAAAGGCGTGT

TTCTGGGCATGAAAGCGCAGCTGCGCGCGATGATTGATAACGGTGGCGGTAGTA

TTGTGAACGCGGCGAGCGCGGCGGGCATCCTGGGCCTGCCGGGCTACAGCGGC

ACCGCGAGCAGCAAACATGGCGTGGTGGGCCTGACCAAAAGCGTGGCGGTGGA

AGCGGCGGATACCGGCGTGCGCATTAACGCGGTGCAGCCGGCGAGCATTGCGA

CCCCGATGCTGCTGAGCCTGCCGGCCGAGGAACAAGAAACCCTGCTGAGCTGG

CAAGCGATTAAACGCCTGGGCAAACCGGATGAAGTGGCGCAAGCGGTGGTGTG

GCTGGCGAGCGATCGCGCGAGCTTTATTACCGGCGTTAGCCTGCCGGTTGATGC

GGGCTATAGCGCGTTT

SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列如下：

ATGAACGGCCGCATTATGCTGGTGGAAGGCAAAAACGGCATTGTGACGGGCGCGGC

GGGTGGCATTGGTCGCGCGAGTGCGGTGGCGTTTGCGCGCGAAGGCGCGAACGTGGT

GATTGGCGATCTGCAAGCGCGCCTGGAAGATCTGGAAGAAACCGCGCGCCAAGTGA

AAAAAGCGGGCGGCGAAGCGCGCGTGCTGGTGATGGATGTGACCGCGCTGGCGGAT

CAAGAACATGCGGTGCGCACCGTGATTGAAAACTTTGGCACCCTGGATTTTGCGTTTA

ACAACGCGGGCATTGAACTGCAGAAAACCGCGCTGGAAACCACCGAAGAGGAATGG

GATCGCGTGCATGATGTGAACCTGAAAGGCGTGTTTCTGGGCATGAAAGCGCAGCTG

CGCGCGATGATTGATAACGGTGGCGGTAGTATTGTGAACGCGGCGAGCGCGGCGGGC

ATCCTGGGCCTGCCGGGCTACAGCGGCACCGCGAGCAGCAAACATGGCGTGGTGGGC

CTGACCAAAAGCGTGGCGGTGGAAGCGGCGGATACCGGCGTGCGCATTAACGCGGT

GCAGCCGGCGAGCATTAAAACCCCGATGCTGCTGAGCCTGCCGGCCGAGGAACAAG

AAACCCTGCTGAGCTGGCAAGCGATTAAACGCCTGGGCAAACCGGATGAAGTGGCGC

AAGCGGTGGTGTGGCTGGCGAGCGATCGCGCGAGCTTTATTACCGGCGTTAGCCTGC

CGGTTGATGCGGGCTATAGCGCGTTT

本发明的基因编码得到的酮还原酶，提高了酶活性和酶的稳定性。使得手性醇的工业生产效率更高，成本更低。

本发明提供的重组表达载体含有编码本发明的酮还原酶突变体的基因。该基因位于重组表达载体的适当位置，使得上述基因能够正确地、顺利地复制、转录或表达。为了满足重组操作的要求，在该重组表达载体中，上述基因序列的两端可添加合适的限制性内切酶的酶切位点，或者额外增加启动密码子、终止密码子等。该重组表达载体可以是原核表达载体也可以是真核表达载体。在本发明中，该重组表达载体包括但不局限于pET-28a、pET-dute1或pRSF-dute1。

本发明提供的基因工程菌用于生产上述酮还原酶突变体，其包含上述重组表达载体。在本发明中，该基因工程菌包括但不局限于大肠杆菌MG1655、大肠杆菌BL21(DE3)和大肠杆菌BL21(DE3)pLysS。

通过发酵培养该基因工程菌可制备上述酮还原酶突变体。例如在一定生产罐发酵条件下，进行工业化制备上述酮还原酶突变体。所述生产罐发酵条件优选：DO 20％以上，温度为室温。

在本发明的一个优选具体实施例中，在对酮还原酶基进行突变时，采用的是无缝克隆的方式，pET28a质粒上的引物分别位于酮还原酶基因的上下游。突变位点处设置两端同源臂15bp的引物，PCR反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s，53-60℃退火15s及72℃延伸50s进行30个循环；于72℃下继续延伸10min，冷却至4℃。按照上述方法PCR扩增后片段与pET28a质粒载体，用无缝克隆试剂盒连接，将连接后载体转入之大肠杆菌BL21(DE3)中建立酮还原酶基因突变体利用大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，pET28a质粒为载体，表达扩展突变的酮还原酶。

本发明提供的上述酮还原酶突变体可催化羰基类化合物还原手性醇，需要辅酶NADH(还原型辅酶I)或NADP+或NADPH(还原型辅酶II)的参与，与化学方法相比，它们的联合使用对羰基底物来说有很高的立体选择性和化学选择性，一步催化到位。其中NAD(P)H在反应过程中是循环再生的，再生的方法可通过酮还原酶将异丙醇转化为丙酮的过程来实现，或是通过葡萄糖脱氢酶(glucose dehydrogenase，GDH)将葡萄糖转化为葡萄糖酸的过程来实现，或是通过甲酸脱氢酶(formate dehydrogenase,FDH)将甲酸转化为二氧化碳的过程来实现。本发明提供的酮还原酶突变体催化羰基类化合物制备手性醇的反应体系中，优先加入NADP+。

本发明的描述中，术语“室温”或“常温”是指温度为4-40oC，较佳地，35±5oC。

本发明同现有技术相比具有以下优点及效果：

1.本发明提供的酮还原酶突变体，尤其是，氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示的酮还原酶突变体使得上述式I所示的羰基底物的10h转化率大于99％；而野生型酶催化还原这类底物10h的转化率约30％；此外，这种酶突变体催化还原上述式I所示的羰基底物得到的手性醇产物ee值可达99.7％，而野生型酶在相同条件下催化还原上述式I所示的羰基底物得到的手性醇产物ee值为0。本发明提供的酮还原酶突变体对羰基底物的催化活性相比野生型有大幅提高，实现了利用酮还原酶催化合成手性醇化合物的绿色化学合成，且使用活性提高的酮还原酶进行还原反应，容易得到高活性高选择性的手性醇化合物。

2.本发明所提供的酮还原酶突变体对羰基底物催化活性高、立体选择性好，可应用于手性醇的生物合成；与化学合成方法相比，其所催化的还原反应，条件简单温和，反应选择性高，制备成本低，具有较好的应用前景。

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释而本发明并不局限于以下实施例。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下列实施例中所用LB液体(每升)的组成为：蛋白胨1g±0.1；酵母提取物0.5g±0.1；NaCl 1g±0.1。

实施例1：野生酮还原酶基因工程菌的建立

根据NCBI收录的Arthrobacter sp.TS-15酮还原酶野生型基因序列(WP_142940120.1)进行序列优化后人工合成全基因片段(核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示)，并经基因合成公司通过NdeI和XhoI内切酶将基因插入pET-28a质粒中(图1)，将连接后的载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中建立野生型酮还原酶基因工程菌，卡那霉素抗性筛选后测序验证。

实施例2：酮还原酶突变体的设计

通过在线蛋白结构预测工具获得来源于Arthrobacter sp.TS-15酮还原酶的三维结构，并通过PDB获取与其结构相似度最高的环己醇脱氢酶的三维结构(4ure.1.A)，然后通过AutoDock进行式I底物与酮还原酶蛋白质三维结构的进行结合模拟，最后通过Pymol分析，选择有可能与底物结合相关的氨基酸作为突变氨基酸。

根据上述Pymol分析结果，使SEQ ID NO:1所示野生型酮还原酶氨基酸序列中的至少1个位点发生突变：第94位，第146位，第161位，第190位，第195位。且第94位由H突变为F或M，第146位由T突变为A、G或V，第161位由Y突变为A或T，第190位由C突变为H、L或Q，第195位由A突变为K或E。根据对接结果分析底物结合区域，优选使SEQ ID NO:1所示野生型酮还原酶氨基酸序列中的至少1个位点发生突变：H94F，T146A，Y161T，C190Q，A195K。根据Pymol分析，最终设计从组合突变位点：(i)H94F，T146A，Y161T(对应SEQ ID NO.3所示氨基酸序列)；(ii)H94F，T146A，Y161T，C190Q(对应SEQ ID NO.4所示氨基酸序列)；(iii)H94F，T146A，Y161T，C190Q，A195K(对应SEQ ID NO.5所示氨基酸序列)中筛选高活性及高选择性突变株。

实施例3重组表达载体的构建：

表达载体pET28a(+)(见图1)分别用限制性内切酶NdeI和XhoI双酶切，酶切体系为：pET28a(+)84uL(约30μg)、NdeII3μL、XhoI3μL，37℃酶切1.5h后进行琼脂糖凝胶电泳。目标条带在0.76kb的位置，用DNA回收试剂盒回收酶切片段。

三个酮还原酶的编码序列：Seq ID No:6、Seq ID No:7、Seq ID No:8由苏州金唯智生物科技有限公司负责合成。以Seq ID No:6合成基因作为模板，引物P1/P2(表1中的H94F，T146A和Y161T)进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳后分离出约0.76k的条带；将PCR扩增产物用DNA回收试剂盒回收。将NdeI和XhoI双酶切线性化的载体与PCR扩增产物用无缝克隆试剂盒连接，构建含有该酮还原酶基因(Seq ID No:6所示的核苷酸序列)的重组表达载体。按照以下反应体系进行连接：线性化载体pET28a(+)50ng、引物P1/P2扩增产物100ng、2*无缝克隆缓冲液5μL，50℃孵育20min，以获得重组表达载体，用T7/T7t通用引物对pcr验证(参见图2)并测序分析验证，正确后命名pET28a-i(含有SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列)。按照同样的方法以获得重组表达载体pET28a-ii(含有SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列)、pET28a-iii(含有SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列)。

表1

实施例4重组表达转化体的获得

将前述重组表达载体pET28a-i、pET28a-ii、pET28a-iii分别转化至BL21(DE3)中，即可获得重组表达转化体。转化方法利用热击法：将感受态从-80℃冰箱中取出放在冰上，加入约200ng～500ng表达载体后冰浴15min，42℃热激90s，冰浴3min，加入500μLLB培养液，37℃220rpm孵育45min，取50uL均匀涂布于含有50μg/ml的LB固体培养基上，倒置培养过夜获取单克隆，扩培后用20％终浓度甘油保存与-80℃，测序分析验证正确后，即为重组表达转化体，命名为BL21(DE3)-i、BL21(DE3)-ii、BL21(DE3)-iii。

实施例5摇瓶培养发酵重组表达转化体

将实施例4制得的重组表达转化体(BL21(DE3)-i、BL21(DE3)-ii、BL21(DE3)-iii)分别接种于在LB液体培养基(添加100μg/ml卡那霉素)中培养，37℃和220rpm下过夜培养；将培养物以1:100比例转接入50mL新鲜LB培养基(每升成分为蛋白胨1g±0.1；酵母提取物0.5g±0.1；NaCl 1g±0.1，250mL摇瓶)中，并在37℃下生长。当600nm处的光密度(OD₆₀₀)达到约0.6时，加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，使其终浓度为1mM，细胞在25℃下生长16小时。12000rpm、4℃离心10min，弃上清，细胞沉淀以预冷的100mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)按200g/L重悬后，超声破碎，然后12000rpm、4℃离心30min，收集上清，即粗酶液，储存于-20℃。摇瓶表达聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果见图2和图3。其中图2泳道从左至右依次为Marker、BL21(DE3)-iii的蛋白酶(其氨基酸序列为Seq ID No:5)、BL21(DE3)-ii的蛋白酶(其氨基酸序列为Seq ID No:4)、BL21(DE3)-i的蛋白酶(其氨基酸序列为Seq ID No:3)、野生型、空白；图3为Marker和BL21(DE3)-iii的蛋白酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。

利用该实施例发酵得到的三种重组表达转化体(BL21(DE3)-i、BL21(DE3)-ii、BL21(DE3)-iii)，以及实施例1得到的野生型酮还原酶基因工程菌分别按照下面的方式催化上述式I所示化合物还原为手性醇：9.75ml 0.1M Tris-Hcl，250ul NADPNa(毕得医药，BD116591，20g/L)，1g底物(式I所示化合物)，0.12g葡萄糖，0.01g葡萄糖脱氢酶(尚科生物医药(上海)有限公司，ES-GDH-109，42U/mg)，0.4g全细胞。40℃/200rpm反应10小时取样测定。分别对四种重组表达转化体的还原反应的反应液进行HPLC检测，结果如下表2所示。

表2.

类型	转化率(％)	ee值(％)
			野生型	30	0
BL21(DE3)-i	90	++
			BL21(DE3)-ii	95	+++
BL21(DE3)-iii	99	++++

注：上表中，++代表ee值大于等于40％且小于60％，+++代表ee值大于等于60％且小于80％，++++代表ee值大于等于80％且小于100％。

实施例6：重组表达转化体(BL21(DE3)-iii的高密度发酵制备

接种实施例4所得的重组突变菌株(BL21(DE3)-iii)于3mL液体LB培养基中，37℃、220rpm震荡过夜培养后，按1％左右的比例接种于400mL液体LB培养基中，培养至OD₆₀₀达到4时作为种子液，接入2L的发酵培养基中进行高密度发酵。初始温度37℃，搅拌速度300rpm，通气量1.5vvm/L/min，pH为6.8，之后不断提高搅拌转速最大至1000rpm。发酵培养分为两个阶段，第一阶段接种后，培养4小时左右，培养基中的碳源消耗完全，按照DO进行反馈补料。补料后温度降为25℃，溶氧保持30％以上，补料8小时后加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导，诱导12小时后放罐。使用离心机8000rpm离心10min弃上清得到的菌体湿细胞，即为KRED-APTI-115。

实施例7：酮还原酶的全细胞催化反应体系

室温下将97.5ml 0.1M Tris-HCl，2.5ml NADPNa(毕得医药，BD116591，20g/L)，10g底物(前述化合物I)，1.2g葡萄糖，0.1g葡萄糖脱氢酶(尚科生物医药(上海)有限公司，ES-GDH-109，42U/mg)，4g KRED-APTI-115混合均匀后，40℃/200rpm反应10小时取样测定。在反应过程中监测pH控制在7.5，并对混合物取样进行HPLC分析。8h后，完全转化率达到97.5％；10h后，完全转化率达到99.9％。目标产物经HPLC检测，ee值＞99％，图4。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (12)

1.一种酮还原酶突变体，其特征在于，所述酮还原酶突变体的氨基酸序列是由SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列发生突变得到的氨基酸序列，所述突变至少包括如下突变位点中的一个：

第94位由H突变为F或M，第146位由T突变为A、G或V，第161位由Y突变为A或T，第190位由C突变为H、L或Q，第195位由A突变为K或E，所述酮还原酶突变体的氨基酸序列具有发生突变的氨基酸序列中的突变位点，与发生突变的氨基酸序列具有至少80％以上、或至少85％以上、或至少90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％的以上同源性，且与发生突变的氨基酸序列具有相同的功能。

2.根据权利要求1所述酮还原酶突变体，其特征在于，所述突变至少包括如下突变位点中的一个：第94位由H突变为F，第146位由T突变为A，第161位由Y突变为T，第190位由C突变为Q，第195位由A突变为K，或者所述酮还原酶突变体的氨基酸序列具有发生突变的氨基酸序列中的突变位点，与发生突变的氨基酸序列具有至少80％以上、或至少85％以上、或至少90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％的以上的同源性，且与发生突变的氨基酸序列具有相同的功能。

3.根据权利要求2所述的酮还原酶突变体，其特征在于，所述酮还原酶突变体包括下列突变位点：

第94位由H突变为F，第146位由T突变为A，以及第161位由Y突变为T，或者

第94位由H突变为F，第146位由T突变为A，第161位由Y突变为T，以及第190位由C突变为Q，或者

第94位由H突变为F，第146位由T突变为A，第161位由Y突变为T，第190位由C突变为Q，以及第195位由A突变为K。

4.根据权利要求2所述的酮还原酶突变体，其特征在于，所述酮还原酶突变体包括突变位点：第94位由H突变为F，第146位由T突变为A，第161位由Y突变为T，第190位由C突变为Q，以及第195位由A突变为K，或者

所述酮还原酶突变体的氨基酸序列具有发生突变的氨基酸序列中的突变位点，与发生突变的氨基酸序列具有至少80％以上、或至少85％以上、或至少90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％的以上的同源性，且与发生突变的氨基酸序列具有相同的功能。

5.一种编码权利要求1至4任一项所述的酮还原酶突变体的基因。

6.根据权利要求5所述的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示序列，或者

优选地，所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.8所示的序列。

7.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含权利要求5或6所述的基因。

8.根据权利要求7所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体选自pET-28a、pET-dute1或pRSF-dute1，更优选pET-28a。

9.一种基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌用于生产权利要求1至4任一项所述的酮还原酶突变体，其包含权利要求7或8所述的重组表达载体。

10.根据权利要求9所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌选自大肠杆菌MG1655或大肠杆菌BL21(DE3)或大肠杆菌BL21(DE3)pLysS，更优选大肠杆菌BL21(DE3)。

11.一种权利要求1至4任一项所述的酮还原酶突变体在以羰基化合物为原料制备手性醇化合物中的应用。

12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述羰基化合物的结构式为

其中，R₁和R₂各自独立地为C₁～C₈烷基、C₅～C₁₀环烷基、C₅～C₁₀芳基、C₅～C₁₀杂芳基或含胺基、醚、硫醚或酯的基团，或者R₁和R₂与羰基上的碳共同形成5～10元环，

所述5～10元环全部由碳构成，或者所述5～10元环中除碳原子之外还有杂原子参与构成5～10元环，所述杂原子选自N、O、S，以及

所述5～10元环是未被取代的，或是被卤素、氧、硫、羟基、烷氧基或烷基中的至少一个基团所取代，

所述手性醇化合物的结构式为

更优选地，所述羰基化合为式I所示化合物，所述醇类化合物为式II所示化合物，

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