CN115975964A - 一种高活性酮基泛解酸内酯还原酶突变体及其编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高活性酮基泛解酸内酯还原酶突变体及其编码基因和应用。本发明公开的酮基泛解酸内酯还原酶突变体相对于SEQ ID NO:1所示的野生型酮基泛解酸内酯还原酶CviCPR，在第126位氨基酸残基和/或第215位氨基酸残基具有以下突变：第126位亮氨酸L突变为脯氨酸P、苯丙氨酸F、酪氨酸Y和色氨酸W中的一种；第215位丙氨酸A突变为天冬氨酸D和谷氨酸E中的一种。本发明提供的酮基泛解酸内酯还原酶突变体可高活性、高立体选择性地催化酮基泛解酸内酯制备D‑泛解酸内酯，为生物酶法不对称还原路线制备D‑泛解酸内酯的工业化生产提供一个潜在的高效生物催化剂。

Description

一种高活性酮基泛解酸内酯还原酶突变体及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于生物催化技术领域，涉及一种来源于维斯假丝酵母(Candidaviswanathii)的酮基泛解酸内酯还原酶突变体、其编码核酸分子、重组载体、重组细胞，以及该酮基泛解酸内酯还原酶突变体的制备方法和在制备D-泛解酸内酯中的应用。

背景技术

D-泛解酸内酯((R)-pantolactone)的结构式如式(I)所示，是合成D-泛酸钙的关键中间体。目前，工业生产中D-泛解酸内酯主要是由异丁醛-甲醛-氰化钠法首先合成DL-泛解酸内酯，然后经由D-泛解酸内酯水解酶催化的微生物酶法拆分路线制备D-泛解酸内酯。该路线工艺成熟，但存在步骤繁琐、萃取溶剂用量大、酸碱用量高等问题。因此，开发工艺简单、环保高效的生物酶法不对称还原路线具有重要意义。

酮基泛解酸内酯还原酶是氧化还原酶法不对称合成D-泛解酸内酯工艺路线的关键酶，其催化活性和对映选择性对酶催化反应效率及产品的光学纯度具有重要影响。目前，公开报道的酮基泛解酸内酯还原酶及其基因资源数量较少，限制了其酶学性质研究、构效关系研究及其在高效不对称合成D-泛解酸内酯中的应用。Kataoka等于2003年报道了来自Candida parapsilosis IFO 0708的两种共轭聚酮还原酶CPR-C1和CPR-C2，其在大肠杆菌中异源表达水平较低，重组细胞比活力仅0.251U/mg，导致其酶催化反应效率较低。2018年以来，仅公开报道了3个酮基泛解酸内酯还原酶用于D-泛解酸内酯的不对称合成，包括CorCPR、CduCPR以及CalCPR，其中，以CduCPR的催化反应效率最高，但其时空得率也仅为307.5g L^-1d^-1。CN 114085820A和CN 113913399A分别公开了新型酮基泛解酸内酯还原酶CviCPR与CmaCPR，其立体选择性不对称还原酮基泛解酸内酯制备D-泛解酸内酯的时空得率达到520-590g L^-1d^-1。

综上所述，在现有的酮基泛解酸内酯还原酶参与的氧化还原酶法不对称合成D-泛解酸内酯技术路线中，仍然存在关键酶酮基泛解酸内酯还原酶不对称还原反应时空得率较低的问题，限制了其在工业规模的应用。因此，开发高活性的酮基泛解酸内酯还原酶，绿色高效地制备D-泛解酸内酯具有重要的工业应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种活性提高的酮基泛解酸内酯还原酶突变体及其编码基因以及应用，从而解决现有的酮基泛解酸内酯还原酶催化合成D-泛解酸内酯的技术存在的产品时空得率不高的问题。

具体地，本发明以实验室前期构建保藏的来源于维斯假丝酵母(Candidaviswanathii)的酮基泛解酸内酯还原酶CviCPR(参见CN 114085820A)作为原始序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，对其进行定点突变，从而得到在催化活性方面显著改善的酮基泛解酸内酯还原酶突变体。

在第一方面，本发明提供一种活性提高的酮基泛解酸内酯还原酶突变体，其相对于SEQ ID NO:1所示的野生型酮基泛解酸内酯还原酶CviCPR，在第126位氨基酸残基和/或第215位氨基酸残基具有以下突变：

第126位亮氨酸L突变为脯氨酸P、苯丙氨酸F、酪氨酸Y和色氨酸W中的一种；第215位丙氨酸A突变为天冬氨酸D和谷氨酸E中的一种。

在一些实施方案中，所述酮基泛解酸内酯还原酶突变体是将SEQ ID NO:1所示的野生型酮基泛解酸内酯还原酶CviCPR第126位亮氨酸L突变为脯氨酸P后得到的酮基泛解酸内酯还原酶单点突变体，记作CviCPR/L126P，其氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示。

在一些实施方案中，所述酮基泛解酸内酯还原酶突变体是将SEQ ID NO:1所示的野生型酮基泛解酸内酯还原酶CviCPR第126位亮氨酸L突变为苯丙氨酸F后得到的酮基泛解酸内酯还原酶单点突变体，记作CviCPR/L126F，其氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示；

在一些实施方案中，所述酮基泛解酸内酯还原酶突变体是将SEQ ID NO:1所示的野生型酮基泛解酸内酯还原酶CviCPR第126位亮氨酸L突变为酪氨酸Y后得到的酮基泛解酸内酯还原酶单点突变体，记作CviCPR/L126Y，其氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示；

在一些实施方案中，所述酮基泛解酸内酯还原酶突变体是将SEQ ID NO:1所示的野生型酮基泛解酸内酯还原酶CviCPR第126位亮氨酸L突变为色氨酸W后得到的酮基泛解酸内酯还原酶单点突变体，记作CviCPR/L126W，其氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示；

在一些实施方案中，所述酮基泛解酸内酯还原酶突变体是将SEQ ID NO:1所示的野生型酮基泛解酸内酯还原酶CviCPR第215位丙氨酸A突变为天冬氨酸D后得到的酮基泛解酸内酯还原酶单点突变体，记作CviCPR/A215D，其氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示；

在一些实施方案中，所述酮基泛解酸内酯还原酶突变体是将SEQ ID NO:1所示的野生型酮基泛解酸内酯还原酶CviCPR第215位丙氨酸A突变为谷氨酸E后得到的酮基泛解酸内酯还原酶单点突变体，记作CviCPR/A215E，其氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示；

在一些实施方案中，所述酮基泛解酸内酯还原酶突变体是将SEQ ID NO:1所示的野生型酮基泛解酸内酯还原酶CviCPR第126位亮氨酸L突变为脯氨酸P，同时将第215位丙氨酸A突变为天冬氨酸D后得到的酮基泛解酸内酯还原酶双点突变体，记作CviCPR/L126P/A215D，其氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示；

在一些实施方案中，所述酮基泛解酸内酯还原酶突变体是将SEQ ID NO:1所示的野生型酮基泛解酸内酯还原酶CviCPR第126位亮氨酸L突变为苯丙氨酸F，同时将第215位丙氨酸A突变为天冬氨酸D后得到的酮基泛解酸内酯还原酶双点突变体，记作CviCPR/L126F/A215D，其氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示；

在一些实施方案中，所述酮基泛解酸内酯还原酶突变体是将SEQ ID NO:1所示的野生型酮基泛解酸内酯还原酶CviCPR第126位亮氨酸L突变为酪氨酸Y，同时将第215位丙氨酸A突变为天冬氨酸D后得到的酮基泛解酸内酯还原酶双点突变体，记作CviCPR/L126Y/A215D，其氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示；

在一些实施方案中，所述酮基泛解酸内酯还原酶突变体是将SEQ ID NO:1所示的野生型酮基泛解酸内酯还原酶CviCPR第126位亮氨酸L突变为色氨酸W，同时将第215位丙氨酸A突变为天冬氨酸D后得到的酮基泛解酸内酯还原酶双点突变体，记作CviCPR/L126W/A215D其氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示；

在一些实施方案中，所述酮基泛解酸内酯还原酶突变体是将SEQ ID NO:1所示的野生型酮基泛解酸内酯还原酶CviCPR第126位亮氨酸L突变为脯氨酸P，同时将第215位丙氨酸A突变为谷氨酸E后得到的酮基泛解酸内酯还原酶双点突变体，记作CviCPR/L126P/A215E，其氨基酸序列如SEQ ID NO:35所示；

在一些实施方案中，所述酮基泛解酸内酯还原酶突变体是将SEQ ID NO:1所示的野生型酮基泛解酸内酯还原酶CviCPR第126位亮氨酸L突变为苯丙氨酸F，同时将第215位丙氨酸A突变为谷氨酸E后得到的酮基泛解酸内酯还原酶双点突变体，记作CviCPR/L126F/A215E，其氨基酸序列如SEQ ID NO:37所示；

在一些实施方案中，所述酮基泛解酸内酯还原酶突变体是将SEQ ID NO:1所示的野生型酮基泛解酸内酯还原酶CviCPR第126位亮氨酸L突变为酪氨酸Y，同时将第215位丙氨酸A突变为谷氨酸E后得到的酮基泛解酸内酯还原酶双点突变体，记作CviCPR/L126Y/A215E，其氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示；

在一些实施方案中，所述酮基泛解酸内酯还原酶突变体是将SEQ ID NO:1所示的野生型酮基泛解酸内酯还原酶CviCPR第126位亮氨酸L突变为色氨酸W，同时将第215位丙氨酸A突变为谷氨酸E后得到的酮基泛解酸内酯还原酶双点突变体记作CviCPR/L126W/A215E，其氨基酸序列如SEQ ID NO:41所示。

本发明提供的上述酮基泛解酸内酯还原酶突变体可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到，例如使用重组技术从原核宿主(例如大肠杆菌)或真核宿主(例如酵母、高等植物)中表达获得。

在一些实施方案中，上述酮基泛解酸内酯还原酶突变体是通过定点突变技术得到其编码基因，再将含有该编码基因的重组载体导入大肠杆菌(例如E.coli BL21(DE3))得到重组基因工程菌，然后将该重组基因工程菌进行诱导表达得到酮基泛解酸内酯还原酶突变体。

在第二方面，本发明提供一种编码上述酮基泛解酸内酯还原酶突变体的核酸分子；

优选地，所述核酸分子为如下1)-14)所示的基因：

1)SEQ ID NO:16所示的DNA分子，其编码CviCPR/L126P；

2)SEQ ID NO:18所示的DNA分子，其编码CviCPR/L126F；

3)SEQ ID NO:20所示的DNA分子，其编码CviCPR/L126Y；

4)SEQ ID NO:22所示的DNA分子，其编码CviCPR/L126W；

5)SEQ ID NO:24所示的DNA分子，其编码CviCPR/A215D；

6)SEQ ID NO:26所示的DNA分子，其编码CviCPR/A215E；

7)SEQ ID NO:28所示的DNA分子，其编码CviCPR/L126P/A215D；

8)SEQ ID NO:30所示的DNA分子，其编码CviCPR/L126F/A215D；

9)SEQ ID NO:32所示的DNA分子，其编码CviCPR/L126Y/A215D；

10)SEQ ID NO:34所示的DNA分子，其编码CviCPR/L126W/A215D；

11)SEQ ID NO:36所示的DNA分子，其编码CviCPR/L126P/A215E；

12)SEQ ID NO:38所示的DNA分子，其编码CviCPR/L126F/A215E；

13)SEQ ID NO:40所示的DNA分子，其编码CviCPR/L126Y/A215E；

14)SEQ ID NO:42所示的DNA分子，其编码CviCPR/L126W/A215E。

特别优选地，本发明提供的一种酶活显著提高的酮基泛解酸内酯还原酶组合突变体CviCPR/L126W/A215E，如上所述，其氨基酸序列如SEQ ID NO:41所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO:42所示。

本发明提供的所述核酸分子通常可以通过PCR扩增或人工合成的方法获得。

在第三方面，本发明提供一种重组载体，其包含上述任一所述的核酸分子；

所述重组载体包括克隆载体和表达载体，所述克隆载体用于复制相关序列，所述表达载体用于表达相关基因。

在一些优选的实施方案中，所述重组载体还包含编码葡萄糖脱氢酶的核酸分子；其优势是所得重组载体可同时表达所述酮基泛解酸内酯还原酶突变体和所述葡萄糖脱氢酶，在酮基泛解酸内酯还原酶突变体催化酮基泛解酸的不对称还原制备D-泛解酸内酯的过程中，所述葡萄糖脱氢酶催化NADP⁺还原为NADPH，NADPH为酮基泛解酸内酯还原酶催化的不对称还原反应提供还原力，从而避免了外源添加昂贵的辅因子，有效降低生产成本；更优选地，所述葡萄糖脱氢酶来源于巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)，其氨基酸序列如SEQID NO:43所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:44所示。

在一些实施方案中，上述重组载体中，所述重组载体为将编码上述任一所述的酮基泛解酸内酯还原酶突变体的核酸分子和编码葡萄糖脱氢酶的核酸分子分别插入pACYCDuet-1载体的第一组多克隆位点的NcoI和NotI酶切位点之间和第二组多克隆位点的BglII于PacI酶切位点之间，其余序列不变，得到共表达酮基泛解酸内酯还原酶突变体和葡萄糖脱氢酶BmGDH的重组质粒，该重组质粒可以是编码酮基泛解酸内酯还原酶单点突变体的重组质粒：pACYCDuet-1-CviCPR/L126P-BmGDH、pACYCDuet-1-CviCPR/L126F-BmGDH、pACYCDuet-1-CviCPR/L126Y-BmGDH、pACYCDuet-1-CviCPR/L126W-BmGDH、pACYCDuet-1-CviCPR/A215D-BmGDH、pACYCDuet-1-CviCPR/A215E-BmGDH；或是编码酮基泛解酸内酯还原酶双点突变体的重组质粒：pACYCDuet-1-CviCPR/L126P/A215D-BmGDH、pACYCDuet-1-CviCPR/L126F/A215D-BmGDH、pACYCDuet-1-CviCPR/L126Y/A215D-BmGDH、pACYCDuet-1-CviCPR/L126W/A215D-BmGDH、pACYCDuet-1-CviCPR/L126P/A215E-BmGDH、pACYCDuet-1-CviCPR/L126F/A215E-BmGDH、pACYCDuet-1-CviCPR/L126Y/A215E-BmGDH、pACYCDuet-1-CviCPR/L126W/A215E-BmGDH。

在第四方面，本发明提供一种重组细胞，其包含上述重组载体。

在一些优选的实施方案中，所述重组细胞诱导产生上述任一所述的酮基泛解酸内酯还原酶突变体；更优选地，所述重组细胞还诱导产生葡萄糖脱氢酶；进一步优选地，所述葡萄糖脱氢酶来源于巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)，其氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:44所示。

在一些优选实施方案中，所述重组细胞的构建方法如下：

将所述重组载体转化到宿主细胞中，经诱导，得到表达上述酮基泛解酸内酯还原酶突变体的重组细胞。

进一步地，所述重组载体为上述任一所述的重组载体，所述宿主细胞为原核生物细胞或真核生物细胞，例如大肠杆菌、酵母等，优选大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。将上述任一所述的重组载体转化到E.coli BL21(DE3)中，经诱导，得到同时表达上述酮基泛解酸内酯还原酶突变体和来源于巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的葡萄糖脱氢酶的重组基因工程菌(重组细胞)。

在一些实施方案中，所述重组基因工程菌为E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-CviCPR/L126P-BmGDH，E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-CviCPR/L126F-BmGDH，E.coliBL21(DE3)/pACYCDuet-1-CviCPR/L126Y-BmGDH，E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-CviCPR/L126W-BmGDH，E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-CviCPR/A215D-BmGDH，E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-CviCPR/A215E-BmGDH；E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-CviCPR/L126P/A215D-BmGDH，E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-CviCPR/L126F/A215D-BmGDH，E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-CviCPR/L126Y/A215D-BmGDH，E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-CviCPR/L126W/A215D-BmGDH，E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-CviCPR/L126P/A215E-BmGDH，E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-CviCPR/L126F/A215E-BmGDH，E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-CviCPR/L126Y/A215E-BmGDH，E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-CviCPR/L126W/A215E-BmGDH。

在第五方面，本发明提供一种酮基泛解酸内酯还原酶的制备方法，包括：

对上述任一所述的重组细胞进行诱导培养，得到培养物；

从所述培养物中分离上述任一所述的酮基泛解酸内酯还原酶突变体。

在一些实施方案中，上述方法中，还包括从所述培养物中分离葡萄糖脱氢酶的步骤。其中，对重组细胞进行诱导培养的方法、从培养物中分离酮基泛解酸内酯还原酶突变体的方法，以及从所述培养物中分离葡萄糖脱氢酶的方法均为本领域的常规方法。

在第六方面，本发明提供上述任一所述的酮基泛解酸内酯还原酶突变体、上述任一所述的核酸分子、上述任一所述的重组载体和/或上述任一所述的重组细胞在制备D-泛解酸内酯中的应用，具体地用于催化D-泛解酸内酯的不对称合成。

在第七方面，本发明提供一种D-泛解酸内酯的制备方法，包括：以上述任一所述的酮基泛解酸内酯还原酶突变体、上述任一所述的重组细胞和/或上述任一所述的方法制备得到的酮基泛解酸内酯还原酶作为催化剂，对酮基泛解酸内酯进行催化反应，得到D-泛解酸内酯。其中，所述D-泛解酸内酯的制备方法涉及的反应原理如图1所示，酮基泛解酸内酯为底物，葡萄糖为辅底物。

在一些优选实施方案中，所述D-泛解酸内酯的制备方法如下：

将表达上述任一所述的酮基泛解酸内酯还原酶突变体和来源于巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的葡萄糖脱氢酶的重组细胞与底物酮基泛解酸内酯和辅底物葡萄糖接触，进行不对称还原反应，然后从反应产物中收集所生成的D-泛解酸内酯。

在一些实施方案中，上述D-泛解酸内酯的制备方法中，所述催化反应的pH为6-8，例如pH 6、pH 6.5、pH 7、pH 7.5和pH 8，或者这些数值中的任意二者之间的数值或范围；和/或

所述催化反应的温度为30℃-50℃，例如30℃、35℃、40℃、45℃和50℃，或者这些数值中的任意二者之间的数值或范围。

在一些实施方案中，上述任一所述的D-泛解酸内酯的制备方法中，所述催化反应在磷酸盐缓冲液中进行；和/或

所述催化反应中，所述酮基泛解酸内酯的累积终浓度为1mM-400mM；和/或

所述催化反应中，所述催化剂与所述酮基泛解酸内酯的质量比为(0.01-0.1):1，例如0.01:1、0.02:1、0.03:1、0.04:1、0.05:1、0.06:1、0.07:1、0.08:1、0.09:1或0.1:1，或者这些数值中的任意二者之间的数值或范围。

在一些实施方案中，上述任一所述的D-泛解酸内酯的制备方法中，包括以上述任一所述的重组细胞(重组基因工程菌)催化酮基泛解酸内酯制备D-泛解酸内酯；

具体地，可以以所述重组基因工程菌经发酵培养后离心获得的菌体、菌体固定化细胞、菌体超声破碎后提取的酶、固定化酶或者纯酶作为催化剂，以酮基泛解酸内酯为底物，以葡萄糖作为辅底物，以pH为6-8的反应液(例如磷酸钾缓冲液(100mM，pH 6.5))为反应介质，在30-50℃，150-300rpm条件下反应，得到含有D-泛解酸内酯的反应液；

优选地，酮基泛解酸内酯的浓度为1-400mM，葡萄糖的浓度为1-600mM，基于底物酮基泛解酸内酯质量的催化剂的使用量为0.01-0.1克细胞/克酮基泛解酸内酯；

所述反应过程中，通过在线监测pH反馈调节Na₂CO₃的滴加，控制pH在6.5左右。反应液pH与酶的催化性能、底物的理化性质等多方面因素有关，经考察，当pH为6-8时具有较好的反应效果，且优选pH为6.5。

应当理解的是，本发明所述的酮基泛解酸内酯还原酶突变体可以以工程菌全细胞形式使用，也可以是未经纯化的粗酶形式使用，也可以是部分纯化的或完全纯化的酶的形式使用。还可以利用本领域已知的固定化技术将本发明的酮基泛解酸内酯还原酶突变体制成固定化酶或固定化细胞形式的催化剂。

优选地，所述酮基泛解酸内酯还原酶突变体为CviCPR/L126W/A215E或表达其的重组基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-CviCPR/L126W/A215E-BmGDH。

重组基因工程菌表达突变体时所使用的培养基可以是本领域可使重组基因工程菌生长并产生本发明的酮基泛解酸内酯还原酶突变体的培养基，优选LB培养基：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，pH为7.0。

培养方法与培养条件没有特殊要求，只要能够使基因工程菌正常生长，并表达酮基泛解酸内酯还原酶即可。具体包括以下步骤：

(1)平板培养：将本发明涉及的重组基因工程菌划线到含有筛选抗生素的LB固体平板上，37℃过夜培养；

(2)种子培养：在超净台中挑取步骤(1)所得平板上的单菌落，接种到含有筛选抗生素的LB液体培养基中，37℃过夜培养；

(3)诱导培养：在超净台中将步骤(2)所得种子培养液接种到含有筛选抗生素的LB液体培养基中，37℃培养至OD₆₀₀数值达到0.6-0.8，加入终浓度为0.2mM的诱导剂IPTG，16℃诱导培养12h；

(4)收集菌体：将步骤(3)诱导培养所得的菌液于8000rpm条件下离心10min，分离得到湿菌体，将所得湿菌体用生理盐水洗涤两遍，即为催化反应所用的催化剂。

由于底物酮基泛解酸内酯极易水解，为了减少底物在催化过程中的自发水解，底物和辅底物的添加优选采用流加模式，从而不断提升反应体系中的酮基泛解酸内酯累积浓度，同时避免高浓度酮基泛解酸内酯累积导致的自发水解及其对催化剂活性的抑制作用。

本发明发现，来源于维斯假丝酵母(Candida viswanathii)的酮基泛解酸内酯还原酶CviCPR第126位与第215位对活性的提高均起到关键作用。尤其是，本发明所提供的酮基泛解酸内酯还原酶突变体CviCPR/L126W/A215E可高活性地催化酮基泛解酸内酯制备D-泛解酸内酯，具有绿色高效、经济环保等特点，为氧化还原酶法不对称合成D-泛解酸内酯提供一个潜在的生物催化剂。

本发明相对现有技术的有益效果如下：

(1)本发明提供的酮基泛解酸内酯还原酶突变体CviCPR/L126W/A215E能够催化高浓度的酮基泛解酸内酯(400mM)生成D-泛解酸内酯，底物转化率达到99％，产物光学纯度(e.e.)达到99％，D-泛解酸内酯的时空得率达到706g L^-1d^-1。

(2)本发明通过酶工程提升酮基泛解酸内酯还原酶的催化活性，对于绿色、高效地制备D-泛解酸内酯具有重要的工业应用价值。

附图说明

图1为本发明酮基泛解酸内酯不对称合成D-泛解酸内酯的原理图。

图2为D-泛解酸内酯标准品的气相色谱图。

图3为L-泛解酸内酯标准品的气相色谱图。

图4为酮基泛解酸内酯标准品的气相色谱图。

图5为本发明实施例4中表达野生型酮基泛解酸内酯还原酶CviCPR的重组基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-CviCPR-BmGDH催化酮基泛解酸内酯生成D-泛解酸内酯的反应进程曲线。

图6为本发明实施例4中表达酮基泛解酸内酯还原酶突变体CviCPR/L126W/A215E的重组基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-CviCPR/L126W/A215E-BmGDH催化酮基泛解酸内酯生成D-泛解酸内酯的反应进程曲线。

图7为重组基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-CviCPR/L126W/A215E-BmGDH催化酮基泛解酸内酯生成D-泛解酸内酯的反应液的气相色谱图。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。如非特殊说明，实施例中所用的技术手段均为本领域常规操作，或按照试剂盒及仪器设备厂商所建议的实验方法。实施例中使用的试剂和生物材料如无特殊说明均可从商业途径获得。

下述实施例中，质粒pACYCDuet-1-CviCPR-BmGDH按照公开号CN 114085820 A、发明名称为“来源于Candida viswanathii的酮基泛解酸内酯还原酶”的中国发明专利申请的实施例2构建得到，该质粒共表达来源于维斯假丝酵母(Candida viswanathii)的酮基泛解酸内酯还原酶CviCPR和来源于巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的葡萄糖脱氢酶BmGDH，其中，酮基泛解酸内酯还原酶CviCPR的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，葡萄糖脱氢酶BmGDH的氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:44所示。该来源于维斯假丝酵母(Candida viswanathii)的酮基泛解酸内酯还原酶CviCPR即为下述实施例中的野生型酮基泛解酸内酯还原酶。

酮基泛解酸内酯为Sigma-Aldrich公司产品，产品目录号为305847。

实施例1酮基泛解酸内酯还原酶突变体重组质粒的构建

1、以含有目的基因片段的重组质粒pACYCDuet-1-CviCPR-BmGDH为模板，通过设计引物，在野生型酮基泛解酸内酯还原酶的基因序列中引入单点突变，所用引物序列见表1。

表1酮基泛解酸内酯还原酶突变体引物

通过全质粒扩增，获得编码酮基泛解酸内酯还原酶单点突变体的重组质粒：pACYCDuet-1-CviCPR/L126P-BmGDH、pACYCDuet-1-CviCPR/L126F-BmGDH、pACYCDuet-1-CviCPR/L126Y-BmGDH、pACYCDuet-1-CviCPR/L126W-BmGDH、pACYCDuet-1-CviCPR/A215D-BmGDH和pACYCDuet-1-CviCPR/A215E-BmGDH。

pACYCDuet-1-CviCPR/L126P-BmGDH表达的酮基泛解酸内酯还原酶是将野生型酮基泛解酸内酯还原酶第126位亮氨酸L突变为脯氨酸P后得到的酮基泛解酸内酯还原酶单点突变体，记作CviCPR/L126P，其氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示，其核苷酸序列如SEQ IDNO:16所示。

pACYCDuet-1-CviCPR/L126F-BmGDH表达的酮基泛解酸内酯还原酶是将野生型酮基泛解酸内酯还原酶第126位亮氨酸L突变为苯丙氨酸F后得到的酮基泛解酸内酯还原酶单点突变体，记作CviCPR/L126F，其氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示，其核苷酸序列如SEQ IDNO:18所示。

pACYCDuet-1-CviCPR/L126Y-BmGDH表达的酮基泛解酸内酯还原酶是将野生型酮基泛解酸内酯还原酶第126位亮氨酸L突变为酪氨酸Y后得到的酮基泛解酸内酯还原酶单点突变体，记作CviCPR/L126Y，其氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示，其核苷酸序列如SEQ IDNO:20所示。

pACYCDuet-1-CviCPR/L126W-BmGDH表达的酮基泛解酸内酯还原酶是将野生型酮基泛解酸内酯还原酶第126位亮氨酸L突变为色氨酸W后得到的酮基泛解酸内酯还原酶单点突变体，记作CviCPR/L126W，其氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示，其核苷酸序列如SEQ IDNO:22所示。

pACYCDuet-1-CviCPR/A215D-BmGDH表达的酮基泛解酸内酯还原酶是将野生型酮基泛解酸内酯还原酶第215位丙氨酸A突变为天冬氨酸D后得到的酮基泛解酸内酯还原酶单点突变体，记作CviCPR/A215D，其氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示，其核苷酸序列如SEQ IDNO:24所示。

pACYCDuet-1-CviCPR/A215E-BmGDH表达的酮基泛解酸内酯还原酶是将野生型酮基泛解酸内酯还原酶第215位丙氨酸A突变为谷氨酸E后得到的酮基泛解酸内酯还原酶单点突变体，记作CviCPR/A215E，其氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示，其核苷酸序列如SEQ IDNO:26所示。

2、分别以上述编码第126位氨基酸单点突变体的重组质粒pACYCDuet-1-CviCPR/L126P-BmGDH、pACYCDuet-1-CviCPR/L126F-BmGDH、pACYCDuet-1-CviCPR/L126Y-BmGDH、pACYCDuet-1-CviCPR/L126W-BmGDH为模板，用第215位单点突变引物进行聚合酶链式反应(PCR)(全质粒扩增)，获得编码酮基泛解酸内酯还原酶双点突变体的重组质粒：pACYCDuet-1-CviCPR/L126P/A215D-BmGDH、pACYCDuet-1-CviCPR/L126F/A215D-BmGDH、pACYCDuet-1-CviCPR/L126Y/A215D-BmGDH、pACYCDuet-1-CviCPR/L126W/A215D-BmGDH、pACYCDuet-1-CviCPR/L126P/A215E-BmGDH、pACYCDuet-1-CviCPR/L126F/A215E-BmGDH、pACYCDuet-1-CviCPR/L126Y/A215E-BmGDH、pACYCDuet-1-CviCPR/L126W/A215E-BmGDH。

pACYCDuet-1-CviCPR/L126P/A215D-BmGDH表达的酮基泛解酸内酯还原酶是将野生型酮基泛解酸内酯还原酶第126位亮氨酸L突变为脯氨酸P，同时将第215位丙氨酸A突变为天冬氨酸D后得到的酮基泛解酸内酯还原酶双点突变体，记作CviCPR/L126P/A215D，其氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO:28所示。

pACYCDuet-1-CviCPR/L126F/A215D-BmGDH表达的酮基泛解酸内酯还原酶是将野生型酮基泛解酸内酯还原酶第126位亮氨酸L突变为苯丙氨酸F，同时将第215位丙氨酸A突变为天冬氨酸D后得到的酮基泛解酸内酯还原酶双点突变体，记作CviCPR/L126F/A215D，其氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO:30所示。

pACYCDuet-1-CviCPR/L126Y/A215D-BmGDH表达的酮基泛解酸内酯还原酶是将野生型酮基泛解酸内酯还原酶第126位亮氨酸L突变为酪氨酸Y，同时将第215位丙氨酸A突变为天冬氨酸D后得到的酮基泛解酸内酯还原酶双点突变体，记作CviCPR/L126Y/A215D，其氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO:32所示。

pACYCDuet-1-CviCPR/L126W/A215D-BmGDH表达的酮基泛解酸内酯还原酶是将野生型酮基泛解酸内酯还原酶第126位亮氨酸L突变为色氨酸W，同时将第215位丙氨酸A突变为天冬氨酸D后得到的酮基泛解酸内酯还原酶双点突变体，记作CviCPR/L126W/A215D，其氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO:34所示。

pACYCDuet-1-CviCPR/L126P/A215E-BmGDH表达的酮基泛解酸内酯还原酶是将野生型酮基泛解酸内酯还原酶第126位亮氨酸L突变为脯氨酸P，同时将第215位丙氨酸A突变为谷氨酸E后得到的酮基泛解酸内酯还原酶双点突变体，记作CviCPR/L126P/A215E，其氨基酸序列如SEQ ID NO:35所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO:36所示。

pACYCDuet-1-CviCPR/L126F/A215E-BmGDH表达的酮基泛解酸内酯还原酶是将野生型酮基泛解酸内酯还原酶第126位亮氨酸L突变为苯丙氨酸F，同时将第215位丙氨酸A突变为谷氨酸E后得到的酮基泛解酸内酯还原酶双点突变体，记作CviCPR/L126F/A215E，其氨基酸序列如SEQ ID NO:37所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO:38所示。

pACYCDuet-1-CviCPR/L126Y/A215E-BmGDH表达的酮基泛解酸内酯还原酶是将野生型酮基泛解酸内酯还原酶第126位亮氨酸L突变为酪氨酸Y，同时将第215位丙氨酸A突变为谷氨酸E后得到的酮基泛解酸内酯还原酶双点突变体，记作CviCPR/L126Y/A215E，其氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO:40所示。

pACYCDuet-1-CviCPR/L126W/A215E-BmGDH表达的酮基泛解酸内酯还原酶是将野生型酮基泛解酸内酯还原酶第126位亮氨酸L突变为色氨酸W，同时将第215位丙氨酸A突变为谷氨酸E后得到的酮基泛解酸内酯还原酶双点突变体，记作CviCPR/L126W/A215E，其氨基酸序列如SEQ ID NO:41所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO:42所示。

实施例2酮基泛解酸内酯还原酶突变体重组基因工程菌的构建

分别将实施例1获得的酮基泛解酸内酯还原酶单点突变体与双点突变体的重组质粒，转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，复苏后涂布于含有筛选抗性(25μg/mL氯霉素)的LB平板上过夜培养。

从过夜培养的LB平板上挑取5-10个克隆子，分别接种至LB液体培养基中，于37℃培养8h。取培养所得菌液测序验证，以获得序列正确的酮基泛解酸内酯还原酶突变体重组基因工程菌：E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-CviCPR/L126P-BmGDH，E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-CviCPR/L126F-BmGDH，E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-CviCPR/L126Y-BmGDH，E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-CviCPR/L126W-BmGDH，E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-CviCPR/A215D-BmGDH，E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-CviCPR/A215E-BmGDH；E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-CviCPR/L126P/A215D-BmGDH，E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-CviCPR/L126F/A215D-BmGDH，E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-CviCPR/L126Y/A215D-BmGDH，E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-CviCPR/L126W/A215D-BmGDH，E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-CviCPR/L126P/A215E-BmGDH，E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-CviCPR/L126F/A215E-BmGDH，E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-CviCPR/L126Y/A215E-BmGDH，E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-CviCPR/L126W/A215E-BmGDH。

采用pACYCDuet-1-CviCPR-BmGDH，按照上述方法，获得野生型酮基泛解酸内酯还原酶重组基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-CviCPR-BmGDH。

实施例3酮基泛解酸内酯还原酶突变体的活性与选择性筛选

将实施例2获得的重组基因工程菌在LB培养基中进行发酵培养并用IPTG诱导基因表达，得到表达各酮基泛解酸内酯还原酶，同时表达来源于巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)的葡萄糖脱氢酶BmGDH的菌液，经离心即可制得湿菌体作为催化剂。

将获取的湿菌体，分别加入到10mL磷酸钾缓冲液(100mM，pH 6.5)和10％(w/v)的底物酮基泛解酸内酯，使湿细胞浓度达1g/L，在30℃、200rpm条件下反应9h。加入乙酸乙酯萃取反应液，取样分析酮基泛解酸内酯的转化率及D-泛解酸内酯的光学纯度，具体采用气相色谱(SHIMADZU GC2030)方法，检测条件如下：色谱柱为BGB-174(30m×250μm×0.25μm)，FID检测器(250℃)，氮气作载气(30mL/min)，氢气40mL/min，进样量为1μL，分流比为30:1，进样口250℃，柱温为175℃维持8min，标准品的色谱图如图2～图4所示，在该分析条件下，D-泛解酸内酯、L-泛解酸内酯和酮基泛解酸内酯的保留时间分别为5.983min、6.116min和6.397min。功能筛选结果见表2。

表2酮基泛解酸内酯还原酶的活性与选择性筛选结果

通过表2可以看出，单点突变体CviCPR/L126W与CviCPR/A215E相对于野生型CviCPR的活性(即，底物酮基泛解酸内酯转化为D-泛解酸内酯的转化率)得到提升，且保持了较高的选择性。两者组合得到的双点突变体CviCPR/L126W/A215E的活性进一步得到显著提升，且保持了较高的选择性，表明突变体CviCPR/L126W/A215E能够高效且立体专一性地不对称还原底物酮基泛解酸内酯生成D-泛解酸内酯，其催化反应的转化率显著优于野生型的CviCPR。

实施例4酮基泛解酸内酯还原酶突变体CviCPR/L126W/A215E催化酮基泛解酸内酯合成D-泛解酸内酯

将实施例2获得的重组基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-CviCPR-BmGDH和E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-CviCPR/L126W/A215E-BmGDH在LB培养基中进行发酵培养并用IPTG诱导基因表达，得到表达酮基泛解酸内酯还原酶，同时表达来源于巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的葡萄糖脱氢酶BmGDH的重组基因工程菌菌液，经离心即可制得湿菌体作为催化剂。

将获得的E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-CviCPR-BmGDH及E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-CviCPR/L126W/A215E-BmGDH的湿菌体分别加入到磷酸钾缓冲液(100mM，pH6.5)中，使湿细胞浓度达5.1g/L，通过连续流加含有1M底物酮基泛解酸内酯和1.1M葡萄糖的磷酸钾缓冲液(100mM，pH 6.5)进行反应，反应温度为30℃，转速为200rpm，通过在线监测pH反馈调节Na₂CO₃的滴加，控制pH在6.5左右。反应过程中间隔取样，使用乙酸乙酯萃取反应液，经稀释，气相分析底物酮基泛解酸内酯的浓度及产物D-泛解酸内酯的光学纯度，据此得到反应进程曲线，重组基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-CviCPR-BmGDH催化酮基泛解酸内酯生成D-泛解酸内酯的反应进程曲线如图5所示，重组基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pACYCDuet-1-CviCPR/L126W/A215E-BmGDH催化酮基泛解酸内酯生成D-泛解酸内酯的反应进程曲线如图6所示。

底物酮基泛解酸内酯与产物D-泛解酸内酯，及其同分异构体L-泛解酸内酯的气相色谱检测条件同实施例3。

重组基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-CviCPR/L126W/A215E-BmGDH催化酮基泛解酸内酯生成D-泛解酸内酯的反应液的气相色谱图如图7所示。

重组基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-CviCPR/L126W/A215E-BmGDH催化的反应1.75h结束，底物酮基泛解酸内酯的累积加入浓度达到400mM。结合图4和图7可知，底物酮基泛解酸内酯保留时间6.397min位置没有检测到色谱峰，可认为底物酮基泛解酸内酯基本完全转化为D-泛解酸内酯，底物转化率≥99％，且D-泛解酸内酯的光学纯度(e.e.)达到99％，经计算，D-泛解酸内酯的时空得率为706g L^-1d^-1。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列

SEQ ID NO:1

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SEQ ID NO:2

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SEQ ID NO:15

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SEQ ID NO:17

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SEQ ID NO:18

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SEQ ID NO:19

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SEQ ID NO:20

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SEQ ID NO:21

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SEQ ID NO:22

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SEQ ID NO:23

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SEQ ID NO:25

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SEQ ID NO:26

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SEQ ID NO:27

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SEQ ID NO:28

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SEQ ID NO:29

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SEQ ID NO:30

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SEQ ID NO:31

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SEQ ID NO:32

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SEQ ID NO:33

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SEQ ID NO:34

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SEQ ID NO:35

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SEQ ID NO:36

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SEQ ID NO:37

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SEQ ID NO:38

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SEQ ID NO:39

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SEQ ID NO:40

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SEQ ID NO:41

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SEQ ID NO:42

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SEQ ID NO:43

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SEQ ID NO:44

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Claims (10)

1.一种酮基泛解酸内酯还原酶突变体，其相对于SEQ ID NO:1所示的野生型酮基泛解酸内酯还原酶CviCPR，在第126位氨基酸残基和/或第215位氨基酸残基具有以下突变：

第126位亮氨酸L突变为脯氨酸P、苯丙氨酸F、酪氨酸Y和色氨酸W中的一种；第215位丙氨酸A突变为天冬氨酸D和谷氨酸E中的一种。

2.编码权利要求1所述的酮基泛解酸内酯还原酶突变体的核酸分子；

优选地，所述核酸分子为如下1)-14)所示的基因：

1)SEQ ID NO:16所示的DNA分子；

2)SEQ ID NO:18所示的DNA分子；

3)SEQ ID NO:20所示的DNA分子；

4)SEQ ID NO:22所示的DNA分子；

5)SEQ ID NO:24所示的DNA分子；

6)SEQ ID NO:26所示的DNA分子；

7)SEQ ID NO:28所示的DNA分子；

8)SEQ ID NO:30所示的DNA分子；

9)SEQ ID NO:32所示的DNA分子；

10)SEQ ID NO:34所示的DNA分子；

11)SEQ ID NO:36所示的DNA分子；

12)SEQ ID NO:38所示的DNA分子；

13)SEQ ID NO:40所示的DNA分子；

14)SEQ ID NO:42所示的DNA分子。

3.一种重组载体，其包含权利要求2所述的核酸分子；

优选地，所述重组载体还包含编码葡萄糖脱氢酶的核酸分子；

更优选地，所述葡萄糖脱氢酶来源于巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)，其氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:44所示。

4.一种重组细胞，其包含权利要求3所述的重组载体；

优选地，所述重组细胞诱导产生权利要求1所述的酮基泛解酸内酯还原酶突变体；

更优选地，所述重组细胞还诱导产生葡萄糖脱氢酶。

5.一种酮基泛解酸内酯还原酶的制备方法，包括：

对权利要求4所述的重组细胞进行诱导培养，得到培养物；

从所述培养物中分离权利要求1所述的酮基泛解酸内酯还原酶突变体。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：还包括从所述培养物中分离葡萄糖脱氢酶的步骤。

7.权利要求1所述的酮基泛解酸内酯还原酶突变体、权利要求2所述的核酸分子、权利要求3所述的重组载体和/或权利要求4所述的重组细胞在制备D-泛解酸内酯中的应用。

8.一种D-泛解酸内酯的制备方法，包括：以权利要求1所述的酮基泛解酸内酯还原酶突变体、权利要求4所述的重组细胞和/或权利要求5或6所述的方法制备得到的酮基泛解酸内酯还原酶作为催化剂，对酮基泛解酸内酯进行催化反应，得到D-泛解酸内酯。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于：所述催化反应的反应pH为6-8；和/或

所述催化反应的温度为30℃-50℃。

10.根据权利要求8或9所述的制备方法，其特征在于：所述催化反应在磷酸盐缓冲液中进行；和/或

所述催化反应中，所述酮基泛解酸内酯的累积终浓度为1mM-400mM；和/或

所述催化反应中，所述催化剂与所述酮基泛解酸内酯的质量比为(0.01-0.1):1。

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