CN109266630A - 一种脂肪酶及其在制备布瓦西坦中间体中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种脂肪酶及其在制备布瓦西坦中间体中的应用，具体地，本发明公开了部分脂肪酶可以用于布瓦西坦中间体的制备，在此基础上进一步提供了一种反应条件温和、收率高、成本低的布瓦西坦中间体(R)‑4‑丙基‑二氢呋喃‑2‑酮的制备方法。

Description

一种脂肪酶及其在制备布瓦西坦中间体中的应用

技术领域

本发明属于生物酶催化领域，具体地说，本发明涉及一种脂肪酶以及在制备布瓦西坦中间体中的应用。

背景技术

布瓦西坦Brivaracetam是比利时UCB公司开发的一种新型抗癫痫药，其中(R)-4-丙基-二氢呋喃-2-酮是其重要的中间体。

(R)-4-丙基-二氢呋喃-2-酮有多种制备方法，如WO2016191435以(R)-环氧氯丙烷为原料，经三步反应制得(R)-4-丙基-二氢呋喃-2-酮，(R)-4-丙基-二氢呋喃-2-酮可进一步制得布瓦西坦。

CN106588741A以(R)-3-甲氧基羰基己酸为原料，经环化制得(R)-4-丙基-二氢呋喃-2-酮，(R)-4-丙基-二氢呋喃-2-酮再经开环，取代，环化可制得布瓦西坦。

但以上都是化学方法，且都采用手性原料，成本较高。

因此，本领域技术人员致力于开发经济环保的布瓦西坦中间体制备工艺。

发明内容

本发明的目的在于提供一种反应条件温和、收率高、成本低的布瓦西坦中间体制备方法。

在本发明的第一方面，提供了一种脂肪酶在制备(R)-4-丙基-二氢呋喃-2-酮中的应用，其中，所述脂肪酶选自下组：

(A)具有SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，或SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的多肽；

(B)具有与SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，或SEQ ID NO:5中任一所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地，≥90％的同源性；更优选地≥95％的同源性；最优选地，≥97％的同源性，如≥99％的同源性)的多肽，且所述多肽具有催化活性；

(C)将SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，或SEQ ID NO:5中任一所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且保留催化活性的衍生多肽。

在另一优选例中，所述脂肪酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，或SEQID NO:5所示。

在另一优选例中，所述脂肪酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:3，或SEQ ID NO:4所示。

在另一优选例中，所述催化活性指所述脂肪酶可催化作为底物的化合物3反应得到化合物2，其反应式如下：

本发明的第二方面，提供了一种制备(R)-4-丙基-二氢呋喃-2-酮的方法，包括步骤：

(1)配制反应体系并进行酶催化反应

所述反应体系中包括作为底物的化合物3、和脂肪酶；以化合物3为底物，在脂肪酶作用下，得到化合物2；

(2)化合物2经环化制得化合物1，化合物1即为(R)-4-丙基-二氢呋喃-2-酮；

其反应式如下：

在另一优选例中，所述脂肪酶选自下组：

(A)具有SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，或SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的多肽；

(B)具有与SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，或SEQ ID NO:5中任一所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地，≥90％的同源性；更优选地≥95％的同源性；最优选地，≥97％的同源性，如≥99％的同源性)的多肽，且所述多肽具有催化活性；

(C)将SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，或SEQ ID NO:5中任一所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且保留催化活性的衍生多肽

在另一优选例中，所述脂肪酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，或SEQID NO:5所示。

在另一优选例中，所述脂肪酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:3，或SEQ ID NO:4所示。

在另一优选例中，所述步骤(1)中，所述反应体系的pH为5.5-8.5，优选为6.5-7.5。

在另一优选例中，所述步骤(1)中，所述反应体系还包括吐温80；优选地，所述吐温80和化合物3的质量比为0.5～5：100。

在另一优选例中，所述步骤(1)中，酶催化反应的温度为20-25℃。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，意外发现部分脂肪酶可以用于布瓦西坦中间体的制备，在此基础上获得了一种反应条件温和、收率高、成本低的布瓦西坦中间体的制备方法。

在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。

脂肪酶

本发明提供了脂肪酶在制备(R)-4-丙基-二氢呋喃-2-酮中的应用。本发明的脂肪酶应当具有催化作为底物的化合物3反应得到化合物2的活性，其反应式如下：

在本发明的一个优选地实施方式中，所述脂肪酶选自下组：

(A)具有SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，或SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的多肽；

(B)具有与SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，或SEQ ID NO:5中任一所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地，≥90％的同源性；更优选地≥95％的同源性；最优选地，≥97％的同源性，如≥99％的同源性)的多肽，且所述多肽具有催化活性；

(C)将SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，或SEQ ID NO:5中任一所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且保留催化活性的衍生多肽。

本领域的普通技术人员可以使用的常规方法获得本发明的脂肪酶基因序列，例如全人工合成或PCR法合成。一种优选的合成法为不对称PCR法。不对称PCR法是用不等量的一对引物，PCR扩增后产生大量的单链DNA(ssDNA)。这对引物分别称为非限制引物与限制性引物，其比例一般为50-100∶1。在PCR反应的最初10-15个循环中，其扩增产物主要是双链DNA，但当限制性引物(低浓度引物)消耗完后，非限制性引物(高浓度引物)引导的PCR就会产生大量的单链DNA。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明的脂肪酶可以通过常规的重组DNA技术进行表达或生产，包括步骤：

(1)用编码本发明蛋白的多核苷酸，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2)在合适的培养基中培养宿主细胞；

(3)从培养基或细胞中分离、纯化目的蛋白质，从而获得脂肪酶。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明脂肪酶的编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体，优选市售的载体：pET28。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。此外，表达载体优选包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状。

所述重组载体在5'到3'方向上包括：启动子，目的基因和终止子。如果需要，所述重组载体还可以包括以下元件：蛋白纯化标签；3'多聚核苷酸化信号；非翻译核酸序列；转运和靶向核酸序列；选择标记(抗生素抗性基因、荧光蛋白等)；增强子；或操作子。

用于制备重组载体的方法是本领域普通技术人员所熟知的。表达载体可以是细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要其能够在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以被采用。

本领域普通技术人员可以采用熟知的方法构建含有本发明启动子和/或目的基因序列的载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。

本发明的表达载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使宿主转录目的RNA或表达目的蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌、链霉菌属、农杆菌：或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体和宿主细胞。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物(如大肠杆菌)时，可以用CaCl₂法处理，也可用电穿孔法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法(如显微注射、电穿孔、脂质体包装等)。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、幼胚转化法、花芽浸泡法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得转基因的植物。

术语“可操作连接”是指将准备转录表达的目的基因以一种本领域的常规方式连接到它的控制序列以被表达。

工程菌的培养和目的蛋白发酵生产

在获得工程细胞后，便可在适合的条件下培养工程细胞，表达本发明的基因序列所编码的蛋白。根据宿主细胞的不同，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基，在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在本发明中，可采用常规的发酵条件。代表性的条件包括(但并不限于)：

(a)就温度而言，脂肪酶的发酵及诱导温度保持在25-37℃；

(b)就诱导期的pH值而言，诱导期pH控制在3-9；

(c)就溶氧(DO)而言，DO控制在10-90％，溶氧的维持可以用氧气/空气混合气体的通入来解决；

(d)就补料而言，补料种类宜包括甘油、甲醇、葡萄糖等碳源，可单独补料或混合补料；

(e)就诱导期IPTG浓度而言，常规诱导浓度都可用于本发明，通常IPTG浓度控制在0.1-1.5mM；

(f)就诱导时间而言，没有特别限制，通常为2-20小时，较佳地为5-15小时。

本发明的目的蛋白脂肪酶存在大肠杆菌细胞胞内，通过离心机收集宿主细胞，然后通过高压、机器力、酶解细胞被或其他细胞破碎方法破碎宿主细胞，释放重组蛋白，优选的是高压法。宿主细胞裂解液可通过絮凝、盐析、超滤等方法进行初步纯化后再进行层析、超滤等纯化，也可直接进行层析纯化。

层析技术包括阳离子交换层析、阴离子交换层析、凝胶过滤层析、疏水层析、亲和层析等技术。常用的层析方法包括：

1.阴离子交换层析：

阴离子交换层析介质包括(但不限于)：Q-Sepharose、DEAE-Sepharose。如果发酵样品的盐浓度较高，影响与离子交换介质的结合，则在进行离子交换层析前需降低盐浓度。样品可以用稀释、超滤、透析、凝胶过滤层析等手段进行平衡缓冲液的更换，直至与对应的离子交换柱平衡液系统相似，然后上样，进行盐浓度或pH的梯度洗脱。

2.疏水层析：

疏水层析介质包括(但不限于)：Phenyl-Sepharose、Butyl-Sepharose、Octyle-Sepharose。样品通过添加NaCl、(NH₄)₂SO₄等方式提高盐浓度，然后上样，通过降低盐浓度方法洗脱。通过疏水层析除去疏水性有较大差异的杂蛋白。

3.凝胶过滤层析

疏水层析介质包括(但不限于)：Sephacryl、Superdex、Sephadex类。通过凝胶过滤层析更换缓冲体系，或进一步精纯。

4.亲和层析

亲和层析介质包括(但不限于)：HiTrap^TMHeparinHPColumns。

5.膜过滤

超滤介质包括：有机膜如聚砜膜、无机膜如陶瓷膜、金属膜类。通过膜过滤可以达到纯化和浓缩的目的。

本发明的主要优点在于：

(1)首次提供了脂肪酶在制备(R)-4-丙基-二氢呋喃-2-酮中的应用；

(2)提供了一种制备(R)-4-丙基-二氢呋喃-2-酮的方法，该方法使用脂肪酶进行催化，反应条件温和。

(3)本发明筛选到了具有较高活性的脂肪酶用于制备(R)-4-丙基-二氢呋喃-2-酮，实验结果表明获得的目标产物ee值可达99％。

下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

实施例1脂肪酶的制备

1.1酶基因的获取

根据NCBI检索到的脂肪酶基因序列，全合成脂肪酶基因，各酶的信息如下表1

表1脂肪酶酶库

1.2酶基因的表达

将酶基因酶连pET28a，酶切位点NdeI&HindII I，将酶连好的载体，转化宿主大肠杆菌BL21感受态细胞；菌种接种LB培养基于37℃下，200rpm摇床，待OD600至0.8左右时，取菌液加入终浓度为25％的无菌甘油编号后，置于-80℃低温冰箱保藏备用。

1.3酶菌株的培养

LB液体培养基组成：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，用去离子水溶解后定容，121℃灭菌20min，待用；

将含有酶基因的工程菌在经平皿划线活化后，挑单菌落接种至含50μg/ml卡那霉素的5ml LB液体培养基中，37℃震荡培养12h，按2％接种量转接至150ml同样含50μg/ml卡那霉素的新鲜LB液体培养基中，37℃震荡至OD600达到0.8左右时，降温至30℃，加入IPTG至其终浓度为0.5mM，诱导培养16h，培养结束后，将培养液10000rpm离心10min，弃上清液，收集菌体，置于-20℃冰箱中保存，待用。

1.4粗酶液的制备以及酶活的测定

将培养结束后收集到的菌体，用50mM pH8.0磷酸缓冲液洗涤两次，之后重悬于50mLpH8.0的磷酸缓冲液中，均质破碎，破碎液离心去除沉淀，得到含重组N-乙酰氨基酸消旋酶的粗酶液。

酶活测定方法：

脂肪酶酶活定义：30℃，pH7.5条件下，1mL反应体系内，1min内催化水解乙酸对硝基苯酯(PNPA)产生1μmol对硝基苯酚(pNP)所需的酶量为1个酶活单位(U)。

取980μl 50mM磷酸盐缓冲液加入到比色皿中，并加入10μl PNPA底物(10mM)，OD400处校正归零；加10μl稀释过脂肪酶酶液至比色皿中，充分混匀；在波长400nm处记录吸光值的变化，记录1min的反应动力学过程；每0.2min读取OD400值，记录数据，制作时间与A_OD400吸光值的变化曲线，取反应动力学斜率，计算酶活。

表2序列表中不同酶的酶活

实施例2化合物3的制备

三口瓶中加入LDA的四氢呋喃溶液(1M)1L，氮气保护后降温至-78℃，滴加化合物5(1eq，116g)，滴完后保温搅拌0.5h，滴入化合物4(1eq，195g)，滴完后保温0.5h，滴加稀盐酸至体系近中性，慢慢回至室温。减压浓缩除去THF，乙酸乙酯萃取，稀盐酸洗涤除去二异丙胺，水洗后浓缩有机相，得淡黄色油状物138g，收率60％。

¹H NMR(CDCl3,400MHz)3.54(s,3H)2.70-2.60(m,1H)2.46(dd,J＝16.3,9.4Hz,1H)2.20(dd,J＝16.3,5.2Hz,1H)1.52-1.40(m,1H)1.35-1.25(m,1H)1.28(s,9H)1.22-1.10(m,2H)0.76(t,J＝7.3Hz,3H)ppm；

¹³C NMR(CDCl3,400MHz)175.6,171.1,80.6,51.5,41.2,37.4,34.0,28.0,20.2,13.8ppm.

实施例3化合物2的制备

脂肪酶加入三口瓶中(各脂肪酶终浓度为50U/mL)，加入400mL磷酸盐缓冲液(pH7.0，0.05M)，1.0g吐温80，加入100g化合物3，保温20-25℃，同时碳酸氢钠饱和水溶液控制pH 7.0。至pH变化不大后，HPLC检测反应45-50％。

后处理：反应体系降温至5℃，调pH至8.5-9.0，EA萃取除去化合物3，水相调pH至3-4，EA萃取三次，合并有机相后减压浓缩除去溶剂得化合物2。

¹H NMR(CDCl3,400MHz)2.88-2.78(m,1H)2.63(dd,J＝16.4,9.3Hz,1H)2.39(dd,J＝16.4,5.2Hz,1H)1.72-1.60(m,1H),1.55-1.48(m,1H)1.45(s,9H)1.45-1.35(m,2H)0.94(t,J＝7.3Hz,3H)ppm；

¹³CNMR(CDCl3,400MHz)181.5,171.1,80.9,41.2,37.1,33.8,28.0,20.1,13.8ppm；MS[M-H]215.1283

表3

实验结果如表3所示，结果表明，脂肪酶3(序列3，SEQ ID NO.:3)和脂肪酶4(序列4，SEQ ID NO.:4)的转化效率最高，且ee值最高。

实施例4化合物1的合成：

化合物2(21.6g)溶于THF中(175mL)慢慢加入硼氢化钠(1eq，3.7g)甲烷后降温至0℃，滴加三氟化硼乙醚(1.4eq，20g)，滴完后保温反应2h，HPLC检测反应完全。升温至50℃保温反应1h，中间体转化完全。降温至20℃后将反应液倒入饱和碳酸氢钠水溶液中，至体系近中性，减压浓缩除去THF，EA萃取三次，得化合物1，收率90％,ee值99％。

¹H NMR(CDCl3,400MHz)4.38-4.40(m，1H)，3.88-3.92(m，1H)，2.50-2.61(m，2H)，2.14-2.19(m，1H)，1.43-1.48(m，2H)，1.26-1.33(m，2H),0.90-0.93(m，3H)

¹³C NMR(CDCl3,400MHz)177.3,73.4,35.4,35.2,34.5,20.5,13.9ppm；MS[M+H]129.0916

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 上海弈柯莱生物医药科技有限公司

<120> 一种脂肪酶以及在制备布瓦西坦中间体中的应用

<130> 000005

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 364

<212> PRT

<213> 洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)

<400> 1

Met Ala Arg Ser Met Arg Ser Arg Val Val Ala Gly Ala Val Ala Cys

1 5 10 15

Ala Met Ser Val Ala Pro Phe Ala Gly Met Thr Ala Ala Met Thr Leu

20 25 30

Ala Thr Thr His Ala Ala Met Ala Ala Ser Ala Pro Val Asp Asn Tyr

35 40 45

Ala Ala Thr Arg Tyr Pro Ile Ile Leu Val His Gly Leu Thr Gly Thr

50 55 60

Asp Lys Tyr Ala Gly Val Leu Glu Tyr Trp Tyr Gly Ile Gln Glu Asp

65 70 75 80

Leu Gln Gln His Gly Ala Thr Val Tyr Val Ala Asn Leu Ser Gly Phe

85 90 95

Gln Ser Asp Asp Gly Pro Asn Gly Arg Gly Glu Gln Leu Leu Ala Tyr

100 105 110

Val Lys Thr Val Leu Ala Ala Thr Gly Ala Thr Lys Val Asn Leu Val

115 120 125

Gly His Ser Gln Gly Gly Leu Thr Ser Arg Tyr Val Ala Ala Val Ala

130 135 140

Pro Asp Leu Val Ala Ser Val Thr Thr Ile Gly Thr Pro His Arg Gly

145 150 155 160

Ser Glu Phe Ala Asp Phe Val Gln Gly Val Leu Ala Tyr Asp Pro Thr

165 170 175

Gly Leu Ser Ser Thr Val Ile Ala Ala Phe Val Asn Val Phe Gly Ile

180 185 190

Leu Thr Ser Ser Ser Asn Asn Thr Asn Gln Asp Ala Leu Ala Ala Leu

195 200 205

Lys Thr Leu Thr Thr Ala Gln Ala Ala Thr Tyr Asn Gln Asn Tyr Pro

210 215 220

Ser Ala Gly Leu Gly Ala Pro Gly Ser Cys Gln Thr Gly Ala Pro Thr

225 230 235 240

Glu Thr Val Gly Gly Asn Thr His Leu Leu Tyr Ser Trp Ala Gly Thr

245 250 255

Ala Ile Gln Pro Thr Ile Ser Val Phe Gly Val Thr Gly Ala Thr Asp

260 265 270

Thr Ser Thr Ile Pro Leu Val Asp Pro Ala Asn Ala Leu Asp Pro Ser

275 280 285

Thr Leu Ala Leu Phe Gly Thr Gly Thr Val Met Ile Asn Arg Gly Ser

290 295 300

Gly Gln Asn Asp Gly Val Val Ser Lys Cys Ser Ala Leu Tyr Gly Gln

305 310 315 320

Val Leu Ser Thr Ser Tyr Lys Trp Asn His Leu Asp Glu Ile Asn Gln

325 330 335

Leu Leu Gly Val Arg Gly Ala Asn Ala Glu Asp Pro Val Ala Val Ile

340 345 350

Arg Thr His Ala Asn Arg Leu Lys Leu Ala Gly Val

355 360

<210> 2

<211> 326

<212> PRT

<213> 南极洲莫氏黑粉菌(Moesziomyces antarcticus)

<400> 2

Ala Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala Phe Ser Gln Pro Lys Ser Val

1 5 10 15

Leu Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln Gly Ala Ser Pro Ser Ser Val Ser

20 25 30

Lys Pro Ile Leu Leu Val Pro Gly Thr Gly Thr Thr Gly Pro Gln Ser

35 40 45

Phe Asp Ser Asn Trp Ile Pro Leu Ser Thr Gln Leu Gly Tyr Thr Pro

50 55 60

Cys Trp Ile Ser Pro Pro Pro Phe Met Leu Asn Asp Thr Gln Val Asn

65 70 75 80

Thr Glu Tyr Met Val Asn Ala Ile Thr Ala Leu Tyr Ala Gly Ser Gly

85 90 95

Asn Asn Lys Leu Pro Val Leu Thr Trp Ser Gln Gly Gly Leu Val Ala

100 105 110

Gln Trp Gly Leu Thr Phe Phe Pro Ser Ile Arg Ser Lys Val Asp Arg

115 120 125

Leu Met Ala Phe Ala Pro Asp Tyr Lys Gly Thr Val Leu Ala Gly Pro

130 135 140

Leu Asp Ala Leu Ala Val Ser Ala Pro Ser Val Trp Gln Gln Thr Thr

145 150 155 160

Gly Ser Ala Leu Thr Thr Ala Leu Arg Asn Ala Gly Gly Leu Thr Gln

165 170 175

Ile Val Pro Thr Thr Asn Leu Tyr Ser Ala Thr Asp Glu Ile Val Gln

180 185 190

Pro Gln Val Ser Asn Ser Pro Leu Asp Ser Ser Tyr Leu Phe Asn Gly

195 200 205

Lys Asn Val Gln Ala Gln Ala Val Cys Gly Pro Leu Phe Val Ile Asp

210 215 220

His Ala Gly Ser Leu Thr Ser Gln Phe Ser Tyr Val Val Gly Arg Ser

225 230 235 240

Ala Leu Arg Ser Thr Thr Gly Gln Ala Arg Ser Ala Asp Tyr Gly Ile

245 250 255

Thr Asp Cys Asn Pro Leu Pro Ala Asn Asp Leu Thr Pro Glu Gln Lys

260 265 270

Val Ala Ala Ala Ala Leu Met Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ile Val Ala

275 280 285

Gly Pro Lys Gln Asn Cys Glu Pro Asp Leu Met Pro Tyr Ala Arg Pro

290 295 300

Phe Ala Val Gly Lys Arg Thr Cys Ser Gly Ile Val Thr Pro Leu Glu

305 310 315 320

His His His His His His

325

<210> 3

<211> 323

<212> PRT

<213> 东工大硫化叶菌(Sulfolobus tokodaii)

<400> 3

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

1 5 10 15

Arg Gly Ser His Met Ile Asp Pro Lys Ile Lys Lys Leu Leu Glu Ser

20 25 30

Thr Ile Gln Leu Pro Ile Gly Lys Ala Ser Val Glu Glu Ile Arg Ser

35 40 45

Leu Phe Lys Gln Phe Ser Ser Leu Thr Pro Arg Glu Glu Val Gly Lys

50 55 60

Ile Glu Asp Ile Thr Ile Pro Gly Ser Glu Thr Asn Ile Lys Ala Arg

65 70 75 80

Val Tyr Tyr Pro Lys Thr Gln Gly Pro Tyr Gly Val Leu Val Tyr Tyr

85 90 95

His Gly Gly Gly Phe Val Leu Gly Asp Ile Glu Ser Tyr Asp Pro Leu

100 105 110

Cys Arg Ala Ile Thr Asn Ser Cys Gln Cys Val Thr Ile Ser Val Asp

115 120 125

Tyr Arg Leu Ala Pro Glu Asn Lys Phe Pro Ala Ala Val Val Asp Ser

130 135 140

Phe Asp Ala Leu Lys Trp Val Tyr Asn Asn Ser Glu Lys Phe Asn Gly

145 150 155 160

Lys Tyr Gly Ile Ala Val Gly Gly Asp Ser Ala Gly Gly Asn Leu Ala

165 170 175

Ala Val Thr Ala Ile Leu Ser Lys Lys Glu Asn Ile Lys Leu Lys Tyr

180 185 190

Gln Val Leu Ile Tyr Pro Ala Val Ser Phe Asp Leu Ile Thr Lys Ser

195 200 205

Leu Tyr Asp Asn Gly Glu Gly Phe Phe Leu Thr Arg Glu His Ile Asp

210 215 220

Trp Phe Gly Gln Gln Tyr Leu Arg Ser Phe Ala Asp Leu Leu Asp Phe

225 230 235 240

Arg Phe Ser Pro Ile Leu Ala Asp Leu Asn Asp Leu Pro Pro Ala Leu

245 250 255

Ile Ile Thr Ala Glu His Asp Pro Leu Arg Asp Gln Gly Glu Ala Tyr

260 265 270

Ala Asn Lys Leu Leu Gln Ser Gly Val Gln Val Thr Ser Val Arg Phe

275 280 285

Asn Asn Val Ile His Gly Phe Val Ser Phe Phe Pro Phe Ile Glu Gln

290 295 300

Gly Arg Asp Ala Ile Gly Leu Ile Gly Tyr Val Leu Arg Lys Val Phe

305 310 315 320

Tyr Gly Lys

<210> 4

<211> 223

<212> PRT

<213> 葡萄糖酸伯克霍尔德菌PG1(Burkholderia glumae PG1)

<400> 4

Met Arg Pro Val Asp Thr Leu Glu Ile Glu Thr Ala Ala Asp Pro Arg

1 5 10 15

Tyr Ala Val Ile Leu Met His Gly Leu Gly Ala Asp Ala Asn Asp Phe

20 25 30

Val Pro Leu Ile Pro Glu Leu Arg Leu Ala Asp Ala Pro Gly Val Arg

35 40 45

Phe Val Phe Pro Asn Ala Pro Glu Met Pro Val Thr Ala Asn Asn Gly

50 55 60

Tyr Val Met Arg Ala Trp Tyr Asp Ile Leu Ser Phe Asn Gly Gly Leu

65 70 75 80

Asn Arg Asp Val Asp Glu Ala Gly Ile Glu Ala Ser Arg Ala Thr Ile

85 90 95

Arg Ala Leu Ile Glu Ala Gln Asn Arg Arg Gly Ile Pro Thr Ser Arg

100 105 110

Ile Phe Val Ala Gly Phe Ser Gln Gly Gly Ala Met Thr Trp Thr Val

115 120 125

Gly Leu Thr His Pro Asp Ala Leu Ala Gly Leu Ile Val Leu Ser Gly

130 135 140

Tyr Leu Pro Ser Pro Ala Leu Ile Thr Arg Asp Phe Gln Thr Ala Asn

145 150 155 160

Arg Asp Thr Pro Ile Phe Ala Ala His Gly Ser Phe Asp Asp Val Leu

165 170 175

Pro Pro Gln Leu Gly Glu Ala Ala Arg Asp Phe Ala Leu Asp Arg Gly

180 185 190

Cys Lys Val Asp Trp His Ala Tyr Pro Met Pro His Ser Thr Cys Met

195 200 205

Glu Glu Val Val Ala Leu Arg Ala Trp Leu Leu Glu Arg Leu Val

210 215 220

<210> 5

<211> 388

<212> PRT

<213> 环境样本(Environmental samples)

<400> 5

Met Ser Ile Ala Asp Gln Ser Leu Ala Lys Arg Val Gln Gly Val Ser

1 5 10 15

Gln Gln Ala Ile Asp Glu Gly Arg Ile Val Gly Ser Val Val Leu Ile

20 25 30

Ala Arg His Gly Arg Val Ile Tyr Ala Asn Ala Ser Gly Tyr Ala Asp

35 40 45

Arg Glu Gln Lys Lys Pro Met Val Arg Glu Thr Gln Phe Arg Leu Ser

50 55 60

Ser Val Ser Lys Pro Tyr Ile Thr Leu Ala Ala Met Arg Met Ile Glu

65 70 75 80

Gln Gln Lys Leu Gly Leu Asp Asp Thr Val Ser Arg Trp Leu Pro Trp

85 90 95

Phe Thr Pro Ala Leu Ala Asp Gly Val Arg Pro Pro Ile Lys Ile Arg

100 105 110

His Leu Leu Ser His Thr Ala Gly Leu Asp Tyr Arg Leu Ser Gln Pro

115 120 125

Ala Glu Gly Pro Tyr His Arg Leu Gly Ile Lys Asp Gly Met Glu Leu

130 135 140

Ser Ser Leu Thr Leu Glu Gln Asn Leu Arg Leu Leu Ala Gln Ala Asp

145 150 155 160

Leu Leu Ala Glu Pro Gly Ser Glu Phe Arg Tyr Ser Leu Ala Ile Asp

165 170 175

Val Leu Gly Ala Val Leu Glu Gln Val Ala Gly Glu Pro Leu Pro Gln

180 185 190

Val Phe Asn His Trp Val Ala Gln Pro Leu Gly Leu Arg Asn Thr Gly

195 200 205

Phe Tyr Thr Thr Asp Val Asp Asn Leu Ala Thr Ala Tyr His Asp Thr

210 215 220

Ala Ala Glu Pro Glu Pro Ile Arg Asp Gly Met Leu Leu Thr Leu Pro

225 230 235 240

Glu Gly Phe Gly Phe Glu Ile Glu Leu Ala Pro Ser Arg Ala Leu Asp

245 250 255

Ala Gln Ala Tyr Pro Ser Gly Gly Ala Gly Met Val Gly Asp Ala Asp

260 265 270

Asp Val Leu Gln Leu Val Glu Thr Leu Arg Thr Gly Lys Glu Gly Ile

275 280 285

Leu Gln Pro Ala Thr Ala Ala Leu Met Arg Gln Ala His Val Gly Ser

290 295 300

His Ala Glu Thr Gln Gly Pro Gly Trp Gly Phe Gly Phe Gly Gly Ala

305 310 315 320

Val Leu Glu Asp Ala Gln Leu Ala Ala Thr Pro Gln His Asn Gly Thr

325 330 335

Leu Gln Trp Gly Gly Val Tyr Gly His Ser Trp Phe Tyr Asp Pro Gln

340 345 350

Ala Ala Ile Ser Val Val Ala Leu Thr Asn Thr Ala Phe Glu Gly Met

355 360 365

Ser Gly Arg Tyr Pro Leu Gln Ile Arg Asp Ala Val Tyr Gly Thr Asn

370 375 380

Glu Pro Thr Arg

385

Claims (10)

1.一种脂肪酶在制备(R)-4-丙基-二氢呋喃-2-酮中的应用，其特征在于，所述脂肪酶选自下组：

(A)具有SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，或SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的多肽；

(B)具有与SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，或SEQ ID NO:5中任一所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地，≥90％的同源性；更优选地≥95％的同源性；最优选地，≥97％的同源性，如≥99％的同源性)的多肽，且所述多肽具有催化活性；

(C)将SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，或SEQ ID NO:5中任一所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且保留催化活性的衍生多肽。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述脂肪酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，或SEQ ID NO:5所示。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述脂肪酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:3，或SEQ ID NO:4所示。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述催化活性指所述脂肪酶可催化作为底物的化合物3反应得到化合物2，其反应式如下：

5.一种制备(R)-4-丙基-二氢呋喃-2-酮的方法，其特征在于，包括步骤：

(1)配制反应体系并进行酶催化反应

所述反应体系中包括作为底物的化合物3、和脂肪酶；以化合物3为底物，在脂肪酶作用下，得到化合物2；

(2)化合物2经环化制得化合物1，化合物1即为(R)-4-丙基-二氢呋喃-2-酮；

其反应式如下：

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述脂肪酶选自下组：

(A)具有SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，或SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的多肽；

(B)具有与SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，或SEQ ID NO:5中任一所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地，≥90％的同源性；更优选地≥95％的同源性；最优选地，≥97％的同源性，如≥99％的同源性)的多肽，且所述多肽具有催化活性；

(C)将SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，或SEQ ID NO:5中任一所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且保留催化活性的衍生多肽。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述脂肪酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，或SEQ ID NO:5所示。

8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述反应体系的pH为5.5-8.5，优选为6.5-7.5。

9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述反应体系还包括吐温80；优选地，所述吐温80和化合物3的质量比为0.5～5：100。

10.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，酶催化反应的温度为20-25℃。