CN111154735A

CN111154735A - 一种烯酮还原酶与一种布瓦西坦中间体的制备方法

Info

Publication number: CN111154735A
Application number: CN202010024863.8A
Authority: CN
Inventors: 蔡宝琴; 张城孝; 章兆琪; 黄勇开; 马克·博科拉; 罗霄; 余梦娇; 崔琴燕
Original assignee: Enzymaster Ningbo Bio Engineering Co Ltd
Current assignee: Sanming Minhe Pharmaceutical Technology Co ltd
Priority date: 2020-01-10
Filing date: 2020-01-10
Publication date: 2020-05-15
Anticipated expiration: 2040-01-10
Also published as: CN111154735B

Abstract

本发明涉及医药中间体技术领域，具体涉及一种烯酮还原酶与一种布瓦西坦中间体的制备方法，该制备方法包括以下步骤：在吗啉的催化下，戊醛和乙醛酸反应生成5‑羟基‑4‑正丙基‑2(5H)‑呋喃酮；在硼氢化钠的催化下，5‑羟基‑4‑正丙基‑2(5H)‑呋喃酮脱除羟基生成4‑正丙基‑2(5H)‑呋喃酮；在烯酮还原酶的存在下，4‑正丙基‑2(5H)‑呋喃酮发生还原反应生成目标产物布瓦西坦中间体；该烯酮还原酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，且其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明所述的布瓦西坦中间体的制备方法仅需3步反应，即可制得布瓦西坦中间体，无需额外化学拆分，整体工艺绿色环保，成本较低，易于实施。

Description

一种烯酮还原酶与一种布瓦西坦中间体的制备方法

技术领域

本发明涉及医药中间体技术领域，具体涉及一种烯酮还原酶与一种布瓦西坦中间体的制备方法。

背景技术

布瓦西坦(Brivaracetam)，即(S)-2-(R)-3-丙基吡咯烷-1-基丁酰胺，是当前世界上应用于治疗癫痫发作的第三代广谱抗癫痫药物之一。与左乙拉西坦相比具有亲和力高，使用剂量大大降低的优点。

布瓦西坦中间体是合成布瓦西坦的重要成分，现有技术提供了诸多合成方法，例如，专利申请CN109134406A中提到布瓦西坦中间体经过一步溴代酰化和一步与S-氨基丁酰胺在碱和相转移催化剂的作用下可以制备得到布瓦西坦。

专利申请CN109134406A公开了一种布瓦西坦中间体的制备方法，其采用化学方法，以5-羟基-4-正丙基-2-呋喃酮为底物通过硼氢盐还原，再以钯、铂、镍金属化合物为催化剂的进一步催化加氢还原，最后以马钱子碱、番木鳖碱、麻黄碱手性拆分剂再进行拆分最终得到布瓦西坦中间体。该方法的缺点是实施了催化加氢这一危险操作，还应用了有毒的手性拆分剂(马钱子碱、番木鳖碱、麻黄碱)，因此该工艺污染环境，并且反应步骤多且难控制手性。

又如，专利申请CN109852644A公开了一种用醇脱氢酶制备布瓦西坦中间体的制备方法，首先以戊醛、乙醛酸为底物以吗啉为催化剂合成5-羟基-4-正丙基-2-呋喃酮，再以Pd/C为催化剂通氢气催化，最后用醇脱氢酶催化得到手性醇(R)-3-(羟甲基)己酸，再通过调节pH至中性使得手性醇(R)-3-(羟甲基)己酸酯化为布瓦西坦中间体。然而，该方法的缺点包括：也实施了催化加氢这一危险操作，并且反应步骤多，反应结束后调节pH会产生废盐问题。

专利申请CN107604018A公开了烯还原酶、辅酶以及酮还原酶、异丙醇、一水葡萄糖和甲酸铵构成的辅酶循环系统催化4-正丙基-2(5H)-呋喃酮为布瓦西坦中间体的制备方法。然而，该方法的缺点包括：从底物4-正丙基-2(5H)-呋喃酮开始，但是这个底物不易采购，此外也没有公开具体的烯还原酶信息。

发明内容

本发明旨在提供一种布瓦西坦中间体的新合成路线，该合成路线包括三步反应：1)戊醛和乙醛酸合成5-羟基-4-正丙基-2(5H)-呋喃酮，2)5-羟基-4-正丙基-2(5H)-呋喃酮脱除羟基生成4-正丙基-2(5H)-呋喃酮，3)4-正丙基-2(5H)-呋喃酮发生还原生成目标产物；并且，本发明还提供了一种全新的烯酮还原酶，成功用于第3)步还原反应。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案包括：

本发明第一方面提供了一种烯酮还原酶，其来源于假丝酵母Candida castelii，所述烯酮还原酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，并且所述烯酮还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体见下表1：

表1烯酮还原酶的核苷酸序列与氨基酸序列

同时，本发明第二方面提供了一种布瓦西坦中间体的制备方法，其反应路线为：

并且，包括以下步骤：

S1：在吗啉的催化下，戊醛和乙醛酸反应生成5-羟基-4-正丙基-2(5H)-呋喃酮；

S2：在硼氢化钠的催化下，5-羟基-4-正丙基-2(5H)-呋喃酮脱除羟基生成4-正丙基-2(5H)-呋喃酮；

S3：在烯酮还原酶的存在下，4-正丙基-2(5H)-呋喃酮发生还原反应生成目标产物布瓦西坦中间体；

其中，所述烯酮还原酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，并且所述烯酮还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

值得补充说明的是，在上述布瓦西坦中间体的制备方法中，所述烯酮还原酶可以是纯的游离状态的酶(例如以酶粉的形式使用)，也可以表达该烯酮还原酶的细胞的形式使用(例如表达该烯酮还原酶的湿菌体)。当然，上述烯酮还原酶还可以本领域技术人员所已知的任何其它形式存在，例如表达该烯酮还原酶的细胞破碎上清液等。

优选地，在上述制备方法中，步骤S1包括：

向反应容器中依次加入蒸馏水、吗啉、乙醛酸以及戊醛，搅拌反应完全，后处理，即得5-羟基-4-正丙基-2(5H)-呋喃酮；其中，吗啉、乙醛酸和戊醛的摩尔比为(101～107)：100：100。

优选地，在上述制备方法中，步骤S2包括：

先向反应容器中加入无水甲醇和5-羟基-4-正丙基-2(5H)-呋喃酮，接着分批加入硼氢化钠，搅拌反应完全，后处理，即得4-正丙基-2(5H)-呋喃酮；其中，硼氢化钠和5-羟基-4-正丙基-2(5H)-呋喃酮的摩尔比为(1.1～3.0)：1。

优选地，在上述制备方法中，步骤S3包括：

向反应容器中加入4-正丙基-2(5H)-呋喃酮，表达所述烯酮还原酶的重组大肠杆菌湿菌体，附加酶湿菌体，辅酶循环反应底物，辅酶，以及缓冲液，搅拌反应完全，后处理，即得所述布瓦西坦中间体；

其中，附加酶湿菌体为酮还原酶湿菌体或葡萄糖脱氢酶湿菌体；

其中，辅酶循环反应底物为异丙醇或者葡萄糖。

值得补充说明的是，在上述布瓦西坦中间体的制备方法中，当使用酮还原酶湿菌体时，采用异丙醇作为辅酶循环反应的底物；而当使用葡萄糖脱氢酶湿菌体时，采用葡萄糖作为辅酶循环反应的底物。

此外，所述酮还原酶湿菌体是已知的，可根据文献①(Hummel W，GrgerH.Strategies for regeneration of nicotinamide coenzymes emphasizingself-sufficient closed-loop recycling systems.J Biotechnol，2014，191:22-31)制得；并且，所述葡萄糖脱氢酶湿菌体是已知的，可根据文献②(Chaparro-Riggers JF,Rogers TA,Va′zquez-Figueroa E&Bommarius AS(2007)Comparison of three enoate reductasesand their potential use for biotransformations.Adv Synth Catal 349,1521–1531)制得。

进一步优选地，在上述制备方法中，所述辅酶为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD+或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NADP+。

进一步优选地，在上述制备方法中，所述缓冲液的pH值为5～9，并且所述缓冲液选自以下任一种：柠檬酸缓冲液，Tric-HCl缓冲溶液，磷酸盐缓冲液，TEOA缓冲液。

进一步优选地，在上述制备方法中，所述重组大肠杆菌湿菌体的制备步骤包括：

将已经用Nco I和EcoR I两种内切酶酶切的表达载体pET-28a与所述烯酮还原酶的核苷酸序列、酮还原酶序列、葡萄糖脱氢酶基因分别用T4连接酶连接，过夜。当酶的氨基酸序列已知时，编码酶蛋白的核苷酸可根据已知的合成方法通过标准的固相方法制备，例如，描述于Beaucage等人,1981,TetLett22：1859-69的经典的亚磷酰胺方法，或描述于Matthes等人,1984,EMBOJ.3:801-05的方法。上述烯酮还原酶、酮还原酶及葡萄糖脱氢酶的核苷酸序列均可由本领域技术人员已知的方法合成。分别将1微升的连接产物加入至含有50微升的大肠杆菌电感受态细胞的电转中，依次在电转仪上立即进行电击，然后立即转移到冰上，加入预热到37℃的肉汤琼脂培养基1毫升，进行混匀；分别转移混匀后的培养基至2毫升的培养管，200转37℃培养一小时；在含有100微升每毫升的卡那霉素的肉汤琼脂平板上进行划线培养，37℃培养箱过夜培养16小时；次日，在接种平板上挑取一个单克隆接种到含有卡那霉素的15毫升培养基的三角烧瓶中，37℃培养箱过夜培养；从过夜培养物以1比100接种量转接至含有200毫升新鲜的含有相同抗性的培养基中，37℃培养，250转振荡培养至菌液在600纳米波长处的吸光值OD600值达0.6～0.8，然后加入1毫升异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，在30℃继续培养过夜；离心，弃上清，收集所述重组大肠杆菌湿菌体。

进一步优选地，在上述制备方法中，4-正丙基-2(5H)-呋喃酮的浓度范围是2g/L～50g/L，表达所述烯酮还原酶的重组大肠杆菌湿菌体的浓度范围是1g/L～50g/L，所述辅酶的浓度范围是0.2～1g/L。

进一步优选地，在上述制备方法中，所述酮还原酶湿菌体的浓度范围是0.2g/L～10g/L，此时作为辅酶循环反应底物的异丙醇的体积浓度范围是5％～20％V/V(体积比)。

进一步优选地，在上述制备方法中，所述葡萄糖脱氢酶湿菌体的浓度范围是0.5g/L～25g/L，此时作为辅酶循环反应底物葡萄糖的浓度范围是2.5g/L～125g/L。

应当说明的是，上述优选实施例中各物质的浓度，例如，4-正丙基-2(5H)-呋喃酮的浓度、重组大肠杆菌湿菌体的浓度、辅酶的浓度、酮还原酶湿菌体的浓度等均是相对于催化体系总体积(例如反应罐的有效容积)而言的，换言之，上述浓度描述的是它们分别相对于催化体系总体积的浓度。

总之，本发明所提供的技术方案与现有技术相比至少具备以下有益效果：

本发明所述的烯酮还原酶，易于获得，手性选择性高，成功将4-正丙基-2(5H)-呋喃酮催化还原以制得布瓦西坦中间体。此外，本发明所述的布瓦西坦中间体的制备方法仅需3步反应，即可制得布瓦西坦中间体，无需额外化学拆分，整体工艺绿色环保，成本较低，易于实施。

因此，本发明所提供的烯酮还原酶和布瓦西坦中间体的制备方法具有广阔的工业化应用前景。

附图说明

图1为5-羟基-4-正丙基-2(5H)-呋喃酮的核磁共振氢谱；

图2为4-正丙基-2(5H)-呋喃酮的核磁共振氢谱；

图3为布瓦西坦中间体的标样的质谱；

图4为实施例4制得的布瓦西坦中间体的质谱；

图5为布瓦西坦中间体外消旋体标样的气相色谱图；

图6为实施例5制得的布瓦西坦中间体的气相色谱图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为本发明的限定。

实施例1

5-羟基-4-正丙基-2(5H)-呋喃酮的制备

室温条件下，在100mL三口瓶中加入15mL蒸馏水及8.89g吗啉(分子量87.1，0.102mol)，冷却至0-5℃，缓慢滴加14.8克50％体积比乙醛酸溶液(分子量74，0.1mol)，滴加过程中温度控制在15℃以下，滴加完毕后继续搅拌15分钟。随后控温在15～25℃缓慢滴加8.61g戊醛(分子量86.1，0.1mol注:在后处理过程中没有醛的味道)，滴加完毕后升至40～41℃，继续搅拌18h。将反应液冷却至室温，滴加12mL 37％盐酸(分子量37.5，0.14mol)，滴加完毕后于23～25℃继续搅拌3小时。随后，加入30mL甲叔醚(薄层色谱TLC)，分层，水相继续采用30mL甲叔醚萃取2次，合并有机相，有机相采用30mL 20％氯化钠溶液洗涤一次，无水硫酸钠干燥，真空除溶剂得粗品14.0克，粗品收率98.5％。此外，图1示出了5-羟基-4-正丙基-2(5H)-呋喃酮的核磁共振氢谱。

实施例2

4-正丙基-2(5H)-呋喃酮的制备

在100mL三口瓶中加入50mL无水甲醇及6.9g 5-羟基-4-正丙基-2(5H)-呋喃酮(分子量142，48.6mmol，1eq)，冷却至-5～0℃，分批加入3.9g硼氢化钠(分子量37.8，103mmol，2.1eq)后升至0～10℃(注：有气体产生，剧烈放热且有延迟)，继续搅拌30min后自然升至室温，薄层色谱法TLC检测反应进程(展开剂：正己烷/乙酸乙酯＝3：1)，待原料完全消失后，冷却至0-5℃，缓慢滴加100mL盐酸，滴加完毕后继续搅拌5分钟，80mL乙酸乙酯萃取3次(注：水相pH＝4.0～4.5)，合并有机相，100mL 5％碳酸钠洗涤一次，饱和食盐水洗涤一次，无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂得粗品5.9克，过柱得纯品5.2g，收率64％。图2示出了产物4-正丙基-2(5H)-呋喃酮的核磁共振氢谱。

实施例3

重组大肠杆菌湿菌体的制备

将已经用Nco I和EcoR I两种内切酶酶切的表达载体pET-28a与所述烯酮还原酶的核苷酸序列、酮还原酶序列、葡萄糖脱氢酶基因分别用T4连接酶连接，过夜。分别将1微升的连接产物加入至含有50微升的大肠杆菌电感受态细胞的电转中，在电转仪上立即进行电击，然后立即转移到冰上，分别加入预热到37℃的肉汤琼脂培养基1mL，进行混匀；分别转移混匀后的培养基至2mL的培养管，200转37℃培养一小时；在含有100微升每mL的卡那霉素的肉汤琼脂平板上进行划线培养，37℃培养箱过夜培养16小时；次日，在接种平板上挑取一个单克隆接种到含有卡那霉素的15mL培养基的三角烧瓶中，37℃培养箱过夜培养；从过夜培养物以1比100接种量转接至含有200mL新鲜的含有相同抗性的培养基中，37℃培养，250转振荡培养至菌液在600纳米波长处的吸光值OD600值达0.6～0.8，然后加入1mL异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，在30℃继续培养过夜；离心，弃上清，收集所述重组大肠杆菌湿菌体。

实施例4

布瓦西坦中间体的制备

在25mL反应瓶中，加入100mg 4-正丙基-2(5H)-呋喃酮，50mg表达所述烯酮还原酶的重组大肠杆菌湿菌体(湿菌体的浓度为5g/L，每mg湿菌体含酶0.1mg)，10mg酮还原酶湿菌体(湿菌体的浓度为1g/L，每mg湿菌体含酶0.2mg)，0.5ml异丙醇，10mg烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD+；加入缓冲液(0.1M，pH8.5)至10ml体积。在55℃的温度下利用磁力搅拌24小时后用乙酸乙酯灭活反应和萃取，取样进行质谱分析。质谱检测的结果图谱如图4所示，分子量129.09的峰即为产物布瓦西坦中间体。在酶反应样品中可以看到确实有129.09分子量的物质生成即产物布瓦西坦中间体生成。

实施例5

在25mL反应瓶中，加入100mg 4-正丙基-2(5H)-呋喃酮,200mg表达所述烯酮还原酶的重组大肠杆菌湿菌体(湿菌体的浓度为20g/L，每mg湿菌体含烯酮还原酶0.1mg)，25mg葡萄糖脱氢酶湿菌体(湿菌体的浓度为2.5g/L，每mg湿菌体含酶0.2mg)，100mg葡萄糖，10mg烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD+；加入缓冲液(0.1M，pH7.5)至10mL体积。在30℃的温度下利用磁力搅拌24小时后用乙酸乙酯灭活反应和萃取，取样进行气相手性分析。气相手性分析方法：SUPELCO的色谱柱Beta Bex-225长度:30.0m内径:250.00um膜厚:0.25um。方法为柱箱平衡时间:1.00min，初始温度：100℃(开启)，运行时间:30.00min，分流比30：1。采用本实施例的气相手性分析方法，检测目标产物布瓦西坦中间体的ee值为99.4％。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

序列表

<110> 宁波酶赛生物工程有限公司

<120> 一种烯酮还原酶与一种布瓦西坦中间体的制备方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1203

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

atgagcttcg tgaaagactt caagccggtg gcactgaaag atacagaact gtttaagccg 60

atcaagatcg gccgtacaga agttaaacat cgtattgtta tgcctccgct gaccagaatg 120

cgtgcacatc atcctggtca tgttcctaat aaggaatggg ccgtggaata ttataaccag 180

cgctcaaaac gtccgggcac aatgatcgtt accgaaggtg tttttacctg cccgcaagca 240

ggtggttatg ataatgcacc tggtgtgtgg agcgatgaac aaatgacaga atggaaaaag 300

atcatcgcga aggtgcatga aaacaaaagt ttcatctggc cgcagctgtg ggttttaggt 360

agacaaggtt ttgccgattg cctggcaaga gatggtttaa gatatgatag cgccagcgat 420

ggtgtgtata tggatgaaga aatggagaag cgcgccaaag atagcagtaa tcctcagcat 480

ggcattacca aagccgaaat tcaggaatat atcgccgcat acgttaaggc cgctaaaaat 540

tgcattgagg ccggtgcaga tggcgttgaa attcatagtg caaatagcta ccttcttaac 600

cagttcctgg atccgattag caataagcgt accgatgaat atggcggcag tattgaaaat 660

cgcagtcgct ttaccctgga agtggttgat gctttaatcg atgccgttgg tgcaggtaga 720

gttggtatta gattttcacc gtacggcacc tatggtacca tgagtggtgg tgcagaacct 780

ttaattgttg cccagtatgc acatgtgatc ggtgaaattg aaaagcgcgg taaagcaggt 840

aaacgtctgg catatattca cctggtggaa cctcgtgtta ccaatccttt tctgaccgaa 900

ggcagtggtg aatatgatga tggcagcaat gatttcgtgt acagtatttg gaagggcccg 960

gttattcgtg caggtaactt agcactgcat ccggaaattg ttcgtgaact ggtgaaagat 1020

ggtcgcacat taattggcat gggcagattt ttcatcgcaa atccggatat tgttgatcgt 1080

atggaaaagg gtctgccgtt aaataagtac gatcgtgata ccttctacgc catgaccgat 1140

aaaggttatc tggattatcc gacctaccag gaagcaattg cactgggttg ggataaacag 1200

taa 1203

<210> 2

<211> 400

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 2

Met Ser Phe Val Lys Asp Phe Lys Pro Val Ala Leu Lys Asp Thr Glu

1 5 10 15

Leu Phe Lys Pro Ile Lys Ile Gly Arg Thr Glu Val Lys His Arg Ile

20 25 30

Val Met Pro Pro Leu Thr Arg Met Arg Ala His His Pro Gly His Val

35 40 45

Pro Asn Lys Glu Trp Ala Val Glu Tyr Tyr Asn Gln Arg Ser Lys Arg

50 55 60

Pro Gly Thr Met Ile Val Thr Glu Gly Val Phe Thr Cys Pro Gln Ala

65 70 75 80

Gly Gly Tyr Asp Asn Ala Pro Gly Val Trp Ser Asp Glu Gln Met Thr

85 90 95

Glu Trp Lys Lys Ile Ile Ala Lys Val His Glu Asn Lys Ser Phe Ile Trp

100 105 110

Pro Gln Leu Trp Val Leu Gly Arg Gln Gly Phe Ala Asp Cys Leu Ala

115 120 125

Arg Asp Gly Leu Arg Tyr Asp Ser Ala Ser Asp Gly Val Tyr Met Asp

130 135 140 145

Glu Glu Met Glu Lys Arg Ala Lys Asp Ser Ser Asn Pro Gln His Gly

150 155 160

Ile Thr Lys Ala Glu Ile Gln Glu Tyr Ile Ala Ala Tyr Val Lys Ala

165 170 175

Ala Lys Asn Cys Ile Glu Ala Gly Ala Asp Gly Val Glu Ile His Ser Ala

180 185 190

Asn Ser Tyr Leu Leu Asn Gln Phe Leu Asp Pro Ile Ser Asn Lys Arg

195 200 205 210

Thr Asp Glu Tyr Gly Gly Ser Ile Glu Asn Arg Ser Arg Phe Thr Leu

215 220 225

Glu Val Val Asp Ala Leu Ile Asp Ala Val Gly Ala Gly Arg Val Gly

230 235 240

Ile Arg Phe Ser Pro Tyr Gly Thr Tyr Gly Thr Met Ser Gly Gly Ala

245 250 255

Glu Pro Leu Ile Val Ala Gln Tyr Ala His Val Ile Gly Glu Ile Glu

260 265 270

Lys Arg Gly Lys Ala Gly Lys Arg Leu Ala Tyr Ile His Leu Val Glu

275 280 285 290

Pro Arg Val Thr Asn Pro Phe Leu Thr Glu Gly Ser Gly Glu Tyr Asp

295 300 305

Asp Gly Ser Asn Asp Phe Val Tyr Ser Ile Trp Lys Gly Pro Val Ile

310 315 320

Arg Ala Gly Asn Leu Ala Leu His Pro Glu Ile Val Arg Glu Leu Val

325 330 335

Lys Asp Gly Arg Thr Leu Ile Gly Met Gly Arg Phe Phe Ile Ala Asn Pro

340 345 350 355

Asp Ile Val Asp Arg Met Glu Lys Gly Leu Pro Leu Asn Lys Tyr Asp

360 365 370

Arg Asp Thr Phe Tyr Ala Met Thr Asp Lys Gly Tyr Leu Asp Tyr Pro

375 380 385

Thr Tyr Gln Glu Ala Ile Ala Leu Gly Trp Asp Lys Gln

390 395 400

Claims

1.一种烯酮还原酶，其特征在于，所述烯酮还原酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，并且所述烯酮还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一种布瓦西坦中间体的制备方法，其特征在于，其反应路线为：

并且，包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的布瓦西坦中间体的制备方法，其特征在于，步骤S1包括：

4.根据权利要求2所述的布瓦西坦中间体的制备方法，其特征在于，步骤S2包括：

5.根据权利要求2所述的布瓦西坦中间体的制备方法，其特征在于，步骤S3包括：

其中，辅酶循环反应底物为异丙醇或者葡萄糖。

6.根据权利要求5所述的布瓦西坦中间体的制备方法，其特征在于，所述辅酶为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD+或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NADP+。

7.根据权利要求5所述的布瓦西坦中间体的制备方法，其特征在于，所述缓冲液的pH值为5～9，并且所述缓冲液选自以下任一种：柠檬酸缓冲液，Tric-HCl缓冲溶液，磷酸盐缓冲液，TEOA缓冲液。

8.根据权利要求5所述的布瓦西坦中间体的制备方法，其特征在于，所述重组大肠杆菌湿菌体的制备步骤包括：

将已经用两种内切酶酶切的表达载体pET-28a与合成的所述烯酮还原酶的核苷酸序列用T4连接酶连接，过夜，将连接产物加入至含有大肠杆菌电感受态细胞的电转中，在电转仪上立即进行电击，然后立即转移到冰上，加入预热到37℃的肉汤琼脂培养基，进行混匀；转移混匀后的培养基至培养管，200转37℃培养1小时；在含有100微升每毫升的卡那霉素的肉汤琼脂平板上进行划线培养，37℃培养箱过夜培养16小时；次日，在接种平板上挑取一个单克隆接种到含有卡那霉素的培养基的三角烧瓶中，37℃培养箱过夜培养；从过夜培养物以1比100接种量转接至含有新鲜的含有相同抗性的培养基中，37℃培养，250转振荡培养至菌液在600纳米波长处的吸光值OD600值达0.6～0.8，然后加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，在30℃继续培养过夜；离心，弃上清，收集所述重组大肠杆菌湿菌体。

9.根据权利要求5所述的布瓦西坦中间体的制备方法，其特征在于，4-正丙基-2(5H)-呋喃酮的浓度范围是2g/L～50g/L，表达所述烯酮还原酶的重组大肠杆菌湿菌体的浓度范围是1g/L～50g/L，所述辅酶的浓度范围是0.2～1g/L。

10.根据权利要求5所述的布瓦西坦中间体的制备方法，其特征在于，所述酮还原酶湿菌体的浓度范围是0.2g/L～10g/L，此时作为辅酶循环反应底物的异丙醇的体积浓度范围是5％～20％；所述葡萄糖脱氢酶湿菌体的浓度范围是0.5g/L～25g/L，此时作为辅酶循环反应底物葡萄糖的浓度范围是2.5g/L～125g/L。