CN114214295B - 一种羰基还原酶及合成(s)-3-(二甲氨基)-1-(2-噻吩基)-1-丙醇的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及化合物合成技术领域，具体涉及一种羰基还原酶及合成(S)‑3‑(二甲氨基)‑1‑(2‑噻吩基)‑1‑丙醇的方法。本发明以以3‑二甲氨基‑1‑(‑噻吩基)‑1‑丙酮盐酸盐为原料在无机盐溶液环境中加入羰基还原酶、葡萄糖脱氢酶组合物、辅酶因子、供氢体，在25‑40℃、pH值为6.8‑7.2条件下反应得到目标产物(S)‑3‑(二甲氨基)‑1‑(2‑噻吩基)‑1‑丙醇；所述的羰基还原酶的核苷酸序列如SEDQ ID NO.1所示，所述葡萄糖脱氢酶的核苷酸序列如SEDQ ID NO.2所示。本发明的方法操作简单，条件温和，产率高，选择性好，耗时短，成本较低，适合产业化应用。

Description

一种羰基还原酶及合成(S)-3-(二甲氨基)-1-(2-噻吩基)-1- 丙醇的方法

技术领域

本发明涉及化合物合成技术领域，具体涉及一种羰基还原酶及合成(S)-3-(二甲氨基)-1-(2-噻吩基)-1-丙醇的方法。

背景技术

(S)-3-(二甲氨基)-1-(2-噻吩基)-1-丙醇，英文名称：(s)-3-(dimethylamino)-1-(2-thienyl)-1-propanol，它是抗抑郁药度洛西汀的重要中间体。

度洛西汀(Duloxetine)，化学名为(S)－N－甲基－3－(1－萘氧基)－3－(2－噻吩)－1－丙胺)，是由美国礼来公司(Elililly)和勃林格殷格翰公司(BoehingerIngelheim)合作开发的用于神经系统疾病的治疗药物，是一种5-羟色胺和去甲肾上腺素双重再吸收抑制剂(SNRIs)，它作为一种安全有效的抗抑郁剂主要用于治疗重型抑郁症，也可用于糖尿病周围神经痛及女性中至重度应激性尿失禁的治疗；随着全球抑郁人数越来越多，对于高效低毒的抗抑郁药的需求越来越大，而度洛西汀相比于其他抗抑郁药物，如帕罗西汀、氟西汀和瑞波西汀等，具有更好的安全性和耐受性，更少的不良反应，且具有多样的治疗活性，因而销量较高，常年占据全球抗抑郁药销量榜前五，为此，众多研究者致力于度洛西汀及其中间体的合成路线的探索，旨在寻找一条经济、环保、操作简单以及高收率的合成路线。

度洛西汀作为一种多功能手性药物，仅(S)-型对映体具有药物活性，合成光学纯度高的(S)-度洛西汀具有重要的价值，因此在合成度洛西汀时需要使反应向生成S型产物的方向进行，尽量避免生成R型产物，以减少原料浪费，提高产品质量。

(S)-度洛西汀较为普遍的合成路线如下：

其中第(Ⅳ)步的(S)-3-甲氨基-1-(2-噻吩基)-1-丙醇，作为合成度洛西汀的关键手性中间体，已成为众多研究者近年来关注热点；目前关于合成关键中间体(S)-3-甲氨基-1-(2-噻吩基)-1-丙醇的方法报道较多，但大部分都是采用化学方法，但在实现该途径的化学还原法中，由于需要钉金属催化剂催化下通入氢气反应，其经济性、安全性和环境友好性并不能满足生产的需要，利用手性拆分剂作为拆分试剂的化学拆分法，其得率通常较低，并会有大量的R异构体难以得到充分利用，经济性差，也不能作为主要生产方法；目前报道的各类化学法通常都有反应副产物多、反应步骤繁杂、能耗大或经济性差等问题，所以利用生物酶法催化制备(S)-3-甲氨基-1-(2-噻吩基)-1-丙醇，因其高效率、合成条件温和，环境友好和绿色节能等优点在合成(S)-3-甲氨基-1-(2-噻吩基)-1-丙醇方面具有更好的潜能

现在也已公布了一些生物催化制备(S)-3-甲氨基-1-(2-噻吩基)-1-丙醇的方法，但部分采取了用有机溶剂异丙醇作为供氢体，不可避免地会产生毒性副产物丙酮，或为了增大底物N-甲基-3-羰基-3-(2-噻吩基)丙酰胺的溶解度，引入有机溶剂DMSO，如专利US8426178、CN 110923277 A/B、CN 103740738 B等；部分仅选用NADH/NADPH作为供氢体，成本较高且产率不佳，如专利CN 111979207 A；大部分能达到的底物浓度较低且反应时间长，如专利US patent2008/0220484A1、CN 103421854 A等；还有部分尽管采取酶催化方法制备目的产物，其步骤仍然繁琐，如专利CN 112126663 A。

总体而言，各种生物催化制备(S)-3-甲氨基-1-(2-噻吩基)-1-丙醇的方法相比较化工合成方法在安全、操作、环境友好和收率方面都有不同提升；但都如上文所述，还存有不同程度的缺点，多数生物催化合成(S)-3-甲氨基-1-(2-噻吩基)-1-丙醇的方法还无法做到大规模的工业应用；对于(S)-度洛西汀关键手性中间体的生物制备法还需更多探索，发掘更多有潜力的备用酶源，以获得更丰富的生物催化剂。

发明内容

为了解决上述问题，本发明旨在提供一种新的羰基还原酶，提供一种耗时短、操作简单，反应条件温和，环保高效的生产工艺。

为了实现本发明目的，具体采用如下技术手段：

一种羰基还原酶，所述羰基还原酶的氨基酸序列选自SEDQ ID NO.1、SEDQ IDNO.2、SEDQ ID NO.3、SEDQ ID NO.4、SEDQ ID NO.5、SEDQ ID NO.6。

优选的，所述羰基还原酶的SEDQ ID NO.1、SEDQ ID NO.2、SEDQ ID NO.3、SEDQ IDNO.4、SEDQ ID NO.5、SEDQ ID NO.6的氨基酸序列所对应的核苷酸序列如SEDQ ID NO.7～SEDQ ID NO.12所示。

一种合成(S)-3-(二甲氨基)-1-(2-噻吩基)-1-丙醇的方法，包括如下步骤：

以3-二甲氨基-1-(-噻吩基)-1-丙酮盐酸盐为原料在无机盐溶液环境中加入前述所述的羰基还原酶、葡萄糖脱氢酶组合物、辅酶因子、供氢体，在25-40℃、pH值为6.8-7.2条件下反应得到目标产物(S)-3-(二甲氨基)-1-(2-噻吩基)-1-丙醇。

优选的，所述的无机盐溶液选自PBS缓冲液或三乙醇胺缓冲液。

优选的，所述辅酶因子可选用NAD或NADP，所述供氢体选用葡萄糖。

优选的，所述羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的获得方式为：将羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的核苷酸序列分别或同时与载体pET21a连接，然后将构建好的载体转至大肠杆菌DE3中，经发酵得到两种酶。

优选的，所述辅酶因子的用量为原料质量的0.005-0.03倍，供氢体的质量为原料质量的1.3-3倍。

优选的，所述方法的具体步骤为：

1)将前述任一项所述的羰基还原酶、葡萄糖脱氢酶的核苷酸序列构建载体后，转入大肠杆菌中进行表达，提取、分离；

2)以3-二甲氨基-1-(-噻吩基)-1-丙酮盐酸盐为原料，在无机盐溶液环境中加入步骤1)所得粗酶或纯化后的酶溶液、辅酶因子、供氢体，25-40℃、pH值为6.8-7.2条件下反应；

3)反应结束后调节反应溶液至碱性，加入有机溶剂萃取，干燥有机相，通过浓缩和重结晶得到白色晶体产物。

优选的，所述步骤3)中的有机溶剂选自乙酸乙酯、二甲苯或正庚烷。

有益效果

本发明是通过将羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶组合作为生物催化剂来制备(S)-3-甲氨基-1-(2-噻吩基)-1-丙醇。在本发明的制备方法中3-二甲氨基-1-(-噻吩基)-1-丙酮盐酸盐作为底物，有极优的溶解度，可避免助溶剂的使用；同时利用了葡萄糖脱氢酶和葡萄糖以及NAD/NADP进行了辅酶循环，较为高效经济，避免了有机溶剂作为供氢体介入反应；相比于许多现行的方法，本发明的方法操作简单，条件温和，产率高，选择性好，耗时较短，成本较低，适合产业化应用。

附图说明

图1为3-二甲氨基-1-(-噻吩基)-1-丙酮盐酸盐的高效液相色谱图。

图2为(S)-3-甲氨基-1-(2-噻吩基)-1-丙醇的高效液相色谱图。

图3为本发明的生物催化方法制备(S)-3-甲氨基-1-(2-噻吩基)-1-丙醇过程中的高效液相色谱图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中所用载体pET21a、大肠杆菌DE3感受态细胞等生物材料均购自市场。葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列为GenBank:KAF2407874.1。

下述实施例中的PBS缓冲液主要成分为Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl，一般作为溶剂，起溶解保护试剂、缓解pH波动的作用。称取80gNaCl、2g KCl、14.4gNa₂HPO₄、2.4gKH₂PO₄溶于800mL蒸馏水中，用HCl调节溶液至7.0，最后加蒸馏水定容至1L即可得0.1MPBS缓冲液。

下述实施例中的三乙醇胺缓冲液主要起溶解保护试剂、缓解pH波动的作用。称取14.9g三乙醇胺于800mL蒸馏水中，用HCl调节溶液至7.0，最后加蒸馏水定容至1L，得0.1M三乙醇胺缓冲液。

下述实施例中所涉及的六种羰基脱氢酶的氨基酸序列如下表所示。

上表中六种羰基脱氢酶的分别对应的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO.7～SEQ ID NO.12所示。

SEQ ID NO.7

SEQ ID NO.8

SEQ ID NO.9

SEQ ID NO.10

SEQ ID NO.11

SEQ ID NO.12

实施例1

S1载体构建与克隆：将选用的葡萄糖脱氢酶和羰基脱氢酶SEQ ID NO.1的核苷酸序列用无缝克隆方式将其分别与载体pET28a连接得到葡萄糖脱氢酶-pET28a、羰基脱氢酶SEQ ID NO.1-pET28a，对前述的连接载体采取如下操作：取10μl连接产物加入冰浴的100μl大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞，随后冰浴30min，42℃热激60s，再冰浴5min，向管中加入37℃无抗LB培养液300μl，37℃、200r摇床修复1h，随后涂在卡那抗性的固体LB平板上37℃培育，长出菌落后用高压灭菌的牙签挑取单菌落，先在含卡那抗性的LB平板上画线保种用，将相应的菌和板子上的画线区做上对应的记号；

S2验证：然后将牙签置于已加入T7通用引物的20μl PCR Mix体系中搅和一下，进行PCR扩增，PCR反应条件为：95℃、15min，94℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸1min，进行30个循环，最后72℃，保温5min，PCR扩增后进行电泳观察结果得阳性克隆，分别获得含有不同目标酶序列的大肠杆菌菌株：葡萄糖脱氢酶-大肠杆菌、羰基脱氢酶SEQ ID NO.1-大肠杆菌；

S3酶的表达和提取：将含有两种目标酶序列的大肠杆菌分别挑取到含卡那抗性的LB培养基中，于37℃下培养OD至1.0左右后加入终浓度0.1mM的IPTG，置于28℃诱导表达16h，然后将菌液以7000g/min离心6min收集菌体，倒掉上清培养基后按菌体重量：PBS溶液＝1g：5ml的比例用100mM PBS溶液将菌体重悬，将重悬后的菌体经高压细胞破碎仪破碎得含酶裂解液，35000g/min离心30min后提取上清液，得到两种目标酶的粗酶溶液。

S4纯化：使含酶的上清液流经Ni柱，随后用不同梯度的咪唑溶液进行洗脱，再使所得含酶量最高的Ni柱洗脱液流经Q柱，随后再用不同梯度的盐溶液(主要成分为KCL)进行洗脱，得到初步纯化的含酶溶液，将初步纯化的含酶溶液进行12h透析，最终得到两种目标酶的纯化的酶溶液；

S5反应：在50mL玻璃反应瓶中，加入2g底物、4g葡萄糖、10mg NADP、5ml羰基还原酶溶液(21.3mg/ml)和1ml葡萄糖脱氢酶溶液(19.7mg/ml)，再向反应瓶中加入4ml 100mM PBS缓冲液开始反应；反应液温度为30℃，用NaOH控制反应液pH在6.8—7.2之间，搅拌均匀后反应4h。

反应前，测量底物3-二甲氨基-1-(-噻吩基)-1-丙酮盐酸盐的高效液相色谱图如图1所示，对照品(S)-3-甲氨基-1-(2-噻吩基)-1-丙醇纯品的高效液相色谱图如图2所示，取S4反应步骤中的混合溶液，所得高效液相色谱图如图3所示，可知底物反应消耗得到产品(S)-3-甲氨基-1-(2-噻吩基)-1-丙醇。

上述反应完成后，将反应后的溶液调至碱性(pH>11)后用等体积乙酸乙酯萃取两次并合并有机相，过0.22μm的滤膜后可取10μl溶液用高效液相色谱检测计算其转化率＞98％，ee值>99％；随后用无水硫酸镁干燥有机相，旋转蒸发浓缩，降温重结晶后可得产物1.58g，纯度达99.7％。

实施例2

采用实施例1的S3步骤制备得到的两种粗酶溶液作为反应原料，进行如下反应。

在50mL玻璃反应瓶中，加入2g底物、4g葡萄糖、10mg NADP、5ml羰基还原酶粗酶溶液和1ml葡萄糖脱氢酶粗酶溶液，再向反应瓶中加入4ml 100mM磷酸盐缓冲液开始反应；反应液温度为30℃，用NaOH控制反应液pH在6.8—7.2之间，搅拌均匀后反应9h。

上述反应完成后，将反应后的溶液调至碱性(pH>11)后用等体积乙酸乙酯萃取两次并合并有机相，过0.22μm的滤膜后可取10μl溶液用高效液相色谱检测计算其转化率＞94％，ee值>99％。

实施例3

S1载体构建与克隆：将选用的葡萄糖脱氢酶和羰基脱氢酶SEQ ID NO.1的核苷酸序列同时与载体pET21a连接，取10μl连接产物加入冰浴的100μl大肠杆菌DE3感受态细胞，随后冰浴30min，42℃热激60s，再冰浴5min，向管中加入37℃无抗LB培养液300μl，37℃、200r摇床修复1h，随后涂在氨苄抗性的固体LB平板上37℃培育，长出菌落后用高压灭菌的牙签挑取单菌落，先在含氨苄抗性的平板上画线保种用，将相应的菌和板子上的画线区做上对应的记号；

S2验证：然后将牙签置于已加入T7通用引物的的20μl PCR Mix体系中搅和一下，进行PCR扩增，PCR反应条件为：95℃、15min，94℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸1min，进行30个循环，最后72℃，保温5min，PCR扩增后进行电泳观察结果得阳性克隆，获得同时含有两种目标酶序列的大肠杆菌菌株；酶在大肠杆菌内进行表达后将菌经高压细胞破碎仪破碎得含酶裂解液，35000g/min离心30min后提取上清液，得含有两种目标酶的粗酶溶液；

S3酶的表达和提取：将同时含有两种目标酶序列的大肠杆菌挑取到含氨苄抗性的LB培养基中，于37℃下培养OD至1.0左右后加入终浓度0.5mM的IPTG，置于28℃诱导表达16h，然后将菌液以7000g/min离心6min收集菌体，倒掉上清培养基后按菌体重量：PBS缓冲液＝1g：5ml的比例用100mM PBS溶液将菌体重悬，将重悬后的菌体经高压细胞破碎仪破碎得含酶裂解液，35000g/min离心30min后提取上清液，得含有两种目标酶的粗酶溶液；

S4反应：在50mL玻璃反应瓶中，加入2g底物、4g葡萄糖、10mg NADP，再向反应瓶中加入10ml S3步骤所得的含两种目标酶的粗酶溶液开始反应；反应液温度为30℃，用NaOH控制反应液pH在6.8—7.2之间，搅拌均匀后反应6h。

上述反应完成后，将反应后的溶液调至碱性(pH>11)后用等体积乙酸乙酯萃取两次并合并有机相，过0.22μm的滤膜后可取10μl溶液用高效液相色谱检测计算其转化率＞98％，ee值>99％；随后用无水硫酸镁干燥有机相，旋转蒸发浓缩，降温重结晶后可得产物1.60g，纯度达99.4％。

实施例4

载体构建与克隆、S2验证及S4反应的操作步骤同实施例3相同，不同的是在S3酶的表达和提取中将菌体重悬所用的PBS缓冲溶液更换为三乙醇胺缓冲液。最终所得反应结果用高效液相色谱检测计算底物转化率＞92％，ee值>99％

实施例5

按照实施例3的S1～S3步骤制备得到含有两种目标酶的粗酶溶液作为反应原料，进行如下反应。

在50mL玻璃反应瓶中，加入2g底物、4g葡萄糖、10mgNAD，再向反应瓶中加入10mlS3步骤所得的含两种目标酶的粗酶溶液开始反应；反应液温度为30℃，用NaOH控制反应液pH在6.8—7.2之间，搅拌均匀后反应6h。

上述反应完成后，将反应后的溶液调至碱性(pH>11)后用等体积乙酸乙酯萃取两次并合并有机相，过0.22μm的滤膜后可取10μl溶液用高效液相色谱检测计算其转化率＞76％，ee值>99％。

实施例6

按照实施例3的S1～S3步骤制备得到含有两种目标酶的粗酶溶液作为反应原料，进行如下反应。

在50mL玻璃反应瓶中，加入2g底物、2.6g葡萄糖、10mg NADP，再向反应瓶中加入10ml S3步骤所得的含两种目标酶的粗酶溶液开始反应；反应液温度为30℃，用NaOH控制反应液pH在6.8—7.2之间，搅拌均匀后反应6h。

上述反应完成后，将反应后的溶液调至碱性(pH>11)后用等体积乙酸乙酯萃取两次并合并有机相，过0.22μm的滤膜后可取10μl溶液用高效液相色谱检测计算其转化率＞98％，ee值>99％；随后用无水硫酸镁干燥有机相，旋转蒸发浓缩，降温重结晶后可得产物1.58g，纯度达99.6％。

实施例7

按照实施例3的S1～S3步骤制备得到含有两种目标酶的粗酶溶液作为反应原料，进行如下反应。

在50mL玻璃反应瓶中，加入2g底物、2.6g葡萄糖、10mg NADP，再向反应瓶中加入10ml含两种目标酶的粗酶溶液开始反应；反应液温度为25℃，用NaOH控制反应液pH在6.8—7.2之间，搅拌均匀后反应6h。

上述反应完成后，将反应后的溶液调至碱性(pH>11)后用等体积乙酸乙酯萃取两次并合并有机相，过0.22μm的滤膜后可取10μl溶液用高效液相色谱检测计算其转化率＞90％，ee值>99％。

实施例8

按照实施例3的S1～S3步骤制备得到含有两种目标酶的粗酶溶液作为反应原料，进行如下反应。

在50mL玻璃反应瓶中，加入2g底物、2.6g葡萄糖、10mg NADP，再向反应瓶中加入10ml含两种目标酶的粗酶溶液开始反应；反应液温度为35℃，用NaOH控制反应液pH在6.8—7.2之间，搅拌均匀后反应6h。

上述反应完成后，将反应后的溶液调至碱性(pH>11)后用等体积乙酸乙酯萃取两次并合并有机相，过0.22μm的滤膜后可取10μl溶液用高效液相色谱检测计算其转化率＞95％，ee值>99％。

实施例9

按照实施例3的S1～S3步骤制备得到含有两种目标酶的粗酶溶液作为反应原料，进行如下反应。

在50mL玻璃反应瓶中，加入2g底物、2.6g葡萄糖、5mgNADP，再向反应瓶中加入10ml含两种目标酶的粗酶溶液开始反应；反应液温度为30℃，用NaOH控制反应液pH在6.8—7.2之间，搅拌均匀后反应6h。

上述反应完成后，将反应后的溶液调至碱性(pH>11)后用等体积乙酸乙酯萃取两次并合并有机相，过0.22μm的滤膜后可取10μl溶液用高效液相色谱检测计算其转化率＞88％，ee值>99％。

实施例10

按照实施例3的S1～S3步骤制备得到含有两种目标酶的粗酶溶液作为反应原料，进行如下反应。

在50mL玻璃反应瓶中，加入2g底物、2.6g葡萄糖、15mg NADP，再向反应瓶中加入10ml含两种目标酶的粗酶溶液开始反应；反应液温度为30℃，用NaOH控制反应液pH在6.8—7.2之间，搅拌均匀后反应4h。

上述反应完成后，将反应后的溶液调至碱性(pH>11)后用等体积乙酸乙酯萃取两次并合并有机相，过0.22μm的滤膜后可取10μl溶液用高效液相色谱检测计算其转化率＞99％，ee值>99％；随后用无水硫酸镁干燥有机相，旋转蒸发浓缩，降温重结晶后可得产物1.61g，纯度达99.6％。

实施例11

按照实施例3的S1～S3步骤制备得到含有两种目标酶的粗酶溶液，然后将粗酶溶液冻干变为粉末状冻干酶。

在500mL玻璃反应瓶中，加入40g底物、52g葡萄糖、200mg NADP和2g混合冻干酶，再向反应瓶中加入200ml 100mM PBS盐缓冲液开始反应；反应液温度为30℃，用NaOH控制反应液pH在6.8—7.2之间，搅拌均匀后反应8h。

上述反应完成后，将反应后的溶液调至碱性(pH>11)后用等体积乙酸乙酯萃取两次并合并有机相，过0.22μm的滤膜后可取10μl溶液用高效液相色谱检测计算其转化率＞90％，ee值>99％；随后用无水硫酸镁干燥有机相，旋转蒸发浓缩，降温重结晶后可得产物29.7g，纯度达99.3％。

实施例12

使用实施例11所得的粉末状冻干酶进行如下实验。

在500mL玻璃反应瓶中，加入40g底物、52g葡萄糖、200mg NADP和4g冻干酶，再向反应瓶中加入200ml 100mM磷酸盐缓冲液开始反应；反应液温度为30℃，用NaOH控制反应液pH在6.8—7.2之间，搅拌均匀后反应8h。

上述反应完成后，将反应后的溶液调至碱性(pH>11)后用等体积乙酸乙酯萃取两次并合并有机相，过0.22μm的滤膜后可取10μl溶液用高效液相色谱检测计算其转化率＞96％，ee值>99％；随后用无水硫酸镁干燥有机相，旋转蒸发浓缩，降温重结晶后可得产物32.1g，纯度达99.6％。

实施例13

使用实施例11所得的粉末状冻干酶进行如下实验。

在1L玻璃反应瓶中，加入80g底物、120g葡萄糖、400mg NADP和8g冻干酶，再向反应瓶中加入500ml 100mM PBS缓冲液开始反应；反应液温度为30℃，用NaOH控制反应液pH在6.8—7.2之间，搅拌均匀后反应8h。

上述反应完成后，将反应后的溶液调至碱性(pH>11)后用等体积乙酸乙酯萃取两次并合并有机相，过0.22μm的滤膜后可取10μl溶液用高效液相色谱检测计算其转化率＞98％，ee值>99％；随后用无水硫酸镁干燥有机相，旋转蒸发浓缩，降温重结晶后可得产物65.5g，纯度达99.3％。

实施例14

载体构建与克隆的操作步骤同实施例3相同，不同的是更改羰基脱氢酶的种类，分别改为SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6。

S2验证、S3酶的表达和提取、S4反应三个步骤也同实施例3相同，仅S4步骤反应所用的粗酶溶液所含的羰基脱氢酶对应为SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.6。最终所得反应结果如下：

羰基脱氢酶	转化率％	ee值％	产物g	纯度％
					SEQ ID NO.2	＞97％	>99	1.58	99.2％
SEQ ID NO.3	＞92％	>99	1.35	99.1％
					SEQ ID NO.4	＞95％	>99	1.52	99.1％
SEQ ID NO.5	＞93％	>99	1.43	99.5％
					SEQ ID NO.6	＞98％	>99	1.67	99.4％

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏海洋大学

<120> 一种羰基还原酶及合成(S)-3-(二甲氨基)-1-(2-噻吩基)-1-丙醇的方法

<130> 20211126

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 305

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 1

Met His His His His His His Gly Gly Ser Gly Met Asp Thr Leu Trp

1 5 10 15

Ser Tyr Val Ala Pro Ala Thr Thr Thr Ala Thr Ser Pro Val Ala Ala

20 25 30

Pro Pro Pro Ala Ala Pro Pro Pro Pro Pro Ser Ser Gly Asp Pro Leu

35 40 45

Phe Asp Trp Ala Val Ile Val Thr Gly Cys Ala Ser Gly Ile Gly Arg

50 55 60

Ala Val Ala Leu Leu Leu Ala Glu Lys Gly Ala Arg Leu Ala Leu Thr

65 70 75 80

Asp Lys Asp Ala Asp Glu Gly Arg Arg Leu Cys Gly Glu Ile Lys Glu

85 90 95

Arg Tyr Pro Ala Val Asp Leu Ala Tyr Ala Thr Leu Asp Val Thr Asp

100 105 110

Glu Glu Ala Val Gly Arg Leu Val Arg Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys

115 120 125

Arg Leu Asp Gly Leu Val Asn Cys Ala Gly Val Asn Leu Leu Ser Pro

130 135 140

Gly Val His Gln Val Lys Val Asp Leu Trp Ser Gln Thr Met Asp Val

145 150 155 160

Asn Ala Arg Gly Thr Tyr Ala Phe Cys Lys His Phe Ala Ala Met Val

165 170 175

Ile Ala Asp Glu Glu Val Ala Asp Pro Pro Lys Gly Gly Tyr Ala Val

180 185 190

Val Asn Ile Gly Ser Asn Ala Ser Val Met Gly Leu Pro Asn Ser Ser

195 200 205

Ala Tyr Cys Ala Ser Lys His Ala Val Leu Gly Met Ser Arg Ala Met

210 215 220

Ala Lys Glu Tyr Ala Gln Arg Asp Ile Arg Val Asn Val Val Ala Pro

225 230 235 240

Gly Pro Ile Asp Thr Pro Leu Leu His Asn Leu Phe Asp Ala Ser Asn

245 250 255

Met Ser Leu Asp Asp Ala Leu Glu Gln Val Pro Met His Arg Val Gly

260 265 270

Gln Pro Glu Glu Val Ala Lys Ala Val Ala Phe Leu Leu Ser Ser Asp

275 280 285

Ser Ser Tyr Ile Thr Gly Ala Cys Leu Pro Val Asp Gly Gly Trp Thr

290 295 300

Ala

305

<210> 2

<211> 257

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 2

Met His His His His His His Gly Gly Ser Gly Met Ala Gly Arg Val

1 5 10 15

Ala Leu Ile Thr Gly Ala Gly Arg Gly Ile Gly Leu Ser Ala Ala Lys

20 25 30

Leu Phe Leu Glu Asn Gly Tyr Arg Val Phe Leu Ser Asp Val Ser Leu

35 40 45

Gln Gln Ala Arg Lys Glu Leu Ser Gly Thr Asp Gly Ala Arg Ile Gly

50 55 60

Phe Leu Glu Thr Asp Val Thr Lys Glu Asp Gln Val Lys Ala Met Ser

65 70 75 80

Gln Ala Ala Leu Lys Gln Phe Gly Gln Val Asp Ala Ala Ile Val Asn

85 90 95

Ala Gly Ile Asn Ser Pro Ile Val Pro Trp Leu Glu Ser Thr Pro Glu

100 105 110

Asp Leu Asp Arg Met Leu Asp Ile Asn Val Lys Gly Ala Trp Leu Thr

115 120 125

Cys Lys His Ala Ala Gln Ala Met Leu Asp Ser Pro His Lys Gly Lys

130 135 140

Gly Gly Ser Ile Val Phe Val Ala Ser Val Ala Ser Leu Tyr Gly Gln

145 150 155 160

Pro Gly Met Ser Gly Phe Cys Ala Ser Lys Trp Ala Val Arg Gly Leu

165 170 175

Ser Leu Thr Ala Ala Ala Glu Phe Ala Pro His Gly Ile Arg Ser Asn

180 185 190

Cys Ile Gln Pro Gly Ala Thr Asp Thr Ala Met Phe Ala Ala Phe Pro

195 200 205

Pro Asp Leu Gln Ser Ala Val Thr Val Pro Leu Lys Arg Ala Ala Gln

210 215 220

Pro Thr Glu Ile Ala Glu Val Met Leu Phe Leu Ala Gly Glu Lys Ser

225 230 235 240

Ser Phe Met Asn Gly Ser Thr Val Ala Val His Gly Gly Gln Thr Pro

245 250 255

Thr

<210> 3

<211> 258

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 3

Met His His His His His His Gly Gly Ser Gly Met Ser Thr Ser Val

1 5 10 15

Ser Gln Thr Val Tyr Leu Val Thr Gly Thr Ala Arg Gly Ile Gly Phe

20 25 30

Gly Leu Val Ser Ser Leu Val Lys Arg Pro Asp Ala Val Val Phe Ala

35 40 45

Gly Val Arg Asp Val Asn Lys Ala Asp Ala Leu Ser Ala Leu Ala Lys

50 55 60

Glu Ala Pro Asn Leu His Ile Val Gln Leu Glu Ser Gly Ser Val Glu

65 70 75 80

Asp Ala Lys Ala Val Ala Ala Ile Ile Glu Gln Thr Ala Gly Lys Leu

85 90 95

Asp Ile Val Leu Ala Asn Ala Gly Ile Ser Asp Gly Tyr Gly Asp Val

100 105 110

Val Asp Val Pro Pro Ala Val Phe Glu Arg His Phe Gln Val Asn Thr

115 120 125

Met Gly Pro Leu Val Leu Phe Gln Ala Val Ala Ser Leu Leu Ala Lys

130 135 140

Ser Ser His Pro Gln Phe Ala Ala Ile Ser Thr Ala Pro Ala Ser Leu

145 150 155 160

Thr Asn Leu Met Tyr Met Arg Met Thr Ala Tyr Thr Leu Ser Lys Ala

165 170 175

Ala Leu Asn Phe Leu Thr Leu Arg Ile Asn Glu Glu His Glu Lys Asp

180 185 190

His Ile Ala Ser Tyr Ala Ile Ser Pro Gly Trp Ala Gln Thr Asp Met

195 200 205

Gly Asn Ala Gly Ala Arg Ala Phe Gly Leu Glu Glu Ala Pro Val Lys

210 215 220

Leu Glu Asp Ser Val Ala Gly Ile Leu Lys Ile Val Asp Gly Ala Thr

225 230 235 240

Arg Glu Lys Thr Gly Gly Lys Phe Trp Asp Tyr Thr Gly Asp Glu Leu

245 250 255

Ser Trp

<210> 4

<211> 257

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 4

Met His His His His His His Gly Gly Ser Gly Met Ser Ser Ala Ala

1 5 10 15

Pro Thr Thr Tyr Leu Val Thr Gly Ala Asn Gln Gly Leu Gly Leu Gly

20 25 30

Phe Val Thr Ala Leu Ser Lys Arg Pro Asn Thr Leu Ile Phe Ala Thr

35 40 45

Ala Arg Asn Pro Asp Lys Ala Asp Asp Leu Asn Ala Leu Ala Ala Glu

50 55 60

Ala Lys Asn Ile Glu Val Val Lys Phe Glu Ala Thr Ser Glu Asn Glu

65 70 75 80

Ala Val Ala Leu Ala Lys Ile Val Glu Glu Lys Ala Gly Lys Leu Asp

85 90 95

Tyr Val Leu Ala Asn Ala Gly Ile Ala Glu Ala Asn Lys Ala Val Met

100 105 110

Asp Val Thr His Thr Asp Phe Val Arg His Ile Glu Thr Asn Ala Trp

115 120 125

Gly Pro Ile Leu Leu Phe Gln His Val Gln Pro Leu Leu Ala Lys Ser

130 135 140

Ala Ser Pro His Phe Val Gly Leu Thr Ser Ile Leu Gly Ser Leu Gly

145 150 155 160

Thr Val Ser Ser Tyr Pro Ala Arg Ser Thr Ala Tyr Gly Ala Ser Lys

165 170 175

Ala Ala Leu Ser Tyr Ala Val Leu Lys Met Gly Gln Glu His Pro Asn

180 185 190

Leu Asp Ala Trp Val Val His Pro Gly Leu Val Gln Thr Arg Met Gly

195 200 205

Asn Arg Ala Ala Ser Gly Leu Gly Phe Glu Lys Ala Pro Val Thr Val

210 215 220

Glu Asp Ser Val Ala Gly Ile Leu Arg Ile Leu Asp Gln Ala Lys Arg

225 230 235 240

Glu Thr His Gly Gly Arg Phe Phe Glu Phe Thr Gly Lys Glu Leu Pro

245 250 255

Trp

<210> 5

<211> 266

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 5

Met His His His His His His Gly Gly Ser Gly Met Ala Thr Ala Asn

1 5 10 15

Ser Leu Glu Gly Lys Val Ala Ile Val Thr Gly Gly Ala Ser Gly Ile

20 25 30

Gly Phe Ala Thr Val Lys Thr Phe Leu Ala Ala Gly Ala Leu Gly Val

35 40 45

Thr Ile Val Asp Leu Thr Ser Asp Ser Leu Ser Arg Ala Val Ser Leu

50 55 60

Leu Pro Ser Ser Ser His Ser Arg Ile Leu Thr Tyr Ala Gly Asp Val

65 70 75 80

Ser Ser Pro Ser Thr Ala Ser Glu Tyr Val Ser Lys Thr Val Asp Gln

85 90 95

Trp Gly Arg Asn Asp Val Ser Val Gln Cys Ala Gly Ile Ser Leu Pro

100 105 110

Ser Lys Asn Val Val Asp Met Asp Val Glu Glu Phe Asp Lys Thr Ile

115 120 125

Ser Val Asn Leu Arg Gly Val Phe Leu Gly Leu Gln Gln Ser Leu Lys

130 135 140

Ala Met Leu Ala Ser Pro Ser Gly Gly Lys Gly Cys Ser Val Val Leu

145 150 155 160

Val Ser Ser Gln Tyr Ala Phe Asp Gly Tyr Pro Gly Ser Ala Pro Tyr

165 170 175

Ser Ala Ser Lys Ala Ala Leu Arg Gly Leu Met Thr Ser Val Ala Gln

180 185 190

Glu Val Gly Pro Gln Gly Ile Arg Val Asn Ala Val Ala Pro Gly Pro

195 200 205

Ile Asp Thr Pro Met Leu Ala Gly Phe Pro Ser Glu Gly His Thr Thr

210 215 220

Lys Gly Asn Ile Lys Arg Ala Gly Gln Pro Glu Glu Val Ala Asn Ala

225 230 235 240

Ile Leu Tyr Leu Ser Ser Glu Met Gly Ser Tyr Cys Ser Gly Thr Thr

245 250 255

Leu Lys Cys Asp Gly Gly Trp Ser Lys Trp

260 265

<210> 6

<211> 263

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 6

Met His His His His His His Gly Gly Ser Gly Met Ser Ser Pro Thr

1 5 10 15

Pro Asn Val Tyr Val Ile Ser Gly Ala Ser Arg Gly Ile Gly Phe Ala

20 25 30

Ile Thr Ser Ile Leu Ala Gln Arg Asp Asn Val Leu Ile Phe Ala Gly

35 40 45

Ala Arg Asp Leu Lys Ser Thr Gln Leu Asn Glu Leu Ala Leu Lys Ser

50 55 60

Gly Gly Lys Val Val Pro Val Lys Leu Glu Ser Thr Ser Val Glu Asp

65 70 75 80

Ala Ala Ala Leu Ala Lys Val Val Asn Glu Lys Ala Gly Lys Val Asp

85 90 95

Tyr Val Leu Ala Val Ala Gly Ile Ser Gln Ser Thr Asp Pro Ile Ala

100 105 110

Gln Val Pro Leu Asp Asp Val Arg Arg His Phe Glu Val Asn Thr Ile

115 120 125

Gly Pro Leu Val Leu Phe Gln Ser Leu Leu Ala Leu Leu Thr Lys Ser

130 135 140

Ser Ala Pro His Tyr Ile Val Val Ser Thr Ile Ala Gly Ser Ile Ala

145 150 155 160

Ser Met Pro Gln Phe Leu Phe Pro Val Ser Ser Tyr Ala Ile Ser Lys

165 170 175

Thr Ala Val Asn Ser Ala Val Val Arg Ile Ala Val Glu His Pro Asp

180 185 190

Leu Asp Ala Phe Val Cys His Pro Gly Val Val Ser Ser Asp Met Ile

195 200 205

Lys Glu Tyr Val Ala Lys Thr Gly Thr Ala Leu Ser Asp Phe Glu Ser

210 215 220

Met Gly Met Ile Thr Pro Glu Glu Ser Ala Ala Ser Leu Val Lys Leu

225 230 235 240

Phe Asp Gly Ala Lys Lys Glu Thr His Ser Gly Lys Phe Phe Asn Val

245 250 255

Asp Gly Thr Phe Leu Pro Trp

260

<210> 7

<211> 918

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 7

atgcatcatc atcatcatca tggcggcagc ggcatggata ccctgtggag ctatgtggcg 60

ccggcgacca ccaccgcgac cagcccggtg gcggcgccgc cgccggcggc gccgccgccg 120

ccgccgagca gcggcgatcc gctgtttgat tgggcggtga ttgtgaccgg ctgcgcgagc 180

ggcattggcc gcgcggtggc gctgctgctg gcggaaaaag gcgcgcgcct ggcgctgacc 240

gataaagatg cggatgaagg ccgccgcctg tgcggcgaaa ttaaagaacg ctatccggcg 300

gtggatctgg cgtatgcgac cctggatgtg accgatgaag aagcggtggg ccgcctggtg 360

cgcagcttta aaaaaagctt taaacgcctg gatggcctgg tgaactgcgc gggcgtgaac 420

ctgctgagcc cgggcgtgca tcaggtgaaa gtggatctgt ggagccagac catggatgtg 480

aacgcgcgcg gcacctatgc gttttgcaaa cattttgcgg cgatggtgat tgcggatgaa 540

gaagtggcgg atccgccgaa aggcggctat gcggtggtga acattggcag caacgcgagc 600

gtgatgggcc tgccgaacag cagcgcgtat tgcgcgagca aacatgcggt gctgggcatg 660

agccgcgcga tggcgaaaga atatgcgcag cgcgatattc gcgtgaacgt ggtggcgccg 720

ggcccgattg ataccccgct gctgcataac ctgtttgatg cgagcaacat gagcctggat 780

gatgcgctgg aacaggtgcc gatgcatcgc gtgggccagc cggaagaagt ggcgaaagcg 840

gtggcgtttc tgctgagcag cgatagcagc tatattaccg gcgcgtgcct gccggtggat 900

ggcggctgga ccgcgtaa 918

<210> 8

<211> 777

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 8

atgcatcatc atcatcatca tggcggcagc ggcatgagca ccagcgtgag ccagaccgtg 60

tatctggtga ccggcaccgc gcgcggcatt ggctttggcc tggtgagcag cctggtgaaa 120

cgcccggatg cggtggtgtt tgcgggcgtg cgcgatgtga acaaagcgga tgcgctgagc 180

gcgctggcga aagaagcgcc gaacctgcat attgtgcagc tggaaagcgg cagcgtggaa 240

gatgcgaaag cggtggcggc gattattgaa cagaccgcgg gcaaactgga tattgtgctg 300

gcgaacgcgg gcattagcga tggctatggc gatgtggtgg atgtgccgcc ggcggtgttt 360

gaacgccatt ttcaggtgaa caccatgggc ccgctggtgc tgtttcaggc ggtggcgagc 420

ctgctggcga aaagcagcca tccgcagttt gcggcgatta gcaccgcgcc ggcgagcctg 480

accaacctga tgtatatgcg catgaccgcg tataccctga gcaaagcggc gctgaacttt 540

ctgaccctgc gcattaacga agaacatgaa aaagatcata ttgcgagcta tgcgattagc 600

ccgggctggg cgcagaccga tatgggcaac gcgggcgcgc gcgcgtttgg cctggaagaa 660

gcgccggtga aactggaaga tagcgtggcg ggcattctga aaattgtgga tggcgcgacc 720

cgcgaaaaaa ccggcggcaa attttgggat tataccggcg atgaactgag ctggtaa 777

<210> 9

<211> 774

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 9

atgcatcatc atcatcatca tggcggcagc ggcatggcgg gccgcgtggc gctgattacc 60

ggcgcgggcc gcggcattgg cctgagcgcg gcgaaactgt ttctggaaaa cggctatcgc 120

gtgtttctga gcgatgtgag cctgcagcag gcgcgcaaag aactgagcgg caccgatggc 180

gcgcgcattg gctttctgga aaccgatgtg accaaagaag atcaggtgaa agcgatgagc 240

caggcggcgc tgaaacagtt tggccaggtg gatgcggcga ttgtgaacgc gggcattaac 300

agcccgattg tgccgtggct ggaaagcacc ccggaagatc tggatcgcat gctggatatt 360

aacgtgaaag gcgcgtggct gacctgcaaa catgcggcgc aggcgatgct ggatagcccg 420

cataaaggca aaggcggcag cattgtgttt gtggcgagcg tggcgagcct gtatggccag 480

ccgggcatga gcggcttttg cgcgagcaaa tgggcggtgc gcggcctgag cctgaccgcg 540

gcggcggaat ttgcgccgca tggcattcgc agcaactgca ttcagccggg cgcgaccgat 600

accgcgatgt ttgcggcgtt tccgccggat ctgcagagcg cggtgaccgt gccgctgaaa 660

cgcgcggcgc agccgaccga aattgcggaa gtgatgctgt ttctggcggg cgaaaaaagc 720

agctttatga acggcagcac cgtggcggtg catggcggcc agaccccgac ctaa 774

<210> 10

<211> 774

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 10

atgcatcatc atcatcatca tggcggcagc ggcatgagca gcgcggcgcc gaccacctat 60

ctggtgaccg gcgcgaacca gggcctgggc ctgggctttg tgaccgcgct gagcaaacgc 120

ccgaacaccc tgatttttgc gaccgcgcgc aacccggata aagcggatga tctgaacgcg 180

ctggcggcgg aagcgaaaaa cattgaagtg gtgaaatttg aagcgaccag cgaaaacgaa 240

gcggtggcgc tggcgaaaat tgtggaagaa aaagcgggca aactggatta tgtgctggcg 300

aacgcgggca ttgcggaagc gaacaaagcg gtgatggatg tgacccatac cgattttgtg 360

cgccatattg aaaccaacgc gtggggcccg attctgctgt ttcagcatgt gcagccgctg 420

ctggcgaaaa gcgcgagccc gcattttgtg ggcctgacca gcattctggg cagcctgggc 480

accgtgagca gctatccggc gcgcagcacc gcgtatggcg cgagcaaagc ggcgctgagc 540

tatgcggtgc tgaaaatggg ccaggaacat ccgaacctgg atgcgtgggt ggtgcatccg 600

ggcctggtgc agacccgcat gggcaaccgc gcggcgagcg gcctgggctt tgaaaaagcg 660

ccggtgaccg tggaagatag cgtggcgggc attctgcgca ttctggatca ggcgaaacgc 720

gaaacccatg gcggccgctt ttttgaattt accggcaaag aactgccgtg gtaa 774

<210> 11

<211> 792

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 11

atgcatcatc atcatcatca tggcggcagc ggcatgagca gcccgacccc gaacgtgtat 60

gtgattagcg gcgcgagccg cggcattggc tttgcgatta ccagcattct ggcgcagcgc 120

gataacgtgc tgatttttgc gggcgcgcgc gatctgaaaa gcacccagct gaacgaactg 180

gcgctgaaaa gcggcggcaa agtggtgccg gtgaaactgg aaagcaccag cgtggaagat 240

gcggcggcgc tggcgaaagt ggtgaacgaa aaagcgggca aagtggatta tgtgctggcg 300

gtggcgggca ttagccagag caccgatccg attgcgcagg tgccgctgga tgatgtgcgc 360

cgccattttg aagtgaacac cattggcccg ctggtgctgt ttcagagcct gctggcgctg 420

ctgaccaaaa gcagcgcgcc gcattatatt gtggtgagca ccattgcggg cagcattgcg 480

agcatgccgc agtttctgtt tccggtgagc agctatgcga ttagcaaaac cgcggtgaac 540

agcgcggtgg tgcgcattgc ggtggaacat ccggatctgg atgcgtttgt gtgccatccg 600

ggcgtggtga gcagcgatat gattaaagaa tatgtggcga aaaccggcac cgcgctgagc 660

gattttgaaa gcatgggcat gattaccccg gaagaaagcg cggcgagcct ggtgaaactg 720

tttgatggcg cgaaaaaaga aacccatagc ggcaaatttt ttaacgtgga tggcaccttt 780

ctgccgtggt aa 792

<210> 12

<211> 801

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 12

atgcatcatc atcatcatca tggcggcagc ggcatggcga ccgcgaacag cctggaaggc 60

aaagtggcga ttgtgaccgg cggcgcgagc ggcattggct ttgcgaccgt gaaaaccttt 120

ctggcggcgg gcgcgctggg cgtgaccatt gtggatctga ccagcgatag cctgagccgc 180

gcggtgagcc tgctgccgag cagcagccat agccgcattc tgacctatgc gggcgatgtg 240

agcagcccga gcaccgcgag cgaatatgtg agcaaaaccg tggatcagtg gggccgcaac 300

gatgtgagcg tgcagtgcgc gggcattagc ctgccgagca aaaacgtggt ggatatggat 360

gtggaagaat ttgataaaac cattagcgtg aacctgcgcg gcgtgtttct gggcctgcag 420

cagagcctga aagcgatgct ggcgagcccg agcggcggca aaggctgcag cgtggtgctg 480

gtgagcagcc agtatgcgtt tgatggctat ccgggcagcg cgccgtatag cgcgagcaaa 540

gcggcgctgc gcggcctgat gaccagcgtg gcgcaggaag tgggcccgca gggcattcgc 600

gtgaacgcgg tggcgccggg cccgattgat accccgatgc tggcgggctt tccgagcgaa 660

ggccatacca ccaaaggcaa cattaaacgc gcgggccagc cggaagaagt ggcgaacgcg 720

attctgtatc tgagcagcga aatgggcagc tattgcagcg gcaccaccct gaaatgcgat 780

ggcggctgga gcaaatggta a 801

Claims (2)

1.一种羰基还原酶，其特征在于，所述羰基还原酶的氨基酸序列选自SEQ ID NO.6。

2.根据权利要求1所述的羰基还原酶，其特征在于，所述羰基还原酶的SEQ ID NO.6的氨基酸序列所对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。