CN117363667B - 亚胺还原酶在制备达泊西汀中间体和/或达泊西汀中的用途 - Google Patents
亚胺还原酶在制备达泊西汀中间体和/或达泊西汀中的用途 Download PDFInfo
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Abstract
本申请涉及一种亚胺还原酶及其在制备达泊西汀中间体和/或达泊西汀中的用途，其中，亚胺还原酶包括SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。本申请采用亚胺还原酶作为催化剂具有催化活性高、化学选择性好和对映体选择性好的优点，可以通过一步反应催化生成手性达泊西汀中间体。
Description
技术领域
本申请涉及基因工程技术领域，具体而言，涉及亚胺还原酶在制备达泊西汀中间体和/或达泊西汀中的用途。
背景技术
达泊西汀(Dapoxetine，商品名为：Priligy)，化学名为：(+)-(S)-N,N-二甲基-α-[2-（1-萘氧基）乙基]-苯甲胺；成品通常为盐酸盐，属于一种快速起效和代谢的选择性5-羟色胺再吸收抑制剂(SSRI)，结构式如下所示：
。
达泊西汀是一款治疗男性早泄的药物，于2004年被提交给美国FDA进行批准，也是唯一一款被CFDA批准用于治疗早泄的药物。盐酸达泊西汀具有起效快，易吸收，半衰期短等优点，首次服用该药物即可起效，能够在体内迅速消除且副作用发生率低。
达泊西汀的合成方法目前主要以化学合成为主，一些化学合成方法以肉桂酸乙酯为起始原料，制备盐酸达泊西汀，在该合成路线中使用到了易燃易爆的氢氧化铝作为还原试剂，并且产物需要使用L-(+)-酒石酸进行手性拆分，最终的收率较低。另一些化学合成方法采用较为简单的化学合成路线，但合成路线依旧较长，且反应过程需要多步反应，工作量大，反应中用到大量有机试剂，不符合绿色化学的理念。
达泊西汀中间体的生物合成方法中，一些反应路线具体如下：
；
该反应路线以3-氯-1-苯丙基-1-酮和1-萘酚为起始原料，通过相转移催化得到3-（萘-1-基氧基）-1-苯丙基-1-酮，再经过转氨酶的作用得到具有手性氨的达珀西 收率也大大提高，说明生物酶的催化作用在药物合成上面有着非常大的应用空间。但该反应的结合了化学反应和生物催化，第一步反应残留的化学试剂会对第二步的酶产生抑制作用，所以需要对第一步的产物进行纯化，增加了工作难度，且两步反应时间较长，不太适合用于工业生产。
一些反应路线进行了优化，降低了化学试剂对酶的影响，具体如下：
；
该反应路线以3-氯-1-苯丙基-1-酮为起始化合物，利用转氨酶得到(S)-3-氯-1-苯丙基-1-胺再利用化学合成的方法得到3-（萘-1-基氧基）-1-苯丙基-1-胺，该路线也是结合了生物催化与化学合成，但是第一步反应得到的产物需要纯化后再进行第二步，化学合成也利用了相转移催化的方法，两步反应的时间较长，操作较为复杂，工业化生产时成本高。
因此，如何提供一条绿色环保且操作简单的合成路线是工业化生产达泊西汀的难点。
发明内容
为了提供一种绿色环保且操作简单的达泊西汀中间体合成路线，本申请的第一目的在于提供一种亚胺还原酶，包括SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
本申请采用亚胺还原酶作为催化剂具有催化活性高、化学选择性好和对映体选择性好的优点，可以通过一步反应催化生成手性达泊西汀中间体。
本申请的第二目的在于提供一种分离的核酸，编码上述亚胺还原酶；
可选地，核酸包括SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
本申请的第三目的在于提供一种重组表达载体，满足以下特征（1）~（2）中的至少一个：
（1）用于表达上述亚胺还原酶；
（2）含有编码上述亚胺还原酶的核酸。
本申请的第四目的在于提供一种宿主细胞，满足以下特征（1）~（3）中的至少一个：
（1）用于表达上述亚胺还原酶；
（2）含有编码上述亚胺还原酶的核酸；
（3）含有上述重组表达载体。
本申请的第五目的在于提供一种上述亚胺还原酶的制备方法，亚胺还原酶的制备步骤包括：
将亚胺还原酶基因和目标表达载体连接构建重组表达载体；
将重组表达载体转化至目标菌株后，诱导培养目标菌株以获得亚胺还原酶；
可选地，亚胺还原酶基因包括SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；
可选地，目标表达载体包括pET28a(+)；
可选地，目标菌株包括大肠杆菌菌株。
本申请的第六目的在于提供亚胺还原酶作为催化剂在制备达泊西汀中间体和/或达泊西汀中的用途，亚胺还原酶包括SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
在其中一个实施例中，亚胺还原酶催化苯丙酮取代物和胺化试剂通过一步反应生成达泊西汀中间体。
在其中一个实施例中，亚胺还原酶催化的反应体系满足以下特征（1）~（2）中的至少一个：
（1）达泊西汀中间体包括如下所示结构的化合物：
；
（1）反应体系包括苯丙酮取代物和二级胺；
（1）反应体系包括辅酶循环试剂，辅酶循环试剂包括葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和辅酶；
（2）反应体系包括缓冲试剂，可选地，缓冲试剂包括Tris-HCl缓冲试剂和/或磷酸盐缓冲试剂；
可选地，葡萄糖脱氢酶包括SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；
可选地，辅酶包括NADP盐和/或NAD盐；
可选地，苯丙酮取代物包括3-氯苯丙酮；
可选地，二级胺包括二甲胺；
可选地，3-氯苯丙酮、二甲胺、辅酶和亚胺还原酶的质量比为（0.1~1）:（0.1~1）:（0.005~0.01）:（0.05~0.1）；
可选地，辅酶、葡萄糖、葡萄糖脱氢酶的质量比为（0.001~0.002）：（0.7~1.5）：（0.01~0.05）。
在其中一个实施例中，对反应体系生成的达泊西汀中间体进行分离纯化。
在其中一个实施例中，达泊西汀采用达泊西汀中间体制备而成。
附图说明
为了更清楚地说明本申请具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本申请的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本申请实施例4提供的亚胺还原酶粗酶液及其冻干酶粉的SDS-PAGE检测结果；
图2为本申请实施例5提供的生物催化反应示意图；
图3为本申请实施例5提供的反应物转化HPLC图谱；
图4为本申请实施例5提供的产物SFC检测图谱。
具体实施方式
现将详细地提供本申请实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本申请。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本申请进行多种修改和变化而不背离本申请的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
因此，旨在本申请覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本申请的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述，而非意在限制本申请更广阔的方面。
为了至少部分解决上述技术问题的至少一个，本申请的第一方面提供了一种亚胺还原酶，包括SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
本申请中，术语“亚胺还原酶(Imine reductases)”是一类可以还原手性亚胺为对应的手性胺的氧化还原酶。
本申请采用亚胺还原酶作为催化剂具有催化活性高、化学选择性好和对映体选择性好的优点，可以通过一步反应催化生成手性达泊西汀中间体。
本申请的第二方面提供了一种分离的核酸，编码上述亚胺还原酶；
可选地，核酸包括SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
本申请的第三方面提供了一种重组表达载体，用于表达上述亚胺还原酶。
本申请中，术语“表达载体”是指线状或环状DNA分子，该分子包含编码多肽的多核苷酸并且该多核苷酸有效地连接于供其用于表达的控制序列。
重组表达载体可以任何合适的方式构建。重组表达载体可包括，例如包含i)对基因表达具有调控作用的遗传元素的集合，例如启动子和增强子；ii)转录成mRNA并翻译成蛋白质的结构或编码序列；以及iii)适当的转录和翻译起始和终止序列的转录亚单位。载体的性质并不重要，并可以使用任何载体，包括质粒、病毒、噬菌体和转座子。用于本申请的可能载体包括但不限于染色体、非染色体和合成DNA序列，例如细菌质粒、噬菌体DNA、酵母质粒以及从质粒和噬菌体DNA的组合中衍生的载体，来自如牛痘、腺病毒、鸡痘、杆状病毒、SV40和伪狂犬病等病毒的DNA。
一些实施方案中，上述重组表达载体含有编码上述亚胺还原酶的核酸。
一些具体实施方案中，重组表达载体含有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，以用于表达上述亚胺还原酶。
一些具体实施方案中，重组表达载体为质粒，具体地，可以为pET28a(+)，其整合有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，用于表达上述亚胺还原酶。
本申请的第四方面提供了一种宿主细胞，上述宿主细胞用于表达上述亚胺还原酶。
本申请中，术语“宿主细胞”意指易于用包含本申请的突变体多肽、编码突变体多肽的多核苷酸或重组表达载体转化、转染、转导等的任何细胞类型。宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞，只要是能够导入本申请的具有编码酰胺合成酶活性的多肽、重组多肽的多核苷酸的细胞即可。
一些实施方案中，上述宿主细胞含有编码上述亚胺还原酶的核酸。
一些实施方案中，上述宿主细胞含有上述重组表达载体。
一些具体实施方案中，宿主细胞包括大肠杆菌菌株。
本申请的第五方面提供了一种上述亚胺还原酶的制备方法，亚胺还原酶的制备步骤包括：
将亚胺还原酶基因和蛋白表达载体连接构建重组表达载体；
将重组表达载体转化至目标菌株后，诱导培养目标菌株以获得亚胺还原酶。
一些具体实施方案中，亚胺还原酶基因包括SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
一些具体实施方案中，蛋白表达载体包括pET28a(+)。
一些具体实施方案中，目标菌株包括大肠杆菌菌株。
本申请的第六方面提供了亚胺还原酶作为催化剂在制备达泊西汀中间体和/或达泊西汀中的用途，亚胺还原酶包括SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
本申请采用亚胺还原酶作为催化剂制备达泊西汀中间体，可以催化苯丙酮取代物和胺化试剂一步反应得到达泊西汀手性中间体(S)-3-氯-N,N-二甲基-1-苯丙基-1-胺，该路线简单易行，反应时间短，具有低生产成本、低污染、产品收率高、产品纯度高，原料价廉易得以及适合于工业化生产等优点。
此外，本申请采用亚胺还原酶作为催化剂制备达泊西汀中间体，副产物少，转化率可以达到93.43%，成本低，化学选择性好同时具有极好的对映体选择性，ee值达到99.82%，且绿色环保，无毒无害。
一些实施方案中，达泊西汀中间体(S)-3-氯-N,N-二甲基-1-苯丙基-1-胺结构如下所示结构：
。
一些具体实施方案中，采用亚胺还原酶催化苯丙酮取代物和胺化试剂，通过一步反应生成上述达泊西汀中间体。
一些具体实施方案中，苯丙酮取代物包括3-氯苯丙酮。
一些具体实施方案中，胺化试剂包括二级胺，可选地，二级胺包括二甲胺。
一些实施方案中，为了促进亚胺还原酶的催化反应，反应体系还包括辅酶循环试剂，辅酶循环试剂包括葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和辅酶。
葡萄糖脱氢酶（Glucose dehydrogenase, GCDH）是一种NAD(P)+依赖型的氧化还原酶，催化D-葡萄糖和NAD(P)生成D-葡萄糖酸和NAD(P)H，主要存在于多种微生物和高等动物的肝脏中。
一些具体实施方案中，葡萄糖脱氢酶包括SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。
一些实施方案中，葡萄糖脱氢酶采用基因工程方法制备得到。基因工程（geneticengineering）又称基因拼接技术和DNA重组技术。所谓基因工程是在分子水平上对基因进行操作的复杂技术，是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。
一些具体实施方案中，葡萄糖脱氢酶的制备步骤包括：
将葡萄糖脱氢酶基因和蛋白表达载体连接构建重组葡萄糖脱氢酶表达载体；
将重组葡萄糖脱氢酶表达载体转化至目标菌株后，诱导培养目标菌株以获得葡萄糖脱氢酶。
一些具体实施方案中，葡萄糖脱氢酶基因包括SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。
一些具体实施方案中，蛋白表达载体包括pET28a(+)。
一些具体实施方案中，目标菌株包括大肠杆菌菌株。
一些实施方案中，辅酶包括NADP盐和/或NAD盐，具体地，辅酶可以是NADP盐。
一些实施方案中，3-氯苯丙酮、二甲胺、辅酶和亚胺还原酶的质量比为（0.1~1）:（0.1~1）:（0.005~0.01）:（0.05~0.1）。具体地，可以为1:1:0.01:0.1。
一些实施方案中，辅酶、葡萄糖、葡萄糖脱氢酶的质量比为（0.001~0.002）：（0.7~1.5）：（0.01~0.05）。具体地，可以为0.002：1.5：0.05。
一些实施方案中，为了达到更好的发挥亚胺还原酶的催化活性，催化反应在水相介质中进行。
一些实施方案中，亚胺还原酶催化反应的反应体系还包括缓冲试剂，用于为亚胺还原酶的催化反应提供稳定的pH环境。
一些具体实施方案中，缓冲试剂包括Tris-HCl缓冲试剂和/或磷酸盐缓冲试剂。
一些具体实施方案中，缓冲试剂用于维持催化反应的pH为7.5~9.0，进一步可以为7.5~8.5，更进一步可以为8.0~8.5。
一些实施方案中，催化反应的温度为20℃~35℃，进一步可以为20℃~30℃，更进一步可以为25℃~30℃。
一些实施方案中，催化反应在搅拌下进行，可选地，搅拌的转速为200~500 r/min，进一步可以为200~400 r/min，更进一步可以为200~300 r/min，。
一些实施方案中，催化反应的反应时间为8h~72h，进一步可以为8h~40h，更进一步可以为16h~24h。
一些实施方案中，对反应体系中生成的达泊西汀中间体进行分离纯化。
一些具体实施方案中，分离纯化的步骤包括：
采用第一试剂对反应体系进行萃取，得到含有达泊西汀中间体的萃取物；
除去萃取物中的水和第一试剂，得到达泊西汀中间体粗产物；
对达泊西汀中间体粗产物进行重结晶，得到分离纯化的达泊西汀中间体。
一些具体实施方案中，第一试剂包括乙酸乙酯。
一些具体实施方案中，采用第二试剂对达泊西汀中间体粗产物进行重结晶，具体地，第二试剂包括无水异丙醇。
一些具体实施方案中，采用第三试剂除去萃取物中的水，具体地，第三试剂包括无水硫酸钠。
一些具体实施方案中，采用减压蒸馏的方式除去萃取物中的第一试剂。
一些实施方案中，达泊西汀采用上述达泊西汀中间体制备而成。具体地，可采用本领域常规的化学合成方法，将(S)-3-氯-1-苯丙基-1-胺和萘酚反应得到3-（萘-1-基氧基）-1-苯丙基-1-胺，反应原理如下所示：
。
下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述。
实施例1 亚胺还原酶的筛选
从NCBI数据库中选取序列一致性有差异的20个序列进行编码基因合成，20个序列的NCBI的序列号如表1所示，基因合成委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行，合成后的编码基因连接到pET28a(+)上，获得重组表达载体pET28a(+)。所得质粒转化至E. coliBL21(DE3)感受态细胞，得到含有重组质粒pET28a(+)-IRED的20个重组表达菌株，添加甘油后保存于-80℃备用。
从-80℃保存的甘油菌(共20个重组菌)取10 μL菌液至一级96孔板(含200 μL LB培养基)中，放入37℃，400 rpm的摇床中培养12 h左右，然后转接40 μL种子液至二级板(含有360 μL LB培养基)于37℃，450 rpm培养3~4 h后，加入诱导剂IPTG (终浓度为1 mM)，放于20℃，400 rpm的摇床中进行目的蛋白的诱导表达。
诱导20~24 h后离心收集菌体。使用2 mg/mL的溶菌酶重悬菌体，并置于30℃，800rpm摇床中破碎3 h。破碎结束后，使用4℃，4000 rpm的水平离心机离心30 min，取上清液进行反应。反应体系如下：300 μL的反应体系(Tris-HCl buffer，50 mM，pH8.5)，包含5mg 3-氯苯丙酮与5 mg 二甲胺，0.05 mg NADH，0.5 mg 葡萄糖，250 μL酶裂解液，35℃，1000 rpm反应18 h。通过与3-氯苯丙酮标准品进行对比确定反应物和产物出峰位置，并计算转化率和手性光学程度，选择转化率及ee值最高的重组酶用于后续的优化反应实验，筛选结果如下表1所示。从实验结果来看，WP_008741284.1对应序列的重组亚胺还原酶的催化合成达泊西汀中间体的效果最佳。
表1
WP_121545166.1
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MNEQQNHTSSQNSPVTVIGLGPMGRAMTRILLAAGHPVTVWNRTVGRTNGVVADGATLAATPGEAVEASDLVILSLTDYRAMYDILGSAAESLAGRTLANLSSDTPDRSREAAAWAAGHGATFLTGGVMVPAPMVGTEAAHVYYSGPDEAMRSHLTTLKLLGAPKYLGEDPGLAQMMYQAQLALFLTTLSGLMHATAMLETAGLKAREALPELLSSADSLGDILRAGEEIPGTALDAGEHPGDLSTVTMMGATSDHIVETSTSLGLDLALPLAVQAHYRRAIENGHGGDNWTRIIDSIRGPR；
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MNAHQNPPTSKDSSVTVIGLGPMGQAMTRTLLAAGHPVTVWNRTASRADGLVADGATLAATPGEAVEASDLVLLSLTDYRAMYDILDRATASLTGRTLVNLSSDTPDRTREAVTWAAGHGAAFLTGGVMVPAPMVGTPASRVYYSGDAPVFERHREVLSRLGTPQYLGADPGLAQLMYQAQLAVFLTTLSGLMHATAMLGTAGTPAKDALPELLSFTDSIGAMLRAGEEHPGAALDAGEHPGDLSTVTMMGATSDHIVETSTSLGLDLALPLAVQAHYRRAIENGHGGDNWTRIIDSIRGRG；
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MNAPQNPPTGRHDTVTVIGLGPMGQAMTRTLLTAGHPVTVWNRTAGRADGVVTDGATLAATPGEAVEASDLVILSLTDYRAMYDILDGATASLAGRTLVNLSSDTPDRSREAAAWAAEHGAAFLTGGVMVPAPMVGTEAAHVYYSGPEKTMRSRLATLTPLGTPKYLGEDPGLAQMMYQAQLTVFLTTLSGLMQATAMLGSAGMKAGEALPELLASADSIGDILRAGEENPGALLDAGEHPGDLSTVTMMGATSDHIVETGASLGLDLALPLAVRAHYRRAIEDGHGGDNWTRIIDGIRAPR。
实施例2 亚胺还原酶编码基因的合成
将亚胺还原酶基因进行目的基因的全合成，基因合成委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行，获得的编码基因序列如SEQ ID NO.2所示，翻译后的亚胺还原酶氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。合成后的编码基因连接到pET28a(+)上，获得重组表达载体pET28a(+)。
其中，SEQ ID NO.1：
MNAPQNPTTSQNSAVTVIGLGPMGQAMTRALLDSGHPVTVWNRTAGRAAGVVADGATLAPTPAGAVEASDLVILSLTDYRAMYEVLGGATGSLAGRTLVNLSSDTPDRTREAARWAAGHGAAFLTGGVMVPAPMVGTEAAHVYYSGGGEAARSHLATLAPLGTPRYLGEDPGLAQLMYQAQLAVFLTTLSALMHATAMLGTAGLKAGEALPELLSSADAIGAILRAGEEHPGAALDAGEHPGDLSTVTMMGATADHIVETSTSLGLDLALPLAVRAHYRRAIEDGHGGDNWTRIIDGIRGPRRADPASADRVIAAPAG。
SEQ ID NO.2：
ATGAACGCCCCCCAGAACCCCACCACCAGCCAGAACAGCGCCGTGACCGTGATCGGCCTGGGCCCCATGGGCCAGGCCATGACCAGGGCCCTGCTGGACAGCGGCCACCCCGTGACCGTGTGGAACAGGACCGCCGGCAGGGCCGCCGGCGTGGTGGCCGACGGCGCCACCCTGGCCCCCACCCCCGCCGGCGCCGTGGAGGCCAGCGACCTGGTGATCCTGAGCCTGACCGACTACAGGGCCATGTACGAGGTGCTGGGCGGCGCCACCGGCAGCCTGGCCGGCAGGACCCTGGTGAACCTGAGCAGCGACACCCCCGACAGGACCAGGGAGGCCGCCAGGTGGGCCGCCGGCCACGGCGCCGCCTTCCTGACCGGCGGCGTGATGGTGCCCGCCCCCATGGTGGGCACCGAGGCCGCCCACGTGTACTACAGCGGCGGCGGCGAGGCCGCCAGGAGCCACCTGGCCACCCTGGCCCCCCTGGGCACCCCCAGGTACCTGGGCGAGGACCCCGGCCTGGCCCAGCTGATGTACCAGGCCCAGCTGGCCGTGTTCCTGACCACCCTGAGCGCCCTGATGCACGCCACCGCCATGCTGGGCACCGCCGGCCTGAAGGCCGGCGAGGCCCTGCCCGAGCTGCTGAGCAGCGCCGACGCCATCGGCGCCATCCTGAGGGCCGGCGAGGAGCACCCCGGCGCCGCCCTGGACGCCGGCGAGCACCCCGGCGACCTGAGCACCGTGACCATGATGGGCGCCACCGCCGACCACATCGTGGAGACCAGCACCAGCCTGGGCCTGGACCTGGCCCTGCCCCTGGCCGTGAGGGCCCACTACAGGAGGGCCATCGAGGACGGCCACGGCGGCGACAACTGGACCAGGATCATCGACGGCATCAGGGGCCCCAGGAGGGCCGACCCCGCCAGCGCCGACAGGGTGATCGCCGCCCCCGCCGGC。
实施例3 亚胺还原酶的表达
LB平板：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，1.2％琼脂，溶剂为去离子水。
LB培养液：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，溶剂为去离子水。
将实施例1构建的重组表达载体pET28a(+)通过化学转化法转到大肠杆菌BL21(DE3)中，获得重组大肠杆菌BL21(DE3)。涂布到含有50 μg/mL卡那霉素的LB平板上，37°C过夜培养。次日，挑取单菌落，将单菌落接入到5mL添加50 μg/mL卡那霉素的LB培养液中，37°C，200rpm振荡培养过夜。次日取1mL菌液加入到含50 μg/mL卡那霉素的100 mL LB培养液中，37°C下振荡培养至OD600至1.5，然后添加IPTG至终浓度为1mM，25°C下诱导培养过夜，培养液离心，转速4000rpm，10 min后收集湿菌体。将湿菌体用20 mL、0.1M磷酸 缓冲液(pH7.0)重悬，将重悬菌体置于冰水浴中，超声破碎仪功率300W，工作3秒，间隔5秒，超声30min，超声破碎所得破碎混合液离心后上清即为粗酶液，粗酶液的SDS-PAGE检测结果如图1中条带“1”所示。酶液进行冻干得到冻干酶粉，冻干酶粉的SDS-PAGE检测结果如图1中条带“2”所示，得到的亚胺还原酶冻干酶粉作为用于生物催化反应。
实施例4 葡萄糖脱氢酶编码基因的合成
将葡萄糖脱氢酶基因进行目的基因的全合成，基因合成委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行，获得的编码基因序列如SEQ ID NO.4所示，翻译后的亚胺还原酶氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。合成后的编码基因连接到pET30a(+)上，获得重组表达载体pET30a(+)。
SEQ ID NO.3：
MYKDLEGKVVVITGSSTGLGKSMAIRFATEKAKVVVNYRSKEDEANSVLEEIKRVGGEAIAVKGDVTVESDVINLVQSAIKEFGKLDVMINNAGLENPVSSHEMSLSDWNKVIDTNLTGAFLGSREAIKYFVENDIKGTVINMSSVHEKIPWPLFVHYAASKGGMKLMTETLALEYAPKGIRVNNIGPGAINTPINAEKFADPEQRADVESMIPMGYIGEPEEIAAVAAWLASSEASYVTGITLFADGGMTLYPSFQAGRG。
SEQ ID NO.4：
ATGTACAAGGACCTGGAGGGCAAGGTGGTGGTGATCACCGGCAGCAGCACCGGCCTGGGCAAGAGCATGGCCATCAGGTTCGCCACCGAGAAGGCCAAGGTGGTGGTGAACTACAGGAGCAAGGAGGACGAGGCCAACAGCGTGCTGGAGGAGATCAAGAGGGTGGGCGGCGAGGCCATCGCCGTGAAGGGCGACGTGACCGTGGAGAGCGACGTGATCAACCTGGTGCAGAGCGCCATCAAGGAGTTCGGCAAGCTGGACGTGATGATCAACAACGCCGGCCTGGAGAACCCCGTGAGCAGCCACGAGATGAGCCTGAGCGACTGGAACAAGGTGATCGACACCAACCTGACCGGCGCCTTCCTGGGCAGCAGGGAGGCCATCAAGTACTTCGTGGAGAACGACATCAAGGGCACCGTGATCAACATGAGCAGCGTGCACGAGAAGATCCCCTGGCCCCTGTTCGTGCACTACGCCGCCAGCAAGGGCGGCATGAAGCTGATGACCGAGACCCTGGCCCTGGAGTACGCCCCCAAGGGCATCAGGGTGAACAACATCGGCCCCGGCGCCATCAACACCCCCATCAACGCCGAGAAGTTCGCCGACCCCGAGCAGAGGGCCGACGTGGAGAGCATGATCCCCATGGGCTACATCGGCGAGCCCGAGGAGATCGCCGCCGTGGCCGCCTGGCTGGCCAGCAGCGAGGCCAGCTACGTGACCGGCATCACCCTGTTCGCCGACGGCGGCATGACCCTGTACCCCAGCTTCCAGGCCGGCAGGGGC。
实施例5 葡萄糖脱氢酶的表达
LB平板：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，1.2％琼脂，溶剂为去离子水。
LB培养液：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，溶剂为去离子水。
将实施例3构建的重组表达载体pET30a(+)通过化学转化法转到大肠杆菌BL21(DE3)中，获得重组大肠杆菌BL21(DE3)。涂布到含有50 μg/mL卡那霉素的LB平板上，37°C过夜培养。次日，挑取单菌落，将单菌落接入到5mL添加50 μg/mL卡那霉素的LB培养液中，37°C，200rpm振荡培养过夜。次日取1mL菌液加入到含50 μg/mL卡那霉素的100 mL LB培养液中，37°C下振荡培养至OD600至1.5，然后添加IPTG至终浓度为1mM，25°C下诱导培养过夜，培养液离心，转速4000rpm，10 min后收集湿菌体。将湿菌体用20 mL、0.1M磷酸缓冲液(pH7.0)重悬，将重悬菌体置于冰水浴中，超声破碎仪功率300W，工作3秒，间隔5秒，超声30 min，超声破碎所得破碎混合液离心后上清即为粗酶液，酶液进行冻干，得到的葡萄糖脱氢酶冻干酶粉作为用于生物催化反应。
实施例6 生物催化反应
将10 g底物3-氯苯丙酮和10g二甲胺加入到含有50 mL Tris-HCl缓冲液(0.05M，pH 8.5)的100 mL反应器中，随后，将100 mg NADH，750 mg 葡萄糖，25 mg实施例4制备的葡萄糖脱氢酶，1 g实施例2中制备的冻干酶粉加入该反应器中，构成如图2所示的反应体系20mL。在35°C下磁力搅拌反应，并调节反应的pH值，使反应体系维持在7.0左右。
反应机理如图2所示。HPLC检测底物几乎完全消耗(约14小时)，用乙酸乙酯萃取。取乙酸乙酯层用无水硫酸钠除水，抽滤，滤液减压浓缩至无乙酸乙酯挥出，添加无水异丙醇混溶静置，待重结晶后过滤，得白色絮状产物，即达泊西汀中间体(S)-3-氯-N,N-二甲基-1-苯丙基-1-胺，其检测谱图数据如下所示：1H-NMR (400 MHz, DMSO) δ 7.36（m, 2H）,7.32(m,2H) ,7.27(m, 1H),3.81（m,1H）,3.70-3.75（m,2H),2.26（s,6H),1.96(m，2H)；13C-NMR:(101 MHz, DMSO-d6) δ 139.9,128.8,128.8,126.0,128.1,128.1,84.1,44.4,44.4,39.8,39.0。
通过SFC检测的达泊西汀中间体产物手性光学程度ee值如图4所示，高达99.8%。
实施例7 生物催化反应
将10 g底物3-氯苯丙酮和5 g二甲胺加入到含有50 mL Tris-HCl缓冲液(0.05M，pH 8.5)的100 mL反应器中，随后，将100 mg NADH，750 mg 葡萄糖，25 mg实施例4制备的葡萄糖脱氢酶，1 g实施例2中制备的冻干酶粉加入该反应器中，构成如图2所示的反应体系20mL。在35°C下磁力搅拌反应，并调节反应的pH值，使反应体系维持在7.0左右。HPLC检测底物消耗75%。
实施例8 生物催化反应
将10 g底物3-氯苯丙酮和10 g二甲胺加入到含有50 mL Tris-HCl缓冲液(0.05M，pH 8.5)的100 mL反应器中，随后，将100 mg NADH，750 mg 葡萄糖，25 mg实施例4制备的葡萄糖脱氢酶，500 mg实施例2中制备的冻干酶粉加入该反应器中，构成如图2所示的反应体系20 mL。在35°C下磁力搅拌反应，并调节反应的pH值，使反应体系维持在7.0左右。HPLC检测底物消耗43%。
以上实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (12)
1.亚胺还原酶作为催化剂在制备达泊西汀中间体和/或达泊西汀中的用途，亚胺还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述达泊西汀中间体包括如下所示结构的化合物：
；
所述亚胺还原酶通过一步反应催化苯丙酮取代物和胺化试剂生成达泊西汀中间体；
所述达泊西汀采用所述亚胺还原酶催化制备的达泊西汀中间体制备而成。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述亚胺还原酶催化的反应体系满足以下特征（1）~（3）中的至少一个：
（1）所述反应体系包括苯丙酮取代物和二级胺；
（2）所述反应体系包括辅酶循环试剂，所述辅酶循环试剂包括葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和辅酶；
（3）所述反应体系包括缓冲试剂。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述亚胺还原酶催化的反应体系中的各物质满足以下条件（1）~（5）中的至少一个：
（1）所述葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
（2）所述辅酶包括NADP盐和/或NAD盐；
（3）所述苯丙酮取代物包括3-氯苯丙酮；
（4）所述二级胺包括二甲胺；
（5）所述缓冲试剂包括Tris-HCl缓冲试剂和/或磷酸盐缓冲试剂。
4.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述反应体系中各物质的质量比满足以下条件（1）~（2）中的至少一个：
（1）3-氯苯丙酮、二甲胺、辅酶和亚胺还原酶的质量比为（0.1~1）：（0.1~1）：（0.005~0.01）：（0.05~0.1）；
（2）辅酶、葡萄糖、葡萄糖脱氢酶的质量比为（0.001~0.002）：（0.7~1.5）：（0.01~0.05）。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述反应体系中达泊西汀中间体的对映体过剩率大于99%。
6.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述葡萄糖脱氢酶的制备步骤包括：
将葡萄糖脱氢酶基因和蛋白表达载体连接构建重组葡萄糖脱氢酶表达载体；
将重组葡萄糖脱氢酶表达载体转化至目标菌株后，诱导培养目标菌株以获得葡萄糖脱氢酶。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述葡萄糖脱氢酶的制备满足以下条件（1）~（3）中的至少一个：
（1）葡萄糖脱氢酶基因包括SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；
（2）蛋白表达载体包括pET28a(+)；
（3）目标菌株包括大肠杆菌菌株。
8.根据权利要求1~7任一项所述的用途，其特征在于，所述亚胺还原酶的制备步骤包括：
将亚胺还原酶基因和蛋白表达载体连接构建重组表达载体；
将重组表达载体转化至目标菌株后，诱导培养目标菌株以获得重组亚胺还原酶。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述亚胺还原酶的制备满足以下条件（1）~（3）中的至少一个：
（1）所述亚胺还原酶基因包括SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；
（2）所述蛋白表达载体包括pET28a(+)；
（3）所述目标菌株包括大肠杆菌菌株。
10.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，对反应体系生成的达泊西汀中间体进行分离纯化。
11.根据权利要求10所述的用途，其特征在于，分离纯化的步骤包括：
对反应体系进行萃取，得到含有达泊西汀中间体的萃取物；
除去萃取物中的水和第一试剂，得到达泊西汀中间体粗产物；
对达泊西汀中间体粗产物进行重结晶，得到分离纯化的达泊西汀中间体。
12.根据权利要求11所述的用途，其特征在于，所述分离纯化的步骤满足以下条件（1）~（4）中的至少一个：
（1）采用第一试剂对反应体系进行萃取，所述第一试剂包括乙酸乙酯；
（2）采用第二试剂对达泊西汀中间体粗产物进行重结晶，所述第二试剂包括无水异丙醇；
（3）采用第三试剂除去萃取物中的水，所述第三试剂包括无水硫酸钠；
（4）采用减压蒸馏的方式除去萃取物中的第一试剂。
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| GR01 | Patent grant | ||
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