CN115404250A - 一种利用还原方式制备(s)-尼古丁的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种利用还原方式制备(S)‑尼古丁的方法，所述方法包括：将式Ⅰ所示的烯胺化合物和/或式Ⅱ所示的亚胺正离子化合物进行还原反应，得到(S)‑尼古丁。鉴于现有技术中已公开的制备(S)‑尼古丁的策略大多需要甲基化方式才能得到(S)‑尼古丁，或者不经甲基化使用酶催化得不到(S)‑尼古丁，(S)‑尼古丁的制备策略还十分有限，本发明创造性地开发了全新的不需使用甲基化过程即可高效制备(S)‑尼古丁的方法，即对上述式Ⅰ所示的烯胺化合物和/或式Ⅱ所示的亚胺正离子化合物进行还原，即可。该合成方法操作简单、安全可靠，收率高，纯度高。

Description

一种利用还原方式制备(S)-尼古丁的方法
技术领域
本发明属于有机合成技术领域，具体涉及一种(S)-尼古丁的合成方法，尤其涉及一种利用还原方式制备(S)-尼古丁的方法。
背景技术
(S)-尼古丁(烟碱)是一种存在于茄科植物(茄属)中的生物碱，也是烟草的重要成分。烟叶中含有1.5％-3.5％的(S)-尼古丁，从烟叶从提取烟碱是目前获取烟碱的最主要方法，虽然已经有化学合成法的相关报道，但是化学合成方法还不成熟，其成本远高于提取法。目前已经报道的化学合成方法包括化学拆分法、不对称氢化法、手性辅助试剂法等。
专利WO2014174505公开了使用亚胺还原酶(ketoreductase enzyme)催化pseudooxynicotine得到尼古丁，该专利使用的亚胺还原酶分别来源Streptomycessp.GF3546和Streptomyces sp.GF3587，且其催化只能制备得到(R)-尼古丁，没有公开如何制备(S)-尼古丁。
专利US10913962B公开了使用酶催化麦思明制备(S)-去甲烟碱，再对(S)-去甲烟碱甲基化最后得到(S)-尼古丁。该发明使用生物催化制备(S)-去甲烟碱解决了成本高的问题，而且能够得到高收率的(S)-去甲烟碱，同时在甲基化过程中需要甲醛提供甲基来源，需要甲酸作为还原剂。
Figure BDA0003660327830000011
为了解决现有技术需要甲基化方式才能制备(S)-尼古丁，或者不经甲基化使用酶催化得不到(S)-尼古丁的问题，需要开发一种新的无需甲基化制备(S)-尼古丁的方法。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种(S)-尼古丁的合成方法，尤其涉及一种利用还原方式制备(S)-尼古丁的方法。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供一种利用还原方式制备(S)-尼古丁的方法，所述方法包括：
将式Ⅰ所示的烯胺化合物和/或式Ⅱ所示的亚胺正离子化合物进行还原反应，得到(S)-尼古丁：
Figure BDA0003660327830000021
鉴于现有技术中已公开的制备(S)-尼古丁的策略大多需要甲基化方式才能得到(S)-尼古丁，或者不经甲基化使用酶催化得不到(S)-尼古丁，(S)-尼古丁的制备策略还十分有限，本发明创造性地开发了全新的不需使用甲基化过程即可高效制备(S)-尼古丁的方法，即对上述式Ⅰ所示的烯胺化合物和/或式Ⅱ所示的亚胺正离子化合物进行还原，即可。该合成方法操作简单、安全可靠，收率高，纯度高。
在本发明中，所述还原具体包括如下两种策略：
所述还原反应采用生物酶催化方法，包括：
在辅酶循环系统的条件下，以亚胺还原酶为催化剂，催化还原式Ⅰ所示的烯胺化合物和/或式Ⅱ所示的亚胺正离子化合物，得到(S)-尼古丁。
优选地，所述辅酶循环系统包括辅酶、葡萄糖和葡萄糖脱氢酶。
优选地，所述辅酶包括NADP盐和/或NAD盐，优选NADP盐。
优选地，所述葡萄糖脱氢酶包括SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。
SEQ ID No.1：
MYKDLEGKVVVITGSSTGLGKSMAIRFATEKAKVVVNYRSKEDEANSVLEEIKKVGGEAIAVKGDVTVESDVINLVQSAIKEFGKLDVMINNAGLENPVSSHEMSLSDWNKVIDTNLTGAFLGSREAIKYFVENDIKGTVINMSSVHEKIPWPLFVHYAASKGGMKLMTETLALEYAPKGIRVNNIGPGAINTPINAEKFADPEQRADVESMIPMGYIGEPEEIAAVAAWLASSEASYVTGITLFADGGMTQYPSFQAGR。
优选地，所述亚胺还原酶包括SEQ ID No.2-6、SEQ ID No.8、SEQ ID No.11、SEQID No.12、或具有与SEQ ID No.12至少95％同一性的氨基酸序列；优选SEQ ID No.2-4、SEQID No.12、或具有与SEQ ID No.12至少95％同一性的氨基酸序列。
SEQ ID No.2：
MRHLSVIGLGAMGSALATTLLKAGHPVTVWNRSAAKAAPLQALGATLAPSVGEAIAASDITLVCVDNYAVSQQLLDEASDAVAGKLLVQLSTGSPQGARSLESWCHTRGARYLDGAILCFPDQIGTTDASIICSGASTAFSEAEPVLRLLAPPLDHVAEAVGAAAAQDCAVAAYFAGGLLGALHGALICEVEGLPVAKVCAQFSELSPILGGDVAHLGKTLASGDFDHPYASLKTWSAAISRLAGHATDAGIDSRFPRFAADLFEEGVAQGFGQQEVSALIKVLRARNGAAQ。
SEQ ID No.3：
MRHLSVIGLGAMGSALATTLLKAGHPVTVWNRSAAKAAPLQALGATLAPSVGAAIAASDITLVCVDNYAVSQLLLDEASDAVAGKLLVQLSTGSPQGARALESWSHARGARYLDGAILCFPAQIGTSDASIICSGASAAFSEAEPVLSLLAPTLDHVAEAVGAAAAQDCAVAAYFAGGLLGALHGALICEAEGLPVAKVCAQFSELSPILGGDVAHLGKTLASGDFDHPYASLKTWSAAISRLAGHATDAGIDSRFPRFAADLFEEGVAQGFGQQEVSALIKVLRARNGAAQ。
SEQ ID No.4：
MRHLSVIGLGAMGSALATTLIKGGHPVTVWNRSAAKAAPLQALGATLAPSVGAAIAASDITLVCVDNYAVSQQLLDEARDAVAGKLLVQLSTGSPQGARALESWSHARGARYLDGAILCFPDQIGTSDASIICSGASAAYFAGGLLGALHGALICEAEGLPVAKVCAQFSELSPILGGDVAHLGKTLASGDFDHPYASLKTWSAAISRLAGHATDAGIDSRFPRFAADLFEEGVAQGFGQQEVSALIKVLRARNGAAL。
SEQ ID No.5：
MRPISVIGLGAMGSALATTLLKAGHPVTVWNRSAAKATPLIALGAILAPSVSEAIAAGDITLICVDNYAVSQQLLDEASNAVTGKLVVQLSTGSPLGARTLESWCHARGACYLDGAILCFPDQIGTTDASIICSGANAAFREAEPVLRLLAPTLEHVAEAVGAAAAQDCAVAAYFAGGLLGALHGALICEAEGLPVAKVCAQFSELSPILGGDVAHLGKTLASGDFDHPYASLKTWSAAISRLTDHAADAGIDNSFPRFAADLFEEGVEQGLGQQEVSALIKVLRARNGAAQ。
SEQ ID No.6：
MRHLSVIGLGAMGSALATTLIKAGHPVTVWNRSAAKSAPLQALGATLAPSVGAAIAASDITLVCVDNYAVSQQLLDEASDAVAGKQLVQLSTGSPQGARALESWSHARGARYLDGAILCFPDQIGTSDASIICSGANTAFSDAEPVLRLLAPTLDHVAEAVGAAAAQDCAVAAYFAGGLLGALHGALICEAEGLPVTKVCAQFSELSPILGGDVAHLGKTLASGDFDHPYASLKTWSAAISRLAGHATDAGIDSRFPRFAADLFEEGVAQGFGQQEVSALIKVLRARNGAAQ。
SEQ ID No.7：
MGTALVEAFLAGGHATTVWNRTPGKADGVVARGAVVAETVAEAVAASPLVVVCLWDDAVVRDVLHPVADALAGRVVVNLTNGTPAQAREMAAWAAEHGVEYVDGGIMAIPPGIGTEHAFVLYSGAEAAFEAHREVLERLGAAKYLGADAGLAALFDLALLSGMYGTFAGLWHSLAMVRTENVSAAEFVPMLGPWMQAMIGGNLDRLAHQLDTGDYGHEVVSNLAMQAAAFPNIVQASLDQGIRPDLMAPIQRLMDQAVAAGHGAEDVAVVVDLLKN。
SEQ ID No.8：
MKPTLTVIGAGRMGSALIKAFLQSGYTTTVWNRTKAKSEPLAKLGAHLADTVRDAVKRSDIIVVNVLDYDTSDQLLRQDEVTRELRGKLLVQLTSGSPALAREQETWARQHGIDYLDGAIMATPDFIGQAECALLYSGSAALFEKHRAVLNVLGGATSHVGEDVGHASALDSALLFQMWGTLFGTLQALAISRAEGIPLEKTTAFIKLTEPVTQGAVADVLTRVQQNRLTADAQTLASLEAHNVAFQHLLALCEERNIHRGVADAMYSVIREAVKAGHGKDDFAILTRFLK。
SEQ ID No.9：
MVSSPYLNVTAYPKVRNLPWPVPGPIRVASQILELRPMTTIGFLGAGRMGSALVKSLLEAGHSVHVWNRTAEKAQALADFGAVPEPSAERAAGPAEIVIVNLLDYEASDAELRKPDVAEALKGKLLVQLTSGSPKTARETGRWAGDHGIAYLDGAIMATPNFIGGAETVILYSGSKTHFEKHEGLFKALGGKSAFVGEDFGTASALDSALLSQMWGTLFGTLQALAVCRAEGIEHDVYAGFLMSAQPMIDGAQQDLMERIRDGRDLADAQTLATVAVHNVAFHHLRDLIADRDLNPAFGDALGSLLETALRNDHQDDDFAVLARFMGAK。
SEQ ID No.10：
MTDLGKSAVTVLGLGAMGTALAEALLAAGHPTTVWNRSPARTAGPAQRGAAVAAATAEAIAASRLIVVCLLDHTSVHAVLDGQELTGRIVVNLTSGTPGQARELDARVAERGGDHLDGAVLAVPSMIGTPDASVLYSGSRGAFDTHRPVLEVFGAADYVGADPGAASLQDAALLSAMYGQVAGVLHAFALVRSAGVTATEFLPRLVGWLTAMGGFPADAARRIDARAYADDVDAALTMQVTAVRNLVRAAREQGVSAELIAPLVPVMQRRIDDGDGGDDLAALVEVITAEEVA。
SEQ ID No.11：
MTDKPPVTVLGLGAMGTALARTLLNAGYPTTVWNRTASKTAPLTELGAHAADSPADAIARGELVLACLLDYDSVHQTLAGTGDALRGKAFVNLTNGTPEQARALAGKLDTAYLDGGIMAVPPMIGSPGAFLFYSGEIAVFEQYRPVLESFGEAIEVGTDPGLAALHDLALLSAMYGMFGGVLQAFALTGSAGVSAASLAPLLHRWLDGMSGFIAQSAAQLDSGDFATGVVSNLAMQDTGFANLFRAAKEQGISTGQLEPLGALIRRRVEDGHGAEDLAGIVEYLKIGANA。
SEQ ID No.12
MRHLSVIGLGAMGSALATTLLKAGHPVTVWNRSAAKAAPLQALGATLAPSVGAAIAASDITLVCVDNYAVSQLLLDEASDAVAGKLLVQLSTGSPQGARALESWSHARGARYLDGAILCFPAQIGTSDASIICSGASAAFSEAEPVLSLLAPTLDHVAEAVGAAAAQDCAVAAYFAGGLLGALHGALICEAEGLPVAKVCAQFSELSPILGGDVAHLGKTLASGDFDHPYASLKTWSAAISRLAGHATDAGIDSRFPRFAADLFEEGVAQGFGQQEVSALIKVLRARNGAAQ。
本领域技术人员在上述SEQ ID No.2-12氨基酸序列的基础上结合本领域的常规技术手段可以对序列中的一个或多个氨基酸进行突变，进一步获得亚胺还原酶突变体，并筛选出能够催化本发明涉及的底物得到(S)-尼古丁、且转化率、ee值均满足实际需要的亚胺还原酶。
优选地，所述与SEQ ID No.12至少95％同一性的氨基酸序列与SEQ ID No.12序列相比在氨基酸残基上存在下述差异的任意一种或至少两种的组合：L73、S148、V171、A172。
进一步优选地，第73位L突变为Q或V、第148位S突变为R，第171位V突变为Y、N、A或S、第172位A突变为V或F。
进一步优选地，所述与SEQ ID No.12至少95％同一性的氨基酸序列与SEQ IDNo.12序列相比在氨基酸残基上还存在下述差异的任意一种或至少两种的组合：A57、A176、Y230、S241。
进一步优选地，第57位A突变为R、第176位A突变为G、第230位Y突变为G、A或T、第241位S突变为G或A。
示例性地，所述与SEQ ID No.12至少95％同一性的氨基酸序列可以为：
SEQ ID No.13：
MRHLSVIGLGAMGSALATTLLKAGHPVTVWNRSAAKAAPLQALGATLAPSVGAAIAASDITLVCVDNYAVSQVLLDEASDAVAGKLLVQLSTGSPQGARALESWSHARGARYLDGAILCFPAQIGTSDASIICSGASAAFSEAEPVLSLLAPTLDHVAEAVGAAAAQDCAAAAYFAGGLLGALHGALICEAEGLPVAKVCAQFSELSPILGGDVAHLGKTLASGDFDHPYASLKTWSAAISRLAGHATDAGIDSRFPRFAADLFEEGVAQGFGQQEVSALIKVLRARNGAAQ。
SEQ ID No.14
MRHLSVIGLGAMGSALATTLLKAGHPVTVWNRSAAKAAPLQALGATLAPSVGAAIAASDITLVCVDNYAVSQQLLDEASDAVAGKLLVQLSTGSPQGARALESWSHARGARYLDGAILCFPAQIGTSDASIICSGASAAFSEAEPVLRLLAPTLDHVAEAVGAAAAQDCAVAAYFAGGLLGALHGALICEAEGLPVAKVCAQFSELSPILGGDVAHLGKTLASGDFDHPYASLKTWSAAISRLAGHATDAGIDSRFPRFAADLFEEGVAQGFGQQEVSALIKVLRARNGAAQ。
SEQ ID No.15
MRHLSVIGLGAMGSALATTLLKAGHPVTVWNRSAAKAAPLQALGATLAPSVGAAIAASDITLVCVDNYAVSQQLLDEASDAVAGKLLVQLSTGSPQGARALESWSHARGARYLDGAILCFPAQIGTSDASIICSGASAAFSEAEPVLRLLAPTLDHVAEAVGAAAAQDCAVAAYFAGGLLGALHGALICEAEGLPVAKVCAQFSELSPILGGDVAHLGKTLASGDFDHPGASLKTWSAAISRLAGHATDAGIDSRFPRFAADLFEEGVAQGFGQQEVSALIKVLRARNGAAQ。
SEQ ID No.16
MRHLSVIGLGAMGSALATTLLKAGHPVTVWNRSAAKAAPLQALGATLAPSVGAAIARSDITLVCVDNYAVSQLLLDEASDAVAGKLLVQLSTGSPQGARALESWSHARGARYLDGAILCFPAQIGTSDASIICSGASAAFSEAEPVLSLLAPTLDHVAEAVGAAAAQDCAAVAYFGGGLLGALHGALICEAEGLPVAKVCAQFSELSPILGGDVAHLGKTLASGDFDHPTASLKTWSAAIGRLAGHATDAGIDSRFPRFAADLFEEGVAQGFGQQEVSALIKVLRARNGAAQ。
SEQ ID No.17
MRHLSVIGLGAMGSALATTLLKAGHPVTVWNRSAAKAAPLQALGATLAPSVGAAIARSDITLVCVDNYAVSQLLLDEASDAVAGKLLVQLSTGSPQGARALESWSHARGARYLDGAILCFPAQIGTSDASIICSGASAAFSEAEPVLSLLAPTLDHVAEAVGAAAAQDCAAVAYFGGGLLGALHGALICEAEGLPVAKVCAQFSELSPILGGDVAHLGKTLASGDFDHPYASLKTWSAAIGRLAGHATDAGIDSRFPRFAADLFEEGVAQGFGQQEVSALIKVLRARNGAAQ。
SEQ ID No.18
MRHLSVIGLGAMGSALATTLLKAGHPVTVWNRSAAKAAPLQALGATLAPSVGAAIARSDITLVCVDNYAVSQLLLDEASDAVAGKLLVQLSTGSPQGARALESWSHARGARYLDGAILCFPAQIGTSDASIICSGASAAFSEAEPVLSLLAPTLDHVAEAVGAAAAQDCAAAAYFGGGLLGALHGALICEAEGLPVAKVCAQFSELSPILGGDVAHLGKTLASGDFDHPYASLKTWSAAIGRLAGHATDAGIDSRFPRFAADLFEEGVAQGFGQQEVSALIKVLRARNGAAQ。
SEQ ID No.19
MRHLSVIGLGAMGSALATTLLKAGHPVTVWNRSAAKAAPLQALGATLAPSVGAAIARSDITLVCVDNYAVSQLLLDEASDAVAGKLLVQLSTGSPQGARALESWSHARGARYLDGAILCFPAQIGTSDASIICSGASAAFSEAEPVLSLLAPTLDHVAEAVGAAAAQDCAVVAYFGGGLLGALHGALICEAEGLPVAKVCAQFSELSPILGGDVAHLGKTLASGDFDHPYASLKTWSAAIGRLAGHATDAGIDSRFPRFAADLFEEGVAQGFGQQEVSALIKVLRARNGAAQ。
SEQ ID No.20
MRHLSVIGLGAMGSALATTLLKAGHPVTVWNRSAAKAAPLQALGATLAPSVGAAIARSDITLVCVDNYAVSQQLLDEASDAVAGKLLVQLSTGSPQGARALESWSHARGARYLDGAILCFPAQIGTSDASIICSGASAAFSEAEPVLRLLAPTLDHVAEAVGAAAAQDCAVAAYFGGGLLGALHGALICEAEGLPVAKVCAQFSELSPILGGDVAHLGKTLASGDFDHPYASLKTWSAAISRLAGHATDAGIDSRFPRFAADLFEEGVAQGFGQQEVSALIKVLRARNGAAQ。
SEQ ID No.21
MRHLSVIGLGAMGSALATTLLKAGHPVTVWNRSAAKAAPLQALGATLAPSVGAAIARSDITLVCVDNYAVSQQLLDEASDAVAGKLLVQLSTGSPQGARALESWSHARGARYLDGAILCFPAQIGTSDASIICSGASAAFSEAEPVLRLLAPTLDHVAEAVGAAAAQDCAVAAYFGGGLLGALHGALICEAEGLPVAKVCAQFSELSPILGGDVAHLGKTLASGDFDHPYASLKTWSAAIARLAGHATDAGIDSRFPRFAADLFEEGVAQGFGQQEVSALIKVLRARNGAAQ。
SEQ ID No.22
MRHLSVIGLGAMGSALATTLLKAGHPVTVWNRSAAKAAPLQALGATLAPSVGAAIARSDITLVCVDNYAVSQQLLDEASDAVAGKLLVQLSTGSPQGARALESWSHARGARYLDGAILCFPAQIGTSDASIICSGASAAFSEAEPVLRLLAPTLDHVAEAVGAAAAQDCAVAAYFGGGLLGALHGALICEAEGLPVAKVCAQFSELSPILGGDVAHLGKTLASGDFDHPTASLKTWSAAISRLAGHATDAGIDSRFPRFAADLFEEGVAQGFGQQEVSALIKVLRARNGAAQ。
本领域技术人员可以根据上述突变点的任意组合结合本领域的常规技术手段获得亚胺还原酶突变体，并筛选出能够催化本发明涉及的底物得到(S)-尼古丁、且转化率99％以上、ee值99％以上的亚胺还原酶。优选地，所述催化还原反应在15-45℃下进行，例如15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述催化还原反应在缓冲液体系中进行，所述缓冲液包括磷酸盐缓冲液、三羟甲基甲胺-盐酸缓冲液或三乙醇胺-盐酸缓冲液。
优选地，所述催化还原反应在pH＝6.0-8.0下进行，例如pH＝6.0、pH＝6.2、pH＝6.5、pH＝6.8、pH＝7.0、pH＝7.2、pH＝7.5、pH＝7.8、pH＝8.0等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
在本发明中，所述还原反应采用手性金属催化剂催化方法，包括：
在氢气气氛中，式Ⅰ所示的烯胺化合物和/或式Ⅱ所示的亚胺正离子化合物被手性金属催化剂催化还原为(S)-尼古丁。
优选地，所述手性金属催化剂包括手性铱催化剂、手性钌催化剂或手性铑催化剂，优选手性铱催化剂。
优选地，在所述催化还原体系中还添加配体。
所述配体选自表1中任意一种或至少两种的组合，优选(R,R)-f-SpiroPhos和(S,S)-Ph-BPE：
表1
Figure BDA0003660327830000081
Figure BDA0003660327830000091
优选地，所述催化还原反应在50-100℃下进行，例如50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃、100℃等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述催化还原反应体系中的氢气维持在1.0-6.0MPa，例如1.0MPa、2.0MPa、3.0MPa、4.0MPa、5.0MPa、6.0MPa等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述催化还原反应在pH＝4.0-13.0下进行，例如pH＝4.0、5.0、6.0、pH＝6.2、pH＝6.5、pH＝6.8、pH＝7.0、pH＝7.2、pH＝7.5、pH＝7.8、pH＝8.0、pH＝10.0、pH＝12.0、pH＝13.0等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
在本发明中，所述式Ⅰ所示的烯胺化合物或式Ⅱ所示的亚胺正离子化合物是由式Ⅲ所示的化合物或其盐经过脱盐和/或环化得到的：
Figure BDA0003660327830000092
优选地，所述盐包括盐酸盐、二盐酸盐、氢溴酸盐、二氢溴酸盐、硫酸盐或硫酸氢盐。
上述式Ⅲ所示的化合物或其盐在无机碱和/或有机碱中和的条件下即可发生脱盐和/或环化反应，得到式Ⅰ所示的烯胺化合物或式Ⅱ所示的亚胺正离子化合物。
在本发明中，式Ⅲ所示化合物的盐的合成方法包括：
将化合物A与N-甲基吡咯烷酮、有机碱混合反应，得到化合物D；化合物D再与酸混合反应，得到式Ⅲ所示化合物的盐；其反应式如下所示。
Figure BDA0003660327830000101
或者，式Ⅲ所示化合物的盐的合成方法包括：
将化合物A与N-甲基吡咯烷酮、有机碱混合反应后，加入酸中和至pH＝7-8，得到化合物B；化合物B再与酸混合反应，得到式Ⅲ所示化合物的盐；其反应式如下所示。
Figure BDA0003660327830000102
在本发明中，所述化合物A的合成方法包括：将烟酸与甲醇混合，在强酸性环境中进行酯化反应，即得。
作为本发明的优选技术方案，所述制备(S)-尼古丁的方法包括：
将烟酸与甲醇混合，在强酸性环境中进行酯化反应，得到化合物A；化合物A与N-甲基吡咯烷酮、有机碱混合反应后，可选地加入酸进行中和，得到化合物B或D；然后再与酸混合反应，得到式Ⅲ所示化合物的盐；脱盐及发生环化，最后采用生物酶催化方法或手性金属催化剂催化方法进行还原反应，得到(S)-尼古丁；其反应式如下所示。
Figure BDA0003660327830000103
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
鉴于现有技术中已公开的制备(S)-尼古丁的策略大多需要甲基化方式才能得到(S)-尼古丁，或者不经甲基化使用酶催化得不到(S)-尼古丁，(S)-尼古丁的制备策略还十分有限，本发明创造性地开发了全新的不需使用甲基化过程即可高效制备(S)-尼古丁的方法，即对上述式Ⅰ所示的烯胺化合物和/或式Ⅱ所示的亚胺正离子化合物进行还原，即可。该合成方法操作简单、安全可靠，收率高，纯度高，丰富了(S)-尼古丁的合成策略。
附图说明
图1是采用本发明所涉及的合成方法制得的(S)-尼古丁的核磁图谱。
图2是采用本发明所涉及的合成方法制得的化合物Ⅲ盐酸盐的核磁图谱。
图3是采用本发明所涉及的合成方法制得的化合物B的核磁图谱。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
下述制备例和实施例中化合物A的纯度检测方法为高效液相色谱法；收率计算方法为：
Figure BDA0003660327830000111
化合物B的纯度检测方法为高效液相色谱法；收率计算方法为：
Figure BDA0003660327830000112
式Ⅲ所示化合物或其盐的纯度检测方法为高效液相色谱法；收率计算方法为：
Figure BDA0003660327830000113
(S)-尼古丁的纯度检测方法为高效液相色谱法；光学纯度检测方法为高效液相色谱法；收率计算方法为：
Figure BDA0003660327830000114
制备例1-1
本制备例制备化合物A：
Figure BDA0003660327830000115
向500mL反应瓶中加入烟酸50g，甲醇250g，启动搅拌，向反应瓶中滴加浓硫酸60g，滴加完毕后升温至回流反应18小时后降温到45℃减压浓缩，蒸出甲醇，待无馏分蒸出后，浓缩残留物降温至20℃，向浓缩残留物中加入乙酸乙酯250g，水250g，搅拌溶清后用20％氢氧化钠水溶液调节pH至7.5，静置分层，收集有机层，水层再用乙酸乙酯250g萃取一次，合并有机层，用无水硫酸钠干燥后，减压蒸除溶剂得无色透明液体55.2g，纯度99％，收率99％，该液体冷却后固化即得。
制备例1-2
本制备例制备化合物A：
向500mL反应瓶中加入烟酸50g，甲醇250g，开启搅拌，升温至回流后向反应瓶中滴加氯化亚砜120.5g(2.5eq)，滴加完毕后保持回流反应9小时后，40℃减压浓缩，蒸出甲醇，待无馏分蒸出后，浓缩残留物降温至10℃，向浓缩残留物中加入二氯甲烷200g，水100g，搅拌溶清后用15％氢氧化钠水溶液调节pH至8，静置分层，收集有机层，水层用200g二氯甲烷再萃取一次，合并有机层，用5％氢氧化钠水溶液100g洗涤一次，有机层用无水硫酸钠干燥后，减压蒸除溶剂得浅黄色透明液体44.8g，纯度99％，收率81％，该液体冷却后固化即得。
制备例1-3
本制备例制备化合物A：
向100mL反应瓶中加入烟酸5g，原甲酸三甲酯5.2g(1.2eq)，甲醇25g，四氯化锆0.48g(0.05eq)，启动搅拌，升温至回流反应17小时后降温到25℃，加入乙醇钠0.55g(0.2eq)中和后，过滤，滤液减压浓缩，蒸出甲醇，得无色透明液体5.5g，纯度98.1％，收率99％，该液体冷却后固化即得。
制备例1-4
本制备例制备化合物A：
向100mL反应瓶中加入烟酸5g，原甲酸三甲酯5.2g(1.2eq)，甲醇25g，四氯化锆0.1g(0.01eq)，启动搅拌，升温至回流反应36小时后降温到30℃，加入乙醇钠0.11g(0.04eq)中和后，过滤，滤液减压浓缩，蒸出甲醇，得无色透明液体5.3g，纯度91.6％，收率95％，该液体冷却后固化即得。
制备例1-5
本制备例制备化合物A：
向100mL反应瓶中加入烟酸5g，原甲酸三甲酯5.2g(1.2eq)，甲醇25g，四氯化锆0.19g(0.02eq)，启动搅拌，升温至回流反应30小时后降温到20℃，加入乙醇钠0.22g(0.08eq)中和后，过滤，滤液减压浓缩，蒸出甲醇，得无色透明液体5.4g，纯度93.9％，收率97％，该液体冷却后固化即得。
制备例1-6
本制备例制备化合物A：
向2L反应瓶中加入烟酸200g，原甲酸三甲酯207g(1.2eq)，甲醇1000g，四氯化锆9.5g(0.025eq)，启动搅拌，升温至回流反应20小时后降温到25℃，加入乙醇钠11.06g(0.1eq)中和后，过滤，滤液减压浓缩，蒸出甲醇，得无色透明液体220.6g，纯度98.5％，收率99％，该液体冷却后固化即得。
制备例2-1
本制备例制备化合物B：
Figure BDA0003660327830000131
向反应瓶中加入制备例1-1制得的化合物A 102.0g，N-甲基吡咯烷酮88.5g(1.2eq)，甲苯1.2kg，叔丁醇钾133.6g(1.6eq)，加完物料后，启动搅拌，升温至回流；反应合格后，降温至25℃，用5％盐酸中和至pH＝7.5，静置分层，水相用二氯甲烷萃取萃取后，合并有机相，减压浓缩除去溶剂得到黄棕色液体121.0g，即为化合物B，纯度94％，收率80％；不用纯化处理，直接进入下一步反应。
粗产品经柱层析纯化后，用核磁检测，产品以酮式和烯醇式两种形态共存，以酮式为主，酮式和烯醇式的比例约为10/1。酮式形态化合物的核磁氢谱数据如下：δppm(400MHz,CDCl3)9.30(s,1H),8.77-8.80(m,1H),8.44(1H,dt,J＝8.0,2.0Hz),7.43-7.47(m,1H)，4.46(1H,dd,J＝8.8,3.2Hz),3.36-3.46(m,2H),2.87(s,3H),2.67-2.75(m,1H),2.22-2.32(m，1H)。核磁氢谱谱图如图3所示。
制备例2-2
本制备例制备化合物B：
向反应瓶中加入制备例1-2制得的化合物A 102.0g，N-甲基吡咯烷酮77.4g(1.05eq)，甲苯1.2kg，叔丁醇钾91.8g(1.1eq)，加完物料后，启动搅拌，升温至回流；反应合格后，降温至20℃，用5％盐酸中和至pH＝7，静置分层，水相用甲苯萃取后，合并有机相，减压浓缩除去溶剂得到黄棕色液体118.0g，即为化合物B，纯度93.5％，收率78％；不用纯化处理，直接进入下一步反应。
粗产品经柱层析纯化后，用核磁检测，产品以酮式和烯醇式两种形态共存，以酮式为主，酮式和烯醇式的比例约为10/1。酮式形态化合物的核磁氢谱数据如下：δppm(400MHz,CDCl3)9.30(s,1H),8.77-8.80(m,1H),8.44(1H,dt,J＝8.0,2.0Hz),7.43-7.47(m,1H)，4.46(1H,dd,J＝8.8,3.2Hz),3.36-3.46(m,2H),2.87(s,3H),2.67-2.75(m,1H),2.22-2.32(m，1H)。
制备例2-3
本制备例制备化合物B：
向反应瓶中加入制备例1-3制得的化合物A 102.0g，N-甲基吡咯烷酮88.5g(1.2eq)，甲苯1.2kg，叔丁醇钠114.4g(1.6eq)，加完物料后，启动搅拌，升温至回流；反应合格后，降温至30℃，用5％盐酸中和至pH＝8，静置分层，水相用乙酸乙酯萃取后，合并有机相，减压浓缩除去溶剂得到黄棕色液体117.8g，即为化合物B，纯度95％，收率78％；不用纯化处理，直接进入下一步反应。
粗产品经柱层析纯化后，用核磁检测，产品以酮式和烯醇式两种形态共存，以酮式为主，酮式和烯醇式的比例约为10/1。酮式形态化合物的核磁氢谱数据如下：δppm(400MHz,CDCl3)9.30(s,1H),8.77-8.80(m,1H),8.44(1H,dt,J＝8.0,2.0Hz),7.43-7.47(m,1H)，4.46(1H,dd,J＝8.8,3.2Hz),3.36-3.46(m,2H),2.87(s,3H),2.67-2.75(m,1H),2.22-2.32(m，1H)。
制备例2-4
本制备例制备化合物B：
向反应瓶中加入制备例1-4制得的化合物A 102.0g，N-甲基吡咯烷酮77.4g(1.05eq)，甲苯1.2kg，叔丁醇钠78.6g(1.1eq)，加完物料后，启动搅拌，升温至回流；反应合格后，降温至25℃，用5％盐酸中和至pH＝7.5，静置分层，水相用甲苯萃取后，合并有机相，减压浓缩除去溶剂得到黄棕色液体108.7g，即为化合物B，纯度93％，收率72％；不用纯化处理，直接进入下一步反应。
粗产品经柱层析纯化后，用核磁检测，产品以酮式和烯醇式两种形态共存，以酮式为主，酮式和烯醇式的比例约为10/1。酮式形态化合物的核磁氢谱数据如下：δppm(400MHz,CDCl3)9.30(s,1H),8.77-8.80(m,1H),8.44(1H,dt,J＝8.0,2.0Hz),7.43-7.47(m,1H)，4.46(1H,dd,J＝8.8,3.2Hz),3.36-3.46(m,2H),2.87(s,3H),2.67-2.75(m,1H),2.22-2.32(m，1H)。
制备例2-5
本制备例制备化合物B：
向反应瓶中加入制备例1-5制得的化合物A 102.0g，N-甲基吡咯烷酮88.5g(1.2eq)，甲苯1.2kg，乙醇钠81.0g(1.6eq)，加完物料后，启动搅拌，升温至回流；反应16小时后，降温至25℃，用5％盐酸中和至pH＝7.5，静置分层，水相用甲苯萃取后，合并有机相，减压浓缩除去溶剂得到黄棕色液体127.0g，即为化合物B，纯度92％，收率84％；不用纯化处理，直接进入下一步反应。
粗产品经柱层析纯化后，用核磁检测，产品以酮式和烯醇式两种形态共存，以酮式为主，酮式和烯醇式的比例约为10/1。酮式形态化合物的核磁氢谱数据如下：δppm(400MHz,CDCl3)9.30(s,1H),8.77-8.80(m,1H),8.44(1H,dt,J＝8.0,2.0Hz),7.43-7.47(m,1H)，4.46(1H,dd,J＝8.8,3.2Hz),3.36-3.46(m,2H),2.87(s,3H),2.67-2.75(m,1H),2.22-2.32(m，1H)。
制备例2-6
本制备例制备化合物B：
向反应瓶中加入制备例1-6制得的化合物A 102.0g，N-甲基吡咯烷酮88.5g(1.2eq)，甲苯1.2kg，氢化钠47.6g(1.6eq，60％Sodium hydride in oil)，加完物料后，启动搅拌，升温至回流；反应合格后，降温至25℃，用5％盐酸中和至pH＝7，静置分层，水相用甲基叔丁基醚萃取后，合并有机相，减压浓缩除去溶剂得到黄棕色液体111.g，即为化合物B，纯度90％，收率70％；不用纯化处理，直接进入下一步反应。
粗产品经柱层析纯化后，用核磁检测，产品以酮式和烯醇式两种形态共存，以酮式为主，酮式和烯醇式的比例约为10/1。酮式形态化合物的核磁氢谱数据如下：δppm(400MHz,CDCl3)9.30(s,1H),8.77-8.80(m,1H),8.44(1H,dt,J＝8.0,2.0Hz),7.43-7.47(m,1H)，4.46(1H,dd,J＝8.8,3.2Hz),3.36-3.46(m,2H),2.87(s,3H),2.67-2.75(m,1H),2.22-2.32(m，1H)。
制备例3-1
本制备例以化合物B为原料制备式Ⅲ所示化合物的盐酸盐：
Figure BDA0003660327830000151
向反应瓶中加入制备例2-1制得的化合物B 100.0g，浓盐酸500.0g，加完物料后，启动搅拌，升温至回流；反应合格后，降温至55℃，减压浓缩，残余物中加入甲醇300.0g，降温到4℃，过滤得到类白色固体92.2g，即为式Ⅲ所示化合物，纯度99％，收率75％。
经检测，所得化合物核磁氢谱与所示结构一致，检测数据如下：1H-NMR(400MHz,D2O):δppm 9.25(m,1H),9.0(dt,J＝8.4Hz,1.6Hz,1H),8.90-8.91(m,1H),8.13-8.17(m,1H),3.28(t,J＝6.8Hz,2H),3.06(t,J＝8.0Hz,2H),2.66(s,3H),2.02-2.09(m,2H)。谱图如图2所示。
制备例3-2
本制备例以化合物B为原料制备式Ⅲ所示化合物：
向反应瓶中加入制备例2-2制得的化合物B 100.0g，浓盐酸100.0g，加完物料后，启动搅拌，升温至回流；反应合格后，降温至50℃，减压浓缩，残余物中加入甲醇100.0g，降温到8℃，过滤得到类白色固体95.9g，即为式Ⅲ所示化合物，纯度98.5％，收率78％。
经检测，所得化合物核磁氢谱与所示结构一致，检测数据如下：1H-NMR(400MHz,D2O):δppm 9.25(m,1H),9.0(dt,J＝8.4Hz,1.6Hz,1H),8.90-8.91(m,1H),8.13-8.17(m,1H),3.28(t,J＝6.8Hz,2H),3.06(t,J＝8.0Hz,2H),2.66(s,3H),2.02-2.09(m,2H)。
制备例3-3
本制备例以化合物B为原料制备式Ⅲ所示化合物：
向反应瓶中加入制备例2-3制得的化合物B 100.0g，浓盐酸300.0g，加完物料后，启动搅拌，升温至回流；反应合格后，降温至50℃，减压浓缩，残余物中加入乙醇300.0g，降温到0℃，过滤得到类白色固体100.8g，即为式Ⅲ所示化合物，纯度99％，收率82％。
经检测，所得化合物核磁氢谱与所示结构一致，检测数据如下：1H-NMR(400MHz,D2O):δppm 9.25(m,1H),9.0(dt,J＝8.4Hz,1.6Hz,1H),8.90-8.91(m,1H),8.13-8.17(m,1H),3.28(t,J＝6.8Hz,2H),3.06(t,J＝8.0Hz,2H),2.66(s,3H),2.02-2.09(m,2H)。
制备例3-4
本制备例以化合物B为原料制备式Ⅲ所示化合物：
向反应瓶中加入制备例2-4制得的化合物B 100.0g，浓盐酸300.0g，加完物料后，启动搅拌，升温至回流；反应合格后，降温至55℃，减压浓缩，残余物中加入异丙醇500.0g，降温到4℃，过滤得到类白色固体93.4g，即为式Ⅲ所示化合物，纯度97.5％，收率76％。
经检测，所得化合物核磁氢谱与所示结构一致，检测数据如下：1H-NMR(400MHz,D2O):δppm 9.25(m,1H),9.0(dt,J＝8.4Hz,1.6Hz,1H),8.90-8.91(m,1H),8.13-8.17(m,1H),3.28(t,J＝6.8Hz,2H),3.06(t,J＝8.0Hz,2H),2.66(s,3H),2.02-2.09(m,2H)。
制备例3-5
本制备例以化合物B为原料制备式Ⅲ所示化合物：
向反应瓶中加入制备例2-5制得的化合物B 100.0g，浓盐酸500.0g，加完物料后，启动搅拌，升温至回流；反应合格后，降温至55℃，减压浓缩，残余物中加入异丙醇100.0g，降温到4℃，过滤得到类白色固体103.3g，即为式Ⅲ所示化合物，纯度96％，收率84％。
经检测，所得化合物核磁氢谱与所示结构一致，检测数据如下：1H-NMR(400MHz,D2O):δppm 9.25(m,1H),9.0(dt,J＝8.4Hz,1.6Hz,1H),8.90-8.91(m,1H),8.13-8.17(m,1H),3.28(t,J＝6.8Hz,2H),3.06(t,J＝8.0Hz,2H),2.66(s,3H),2.02-2.09(m,2H)。
制备例4-1
本制备例以化合物A为原料先制备化合物D，再制备式Ⅲ所示化合物：
向反应瓶中加入制备例1-1制得的化合物A 120.0g，N-甲基吡咯烷酮96.2g，甲苯1.6kg，叔丁醇钾147g，加完物料后，启动搅拌，升温至回流；反应合格后，降温至25℃，过滤，得化合物D(钾盐)，直接用于下一步反应。
将过滤得到的D(钾盐)，加入到650g浓盐酸中，升温至100℃反应，直至反应完全。减压蒸馏除去大部分水，向残余物中加入95％乙醇650mL，充分搅拌后降温到10℃，过滤，烘干，得到类白色固体86g，即为式Ⅲ所示化合物，收率55.2％，纯度97.2％。
经检测，所得化合物核磁氢谱与所示结构一致，检测数据如下：1H-NMR(400MHz,D2O):δppm 9.25(m,1H),9.0(dt,J＝8.4Hz,1.6Hz,1H),8.90-8.91(m,1H),8.13-8.17(m,1H),3.28(t,J＝6.8Hz,2H),3.06(t,J＝8.0Hz,2H),2.66(s,3H),2.02-2.09(m,2H)。
制备例4-2
本制备例以化合物A为原料先制备化合物D，再制备式Ⅲ所示化合物：
向反应瓶中加入制备例1-2制得的化合物A153.0g，N-甲基吡咯烷酮165g，甲苯2kg，叔丁醇钠214.5g，加完物料后，启动搅拌，升温至回流；反应合格后，降温至15℃，过滤，得化合物D(钠盐)，直接用于下一步反应。
将过滤得到的D(钠盐)，加入到960g浓盐酸中，升温至100℃左右反应，直至反应完全。减压蒸馏除去大部分水，向残余物中加入异丙醇800mL，充分搅拌后除温到20℃，过滤，烘干，得到类白色固体127g，即为式Ⅲ所示化合物，收率63.5％，纯度96.7％。
经检测，所得化合物核磁氢谱与所示结构一致，检测数据如下：1H-NMR(400MHz,D2O):δppm 9.25(m,1H),9.0(dt,J＝8.4Hz,1.6Hz,1H),8.90-8.91(m,1H),8.13-8.17(m,1H),3.28(t,J＝6.8Hz,2H),3.06(t,J＝8.0Hz,2H),2.66(s,3H),2.02-2.09(m,2H)。
制备例5-1
本制备例制备如SEQ ID No.1所示氨基酸序列的葡萄糖脱氢酶：
将来源于Priestia megaterium(NCBI登录号AUO12718.1)的葡萄糖脱氢酶氨基酸序列(SEQ ID No.1)送至南京金斯瑞公司进行密码子优化和全基因合成，连接入质粒pET30a(+)中；将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，获得含有葡萄糖脱氢酶基因的重组菌。
将上述重组菌接种于5mL含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，置于37℃下培养过夜；取1mL菌液接种于125mL含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，置于37℃下培养3h，然后加入125μL 1M IPTG，25℃下诱导过夜；离心(4000rpm，4℃，10min)收集菌体，加入4倍体积的磷酸缓冲液(pH＝7.0)重悬，重悬后对细胞进行超声破碎，离心(4000rpm，4℃，10min)取上清溶液进行冷冻干燥，获得葡萄糖脱氢酶酶粉。
制备例5-2
本制备例制备以下11种亚胺还原酶，依次记为酶1、酶3-11、酶13：
将NCBI上报道的亚胺还原酶氨基酸序列(SEQ ID No.2-12，信息见下表)送至南京金斯瑞公司进行密码子优化和全基因合成，连接入质粒pET30a(+)中；将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，获得含有亚胺还原酶基因的重组菌。
氨基酸序列 NCBI登录号 来源
SEQ ID No.2 WP_201992507.1 Aeromonas veronii
SEQ ID No.3 WP_139729886.1 Aeromonas sobria
SEQ ID No.4 WP_010862236.1 Plesiomonas shigelloides
SEQ ID No.5 WP_064339362.1 Aeromonas veronii
SEQ ID No.6 QNF15299.1 Aeromonas jandaei
SEQ ID No.7 WP_073480922.1 Streptoalloteichus hindustanus
SEQ ID No.8 WP_015347361.1 Myxococcus stipitatus
SEQ ID No.9 WP_198539790.1 Rhizobium sp.
SEQ ID No.10 WP_073459042.1 Pseudonocardia thermophila
SEQ ID No.11 WP_020496004.1 Sciscionella marina
SEQ ID No.12 WP_005335883.1 Aeromonas veronii
将上述重组菌接种于5mL含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，置于37℃下培养过夜；取1mL菌液接种于125mL含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，置于37℃下培养3h，然后加入125μL 1M IPTG，25℃下诱导16h；离心(4000rpm，4℃，10min)收集菌体，加入4倍体积的磷酸缓冲液(pH＝7.0)重悬，重悬后对细胞进行超声破碎，离心(4000rpm，4℃，10min)取上清溶液进行冷冻干燥，获得亚胺还原酶酶粉。
本制备例还制备以下10种亚胺还原酶，记为酶14-酶23，即对氨基酸序列SEQ IDNO:12进行定点突变，获得SEQ ID No.13-22所示的亚胺还原酶氨基酸序列，送至南京金斯瑞公司进行密码子优化和全基因合成，连接入质粒pET30a(+)中；将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，获得含有亚胺还原酶基因的重组菌。进行如上述操作，最终获得亚胺还原酶酶粉。
制备例5-3
本制备例制备以下酶，记为酶12：
将亚胺还原酶(氨基酸序列SEQ ID No.2)和葡萄糖脱氢酶(氨基酸序列SEQ IDNo.1)依次亚克隆至质粒pETDuet-1中；将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，获得同时含有亚胺还原酶基因和葡萄糖脱氢酶基因的重组菌。
将上述重组菌接种于5mL含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，置于37℃下培养过夜；取1mL菌液接种于125mL含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，置于37℃下培养3h，然后加入125μL 1M IPTG，25℃下诱导过夜；离心(4000rpm，4℃，10min)收集菌体，加入4倍体积的磷酸缓冲液(pH＝7.0)重悬，重悬后对细胞进行超声破碎，离心(4000rpm，4℃，10min)取上清溶液进行冷冻干燥，获得酶12酶粉。
实施例1
本实施例采用手性金属催化剂催化还原制备(S)-尼古丁：
Figure BDA0003660327830000191
向100mL氢化釜中加入制备例3-1制得的化合物C1.25g，甲醇50mL，三乙胺1.0g，再加入催化剂1,5-环辛二烯氯化铱二聚体16.7mg，配体(S)-(-)-1-[(R)-2-二苯基膦二茂铁乙基-二叔丁基膦30mg，加完物料后，通入氢气维持在2.5MPa，温度控制在60℃。反应完毕后，浓缩除去溶剂，残余物再用正庚烷打浆，过滤，浓缩，即得到目标化合物；纯度96％，光学纯度72％。
对制备得到的(S)-尼古丁柱层析纯化后进行核磁氢谱表征，如图1所示，数据为：1H-NMR(400MHz,CDCl3):δppm 8.54(1H,d),8.50(1H,dd),7.70(1H,dt),7.24-7.27(1H，m),3.22-3.27(1H,m),3.08(1H,t),2.27-2.34(1H,m),2.17-2.24(1H,m),2.16(3H,m),1.91-2.02(1H,m),1.79-1.87(1H,m),1.68-1.76(1H,m)。表明(S)-尼古丁被成功合成。
实施例2
本实施例采用手性金属催化剂催化还原制备(S)-尼古丁：
Figure BDA0003660327830000201
向100mL氢化釜中加入制备例3-2制得的化合物C1.25g，甲醇50mL，三乙胺1.0g，再加入催化剂1,5-环辛二烯氯化铱二聚体16.7mg，配体(+)-1,2-双((2S,5S)-2,5-二苯基膦)乙烷27mg，加完物料后，通入氢气维持在3.0MPa，温度控制在60℃。反应完毕后，浓缩除去溶剂，残余物再用正庚烷打浆，过滤，浓缩，即得到目标化合物；纯度94％，光学纯度80％。
对制备得到的(S)-尼古丁柱层析纯化后进行核磁氢谱表征，数据为：1H-NMR(400MHz,CDCl3):δppm 8.54(1H,d),8.50(1H,dd),7.70(1H,dt),7.24-7.27(1H，m),3.22-3.27(1H,m),3.08(1H,t),2.27-2.34(1H,m),2.17-2.24(1H,m),2.16(3H,m),1.91-2.02(1H,m),1.79-1.87(1H,m),1.68-1.76(1H,m)。表明(S)-尼古丁被成功合成。
实施例3
本实施例采用手性金属催化剂催化还原制备(S)-尼古丁：
Figure BDA0003660327830000202
向100mL氢化釜中加入制备例3-3制得的化合物C1.25g，甲醇50mL，三乙胺1.0g，再加入催化剂1,5-环辛二烯氯化铱二聚体16.7mg，配体(R,R)-f-SpiroPhos 38mg，加完物料后，通入氢气维持在5.5MPa，温度控制在80℃。反应完毕后，反应液直接浓缩，除去溶剂，残余物再用正庚烷打浆，过滤，浓缩，即得到目标化合物；纯度90％，光学纯度88％。
对制备得到的(S)-尼古丁柱层析纯化后进行核磁氢谱表征，数据为：1H-NMR(400MHz,CDCl3):δppm 8.54(1H,d),8.50(1H,dd),7.70(1H,dt),7.24-7.27(1H，m),3.22-3.27(1H,m),3.08(1H,t),2.27-2.34(1H,m),2.17-2.24(1H,m),2.16(3H,m),1.91-2.02(1H,m),1.79-1.87(1H,m),1.68-1.76(1H,m)。表明(S)-尼古丁被成功合成。
实施例4
本实施例采用手性金属催化剂催化还原制备(S)-尼古丁：
Figure BDA0003660327830000211
其制备方法与实施例3的区别仅在于将催化剂1,5-环辛二烯氯化铱二聚体16.7mg，配体(R,R)-f-SpiroPhos 38mg替换为Rh[(R,R)-DIPAMP](COD)BF4 45mg，其他条件均保持不变。得到目标化合物；纯度45％，光学纯度27％。
对制备得到的(S)-尼古丁柱层析纯化后进行核磁氢谱表征，数据为：1H-NMR(400MHz,CDCl3):δppm 8.54(1H,d),8.50(1H,dd),7.70(1H,dt),7.24-7.27(1H，m),3.22-3.27(1H,m),3.08(1H,t),2.27-2.34(1H,m),2.17-2.24(1H,m),2.16(3H,m),1.91-2.02(1H,m),1.79-1.87(1H,m),1.68-1.76(1H,m)。表明(S)-尼古丁被成功合成。
实施例5
本实施例采用手性金属催化剂催化还原制备(S)-尼古丁：
Figure BDA0003660327830000212
向100mL氢化釜中加入制备例3-4制得的化合物C1.25g，乙醇60mL，三乙胺1.0g，再加入催化剂Rh[(R,R)-DIPAMP](COD)BF4 45mg，加完物料后，通入氢气维持在4.0MPa，温度维持在90℃。反应合格后，浓缩除去溶剂，残余物再用正庚烷打浆，过滤，浓缩，即得到目标化合物；纯度85％，光学纯度58％。
对制备得到的(S)-尼古丁柱层析纯化后进行核磁氢谱表征，数据为：1H-NMR(400MHz,CDCl3):δppm 8.54(1H,d),8.50(1H,dd),7.70(1H,dt),7.24-7.27(1H，m),3.22-3.27(1H,m),3.08(1H,t),2.27-2.34(1H,m),2.17-2.24(1H,m),2.16(3H,m),1.91-2.02(1H,m),1.79-1.87(1H,m),1.68-1.76(1H,m)。表明(S)-尼古丁被成功合成。
实施例6
本实施例采用手性金属催化剂催化还原制备(S)-尼古丁：
Figure BDA0003660327830000221
向100mL氢化釜中加入制备例3-5制得的化合物C1.25g，甲醇50mL，二异丙基乙胺1.2g，再加入催化剂(-)-1,2-双((2S,5S)-2,5-二甲基磷)乙烷(环辛二烯)四氟硼酸铑39mg，加完物料后，通入氢气维持在1.5MPa，温度控制在100℃。反应完成后，浓缩除去溶剂，残余物再用甲基叔丁基醚打浆，过滤，浓缩，即得到目标化合物；纯度64％，光学纯度82％。
对制备得到的(S)-尼古丁柱层析纯化后进行核磁氢谱表征，数据为：1H-NMR(400MHz,CDCl3):δppm 8.54(1H,d),8.50(1H,dd),7.70(1H,dt),7.24-7.27(1H，m),3.22-3.27(1H,m),3.08(1H,t),2.27-2.34(1H,m),2.17-2.24(1H,m),2.16(3H,m),1.91-2.02(1H,m),1.79-1.87(1H,m),1.68-1.76(1H,m)。表明(S)-尼古丁被成功合成。
实施例7
本实施例采用手性金属催化剂催化还原制备(S)-尼古丁：
Figure BDA0003660327830000222
向100mL氢化釜中加入制备例4-1制得的化合物C1.25g，甲醇50mL，三乙胺1.0g，再加入催化剂[(R)-(+)-2,2'-双(二苯基磷)-1,1'-联萘]二氯化钌35mg，加完物料后，通入氢气维持在3.0MPa，温度控制在90℃，中控反应合格后，反应液直接浓缩，除去溶剂，残余物再用正庚烷打浆，过滤，浓缩，即得到目标化合物；纯度59％，光学纯度66％。
对制备得到的(S)-尼古丁柱层析纯化后进行核磁氢谱表征，数据为：1H-NMR(400MHz,CDCl3):δppm 8.54(1H,d),8.50(1H,dd),7.70(1H,dt),7.24-7.27(1H，m),3.22-3.27(1H,m),3.08(1H,t),2.27-2.34(1H,m),2.17-2.24(1H,m),2.16(3H,m),1.91-2.02(1H,m),1.79-1.87(1H,m),1.68-1.76(1H,m)。表明(S)-尼古丁被成功合成。
实施例8
本实施例采用生物酶催化还原制备(S)-尼古丁：
Figure BDA0003660327830000231
向10个5mL离心管中加入30mg制备例4-2制得的化合物C，加入2mL 0.1M的磷酸盐缓冲液，调节pH至6.0。再向反应瓶中加入32mg葡萄糖，搅拌至完全溶解，再向其中分别加入30mg制备例5-2制得的氨基酸序列依次为SEQ ID No.2-22所示的亚胺还原酶。在另一个5mL离心管中加入3mL 0.1M的磷酸盐缓冲液，40mg制备例5-1制得的氨基酸序列为SEQ ID No.1所示的酶2和40mg NADP盐，搅拌至完全溶解。然后将第二个离心管中的溶液分别取0.1mL缓慢加入第一个离心管中，升温至25℃，以300r/min搅拌反应16h。分别取反应液0.1mL加入0.9mL的甲醇中振荡1min后过滤至1mL液相瓶中供高效液相分析，以(S)-尼古丁的面积比为转化率。
转化率数据如表2所示：
表2
Figure BDA0003660327830000232
Figure BDA0003660327830000241
由表2数据可知：相比于其他酶，酶1，酶3，酶4，酶13-18，酶22的催化效果最好，转化率能达到94.6％以上。
实施例9
本实施例采用生物酶催化还原制备(S)-尼古丁：
Figure BDA0003660327830000242
向50mL三口圆底烧瓶中加入4.5g制备例4-1制得的化合物C，加入20mL 0.1M的磷酸盐缓冲液，调节pH至7.0。再向反应瓶中加入4.8g葡萄糖，搅拌至完全溶解。在另一个50mL烧瓶中加入10mL 0.1M的磷酸盐缓冲液，0.3g制备例5-2制得的酶1，0.04g制备例5-1制得的酶2和0.008g NADP盐，搅拌至完全溶解。然后将第二个烧瓶中的溶液缓慢加入第一个烧瓶中，升温至30℃，以300r/min搅拌反应16h。过滤，滤液用氢氧化钠溶液调节至pH＝10后用甲基叔丁基醚萃取，无水硫酸钠干燥，浓缩后得(S)-尼古丁2.6g。纯度99％，光学纯度100％，收率89.5％。
对制备得到的(S)-尼古丁进行核磁氢谱表征，数据为：1H-NMR(400MHz,CDCl3):δppm8.54(1H,d),8.50(1H,dd),7.70(1H,dt),7.24-7.27(1H，m),3.22-3.27(1H,m),3.08(1H,t),2.27-2.34(1H,m),2.17-2.24(1H,m),2.16(3H,m),1.91-2.02(1H,m),1.79-1.87(1H,m),1.68-1.76(1H,m)。表明(S)-尼古丁被成功合成。
实施例10
本实施例采用生物酶催化还原制备(S)-尼古丁：
Figure BDA0003660327830000251
向50mL三口圆底烧瓶中加入4.5g制备例3-1制得的化合物C，加入20mL 0.1M的磷酸盐缓冲液，调节pH至6.0。再向反应瓶中加入4.8g葡萄糖，搅拌至完全溶解。在另一个50mL烧瓶中加入10mL 0.1M的磷酸盐缓冲液，0.4g制备例5-2制得的酶3，0.04g制备例5-1制得的酶2和0.008g NADP盐，搅拌至完全溶解。然后将第二个烧瓶中的溶液缓慢加入第一个烧瓶中，升温至35℃，以300r/min搅拌反应16h。过滤，滤液用氢氧化钠溶液调节至pH＝10后用乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，浓缩后得(S)-尼古丁2.4g。纯度99％，光学纯度99.4％，收率82.6％。
对制备得到的(S)-尼古丁进行核磁氢谱表征，数据为：1H-NMR(400MHz,CDCl3):δppm8.54(1H,d),8.50(1H,dd),7.70(1H,dt),7.24-7.27(1H，m),3.22-3.27(1H,m),3.08(1H,t),2.27-2.34(1H,m),2.17-2.24(1H,m),2.16(3H,m),1.91-2.02(1H,m),1.79-1.87(1H,m),1.68-1.76(1H,m)。表明(S)-尼古丁被成功合成。
实施例11
本实施例采用生物酶催化还原制备(S)-尼古丁：
Figure BDA0003660327830000252
向50mL三口圆底烧瓶中加入4.5g制备例3-1制得的化合物C，加入20mL 0.1M的磷酸盐缓冲液，调节pH至6.0。再向反应瓶中加入4.8g葡萄糖，搅拌至完全溶解。在另一个50mL烧瓶中加入10mL 0.1M的磷酸盐缓冲液，0.4g制备例5-3制得的酶12和0.008g NADP盐，搅拌至完全溶解。然后将第二个烧瓶中的溶液缓慢加入第一个烧瓶中，升温至35℃，以300r/min搅拌反应16h。过滤，滤液用氢氧化钠溶液调节至pH＝10后用乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，浓缩后得(S)-尼古丁2.3g。纯度99％，光学纯度99.6％，收率79.2％。
对制备得到的(S)-尼古丁进行核磁氢谱表征，数据为：1H-NMR(400MHz,CDCl3):δppm8.54(1H,d),8.50(1H,dd),7.70(1H,dt),7.24-7.27(1H，m),3.22-3.27(1H,m),3.08(1H,t),2.27-2.34(1H,m),2.17-2.24(1H,m),2.16(3H,m),1.91-2.02(1H,m),1.79-1.87(1H,m),1.68-1.76(1H,m)。表明(S)-尼古丁被成功合成。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种利用还原方式制备(S)-尼古丁的方法，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
序列表
<110> 重庆博腾制药科技股份有限公司
<120> 一种利用还原方式制备(S)-尼古丁的方法
<130> 2022
<160> 22
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 260
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Tyr Lys Asp Leu Glu Gly Lys Val Val Val Ile Thr Gly Ser Ser
1 5 10 15
Thr Gly Leu Gly Lys Ser Met Ala Ile Arg Phe Ala Thr Glu Lys Ala
20 25 30
Lys Val Val Val Asn Tyr Arg Ser Lys Glu Asp Glu Ala Asn Ser Val
35 40 45
Leu Glu Glu Ile Lys Lys Val Gly Gly Glu Ala Ile Ala Val Lys Gly
50 55 60
Asp Val Thr Val Glu Ser Asp Val Ile Asn Leu Val Gln Ser Ala Ile
65 70 75 80
Lys Glu Phe Gly Lys Leu Asp Val Met Ile Asn Asn Ala Gly Leu Glu
85 90 95
Asn Pro Val Ser Ser His Glu Met Ser Leu Ser Asp Trp Asn Lys Val
100 105 110
Ile Asp Thr Asn Leu Thr Gly Ala Phe Leu Gly Ser Arg Glu Ala Ile
115 120 125
Lys Tyr Phe Val Glu Asn Asp Ile Lys Gly Thr Val Ile Asn Met Ser
130 135 140
Ser Val His Glu Lys Ile Pro Trp Pro Leu Phe Val His Tyr Ala Ala
145 150 155 160
Ser Lys Gly Gly Met Lys Leu Met Thr Glu Thr Leu Ala Leu Glu Tyr
165 170 175
Ala Pro Lys Gly Ile Arg Val Asn Asn Ile Gly Pro Gly Ala Ile Asn
180 185 190
Thr Pro Ile Asn Ala Glu Lys Phe Ala Asp Pro Glu Gln Arg Ala Asp
195 200 205
Val Glu Ser Met Ile Pro Met Gly Tyr Ile Gly Glu Pro Glu Glu Ile
210 215 220
Ala Ala Val Ala Ala Trp Leu Ala Ser Ser Glu Ala Ser Tyr Val Thr
225 230 235 240
Gly Ile Thr Leu Phe Ala Asp Gly Gly Met Thr Gln Tyr Pro Ser Phe
245 250 255
Gln Ala Gly Arg
260
<210> 2
<211> 292
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Arg His Leu Ser Val Ile Gly Leu Gly Ala Met Gly Ser Ala Leu
1 5 10 15
Ala Thr Thr Leu Leu Lys Ala Gly His Pro Val Thr Val Trp Asn Arg
20 25 30
Ser Ala Ala Lys Ala Ala Pro Leu Gln Ala Leu Gly Ala Thr Leu Ala
35 40 45
Pro Ser Val Gly Glu Ala Ile Ala Ala Ser Asp Ile Thr Leu Val Cys
50 55 60
Val Asp Asn Tyr Ala Val Ser Gln Gln Leu Leu Asp Glu Ala Ser Asp
65 70 75 80
Ala Val Ala Gly Lys Leu Leu Val Gln Leu Ser Thr Gly Ser Pro Gln
85 90 95
Gly Ala Arg Ser Leu Glu Ser Trp Cys His Thr Arg Gly Ala Arg Tyr
100 105 110
Leu Asp Gly Ala Ile Leu Cys Phe Pro Asp Gln Ile Gly Thr Thr Asp
115 120 125
Ala Ser Ile Ile Cys Ser Gly Ala Ser Thr Ala Phe Ser Glu Ala Glu
130 135 140
Pro Val Leu Arg Leu Leu Ala Pro Pro Leu Asp His Val Ala Glu Ala
145 150 155 160
Val Gly Ala Ala Ala Ala Gln Asp Cys Ala Val Ala Ala Tyr Phe Ala
165 170 175
Gly Gly Leu Leu Gly Ala Leu His Gly Ala Leu Ile Cys Glu Val Glu
180 185 190
Gly Leu Pro Val Ala Lys Val Cys Ala Gln Phe Ser Glu Leu Ser Pro
195 200 205
Ile Leu Gly Gly Asp Val Ala His Leu Gly Lys Thr Leu Ala Ser Gly
210 215 220
Asp Phe Asp His Pro Tyr Ala Ser Leu Lys Thr Trp Ser Ala Ala Ile
225 230 235 240
Ser Arg Leu Ala Gly His Ala Thr Asp Ala Gly Ile Asp Ser Arg Phe
245 250 255
Pro Arg Phe Ala Ala Asp Leu Phe Glu Glu Gly Val Ala Gln Gly Phe
260 265 270
Gly Gln Gln Glu Val Ser Ala Leu Ile Lys Val Leu Arg Ala Arg Asn
275 280 285
Gly Ala Ala Gln
290
<210> 3
<211> 292
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Met Arg His Leu Ser Val Ile Gly Leu Gly Ala Met Gly Ser Ala Leu
1 5 10 15
Ala Thr Thr Leu Leu Lys Ala Gly His Pro Val Thr Val Trp Asn Arg
20 25 30
Ser Ala Ala Lys Ala Ala Pro Leu Gln Ala Leu Gly Ala Thr Leu Ala
35 40 45
Pro Ser Val Gly Ala Ala Ile Ala Ala Ser Asp Ile Thr Leu Val Cys
50 55 60
Val Asp Asn Tyr Ala Val Ser Gln Leu Leu Leu Asp Glu Ala Ser Asp
65 70 75 80
Ala Val Ala Gly Lys Leu Leu Val Gln Leu Ser Thr Gly Ser Pro Gln
85 90 95
Gly Ala Arg Ala Leu Glu Ser Trp Ser His Ala Arg Gly Ala Arg Tyr
100 105 110
Leu Asp Gly Ala Ile Leu Cys Phe Pro Ala Gln Ile Gly Thr Ser Asp
115 120 125
Ala Ser Ile Ile Cys Ser Gly Ala Ser Ala Ala Phe Ser Glu Ala Glu
130 135 140
Pro Val Leu Ser Leu Leu Ala Pro Thr Leu Asp His Val Ala Glu Ala
145 150 155 160
Val Gly Ala Ala Ala Ala Gln Asp Cys Ala Val Ala Ala Tyr Phe Ala
165 170 175
Gly Gly Leu Leu Gly Ala Leu His Gly Ala Leu Ile Cys Glu Ala Glu
180 185 190
Gly Leu Pro Val Ala Lys Val Cys Ala Gln Phe Ser Glu Leu Ser Pro
195 200 205
Ile Leu Gly Gly Asp Val Ala His Leu Gly Lys Thr Leu Ala Ser Gly
210 215 220
Asp Phe Asp His Pro Tyr Ala Ser Leu Lys Thr Trp Ser Ala Ala Ile
225 230 235 240
Ser Arg Leu Ala Gly His Ala Thr Asp Ala Gly Ile Asp Ser Arg Phe
245 250 255
Pro Arg Phe Ala Ala Asp Leu Phe Glu Glu Gly Val Ala Gln Gly Phe
260 265 270
Gly Gln Gln Glu Val Ser Ala Leu Ile Lys Val Leu Arg Ala Arg Asn
275 280 285
Gly Ala Ala Gln
290
<210> 4
<211> 258
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Met Arg His Leu Ser Val Ile Gly Leu Gly Ala Met Gly Ser Ala Leu
1 5 10 15
Ala Thr Thr Leu Ile Lys Gly Gly His Pro Val Thr Val Trp Asn Arg
20 25 30
Ser Ala Ala Lys Ala Ala Pro Leu Gln Ala Leu Gly Ala Thr Leu Ala
35 40 45
Pro Ser Val Gly Ala Ala Ile Ala Ala Ser Asp Ile Thr Leu Val Cys
50 55 60
Val Asp Asn Tyr Ala Val Ser Gln Gln Leu Leu Asp Glu Ala Arg Asp
65 70 75 80
Ala Val Ala Gly Lys Leu Leu Val Gln Leu Ser Thr Gly Ser Pro Gln
85 90 95
Gly Ala Arg Ala Leu Glu Ser Trp Ser His Ala Arg Gly Ala Arg Tyr
100 105 110
Leu Asp Gly Ala Ile Leu Cys Phe Pro Asp Gln Ile Gly Thr Ser Asp
115 120 125
Ala Ser Ile Ile Cys Ser Gly Ala Ser Ala Ala Tyr Phe Ala Gly Gly
130 135 140
Leu Leu Gly Ala Leu His Gly Ala Leu Ile Cys Glu Ala Glu Gly Leu
145 150 155 160
Pro Val Ala Lys Val Cys Ala Gln Phe Ser Glu Leu Ser Pro Ile Leu
165 170 175
Gly Gly Asp Val Ala His Leu Gly Lys Thr Leu Ala Ser Gly Asp Phe
180 185 190
Asp His Pro Tyr Ala Ser Leu Lys Thr Trp Ser Ala Ala Ile Ser Arg
195 200 205
Leu Ala Gly His Ala Thr Asp Ala Gly Ile Asp Ser Arg Phe Pro Arg
210 215 220
Phe Ala Ala Asp Leu Phe Glu Glu Gly Val Ala Gln Gly Phe Gly Gln
225 230 235 240
Gln Glu Val Ser Ala Leu Ile Lys Val Leu Arg Ala Arg Asn Gly Ala
245 250 255
Ala Leu
<210> 5
<211> 292
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Met Arg Pro Ile Ser Val Ile Gly Leu Gly Ala Met Gly Ser Ala Leu
1 5 10 15
Ala Thr Thr Leu Leu Lys Ala Gly His Pro Val Thr Val Trp Asn Arg
20 25 30
Ser Ala Ala Lys Ala Thr Pro Leu Ile Ala Leu Gly Ala Ile Leu Ala
35 40 45
Pro Ser Val Ser Glu Ala Ile Ala Ala Gly Asp Ile Thr Leu Ile Cys
50 55 60
Val Asp Asn Tyr Ala Val Ser Gln Gln Leu Leu Asp Glu Ala Ser Asn
65 70 75 80
Ala Val Thr Gly Lys Leu Val Val Gln Leu Ser Thr Gly Ser Pro Leu
85 90 95
Gly Ala Arg Thr Leu Glu Ser Trp Cys His Ala Arg Gly Ala Cys Tyr
100 105 110
Leu Asp Gly Ala Ile Leu Cys Phe Pro Asp Gln Ile Gly Thr Thr Asp
115 120 125
Ala Ser Ile Ile Cys Ser Gly Ala Asn Ala Ala Phe Arg Glu Ala Glu
130 135 140
Pro Val Leu Arg Leu Leu Ala Pro Thr Leu Glu His Val Ala Glu Ala
145 150 155 160
Val Gly Ala Ala Ala Ala Gln Asp Cys Ala Val Ala Ala Tyr Phe Ala
165 170 175
Gly Gly Leu Leu Gly Ala Leu His Gly Ala Leu Ile Cys Glu Ala Glu
180 185 190
Gly Leu Pro Val Ala Lys Val Cys Ala Gln Phe Ser Glu Leu Ser Pro
195 200 205
Ile Leu Gly Gly Asp Val Ala His Leu Gly Lys Thr Leu Ala Ser Gly
210 215 220
Asp Phe Asp His Pro Tyr Ala Ser Leu Lys Thr Trp Ser Ala Ala Ile
225 230 235 240
Ser Arg Leu Thr Asp His Ala Ala Asp Ala Gly Ile Asp Asn Ser Phe
245 250 255
Pro Arg Phe Ala Ala Asp Leu Phe Glu Glu Gly Val Glu Gln Gly Leu
260 265 270
Gly Gln Gln Glu Val Ser Ala Leu Ile Lys Val Leu Arg Ala Arg Asn
275 280 285
Gly Ala Ala Gln
290
<210> 6
<211> 292
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Met Arg His Leu Ser Val Ile Gly Leu Gly Ala Met Gly Ser Ala Leu
1 5 10 15
Ala Thr Thr Leu Ile Lys Ala Gly His Pro Val Thr Val Trp Asn Arg
20 25 30
Ser Ala Ala Lys Ser Ala Pro Leu Gln Ala Leu Gly Ala Thr Leu Ala
35 40 45
Pro Ser Val Gly Ala Ala Ile Ala Ala Ser Asp Ile Thr Leu Val Cys
50 55 60
Val Asp Asn Tyr Ala Val Ser Gln Gln Leu Leu Asp Glu Ala Ser Asp
65 70 75 80
Ala Val Ala Gly Lys Gln Leu Val Gln Leu Ser Thr Gly Ser Pro Gln
85 90 95
Gly Ala Arg Ala Leu Glu Ser Trp Ser His Ala Arg Gly Ala Arg Tyr
100 105 110
Leu Asp Gly Ala Ile Leu Cys Phe Pro Asp Gln Ile Gly Thr Ser Asp
115 120 125
Ala Ser Ile Ile Cys Ser Gly Ala Asn Thr Ala Phe Ser Asp Ala Glu
130 135 140
Pro Val Leu Arg Leu Leu Ala Pro Thr Leu Asp His Val Ala Glu Ala
145 150 155 160
Val Gly Ala Ala Ala Ala Gln Asp Cys Ala Val Ala Ala Tyr Phe Ala
165 170 175
Gly Gly Leu Leu Gly Ala Leu His Gly Ala Leu Ile Cys Glu Ala Glu
180 185 190
Gly Leu Pro Val Thr Lys Val Cys Ala Gln Phe Ser Glu Leu Ser Pro
195 200 205
Ile Leu Gly Gly Asp Val Ala His Leu Gly Lys Thr Leu Ala Ser Gly
210 215 220
Asp Phe Asp His Pro Tyr Ala Ser Leu Lys Thr Trp Ser Ala Ala Ile
225 230 235 240
Ser Arg Leu Ala Gly His Ala Thr Asp Ala Gly Ile Asp Ser Arg Phe
245 250 255
Pro Arg Phe Ala Ala Asp Leu Phe Glu Glu Gly Val Ala Gln Gly Phe
260 265 270
Gly Gln Gln Glu Val Ser Ala Leu Ile Lys Val Leu Arg Ala Arg Asn
275 280 285
Gly Ala Ala Gln
290
<210> 7
<211> 276
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
Met Gly Thr Ala Leu Val Glu Ala Phe Leu Ala Gly Gly His Ala Thr
1 5 10 15
Thr Val Trp Asn Arg Thr Pro Gly Lys Ala Asp Gly Val Val Ala Arg
20 25 30
Gly Ala Val Val Ala Glu Thr Val Ala Glu Ala Val Ala Ala Ser Pro
35 40 45
Leu Val Val Val Cys Leu Trp Asp Asp Ala Val Val Arg Asp Val Leu
50 55 60
His Pro Val Ala Asp Ala Leu Ala Gly Arg Val Val Val Asn Leu Thr
65 70 75 80
Asn Gly Thr Pro Ala Gln Ala Arg Glu Met Ala Ala Trp Ala Ala Glu
85 90 95
His Gly Val Glu Tyr Val Asp Gly Gly Ile Met Ala Ile Pro Pro Gly
100 105 110
Ile Gly Thr Glu His Ala Phe Val Leu Tyr Ser Gly Ala Glu Ala Ala
115 120 125
Phe Glu Ala His Arg Glu Val Leu Glu Arg Leu Gly Ala Ala Lys Tyr
130 135 140
Leu Gly Ala Asp Ala Gly Leu Ala Ala Leu Phe Asp Leu Ala Leu Leu
145 150 155 160
Ser Gly Met Tyr Gly Thr Phe Ala Gly Leu Trp His Ser Leu Ala Met
165 170 175
Val Arg Thr Glu Asn Val Ser Ala Ala Glu Phe Val Pro Met Leu Gly
180 185 190
Pro Trp Met Gln Ala Met Ile Gly Gly Asn Leu Asp Arg Leu Ala His
195 200 205
Gln Leu Asp Thr Gly Asp Tyr Gly His Glu Val Val Ser Asn Leu Ala
210 215 220
Met Gln Ala Ala Ala Phe Pro Asn Ile Val Gln Ala Ser Leu Asp Gln
225 230 235 240
Gly Ile Arg Pro Asp Leu Met Ala Pro Ile Gln Arg Leu Met Asp Gln
245 250 255
Ala Val Ala Ala Gly His Gly Ala Glu Asp Val Ala Val Val Val Asp
260 265 270
Leu Leu Lys Asn
275
<210> 8
<211> 291
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 8
Met Lys Pro Thr Leu Thr Val Ile Gly Ala Gly Arg Met Gly Ser Ala
1 5 10 15
Leu Ile Lys Ala Phe Leu Gln Ser Gly Tyr Thr Thr Thr Val Trp Asn
20 25 30
Arg Thr Lys Ala Lys Ser Glu Pro Leu Ala Lys Leu Gly Ala His Leu
35 40 45
Ala Asp Thr Val Arg Asp Ala Val Lys Arg Ser Asp Ile Ile Val Val
50 55 60
Asn Val Leu Asp Tyr Asp Thr Ser Asp Gln Leu Leu Arg Gln Asp Glu
65 70 75 80
Val Thr Arg Glu Leu Arg Gly Lys Leu Leu Val Gln Leu Thr Ser Gly
85 90 95
Ser Pro Ala Leu Ala Arg Glu Gln Glu Thr Trp Ala Arg Gln His Gly
100 105 110
Ile Asp Tyr Leu Asp Gly Ala Ile Met Ala Thr Pro Asp Phe Ile Gly
115 120 125
Gln Ala Glu Cys Ala Leu Leu Tyr Ser Gly Ser Ala Ala Leu Phe Glu
130 135 140
Lys His Arg Ala Val Leu Asn Val Leu Gly Gly Ala Thr Ser His Val
145 150 155 160
Gly Glu Asp Val Gly His Ala Ser Ala Leu Asp Ser Ala Leu Leu Phe
165 170 175
Gln Met Trp Gly Thr Leu Phe Gly Thr Leu Gln Ala Leu Ala Ile Ser
180 185 190
Arg Ala Glu Gly Ile Pro Leu Glu Lys Thr Thr Ala Phe Ile Lys Leu
195 200 205
Thr Glu Pro Val Thr Gln Gly Ala Val Ala Asp Val Leu Thr Arg Val
210 215 220
Gln Gln Asn Arg Leu Thr Ala Asp Ala Gln Thr Leu Ala Ser Leu Glu
225 230 235 240
Ala His Asn Val Ala Phe Gln His Leu Leu Ala Leu Cys Glu Glu Arg
245 250 255
Asn Ile His Arg Gly Val Ala Asp Ala Met Tyr Ser Val Ile Arg Glu
260 265 270
Ala Val Lys Ala Gly His Gly Lys Asp Asp Phe Ala Ile Leu Thr Arg
275 280 285
Phe Leu Lys
290
<210> 9
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 9
Met Val Ser Ser Pro Tyr Leu Asn Val Thr Ala Tyr Pro Lys Val Arg
1 5 10 15
Asn Leu Pro Trp Pro Val Pro Gly Pro Ile Arg Val Ala Ser Gln Ile
20 25 30
Leu Glu Leu Arg Pro Met Thr Thr Ile Gly Phe Leu Gly Ala Gly Arg
35 40 45
Met Gly Ser Ala Leu Val Lys Ser Leu Leu Glu Ala Gly His Ser Val
50 55 60
His Val Trp Asn Arg Thr Ala Glu Lys Ala Gln Ala Leu Ala Asp Phe
65 70 75 80
Gly Ala Val Pro Glu Pro Ser Ala Glu Arg Ala Ala Gly Pro Ala Glu
85 90 95
Ile Val Ile Val Asn Leu Leu Asp Tyr Glu Ala Ser Asp Ala Glu Leu
100 105 110
Arg Lys Pro Asp Val Ala Glu Ala Leu Lys Gly Lys Leu Leu Val Gln
115 120 125
Leu Thr Ser Gly Ser Pro Lys Thr Ala Arg Glu Thr Gly Arg Trp Ala
130 135 140
Gly Asp His Gly Ile Ala Tyr Leu Asp Gly Ala Ile Met Ala Thr Pro
145 150 155 160
Asn Phe Ile Gly Gly Ala Glu Thr Val Ile Leu Tyr Ser Gly Ser Lys
165 170 175
Thr His Phe Glu Lys His Glu Gly Leu Phe Lys Ala Leu Gly Gly Lys
180 185 190
Ser Ala Phe Val Gly Glu Asp Phe Gly Thr Ala Ser Ala Leu Asp Ser
195 200 205
Ala Leu Leu Ser Gln Met Trp Gly Thr Leu Phe Gly Thr Leu Gln Ala
210 215 220
Leu Ala Val Cys Arg Ala Glu Gly Ile Glu His Asp Val Tyr Ala Gly
225 230 235 240
Phe Leu Met Ser Ala Gln Pro Met Ile Asp Gly Ala Gln Gln Asp Leu
245 250 255
Met Glu Arg Ile Arg Asp Gly Arg Asp Leu Ala Asp Ala Gln Thr Leu
260 265 270
Ala Thr Val Ala Val His Asn Val Ala Phe His His Leu Arg Asp Leu
275 280 285
Ile Ala Asp Arg Asp Leu Asn Pro Ala Phe Gly Asp Ala Leu Gly Ser
290 295 300
Leu Leu Glu Thr Ala Leu Arg Asn Asp His Gln Asp Asp Asp Phe Ala
305 310 315 320
Val Leu Ala Arg Phe Met Gly Ala Lys
325
<210> 10
<211> 293
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 10
Met Thr Asp Leu Gly Lys Ser Ala Val Thr Val Leu Gly Leu Gly Ala
1 5 10 15
Met Gly Thr Ala Leu Ala Glu Ala Leu Leu Ala Ala Gly His Pro Thr
20 25 30
Thr Val Trp Asn Arg Ser Pro Ala Arg Thr Ala Gly Pro Ala Gln Arg
35 40 45
Gly Ala Ala Val Ala Ala Ala Thr Ala Glu Ala Ile Ala Ala Ser Arg
50 55 60
Leu Ile Val Val Cys Leu Leu Asp His Thr Ser Val His Ala Val Leu
65 70 75 80
Asp Gly Gln Glu Leu Thr Gly Arg Ile Val Val Asn Leu Thr Ser Gly
85 90 95
Thr Pro Gly Gln Ala Arg Glu Leu Asp Ala Arg Val Ala Glu Arg Gly
100 105 110
Gly Asp His Leu Asp Gly Ala Val Leu Ala Val Pro Ser Met Ile Gly
115 120 125
Thr Pro Asp Ala Ser Val Leu Tyr Ser Gly Ser Arg Gly Ala Phe Asp
130 135 140
Thr His Arg Pro Val Leu Glu Val Phe Gly Ala Ala Asp Tyr Val Gly
145 150 155 160
Ala Asp Pro Gly Ala Ala Ser Leu Gln Asp Ala Ala Leu Leu Ser Ala
165 170 175
Met Tyr Gly Gln Val Ala Gly Val Leu His Ala Phe Ala Leu Val Arg
180 185 190
Ser Ala Gly Val Thr Ala Thr Glu Phe Leu Pro Arg Leu Val Gly Trp
195 200 205
Leu Thr Ala Met Gly Gly Phe Pro Ala Asp Ala Ala Arg Arg Ile Asp
210 215 220
Ala Arg Ala Tyr Ala Asp Asp Val Asp Ala Ala Leu Thr Met Gln Val
225 230 235 240
Thr Ala Val Arg Asn Leu Val Arg Ala Ala Arg Glu Gln Gly Val Ser
245 250 255
Ala Glu Leu Ile Ala Pro Leu Val Pro Val Met Gln Arg Arg Ile Asp
260 265 270
Asp Gly Asp Gly Gly Asp Asp Leu Ala Ala Leu Val Glu Val Ile Thr
275 280 285
Ala Glu Glu Val Ala
290
<210> 11
<211> 290
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 11
Met Thr Asp Lys Pro Pro Val Thr Val Leu Gly Leu Gly Ala Met Gly
1 5 10 15
Thr Ala Leu Ala Arg Thr Leu Leu Asn Ala Gly Tyr Pro Thr Thr Val
20 25 30
Trp Asn Arg Thr Ala Ser Lys Thr Ala Pro Leu Thr Glu Leu Gly Ala
35 40 45
His Ala Ala Asp Ser Pro Ala Asp Ala Ile Ala Arg Gly Glu Leu Val
50 55 60
Leu Ala Cys Leu Leu Asp Tyr Asp Ser Val His Gln Thr Leu Ala Gly
65 70 75 80
Thr Gly Asp Ala Leu Arg Gly Lys Ala Phe Val Asn Leu Thr Asn Gly
85 90 95
Thr Pro Glu Gln Ala Arg Ala Leu Ala Gly Lys Leu Asp Thr Ala Tyr
100 105 110
Leu Asp Gly Gly Ile Met Ala Val Pro Pro Met Ile Gly Ser Pro Gly
115 120 125
Ala Phe Leu Phe Tyr Ser Gly Glu Ile Ala Val Phe Glu Gln Tyr Arg
130 135 140
Pro Val Leu Glu Ser Phe Gly Glu Ala Ile Glu Val Gly Thr Asp Pro
145 150 155 160
Gly Leu Ala Ala Leu His Asp Leu Ala Leu Leu Ser Ala Met Tyr Gly
165 170 175
Met Phe Gly Gly Val Leu Gln Ala Phe Ala Leu Thr Gly Ser Ala Gly
180 185 190
Val Ser Ala Ala Ser Leu Ala Pro Leu Leu His Arg Trp Leu Asp Gly
195 200 205
Met Ser Gly Phe Ile Ala Gln Ser Ala Ala Gln Leu Asp Ser Gly Asp
210 215 220
Phe Ala Thr Gly Val Val Ser Asn Leu Ala Met Gln Asp Thr Gly Phe
225 230 235 240
Ala Asn Leu Phe Arg Ala Ala Lys Glu Gln Gly Ile Ser Thr Gly Gln
245 250 255
Leu Glu Pro Leu Gly Ala Leu Ile Arg Arg Arg Val Glu Asp Gly His
260 265 270
Gly Ala Glu Asp Leu Ala Gly Ile Val Glu Tyr Leu Lys Ile Gly Ala
275 280 285
Asn Ala
290
<210> 12
<211> 292
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 12
Met Arg His Leu Ser Val Ile Gly Leu Gly Ala Met Gly Ser Ala Leu
1 5 10 15
Ala Thr Thr Leu Leu Lys Ala Gly His Pro Val Thr Val Trp Asn Arg
20 25 30
Ser Ala Ala Lys Ala Ala Pro Leu Gln Ala Leu Gly Ala Thr Leu Ala
35 40 45
Pro Ser Val Gly Ala Ala Ile Ala Ala Ser Asp Ile Thr Leu Val Cys
50 55 60
Val Asp Asn Tyr Ala Val Ser Gln Leu Leu Leu Asp Glu Ala Ser Asp
65 70 75 80
Ala Val Ala Gly Lys Leu Leu Val Gln Leu Ser Thr Gly Ser Pro Gln
85 90 95
Gly Ala Arg Ala Leu Glu Ser Trp Ser His Ala Arg Gly Ala Arg Tyr
100 105 110
Leu Asp Gly Ala Ile Leu Cys Phe Pro Ala Gln Ile Gly Thr Ser Asp
115 120 125
Ala Ser Ile Ile Cys Ser Gly Ala Ser Ala Ala Phe Ser Glu Ala Glu
130 135 140
Pro Val Leu Ser Leu Leu Ala Pro Thr Leu Asp His Val Ala Glu Ala
145 150 155 160
Val Gly Ala Ala Ala Ala Gln Asp Cys Ala Val Ala Ala Tyr Phe Ala
165 170 175
Gly Gly Leu Leu Gly Ala Leu His Gly Ala Leu Ile Cys Glu Ala Glu
180 185 190
Gly Leu Pro Val Ala Lys Val Cys Ala Gln Phe Ser Glu Leu Ser Pro
195 200 205
Ile Leu Gly Gly Asp Val Ala His Leu Gly Lys Thr Leu Ala Ser Gly
210 215 220
Asp Phe Asp His Pro Tyr Ala Ser Leu Lys Thr Trp Ser Ala Ala Ile
225 230 235 240
Ser Arg Leu Ala Gly His Ala Thr Asp Ala Gly Ile Asp Ser Arg Phe
245 250 255
Pro Arg Phe Ala Ala Asp Leu Phe Glu Glu Gly Val Ala Gln Gly Phe
260 265 270
Gly Gln Gln Glu Val Ser Ala Leu Ile Lys Val Leu Arg Ala Arg Asn
275 280 285
Gly Ala Ala Gln
290
<210> 13
<211> 292
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 13
Met Arg His Leu Ser Val Ile Gly Leu Gly Ala Met Gly Ser Ala Leu
1 5 10 15
Ala Thr Thr Leu Leu Lys Ala Gly His Pro Val Thr Val Trp Asn Arg
20 25 30
Ser Ala Ala Lys Ala Ala Pro Leu Gln Ala Leu Gly Ala Thr Leu Ala
35 40 45
Pro Ser Val Gly Ala Ala Ile Ala Ala Ser Asp Ile Thr Leu Val Cys
50 55 60
Val Asp Asn Tyr Ala Val Ser Gln Val Leu Leu Asp Glu Ala Ser Asp
65 70 75 80
Ala Val Ala Gly Lys Leu Leu Val Gln Leu Ser Thr Gly Ser Pro Gln
85 90 95
Gly Ala Arg Ala Leu Glu Ser Trp Ser His Ala Arg Gly Ala Arg Tyr
100 105 110
Leu Asp Gly Ala Ile Leu Cys Phe Pro Ala Gln Ile Gly Thr Ser Asp
115 120 125
Ala Ser Ile Ile Cys Ser Gly Ala Ser Ala Ala Phe Ser Glu Ala Glu
130 135 140
Pro Val Leu Ser Leu Leu Ala Pro Thr Leu Asp His Val Ala Glu Ala
145 150 155 160
Val Gly Ala Ala Ala Ala Gln Asp Cys Ala Ala Ala Ala Tyr Phe Ala
165 170 175
Gly Gly Leu Leu Gly Ala Leu His Gly Ala Leu Ile Cys Glu Ala Glu
180 185 190
Gly Leu Pro Val Ala Lys Val Cys Ala Gln Phe Ser Glu Leu Ser Pro
195 200 205
Ile Leu Gly Gly Asp Val Ala His Leu Gly Lys Thr Leu Ala Ser Gly
210 215 220
Asp Phe Asp His Pro Tyr Ala Ser Leu Lys Thr Trp Ser Ala Ala Ile
225 230 235 240
Ser Arg Leu Ala Gly His Ala Thr Asp Ala Gly Ile Asp Ser Arg Phe
245 250 255
Pro Arg Phe Ala Ala Asp Leu Phe Glu Glu Gly Val Ala Gln Gly Phe
260 265 270
Gly Gln Gln Glu Val Ser Ala Leu Ile Lys Val Leu Arg Ala Arg Asn
275 280 285
Gly Ala Ala Gln
290
<210> 14
<211> 292
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 14
Met Arg His Leu Ser Val Ile Gly Leu Gly Ala Met Gly Ser Ala Leu
1 5 10 15
Ala Thr Thr Leu Leu Lys Ala Gly His Pro Val Thr Val Trp Asn Arg
20 25 30
Ser Ala Ala Lys Ala Ala Pro Leu Gln Ala Leu Gly Ala Thr Leu Ala
35 40 45
Pro Ser Val Gly Ala Ala Ile Ala Ala Ser Asp Ile Thr Leu Val Cys
50 55 60
Val Asp Asn Tyr Ala Val Ser Gln Gln Leu Leu Asp Glu Ala Ser Asp
65 70 75 80
Ala Val Ala Gly Lys Leu Leu Val Gln Leu Ser Thr Gly Ser Pro Gln
85 90 95
Gly Ala Arg Ala Leu Glu Ser Trp Ser His Ala Arg Gly Ala Arg Tyr
100 105 110
Leu Asp Gly Ala Ile Leu Cys Phe Pro Ala Gln Ile Gly Thr Ser Asp
115 120 125
Ala Ser Ile Ile Cys Ser Gly Ala Ser Ala Ala Phe Ser Glu Ala Glu
130 135 140
Pro Val Leu Arg Leu Leu Ala Pro Thr Leu Asp His Val Ala Glu Ala
145 150 155 160
Val Gly Ala Ala Ala Ala Gln Asp Cys Ala Val Ala Ala Tyr Phe Ala
165 170 175
Gly Gly Leu Leu Gly Ala Leu His Gly Ala Leu Ile Cys Glu Ala Glu
180 185 190
Gly Leu Pro Val Ala Lys Val Cys Ala Gln Phe Ser Glu Leu Ser Pro
195 200 205
Ile Leu Gly Gly Asp Val Ala His Leu Gly Lys Thr Leu Ala Ser Gly
210 215 220
Asp Phe Asp His Pro Tyr Ala Ser Leu Lys Thr Trp Ser Ala Ala Ile
225 230 235 240
Ser Arg Leu Ala Gly His Ala Thr Asp Ala Gly Ile Asp Ser Arg Phe
245 250 255
Pro Arg Phe Ala Ala Asp Leu Phe Glu Glu Gly Val Ala Gln Gly Phe
260 265 270
Gly Gln Gln Glu Val Ser Ala Leu Ile Lys Val Leu Arg Ala Arg Asn
275 280 285
Gly Ala Ala Gln
290
<210> 15
<211> 292
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 15
Met Arg His Leu Ser Val Ile Gly Leu Gly Ala Met Gly Ser Ala Leu
1 5 10 15
Ala Thr Thr Leu Leu Lys Ala Gly His Pro Val Thr Val Trp Asn Arg
20 25 30
Ser Ala Ala Lys Ala Ala Pro Leu Gln Ala Leu Gly Ala Thr Leu Ala
35 40 45
Pro Ser Val Gly Ala Ala Ile Ala Ala Ser Asp Ile Thr Leu Val Cys
50 55 60
Val Asp Asn Tyr Ala Val Ser Gln Gln Leu Leu Asp Glu Ala Ser Asp
65 70 75 80
Ala Val Ala Gly Lys Leu Leu Val Gln Leu Ser Thr Gly Ser Pro Gln
85 90 95
Gly Ala Arg Ala Leu Glu Ser Trp Ser His Ala Arg Gly Ala Arg Tyr
100 105 110
Leu Asp Gly Ala Ile Leu Cys Phe Pro Ala Gln Ile Gly Thr Ser Asp
115 120 125
Ala Ser Ile Ile Cys Ser Gly Ala Ser Ala Ala Phe Ser Glu Ala Glu
130 135 140
Pro Val Leu Arg Leu Leu Ala Pro Thr Leu Asp His Val Ala Glu Ala
145 150 155 160
Val Gly Ala Ala Ala Ala Gln Asp Cys Ala Val Ala Ala Tyr Phe Ala
165 170 175
Gly Gly Leu Leu Gly Ala Leu His Gly Ala Leu Ile Cys Glu Ala Glu
180 185 190
Gly Leu Pro Val Ala Lys Val Cys Ala Gln Phe Ser Glu Leu Ser Pro
195 200 205
Ile Leu Gly Gly Asp Val Ala His Leu Gly Lys Thr Leu Ala Ser Gly
210 215 220
Asp Phe Asp His Pro Gly Ala Ser Leu Lys Thr Trp Ser Ala Ala Ile
225 230 235 240
Ser Arg Leu Ala Gly His Ala Thr Asp Ala Gly Ile Asp Ser Arg Phe
245 250 255
Pro Arg Phe Ala Ala Asp Leu Phe Glu Glu Gly Val Ala Gln Gly Phe
260 265 270
Gly Gln Gln Glu Val Ser Ala Leu Ile Lys Val Leu Arg Ala Arg Asn
275 280 285
Gly Ala Ala Gln
290
<210> 16
<211> 292
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 16
Met Arg His Leu Ser Val Ile Gly Leu Gly Ala Met Gly Ser Ala Leu
1 5 10 15
Ala Thr Thr Leu Leu Lys Ala Gly His Pro Val Thr Val Trp Asn Arg
20 25 30
Ser Ala Ala Lys Ala Ala Pro Leu Gln Ala Leu Gly Ala Thr Leu Ala
35 40 45
Pro Ser Val Gly Ala Ala Ile Ala Arg Ser Asp Ile Thr Leu Val Cys
50 55 60
Val Asp Asn Tyr Ala Val Ser Gln Leu Leu Leu Asp Glu Ala Ser Asp
65 70 75 80
Ala Val Ala Gly Lys Leu Leu Val Gln Leu Ser Thr Gly Ser Pro Gln
85 90 95
Gly Ala Arg Ala Leu Glu Ser Trp Ser His Ala Arg Gly Ala Arg Tyr
100 105 110
Leu Asp Gly Ala Ile Leu Cys Phe Pro Ala Gln Ile Gly Thr Ser Asp
115 120 125
Ala Ser Ile Ile Cys Ser Gly Ala Ser Ala Ala Phe Ser Glu Ala Glu
130 135 140
Pro Val Leu Ser Leu Leu Ala Pro Thr Leu Asp His Val Ala Glu Ala
145 150 155 160
Val Gly Ala Ala Ala Ala Gln Asp Cys Ala Ala Val Ala Tyr Phe Gly
165 170 175
Gly Gly Leu Leu Gly Ala Leu His Gly Ala Leu Ile Cys Glu Ala Glu
180 185 190
Gly Leu Pro Val Ala Lys Val Cys Ala Gln Phe Ser Glu Leu Ser Pro
195 200 205
Ile Leu Gly Gly Asp Val Ala His Leu Gly Lys Thr Leu Ala Ser Gly
210 215 220
Asp Phe Asp His Pro Thr Ala Ser Leu Lys Thr Trp Ser Ala Ala Ile
225 230 235 240
Gly Arg Leu Ala Gly His Ala Thr Asp Ala Gly Ile Asp Ser Arg Phe
245 250 255
Pro Arg Phe Ala Ala Asp Leu Phe Glu Glu Gly Val Ala Gln Gly Phe
260 265 270
Gly Gln Gln Glu Val Ser Ala Leu Ile Lys Val Leu Arg Ala Arg Asn
275 280 285
Gly Ala Ala Gln
290
<210> 17
<211> 292
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 17
Met Arg His Leu Ser Val Ile Gly Leu Gly Ala Met Gly Ser Ala Leu
1 5 10 15
Ala Thr Thr Leu Leu Lys Ala Gly His Pro Val Thr Val Trp Asn Arg
20 25 30
Ser Ala Ala Lys Ala Ala Pro Leu Gln Ala Leu Gly Ala Thr Leu Ala
35 40 45
Pro Ser Val Gly Ala Ala Ile Ala Arg Ser Asp Ile Thr Leu Val Cys
50 55 60
Val Asp Asn Tyr Ala Val Ser Gln Leu Leu Leu Asp Glu Ala Ser Asp
65 70 75 80
Ala Val Ala Gly Lys Leu Leu Val Gln Leu Ser Thr Gly Ser Pro Gln
85 90 95
Gly Ala Arg Ala Leu Glu Ser Trp Ser His Ala Arg Gly Ala Arg Tyr
100 105 110
Leu Asp Gly Ala Ile Leu Cys Phe Pro Ala Gln Ile Gly Thr Ser Asp
115 120 125
Ala Ser Ile Ile Cys Ser Gly Ala Ser Ala Ala Phe Ser Glu Ala Glu
130 135 140
Pro Val Leu Ser Leu Leu Ala Pro Thr Leu Asp His Val Ala Glu Ala
145 150 155 160
Val Gly Ala Ala Ala Ala Gln Asp Cys Ala Ala Val Ala Tyr Phe Gly
165 170 175
Gly Gly Leu Leu Gly Ala Leu His Gly Ala Leu Ile Cys Glu Ala Glu
180 185 190
Gly Leu Pro Val Ala Lys Val Cys Ala Gln Phe Ser Glu Leu Ser Pro
195 200 205
Ile Leu Gly Gly Asp Val Ala His Leu Gly Lys Thr Leu Ala Ser Gly
210 215 220
Asp Phe Asp His Pro Tyr Ala Ser Leu Lys Thr Trp Ser Ala Ala Ile
225 230 235 240
Gly Arg Leu Ala Gly His Ala Thr Asp Ala Gly Ile Asp Ser Arg Phe
245 250 255
Pro Arg Phe Ala Ala Asp Leu Phe Glu Glu Gly Val Ala Gln Gly Phe
260 265 270
Gly Gln Gln Glu Val Ser Ala Leu Ile Lys Val Leu Arg Ala Arg Asn
275 280 285
Gly Ala Ala Gln
290
<210> 18
<211> 292
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 18
Met Arg His Leu Ser Val Ile Gly Leu Gly Ala Met Gly Ser Ala Leu
1 5 10 15
Ala Thr Thr Leu Leu Lys Ala Gly His Pro Val Thr Val Trp Asn Arg
20 25 30
Ser Ala Ala Lys Ala Ala Pro Leu Gln Ala Leu Gly Ala Thr Leu Ala
35 40 45
Pro Ser Val Gly Ala Ala Ile Ala Arg Ser Asp Ile Thr Leu Val Cys
50 55 60
Val Asp Asn Tyr Ala Val Ser Gln Leu Leu Leu Asp Glu Ala Ser Asp
65 70 75 80
Ala Val Ala Gly Lys Leu Leu Val Gln Leu Ser Thr Gly Ser Pro Gln
85 90 95
Gly Ala Arg Ala Leu Glu Ser Trp Ser His Ala Arg Gly Ala Arg Tyr
100 105 110
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115 120 125
Ala Ser Ile Ile Cys Ser Gly Ala Ser Ala Ala Phe Ser Glu Ala Glu
130 135 140
Pro Val Leu Ser Leu Leu Ala Pro Thr Leu Asp His Val Ala Glu Ala
145 150 155 160
Val Gly Ala Ala Ala Ala Gln Asp Cys Ala Ala Ala Ala Tyr Phe Gly
165 170 175
Gly Gly Leu Leu Gly Ala Leu His Gly Ala Leu Ile Cys Glu Ala Glu
180 185 190
Gly Leu Pro Val Ala Lys Val Cys Ala Gln Phe Ser Glu Leu Ser Pro
195 200 205
Ile Leu Gly Gly Asp Val Ala His Leu Gly Lys Thr Leu Ala Ser Gly
210 215 220
Asp Phe Asp His Pro Tyr Ala Ser Leu Lys Thr Trp Ser Ala Ala Ile
225 230 235 240
Gly Arg Leu Ala Gly His Ala Thr Asp Ala Gly Ile Asp Ser Arg Phe
245 250 255
Pro Arg Phe Ala Ala Asp Leu Phe Glu Glu Gly Val Ala Gln Gly Phe
260 265 270
Gly Gln Gln Glu Val Ser Ala Leu Ile Lys Val Leu Arg Ala Arg Asn
275 280 285
Gly Ala Ala Gln
290
<210> 19
<211> 292
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 19
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1 5 10 15
Ala Thr Thr Leu Leu Lys Ala Gly His Pro Val Thr Val Trp Asn Arg
20 25 30
Ser Ala Ala Lys Ala Ala Pro Leu Gln Ala Leu Gly Ala Thr Leu Ala
35 40 45
Pro Ser Val Gly Ala Ala Ile Ala Arg Ser Asp Ile Thr Leu Val Cys
50 55 60
Val Asp Asn Tyr Ala Val Ser Gln Leu Leu Leu Asp Glu Ala Ser Asp
65 70 75 80
Ala Val Ala Gly Lys Leu Leu Val Gln Leu Ser Thr Gly Ser Pro Gln
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
Ala Ser Ile Ile Cys Ser Gly Ala Ser Ala Ala Phe Ser Glu Ala Glu
130 135 140
Pro Val Leu Ser Leu Leu Ala Pro Thr Leu Asp His Val Ala Glu Ala
145 150 155 160
Val Gly Ala Ala Ala Ala Gln Asp Cys Ala Val Val Ala Tyr Phe Gly
165 170 175
Gly Gly Leu Leu Gly Ala Leu His Gly Ala Leu Ile Cys Glu Ala Glu
180 185 190
Gly Leu Pro Val Ala Lys Val Cys Ala Gln Phe Ser Glu Leu Ser Pro
195 200 205
Ile Leu Gly Gly Asp Val Ala His Leu Gly Lys Thr Leu Ala Ser Gly
210 215 220
Asp Phe Asp His Pro Tyr Ala Ser Leu Lys Thr Trp Ser Ala Ala Ile
225 230 235 240
Gly Arg Leu Ala Gly His Ala Thr Asp Ala Gly Ile Asp Ser Arg Phe
245 250 255
Pro Arg Phe Ala Ala Asp Leu Phe Glu Glu Gly Val Ala Gln Gly Phe
260 265 270
Gly Gln Gln Glu Val Ser Ala Leu Ile Lys Val Leu Arg Ala Arg Asn
275 280 285
Gly Ala Ala Gln
290
<210> 20
<211> 292
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 20
Met Arg His Leu Ser Val Ile Gly Leu Gly Ala Met Gly Ser Ala Leu
1 5 10 15
Ala Thr Thr Leu Leu Lys Ala Gly His Pro Val Thr Val Trp Asn Arg
20 25 30
Ser Ala Ala Lys Ala Ala Pro Leu Gln Ala Leu Gly Ala Thr Leu Ala
35 40 45
Pro Ser Val Gly Ala Ala Ile Ala Arg Ser Asp Ile Thr Leu Val Cys
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Val Asp Asn Tyr Ala Val Ser Gln Gln Leu Leu Asp Glu Ala Ser Asp
65 70 75 80
Ala Val Ala Gly Lys Leu Leu Val Gln Leu Ser Thr Gly Ser Pro Gln
85 90 95
Gly Ala Arg Ala Leu Glu Ser Trp Ser His Ala Arg Gly Ala Arg Tyr
100 105 110
Leu Asp Gly Ala Ile Leu Cys Phe Pro Ala Gln Ile Gly Thr Ser Asp
115 120 125
Ala Ser Ile Ile Cys Ser Gly Ala Ser Ala Ala Phe Ser Glu Ala Glu
130 135 140
Pro Val Leu Arg Leu Leu Ala Pro Thr Leu Asp His Val Ala Glu Ala
145 150 155 160
Val Gly Ala Ala Ala Ala Gln Asp Cys Ala Val Ala Ala Tyr Phe Gly
165 170 175
Gly Gly Leu Leu Gly Ala Leu His Gly Ala Leu Ile Cys Glu Ala Glu
180 185 190
Gly Leu Pro Val Ala Lys Val Cys Ala Gln Phe Ser Glu Leu Ser Pro
195 200 205
Ile Leu Gly Gly Asp Val Ala His Leu Gly Lys Thr Leu Ala Ser Gly
210 215 220
Asp Phe Asp His Pro Tyr Ala Ser Leu Lys Thr Trp Ser Ala Ala Ile
225 230 235 240
Ser Arg Leu Ala Gly His Ala Thr Asp Ala Gly Ile Asp Ser Arg Phe
245 250 255
Pro Arg Phe Ala Ala Asp Leu Phe Glu Glu Gly Val Ala Gln Gly Phe
260 265 270
Gly Gln Gln Glu Val Ser Ala Leu Ile Lys Val Leu Arg Ala Arg Asn
275 280 285
Gly Ala Ala Gln
290
<210> 21
<211> 292
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 21
Met Arg His Leu Ser Val Ile Gly Leu Gly Ala Met Gly Ser Ala Leu
1 5 10 15
Ala Thr Thr Leu Leu Lys Ala Gly His Pro Val Thr Val Trp Asn Arg
20 25 30
Ser Ala Ala Lys Ala Ala Pro Leu Gln Ala Leu Gly Ala Thr Leu Ala
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Pro Ser Val Gly Ala Ala Ile Ala Arg Ser Asp Ile Thr Leu Val Cys
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Val Asp Asn Tyr Ala Val Ser Gln Gln Leu Leu Asp Glu Ala Ser Asp
65 70 75 80
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Gly Ala Arg Ala Leu Glu Ser Trp Ser His Ala Arg Gly Ala Arg Tyr
100 105 110
Leu Asp Gly Ala Ile Leu Cys Phe Pro Ala Gln Ile Gly Thr Ser Asp
115 120 125
Ala Ser Ile Ile Cys Ser Gly Ala Ser Ala Ala Phe Ser Glu Ala Glu
130 135 140
Pro Val Leu Arg Leu Leu Ala Pro Thr Leu Asp His Val Ala Glu Ala
145 150 155 160
Val Gly Ala Ala Ala Ala Gln Asp Cys Ala Val Ala Ala Tyr Phe Gly
165 170 175
Gly Gly Leu Leu Gly Ala Leu His Gly Ala Leu Ile Cys Glu Ala Glu
180 185 190
Gly Leu Pro Val Ala Lys Val Cys Ala Gln Phe Ser Glu Leu Ser Pro
195 200 205
Ile Leu Gly Gly Asp Val Ala His Leu Gly Lys Thr Leu Ala Ser Gly
210 215 220
Asp Phe Asp His Pro Tyr Ala Ser Leu Lys Thr Trp Ser Ala Ala Ile
225 230 235 240
Ala Arg Leu Ala Gly His Ala Thr Asp Ala Gly Ile Asp Ser Arg Phe
245 250 255
Pro Arg Phe Ala Ala Asp Leu Phe Glu Glu Gly Val Ala Gln Gly Phe
260 265 270
Gly Gln Gln Glu Val Ser Ala Leu Ile Lys Val Leu Arg Ala Arg Asn
275 280 285
Gly Ala Ala Gln
290
<210> 22
<211> 292
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 22
Met Arg His Leu Ser Val Ile Gly Leu Gly Ala Met Gly Ser Ala Leu
1 5 10 15
Ala Thr Thr Leu Leu Lys Ala Gly His Pro Val Thr Val Trp Asn Arg
20 25 30
Ser Ala Ala Lys Ala Ala Pro Leu Gln Ala Leu Gly Ala Thr Leu Ala
35 40 45
Pro Ser Val Gly Ala Ala Ile Ala Arg Ser Asp Ile Thr Leu Val Cys
50 55 60
Val Asp Asn Tyr Ala Val Ser Gln Gln Leu Leu Asp Glu Ala Ser Asp
65 70 75 80
Ala Val Ala Gly Lys Leu Leu Val Gln Leu Ser Thr Gly Ser Pro Gln
85 90 95
Gly Ala Arg Ala Leu Glu Ser Trp Ser His Ala Arg Gly Ala Arg Tyr
100 105 110
Leu Asp Gly Ala Ile Leu Cys Phe Pro Ala Gln Ile Gly Thr Ser Asp
115 120 125
Ala Ser Ile Ile Cys Ser Gly Ala Ser Ala Ala Phe Ser Glu Ala Glu
130 135 140
Pro Val Leu Arg Leu Leu Ala Pro Thr Leu Asp His Val Ala Glu Ala
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Val Gly Ala Ala Ala Ala Gln Asp Cys Ala Val Ala Ala Tyr Phe Gly
165 170 175
Gly Gly Leu Leu Gly Ala Leu His Gly Ala Leu Ile Cys Glu Ala Glu
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Gly Leu Pro Val Ala Lys Val Cys Ala Gln Phe Ser Glu Leu Ser Pro
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Ile Leu Gly Gly Asp Val Ala His Leu Gly Lys Thr Leu Ala Ser Gly
210 215 220
Asp Phe Asp His Pro Thr Ala Ser Leu Lys Thr Trp Ser Ala Ala Ile
225 230 235 240
Ser Arg Leu Ala Gly His Ala Thr Asp Ala Gly Ile Asp Ser Arg Phe
245 250 255
Pro Arg Phe Ala Ala Asp Leu Phe Glu Glu Gly Val Ala Gln Gly Phe
260 265 270
Gly Gln Gln Glu Val Ser Ala Leu Ile Lys Val Leu Arg Ala Arg Asn
275 280 285
Gly Ala Ala Gln
290

Claims (10)

1.一种利用还原方式制备(S)-尼古丁的方法，其特征在于，所述方法包括：
将式Ⅰ所示的烯胺化合物和/或式Ⅱ所示的亚胺正离子化合物进行还原反应，得到(S)-尼古丁：
Figure FDA0003660327820000011
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述还原反应采用生物酶催化方法，包括：
在辅酶循环系统的条件下，以亚胺还原酶为催化剂，催化还原式Ⅰ所示的烯胺化合物和/或式Ⅱ所示的亚胺正离子化合物，得到(S)-尼古丁。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述辅酶循环系统包括辅酶、葡萄糖和葡萄糖脱氢酶；
优选地，所述辅酶包括NADP盐和/或NAD盐，优选NADP盐；
优选地，所述葡萄糖脱氢酶包括SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；
优选地，所述亚胺还原酶包括SEQ ID No.2-6、SEQ ID No.8、SEQ ID No.11、SEQ IDNo.12、或具有与SEQ ID No.12至少95％同一性的氨基酸序列，优选SEQ ID No.2-4、SEQ IDNo.12、或具有与SEQ ID No.12至少95％同一性的氨基酸序列；
优选地，所述催化还原反应在15-45℃下进行；
优选地，所述催化还原反应在缓冲液体系中进行，所述缓冲液包括磷酸盐缓冲液、三羟甲基甲胺-盐酸缓冲液或三乙醇胺-盐酸缓冲液；
优选地，所述催化还原反应在pH＝6.0-8.0下进行。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述还原反应采用手性金属催化剂催化方法，包括：
在氢气气氛中，式Ⅰ所示的烯胺化合物和/或式Ⅱ所示的亚胺正离子化合物被手性金属催化剂催化还原为(S)-尼古丁。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述手性金属催化剂包括手性铱催化剂、手性钌催化剂或手性铑催化剂，优选手性铱催化剂；
优选地，在所述催化还原体系中还添加配体；
优选地，所述催化还原反应在50-100℃下进行；
优选地，所述催化还原反应体系中的氢气维持在1.0-6.0MPa；
优选地，所述催化还原反应在pH＝4.0-13.0下进行。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述式Ⅰ所示的烯胺化合物或式Ⅱ所示的亚胺正离子化合物是由式Ⅲ所示的化合物或其盐经过脱盐和/或环化得到的：
Figure FDA0003660327820000021
优选地，所述盐包括盐酸盐、二盐酸盐、氢溴酸盐、二氢溴酸盐、硫酸盐或硫酸氢盐。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，式Ⅲ所示化合物的盐的合成方法包括：
将化合物A与N-甲基吡咯烷酮、有机碱混合反应，得到化合物D；化合物D再与酸混合反应，得到式Ⅲ所示化合物的盐；其反应式如下所示。
Figure FDA0003660327820000031
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，式Ⅲ所示化合物的盐的合成方法包括：
将化合物A与N-甲基吡咯烷酮、有机碱混合反应后，加入酸中和至pH＝7-8，得到化合物B；化合物B再与酸混合反应，得到式Ⅲ所示化合物的盐；其反应式如下所示。
Figure FDA0003660327820000032
9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述化合物A的合成方法包括：将烟酸与甲醇混合，在强酸性环境中进行酯化反应，即得。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括：
将烟酸与甲醇混合，在强酸性环境中进行酯化反应，得到化合物A；化合物A与N-甲基吡咯烷酮、有机碱混合反应后，可选地加入酸进行中和，得到化合物B或D；然后再与酸混合反应，得到式Ⅲ所示化合物的盐；脱盐及发生环化，最后采用生物酶催化方法或手性金属催化剂催化方法进行还原反应，得到(S)-尼古丁；其反应式如下所示。
Figure FDA0003660327820000041
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