CN116555205A - 一种使用羰基还原酶及其突变体对羰基的不对称还原方法 - Google Patents
一种使用羰基还原酶及其突变体对羰基的不对称还原方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种使用羰基还原酶及其突变体对羰基的不对称还原方法。具体地,本发明公开了一种使用羰基还原酶及其突变体对羰基的不对称还原方法,其包括如下步骤:羰基还原酶或其突变体和辅酶的存在下,将化合物II在有机溶剂中进行不对称还原反应得到化合物I即可;所述羰基还原酶为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或其突变体。本发明的积极进步效果在于:以本申请中的羰基还原酶催化的羰基还原反应,选择性低、收率低、纯度低、利于工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于酶工程技术领域,特别涉及一种使用羰基还原酶及其突变体对羰基的不对称还原方法。
背景技术
化合物8-苄氧基-5-((R)-2-溴-1-羟乙基)-1H-喹啉酮(CAS:530084-79-8)及其类似物是临床上治疗哮喘药物茚达特罗的重要手性中间体。目前化学上的合成方法是用手性硼烷或化学手性催化剂-二甲硫醚等催化剂进行不对称还原得。硼烷毒性较高、二甲硫醚有恶臭气味,用于放大生产存在安全隐患。
用羰基还原酶(KRED)或醇脱氢酶(ADH)进行8-苄氧基-5-((R)-2-溴-1-羟乙基)-1H-喹啉酮的不对称还原,是一种合成对应手性醇的理想方法。然而现有商业化酶以及天然酶,均不能产生所需的该构型,或产生该构型的立体特异性的转化率非常低下。再者反应的底物8-苄氧基-5-(2-溴乙酰基)-2-羟基喹啉(CAS:100331-89-3)难溶于水,若使用有机溶剂助溶(如占反应总体积10~25%的DMSO二甲基亚砜或DMF二甲基甲酰胺等),则在水中溶解部分容易变质。只有在短时间内(如4h以内)将底物完全转化成稳定性相对较高的产物,才能保证收率。
目前主要有两篇专利报道了有关于羰基还原酶(KRED)或醇脱氢酶(ADH)合成茚达特罗中间体或结构类似物。
CN106701698B报道了一种Scheffersomyces stipitis CBS 6054(木糖发酵酵母)羰基还原酶,使用该酶及其突变体催化2-氯-2’,4’-二氟苯乙酮、2,2’,4’-三氯苯乙酮及其结构类似物(α-卤代酮)的不对称还原,在催化转化α卤代酮上尽管得到了相对与野生型羰基还原酶较高的酶活和手性选择性的突变体,扩大了CBS 6054羰基还原酶的使用范围。但该专利并未涉及α-卤代酮另一端大大位阻结构的生物催化研究,未见该专利涉及的突变体用于茚达特罗中间体的生物合成的报道。
CN110713991A报道了利用来源于Ralstonia sp.DSM 6428的羰基还原酶(RasADH)及其突变体实现茚达特罗中间体的绿色还原且光学纯度>99%,但专利所涉及的酶(或其突变体)存在以下不足:
1.CN110713991A专利中所涉及的化合物5-((R)-2-溴-1-羟乙基)-8-取代氧基-1H-喹啉酮或5-((R)-2-氯-1-羟乙基)-8-取代氧基-1H-喹啉酮的降解性质较强,本专利研究发现在溶剂状态下,例如即使在接近中性条件下,即pH=7.0±0.5的磷酸盐缓冲液(PBS)中,10h就会降解,产生多种、较高比例的杂质,如附图1所示。CN110713991A中显示突变体需要10~12h在PBS中可以实现完全转化必然伴随着底物的降解,(但CN110713991A专利没有提及该降解,也没有分析数据(如NMR)支撑其得到的产物纯度)因此需要比CN110713991A反应活性更高的突变体才能解决该降解问题。并且CN110713991A中在转化5mg的5-((R)-2-溴-1-羟乙基)-8-取代氧基-1H-喹啉酮或5-((R)-2-氯-1-羟乙基)-8-取代氧基-1H-喹啉酮时需要1L左右的发酵液(约为底物的500倍),也体现出其活性并不能达到工业生产要求的低成本生物转化,这在工业生产上是难以接受的。
2.同样由图1所示,PBS并不是一个理想的缓冲液,因此需要酶活提高的同时,也要寻找能有效控制底物降解程度在可接受水平的缓冲液。
3.5-((R)-2-溴-1-羟乙基)-8-取代氧基-1H-喹啉酮或5-((R)-2-氯-1-羟乙基)-8-取代氧基-1H-喹啉酮是非常难溶解的化合物,本专利研究发现该类底物溶解最高的溶剂为DMSO,完全溶解所需要的溶剂为200mL/g左右,乙酸乙酯为500~1,000mL/g左右,因此CN110713991A中所涉及的反应,用乙酸乙酯萃取就会需要非常大量的溶剂,并且CN110713991A用溶解度更高的DMSO或DMF(良溶剂)作为助溶剂,用溶解度更低的乙酸乙酯(不良溶剂)来萃取,则需要比从纯水溶液更大的用量,即比1,000mL/g更大的用量,这在工业生产上是难以接受的。
发明内容
本发明所要解决的问题是现有技术中的羰基还原酶在羰基还原时选择性低、收率低、纯度低、不利于工业化生产。为此,本发明提供了一种使用羰基还原酶及其突变体对羰基的不对称还原方法。以本申请中的羰基还原酶催化的羰基还原反应,选择性高、收率高、纯度高、利于工业化生产。
本发明提供了一种使用羰基还原酶及其突变体对羰基的不对称还原方法,其包括如下步骤:羰基还原酶或其突变体和辅酶的存在下,将化合物II在有机溶剂中进行不对称还原反应得到化合物I即可;
R1为H、Br或Cl;
R2、R3独立地为H或
R4独立地为H、OMe或OBn;
所述羰基还原酶为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或其突变体;
所述的突变体的突变位点选自如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第001位、第002位、第003位、第004位、第005位、第007位、第008位、第010位、第011位、第012位、第013位、第014位、第015位、第018位、第019位、第020位、第022位、第026位、第028位、第029位、第031位、第034位、第35位、第036位、第037位、第040位、第041位、第42位、第44位、第045位、第047位、第048位、第049位、第051位、第056位、第060位、第061位、第066位、第067位、第069位、第70位、第072位、第077位、第079位、第080位、第082位、第083位、第084位、第085位、第086位、第087位、第089位、第090位、第091位、第092位、第093位、第94位、第96位、第97位、第100位、第101位、第106位、第107位、第108位、第113位、第118位、第121位、第122位、第123位、第124位、第125位、第第128位、第131位、第133位、第135位、第137位、第138位、第139位、第141位、第142位、第143位、第144位、第145位、第146位、第147位、第149位、第152位、第153位、第156位、第157位、第158位、第159位、第163位、第167位、第170位、第171位、第176位、第179位、第180位、第184位、第188位、第189位、第190位、第191位、第192位、第193位、第194位、第195位、第196位、第197位、第200位、第203位、第205位、第206位、第207位、第208位、第209位、第210位、第211位、第212位、第213位、第214位、第216位、第217位、第218位、第219位、第220位、第221位、第222位、第224位、第225位、第226位、第227位、第228位、第229位、第230位、第231位、第232位、第233位、第234位、第236位、第237位、第238位、第239位、第240位、第241位、第245位、第252位、第253位、第254位、第255位、第256位、第257位、第258位、第260位、第261位、第263位、第264位、第265位、第266位、第267位、第268位、第269位、第270位、第271位、第272位、第277位、第278位、第280位、第281位、第282位、第283位、第284位、第285位、第286位、第289位、第292位、第294位、第295位、第297位、第298位、第299位、第300位、第301位、第302位、第304位、第305位、第306位、第307位、第309位、第310位、第311位、第312位、第313位、第314位、第315位、第316位、第317位、第322位、第324位、第325位、第326位、第327位、第328位、第329位、第331位、第333位。
在本发明某一方案中,所述的制备方法中的某些条件的定义可如下所述,其他条件的定义可如上任一方案所述(以下简称“在本发明某一方案中”):所述化合物II独立地为
在本发明某一方案中,所述的化合物I独立地为
在本发明某一方案中,所述有机溶剂可为本领域该类反应常规,例如含硫类有机溶剂,又例如二甲基亚砜。
在本发明某一方案中,所述化合物II与所述有机溶剂中的质量体积比可为本领域该类反应常规,例如20g/L~100g/L,又例如20g/L或100g/L。
在本发明某一方案中,所述羰基还原酶或其突变体与化合物II的质量比可为本领域该类反应常规,例如(0.01~5):1,又例如0.01:1、0.05:1、0.1:1、0.25:1,2:1或5:1。所述烯还原酶或其突变体可以以纯酶的形式存在,也可以以宿主菌培养并表达后的粗酶提取液或其浓缩液的形式存在。
在本发明某一方案中,所述不对称还原反应温度可为本领域该类反应常规,例如0~50℃,又例如27~47℃,优选17℃、27℃、37℃或47℃。
在本发明某一方案中,所述不对称还原反应时间可为本领域该类反应常规,例如1~16小时,还例如2小时、4小时或10小时。
在本发明某一方案中,所述辅酶可为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH,即辅酶II),或还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH,即辅酶I)或它们的盐的形式,所述NADPH或NADH可为由D-葡萄糖与葡萄糖脱氢酶和氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)或氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)或它们的盐的形式在缓冲溶液中反应得到。
在本发明某一方案中,所述D-葡萄糖与所述化合物II的质量比可为本领域该类反应常规,例如0.5:1~2:1,又例如1:1。
在本发明某一方案中,所述β-磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠盐或β-磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐与所述化合物II的质量比可为本领域该类反应常规,例如(0.01~0.1):1,又例如0.01:1、0.05:1或0.1:1。
在本发明某一方案中,所述葡萄糖脱氢酶与所述化合物II的质量比可为本领域该类反应常规,例如0.05~0.2:1,又例如0.05:1、0.1:1或0.2:1。
在本发明某一方案中,所述缓冲溶液可为本领域该类反应常规,例如PBS缓冲溶液(磷酸盐缓冲液)、TEOA缓冲溶液(三乙醇胺盐缓冲液)、Tris-HCl(三羟甲基甲胺盐酸缓冲液)、Tris-H2SO4(三羟甲基甲胺硫酸盐缓冲液),优选Tris-H2SO4。
在本发明某一方案中,所述D-葡萄糖与所述缓冲溶液的质量体积比可为本领域该类反应常规,例如5g/L~40g/L,又例如5g/L、6.67g/L、20g/L、28.6g/L或40g/L。
在本发明某一方案中,所述缓冲溶液的pH值可为本领域该类反应常规,优选pH=6~8;例如pH=6,pH=7或pH=8。
在本发明某一方案中,所述不对称还原反应的后处理可为本领域该类反应的常规后处理方法,例如离心、过滤。
在本发明某一方案中,所述的突变体的突变位点还包括选自如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列第126位、第127位、第130位、第132位、第136位、第160位、第164位、第165位、第169位、第182位、第215位、第235位、第243位、第290位、第308位或第327位。
在本发明某一方案中,所述的突变体的突变位点优选选自如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第003位、第011位、第013位、第014位、第041位、第42位、第060位、第086位、第091位、第093位、第94位、第97位、第107位、第108位、第158位、第第176位、第188位、第189位、第193位、第207位、第208位、第210位、第211位、第217位、第218位、第230位、第237位、第254位、第255位、第268位、第270位、第272位、第278位、第281位、第292位、第306位、第309位、第316位、第327位。
在本发明某一方案中,所述的突变体的突变位点还包括选自如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列第127位、第132位、第136位、第160位、第182位、第215位、第243位或第327位。
在本发明某一方案中,所述的突变体的为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第4位的氨基酸残基突变为第001位氨基酸残基突变为A、E或H,和/或,第002位氨基酸残基突变为A、F或D,和/或,第003位氨基酸残基突变为H、P或T,和/或,第004位氨基酸残基突变为E、G、H或V,和/或,第005位氨基酸残基突变为A、L、P或S,和/或,第007位氨基酸残基突变为A、E、L或M,和/或,第008位氨基酸残基突变为C、F、L或T,和/或,第010位氨基酸残基突变为C、F、L、N或,和/或,第011位氨基酸残基突变为C、G、I、L、N或S,和/或,第012位氨基酸残基突变为D、F、K、L、R、T、V、W或Y,和/或,第013位氨基酸残基突变为A、E、I、S或V,和/或,第014位氨基酸残基突变为A、C、D、G、K、N、R、V、W或Y,和/或,第015位氨基酸残基突变为M、P、S、T或W,和/或,第018位氨基酸残基突变为F、M或N,和/或,第019位氨基酸残基突变为A、N、S或W,和/或,第020位氨基酸残基突变为T,和/或,第022位氨基酸残基突变为T,和/或,第026位氨基酸残基突变为K、P或R,和/或,第028位氨基酸残基突变为A、D、P、T或V,和/或,第029位氨基酸残基突变为A、H、T或V,和/或,第031氨基酸残基突变为H、K或L,和/或,第034氨基酸残基突变为C、M、N、P或Q,和/或,第35氨基酸残基突变为T,和/或,第036位氨基酸残基突变为A、G、I、K、S、V或W,和/或,第037位氨基酸残基突变为E、G、K、R、T或F,和/或,第040位氨基酸残基突变为H、I、L、P或T,和/或,第041位氨基酸残基突变为C、D、F、K或L,和/或,第42位氨基酸残基突变为M,和/或,第44位氨基酸残基突变为A,和/或,第045位氨基酸残基突变为A、E、K、L、N、R或Y,和/或,第047位氨基酸残基突变为H、I、N、R或V,和/或,第048位氨基酸残基突变为I、P或Y,和/或,第049位氨基酸残基突变为A、C或K,和/或,第051位氨基酸残基突变为C或V,和/或,第056位氨基酸残基突变为F、G、H、L、Y,和/或,第060位氨基酸残基突变为E、I、L、M、R、S或Y,和/或,第061位氨基酸残基突变为E、K或M,和/或,第066位氨基酸残基突变为C、K、L或T,第067位氨基酸残基突变为G,和/或,第069位氨基酸残基突变为D或T,和/或,第70位氨基酸残基突变为V或D,和/或,第072位氨基酸残基突变为P或V,和/或,第077位氨基酸残基突变为E、R、T或Y,和/或,第079位氨基酸残基突变为A、F、K、P、S或W,和/或,第080位氨基酸残基突变为D、I、T或V,和/或,第082位氨基酸残基突变为E、I、L、Q、T或V,和/或,第083位氨基酸残基突变为K、Q或W,和/或,第084位氨基酸残基突变为A、C、D、E、I、K、M、P、Q、S、T或W,和/或,第085位氨基酸残基突变为C、H或V,和/或,第086位氨基酸残基突变为A、C、E、F、H、I、K、L、M、P、Q、T、V、W或Y,和/或,第087位氨基酸残基突变为A、C、D、E、F、Q、R、T或Y,和/或,第089位氨基酸残基突变为L,和/或,第090位氨基酸残基突变为A、C、E、I、M、P、R、T、V或Y,和/或,第091位氨基酸残基突变为F、H、P或R,和/或,第092位氨基酸残基突变为D,和/或,第093位氨基酸残基突变为D、G或N,和/或,第94位氨基酸残基突变为D或N,和/或,第96位氨基酸残基突变为R,和/或,第97位氨基酸残基突变为T,和/或,第100位氨基酸残基突变为A、E、F、M、N、S、V或W,和/或,第101位氨基酸残基突变为L、N、S、V或Y,和/或,第106位氨基酸残基突变为E,和/或,第107位氨基酸残基突变为C、D、E、F、H、I、N、P、Q、S或Y,和/或,第108位氨基酸残基突变为H或K,和/或,第113位氨基酸残基突变为S,和/或,第118位氨基酸残基突变为C、D、N或P,和/或,第121位氨基酸残基突变为A、H、P或R,和/或,第122位氨基酸残基突变为D、F、H、M、P、Q、T、V、W或Y,和/或,第123位氨基酸残基突变为K、P、T或V,和/或,第124位氨基酸残基突变为A、F、G、K、L、N、P或R,和/或,第125位氨基酸残基突变为D、H、K、M、P、Q、V、W或Y,和/或,和/或,第128位氨基酸残基突变为G或K,和/或,第131位氨基酸残基突变为E、N、P、T或Y,和/或,第133位氨基酸残基突变为G、N、R或T,和/或,第135位氨基酸残基突变为A、C、E、I、K、M、N或Q,和/或,第137位氨基酸残基突变为A、C、K、M、N、P或Q,和/或,第138位氨基酸残基突变为A、P、T或W,和/或,第139位氨基酸残基突变为F、G、K或P,和/或,第141位氨基酸残基突变为A、C、F或N,和/或,第142位氨基酸残基突变为A、C、F、G、H、M、Q、S、T、V或Y,和/或,第143位氨基酸残基突变为A、H、K、N、Q、S、T、W或Y,和/或,第144位氨基酸残基突变为A、D、E、G、I、L、P或V,和/或,第145位氨基酸残基突变为C、E、H、L、S、T、V或W,和/或,第146位氨基酸残基突变为C、D、H或V,和/或,第147位氨基酸残基突变为A、D、E、F、G、H、K、L、P、R、W或Y,和/或,第149位氨基酸残基突变为C、G、H、K、L或T,和/或,第152位氨基酸残基突变为C或D,和/或,第153位氨基酸残基突变为M或W,和/或,第156位氨基酸残基突变为A、F、L、M、N、R或W,和/或,第157位氨基酸残基突变为D、F、G、I、K、L、N或Q,和/或,第158位氨基酸残基突变为D、G或N,和/或,第159位氨基酸残基突变为C、H、I、N、Q、R或W,和/或,第163位氨基酸残基突变为C、D、E、F、H、K、L、M、N、Q、R、T、V、W或Y,和/或,第167位氨基酸残基突变为A、H、N、T或V,和/或,第170位氨基酸残基突变为E、L或P,和/或,第171位氨基酸残基突变为G、H、L、M或N,和/或,第176位氨基酸残基突变为D、K、N、P、R或S,和/或,第179位氨基酸残基突变为A、I或N,和/或,第180位氨基酸残基突变为D、L或R,和/或,第184位氨基酸残基突变为D、F、H、R或W,和/或,第188位氨基酸残基突变为A、C、E、F、G、K、L、N、T、W或Y,和/或,第189位氨基酸残基突变为C、E、K、M、N、Q、S或V,和/或,第190位氨基酸残基突变为A、C、H、I、K、L、M、N、S或T,和/或,第191位氨基酸残基突变为D、E、F、H、I、L、M、P、S、T或Y,和/或,第192位氨基酸残基突变为A、D、E、I、R或S,和/或,第193位氨基酸残基突变为A、C、E、F、H、K、L、M、N、P、S或T,和/或,第194位氨基酸残基突变为A、C、D、F、G、H、I、P、R、S或V,和/或,第195位氨基酸残基突变为A、D、F、G、H、I、L、N、S、T、V、W或Y,和/或,第196位氨基酸残基突变为G,和/或,第197位氨基酸残基突变为E、F、H、K、L、P、S、T或Y,和/或,第200位氨基酸残基突变为D、L、N、P、Q或W,和/或,第203位氨基酸残基突变为A、D、F、G、I、Q或Y,和/或,第205位氨基酸残基突变为A、C、D或T,和/或,第206位氨基酸残基突变为K、Q、S、T或V,和/或,第207位氨基酸残基突变为F、H、I、S、T、V、W或Y,和/或,第208位氨基酸残基突变为D、E、F、G、H、K、P、R或V,和/或,第209位氨基酸残基突变为A、I、K或M,和/或,第210位氨基酸残基突变为A、E、G、H、K、L、M、R或W,和/或,第211位氨基酸残基突变为A、C、E、G、I、K、M、N、Q、R、S、T或W,和/或,第212位氨基酸残基突变为C、D、F、L、M、N、P、S或W,和/或,第213位氨基酸残基突变为C或N,和/或,第214位氨基酸残基突变为I、N、S或W,和/或,第216位氨基酸残基突变为A、H、L或T,和/或,第217位氨基酸残基突变为A或G,和/或,第218位氨基酸残基突变为A、E、I或L,和/或,第219位氨基酸残基突变为C、F、K、M、N、T、V或W,和/或,第220位氨基酸残基突变为C、E、M、P、T或Y,和/或,第221位氨基酸残基突变为A、K、L、M、P或Y,和/或,第222位氨基酸残基突变为F、K、L、P、S或V,和/或,第224位氨基酸残基突变为A、G、H、N、Q、W或Y,和/或,第225位氨基酸残基突变为Q或W,和/或,第226位氨基酸残基突变为D、E、W或Y,和/或,第227位氨基酸残基突变为D、G、N、T或W,和/或,第228位氨基酸残基突变为I、L、N或V,和/或,第229位氨基酸残基突变为E、G或M,和/或,第230位氨基酸残基突变为A、C、I、L、M、Q、R、S或T,和/或,第231位氨基酸残基突变为A、D、G、H、K、P、R、S、V、W或Y,和/或,第232位氨基酸残基突变为E、F、N、Q、S、V或Y,和/或,第233位氨基酸残基突变为A、C、H、K、L、R、S、W或Y,和/或,第234位氨基酸残基突变为C、H、I、M、Q、S、V或W,和/或,第236位氨基酸残基突变为Q,和/或,第237位氨基酸残基突变为A、C、G、R或S,和/或,第238位氨基酸残基突变为G、L、Q、R、S或Y,和/或,第239位氨基酸残基突变为A、F、G、N或R,和/或,第240位氨基酸残基突变为D、E或R,和/或,第241位氨基酸残基突变为L、N、P或R,和/或,第245位氨基酸残基突变为C、I、M、R或S,和/或,第252位氨基酸残基突变为N、R、W或Y,和/或,第253位氨基酸残基突变为C、H、R或W,和/或,第254位氨基酸残基突变为S,和/或,第255位氨基酸残基突变为A或R,和/或,第256位氨基酸残基突变为G、H、I、T或W,和/或,第257位氨基酸残基突变为A,和/或,第258位氨基酸残基突变为A、I、K、N、Y,和/或,第260位氨基酸残基突变为A、E、N、S、T或Y,和/或,第261位氨基酸残基突变为G、H、I、K、T、W或Y,和/或,第263位氨基酸残基突变为E、H、N、S或V,和/或,第264位氨基酸残基突变为D、F、G、I、K、Q或S,和/或,第265位氨基酸残基突变为A、C、G、K、M、P、Q、R或V,和/或,第266位氨基酸残基突变为A、C、H、N或P,和/或,第267位氨基酸残基突变为I、L、S或Y,和/或,第268位氨基酸残基突变为E、L或R,和/或,第269位氨基酸残基突变为C、F、K、L、N、R或V,和/或,第270位氨基酸残基突变为E、G、H、M、P、S、T、V或Y,和/或,第271位氨基酸残基突变为I、L、W,和/或,第272位氨基酸残基突变为V,和/或,第277位氨基酸残基突变为E,和/或,第278位氨基酸残基突变为T,和/或,第280位氨基酸残基突变为D、I、K、L、R或S,和/或,第281位氨基酸残基突变为W或Y,和/或,第282位氨基酸残基突变为A、E、I、L、N或R,和/或,第283位氨基酸残基突变为C、I、M、R或Y,和/或,第284位氨基酸残基突变为L或R,和/或,第285位氨基酸残基突变为F、L、P、T、W或Y,和/或,第286位氨基酸残基突变为V,和/或,第289位氨基酸残基突变为I、L、N、R、S、T或W,和/或,第294位氨基酸残基突变为D、E、F、K或S,和/或,第295位氨基酸残基突变为A、L或Q,和/或,第297位氨基酸残基突变为D、H、K、M或N,和/或,第298位氨基酸残基突变为E、F、T、W或Y,和/或,第299位氨基酸残基突变为A、E、G、N或Y,和/或,第300位氨基酸残基突变为A、K、Q、T、W或Y,和/或,第301位氨基酸残基突变为E、M或T,和/或,第302位氨基酸残基突变为A、C、G、H、Q、T或V,和/或,第304位氨基酸残基突变为A、D、E、L、S或W,和/或,第305位氨基酸残基突变为D、L、Q、R、S或T,和/或,第306位氨基酸残基突变为E、G、H、I、K、R或V,和/或,第307位氨基酸残基突变为A、C、D、E、G、H、K、N或V和/或,第309位氨基酸残基突变为C、D、H、R、S、T、V,和/或,第310位氨基酸残基突变为H、L、P或Q,和/或,第311位氨基酸残基突变为L或P,和/或,第312位氨基酸残基突变为D、E、H、I、M、Q、R或V,和/或,第313位氨基酸残基突变为E、K、L、N、R或S,和/或,第314位氨基酸残基突变为A、F、K、L、P或W,和/或,第315位氨基酸残基突变为E,和/或,第316位氨基酸残基突变为Q或V,和/或,第317位氨基酸残基突变为E、H、P或R,和/或,第322位氨基酸残基突变为A或K,和/或,第324位氨基酸残基突变为H、I、T或V,和/或,第325位氨基酸残基突变为P、T、V或W,和/或,第326位氨基酸残基突变为D,和/或,第328位氨基酸残基突变为K、N或S,和/或,第329位氨基酸残基突变为A、E、H、M、Q、R、S或V,和/或,第331位氨基酸残基突变为C、G或V,和/或,第333位氨基酸残基突变为P。
在本发明某一方案中,所述的突变体的还选自如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第126位氨基酸残基突变为A、D、E、F、L、P、Q、R、S、T、或V,和/或,第127位氨基酸残基突变为A、H、K、M、N、Q、S、T或V,第130位氨基酸残基突变为A或S,和/或,第132位氨基酸残基突变为A、D、F、G、H、I、K、L、P、Q、R、S或W,和/或,第136位氨基酸残基突变为A、E、F、G、H、I、L、N、R、S、T或Y,第160位氨基酸残基突变为A、D、E、G、K、M、R、T或V,和/或,第164位氨基酸残基突变为A、C、D、P、R、T或Y,和/或,第165位氨基酸残基突变为D、L或Q,和/或,第182位氨基酸残基突变为G、K、S或T,和/或,第215位氨基酸残基突变为A、C、D、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T或Y,和/或,第235位氨基酸残基突变为A或L,和/或,第243位氨基酸残基突变为F、N、R、S、T、W或Y,和/或,第290位氨基酸残基突变为F、H或T,和/或,第292位氨基酸残基突变为C、E、G、I、K或V,和/或,第308位氨基酸残基突变为A、D、G、K、M、N或S,和/或,第327位氨基酸残基突变为A、H、I、M、Q、R、T或V。
在本发明某一方案中,所述的突变体的突变位置和种类如表1所示:
表1
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本发明还提供了一种羰基还原酶的突变体,其中所述羰基还原酶为如上所述的氨基酸序列,所述的突变体为如上所述的不对称还原方法中所定义的突变体。
本发明还提供了一种分离的核酸,其中所述核酸编码如上所述的羰基还原酶的突变体。
本发明还提供了一种重组表达载体,其中所述重组表达载体包含如上所述的核酸。
本发明还提供了一种转化体,其中所述转化体包含如上所述的重组表达载体。
本发明还提供了一种制备羰基还原酶突变体的方法,其培养如上所述的转化体并获得含羰基还原酶突变体的培养物,即得。
本发明还提供了一种如上所述的羰基还原酶或其突变体在制备不对称手性还原剂中的应用。
在本发明某一方案中,化合物1在化合物I范围内;化合物2在化合物II范围内。
在符合本领域常识的基础上,上述各优选条件,可任意组合,即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明中的氨基酸简写符号如无特殊说明均为本领域常规,具体简写符号对应的氨基酸如表2所示。
表2
本发明的积极进步效果在于:以本申请中的羰基还原酶催化的羰基还原反应,选择性低、收率低、纯度低、利于工业化生产。
附图说明
图1为5-((R)-2-溴-1-羟乙基)-8-取代氧基-1H-喹啉酮在PBS缓冲液中随着时间延长变质程度的SFC图。
具体实施方式
下面结合具体实施例本发明做进一步的详细说明,以下实施例用于进一步说明本发明,但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。本发明的羰基还原酶可通过重组表达技术表达纯化,也可以通过全人工合成制备,这些方法都是本领域熟知的获取酶蛋白的常规手段。
确认质量为0.01X~5X羰基还原酶加入到25-200V体积的缓冲液中,加入0.05X~0.1X的葡萄糖脱氢酶、0.01X~0.1X的NADP和1X的葡萄糖,加0.01-1g底物持续搅拌反应2h-10h。
实施例1在PBS缓冲液中羰基还原酶催化化合物2为化合物1。
突变体119通过全人工合成并将其用于以下实验(突变体119的具体序列详见表1)。
向200mL的夹套瓶中加入0.1g的羰基还原酶突变体119、0.2g葡萄糖脱氢酶、0.05gβ-磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐、1g D-葡萄糖和150mL的PBS(pH=7.0)缓冲液,利用磁力搅拌直到酶全部溶解得到均匀的溶液。在37℃条件下加1g的化合物2(50mL DMSO溶解)反应4h。将反应液离心,过滤得到固体,最终得到产物0.904g,得率为90.4%,ee值>99%,产物经核磁检测,结果显示,产物的纯度>98%。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 2.47-2.53(m,28H)3.33(s,61H)3.55-3.73(m,2H)5.16-5.24(m,1H)5.27-5.33(m,2H)5.90-5.97(m,1H)6.53-6.60(m,1H)7.15-7.23(m,2H)7.27-7.42(m,1H)7.29-7.32(m,1H)7.38-7.40(m,1H)7.52-7.62(m,2H)8.14-8.23(m,1H)10.59-10.72(m,1H)。
实施例2在Tris-HCl缓冲液中羰基还原酶催化化合物2为化合物1。
向200mL的夹套瓶中加入0.1g的羰基还原酶突变体013、0.2g葡萄糖脱氢酶、0.05gβ-磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐、1g D-葡萄糖和150mL的Tris-HCl(pH=7.0)缓冲液,利用磁力搅拌直到酶全部溶解得到均匀的溶液。在37℃条件下加1g的化合物2(50mL DMSO溶解)反应4h。将反应液离心,将反应液离心,过滤得到固,最终得到产物0.925g,得率为92.5%,ee值>99%,产物经核磁检测,结果显示,产物的纯度>98%。产物的核磁数据如实施例1所示。
实施例3在Tris-H2SO4缓冲液中羰基还原酶催化化合物2为化合物1。
向200mL的夹套瓶中加入0.1g的羰基还原酶突变体279、0.2g葡萄糖脱氢酶、0.05gβ-磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐、1g D-葡萄糖和150mL的Tris-H2SO4(pH=7.0)缓冲液,利用磁力搅拌直到酶全部溶解得到均匀的溶液。在37℃条件下加1g的化合物2(50mLDMSO溶解)反应4h。将反应液离心,将反应液离心,过滤得到固体,最终得到产物0.951g,得率为95.1%,ee值>99%,产物经核磁检测,结果显示,产物的纯度>98%。产物的核磁数据如实施例1所示。
实施例4在TEOA缓冲液中羰基还原酶催化化合物2为化合物1。
向200mL的夹套瓶中加入0.1g的羰基还原酶突变体360、0.2g葡萄糖脱氢酶、0.05gβ-磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐、1g D-葡萄糖和150mL的TEOA(pH=7.0)缓冲液,利用磁力搅拌直到酶全部溶解得到均匀的溶液。在37℃条件下加1g的化合物2(50mL DMSO溶解)反应4h。将反应液离心,将反应液离心,过滤得到固体,最终得到产物0.901g,得率为90.1%,ee值>99%,产物经核磁检测,结果显示,产物的纯度>98%。产物的核磁数据如实施例1所示。
实施例5在pH=6.0条件下羰基还原酶催化化合物2为化合物1。
向200mL的夹套瓶中加入0.1g的羰基还原酶突变体225、0.2g葡萄糖脱氢酶、0.05gβ-磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐、1g D-葡萄糖和150mL的Tris-H2SO4(pH=6.0)缓冲液,利用磁力搅拌直到酶全部溶解得到均匀的溶液。在37℃条件下加1g的化合物2(50mLDMSO溶解)反应4h。将反应液离心,将反应液离心,过滤得到固体,最终得到产物0.957g,得率为95.7%,ee值>99%,产物经核磁检测,结果显示,产物的纯度>98%。产物的核磁数据如实施例1所示。
实施例6在pH=8.0条件下羰基还原酶催化化合物2为化合物1。
向200mL的夹套瓶中加入0.1g的羰基还原酶突变体037、0.2g葡萄糖脱氢酶、0.05gβ-磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐、1g D-葡萄糖和150mL的Tris-H2SO4(pH=8.0)缓冲液,利用磁力搅拌直到酶全部溶解得到均匀的溶液。在37℃条件下加1g的化合物2(50mLDMSO溶解)反应4h。将反应液离心,将反应液离心,过滤得到固体,最终得到产物0.95g,得率为95%,ee值>99%,产物经核磁检测,结果显示,产物的纯度>98%。产物的核磁数据如实施例1所示。
实施例7在助溶剂DMSO与化合物1的体积比例为10的条件下羰基还原酶催化化合物2为化合物1。
向200mL的夹套瓶中加入0.1g的羰基还原酶突变体039、0.2g葡萄糖脱氢酶、0.05gβ-磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐、1g D-葡萄糖和150mL的Tris-H2SO4(pH=7.0)缓冲液,利用磁力搅拌直到酶全部溶解得到均匀的溶液。在37℃条件下加1g的化合物2(10mLDMSO溶解)反应4h。将反应液离心,将反应液离心,过滤得到固体,最终得到产物0.895g,得率为89.5%,ee值>99%,产物经核磁检测,结果显示,产物的纯度>98%。产物的核磁数据如实施例1所示。
实施例8在助溶剂DMSO与化合物1的体积比例为20的条件下羰基还原酶催化化合物2为化合物1。
向100mL的夹套瓶中加入0.25g的羰基还原酶突变体301、0.2g葡萄糖脱氢酶、0.05gβ-磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐、1g D-葡萄糖和150mL的Tris-H2SO4(pH=7.0)缓冲液,利用磁力搅拌直到酶全部溶解得到均匀的溶液。在37℃条件下加1g的化合物2(20mL DMSO溶解)反应4h。将反应液离心,将反应液离心,过滤得到固体,最终得到产物0.95g,得率为95%,ee值>99%,产物经核磁检测,结果显示,产物的纯度>98%。产物的核磁数据如实施例1所示。
实施例9羰基还原酶与化合物1的质量比为0.01:1条件下羰基还原酶催化化合物2为化合物1。
向200mL的夹套瓶中加入0.01g的羰基还原酶突变体353、0.2g葡萄糖脱氢酶、0.05gβ-磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐、1g D-葡萄糖和150mL的Tris-H2SO4(pH=7.0)缓冲液,利用磁力搅拌直到酶全部溶解得到均匀的溶液。在37℃条件下加1g的化合物2(50mL DMSO溶解)反应4h。将反应液离心,将反应液离心,过滤得到固体,最终得到产物0.842g,得率为84.2%,ee值>99%,产物经核磁检测,结果显示,产物的纯度>98%。产物的核磁数据如实施例1所示。
实施例10羰基还原酶与化合物1的质量比为0.05:1条件下羰基还原酶催化化合物2为化合物1。
向200mL的夹套瓶中加入0.05g的羰基还原酶突变体117、0.2g葡萄糖脱氢酶、0.05gβ-磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐、1g D-葡萄糖和150mL的Tris-H2SO4(pH=7.0)缓冲液,利用磁力搅拌直到酶全部溶解得到均匀的溶液。在37℃条件下加1g的化合物2(50mL DMSO溶解)反应4h。将反应液离心,将反应液离心,过滤得到固体,最终得到产物0.964g,得率为96.4%,ee值>99%,产物经核磁检测,结果显示,产物的纯度>98%。产物的核磁数据如实施例1所示。
实施例11羰基还原酶与化合物1的质量比为2:1条件下羰基还原酶催化化合物2为化合物1。
向200mL的夹套瓶中加入2g的羰基还原酶突变体181、0.2g葡萄糖脱氢酶、0.05gβ-磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐、1g D-葡萄糖和150mL的Tris-H2SO4(pH=7.0)缓冲液,利用磁力搅拌直到酶全部溶解得到均匀的溶液。在37℃条件下加1g的化合物2(50mL DMSO溶解)反应4h。将反应液离心,将反应液离心,过滤得到固体,最终得到产物0.995g,得率为99.5%,ee值>99%,产物经核磁检测,结果显示,产物的纯度>98%。产物的核磁数据如实施例1所示。
实施例12羰基还原酶与化合物1的质量比为5:1条件下羰基还原酶催化化合物2为化合物1。
向200mL的夹套瓶中加入5g的羰基还原酶突变体294、0.2g葡萄糖脱氢酶、0.05gβ-磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐、1g D-葡萄糖和150mL的Tris-H2SO4(pH=7.0)缓冲液,利用磁力搅拌直到酶全部溶解得到均匀的溶液。在37℃条件下加1g的化合物2(50mL DMSO溶解)反应4h。将反应液离心,将反应液离心,过滤得到固体,最终得到产物0.997g,得率为99.7%,ee值>99%,产物经核磁检测,结果显示,产物的纯度>98%。产物的核磁数据如实施例1所示。
实施例13葡萄糖脱氢酶与化合物1的质量比为0.05:1条件下羰基还原酶催化化合物2为化合物1。
向200mL的夹套瓶中加入0.1g的羰基还原酶突变体002、0.05g葡萄糖脱氢酶、0.05gβ-磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐、1g D-葡萄糖和150mL的Tris-H2SO4(pH=7.0)缓冲液,利用磁力搅拌直到酶全部溶解得到均匀的溶液。在37℃条件下加1g的化合物2(50mL DMSO溶解)反应4h。将反应液离心,将反应液离心,过滤得到固体,最终得到产物0.945g,得率为94.5%,ee值>99%,产物经核磁检测,结果显示,产物的纯度>98%。产物的核磁数据如实施例1所示。
实施例14葡萄糖脱氢酶与化合物1的质量比为0.1:1条件下羰基还原酶催化化合物2为化合物1。
向200mL的夹套瓶中加入0.1g的羰基还原酶突变体188、0.1g葡萄糖脱氢酶、0.05gβ-磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐、1g D-葡萄糖和150mL的Tris-H2SO4(pH=7.0)缓冲液,利用磁力搅拌直到酶全部溶解得到均匀的溶液。在37℃条件下加1g的化合物2(50mLDMSO溶解)反应4h。将反应液离心,将反应液离心,过滤得到固体,最终得到产物0.967,率为为96.7%,ee值>99%,产物经核磁检测,结果显示,产物的纯度>98%。产物的核磁数据如实施例1所示。
实施例15β-磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐与化合物1的质量比为0.01:1条件下羰基还原酶催化化合物2为化合物1。
向200mL的夹套瓶中加入0.1g的羰基还原酶突变体344、0.2g葡萄糖脱氢酶、0.01gβ-磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐、1g D-葡萄糖和35mL的Tris-H2SO4(pH=7.0)缓冲液,利用磁力搅拌直到酶全部溶解得到均匀的溶液。在37℃条件下加1g的化合物2(50mL DMSO溶解)反应4h。将反应液离心,将反应液离心,过滤得到固体,最终得到产物0.931g,得率为93.1%,ee值>99%,产物经核磁检测,结果显示,产物的纯度>98%。产物的核磁数据如实施例1所示。
实施例16β-磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐与化合物1的质量比为0.1:1条件下羰基还原酶催化化合物2为化合物1。
向200mL的夹套瓶中加入0.1g的羰基还原酶突变体167、0.2g葡萄糖脱氢酶、0.1gβ-磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐、1g D-葡萄糖和150mL的Tris-H2SO4(pH=7.0)缓冲液,利用磁力搅拌直到酶全部溶解得到均匀的溶液。在37℃条件下加1g的化合物2(50mLDMSO溶解)反应4h。将反应液离心,将反应液离心,过滤得到固体,最终得到产物0.948g,得率为94.8%,ee值>99%,产物经核磁检测,结果显示,产物的纯度>98%。产物的核磁数据如实施例1所示。
实施例17化合物1与缓冲液的质量体积比为1:25g/mL条件下羰基还原酶催化化合物2为化合物1。
向200mL的夹套瓶中加入0.1g的羰基还原酶突变体020、0.2g葡萄糖脱氢酶、0.05gβ-磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐、1g D-葡萄糖和25mL的Tris-H2SO4(pH=7.0)缓冲液,利用磁力搅拌直到酶全部溶解得到均匀的溶液。在37℃条件下加1g的化合物2(15mL DMSO溶解)反应4h。将反应液离心,将反应液离心,过滤得到固体,最终得到产物0.83g,得率为83.0%,ee值>99%,产物经核磁检测,结果显示,产物的纯度>98%。产物的核磁数据如实施例1所示。
实施例18化合物1与缓冲液的质量体积比为1:200g/mL条件下羰基还原酶催化化合物2为化合物1。
向250mL的夹套瓶中加入0.25g的羰基还原酶突变体026、0.2g葡萄糖脱氢酶、0.05gβ-磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐、1g D-葡萄糖和200mL的Tris-H2SO4(pH=7.0)缓冲液,利用磁力搅拌直到酶全部溶解得到均匀的溶液。在37℃条件下加1g的化合物2(50mL DMSO溶解)反应4h。将反应液离心,将反应液离心,过滤得到固体,最终得到产物0.975g,得率为97.5%,ee值>99%,产物经核磁检测,结果显示,产物的纯度>98%。产物的核磁数据如实施例1所示。
实施例19在反应温度可为17℃条件下羰基还原酶催化化合物2为化合物1。
向200mL的夹套瓶中加入0.1g的羰基还原酶突变体312、0.2g葡萄糖脱氢酶、0.05gβ-磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐、1g D-葡萄糖和150mL的Tris-H2SO4(pH=7.0)缓冲液,利用磁力搅拌直到酶全部溶解得到均匀的溶液。在17℃条件下加1g的化合物2(50mLDMSO溶解)反应4h。将反应液离心,将反应液离心,过滤得到固体,最终得到产物0.846g,得率为84.6%,ee值>99%,产物经核磁检测,结果显示,产物的纯度>98%。产物的核磁数据如实施例1所示。
实施例20在反应温度可为27℃条件下羰基还原酶催化化合物2为化合物1。
向200mL的夹套瓶中加入0.1g的羰基还原酶突变体175、0.2g葡萄糖脱氢酶、0.05gβ-磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐、1g D-葡萄糖和150mL的Tris-H2SO4(pH=7.0)缓冲液,利用磁力搅拌直到酶全部溶解得到均匀的溶液。在27℃条件下加1g的化合物2(50mLDMSO溶解)反应4h。将反应液离心,将反应液离心,过滤得到固体,最终得到产物0.943g,得率为94.3%,ee值>99%,产物经核磁检测,结果显示,产物的纯度>98%。产物的核磁数据如实施例1所示。
实施例21在反应温度可为47℃条件下羰基还原酶催化化合物2为化合物1。
向200mL的夹套瓶中加入0.1g的羰基还原酶突变体179、0.2g葡萄糖脱氢酶、0.05gβ-磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐、1g D-葡萄糖和150mL的Tris-H2SO4(pH=7.0)缓冲液,利用磁力搅拌直到酶全部溶解得到均匀的溶液。在47℃条件下加1g的化合物2(50mLDMSO溶解)反应4h。将反应液离心,将反应液离心,过滤得到固体,最终得到产物0.972g,得率为97.2%,ee值>99%,产物经核磁检测,结果显示,产物的纯度>98%。产物的核磁数据如实施例1所示。
实施例22在反应时间为2h条件下羰基还原酶催化化合物2为化合物1。
向200mL的夹套瓶中加入0.1g的羰基还原酶突变体258、0.2g葡萄糖脱氢酶、0.05gβ-磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐、1g D-葡萄糖和150mL的Tris-H2SO4(pH=7.0)缓冲液,利用磁力搅拌直到酶全部溶解得到均匀的溶液。在37℃条件下加1g的化合物2(50mLDMSO溶解)反应2h。将反应液离心,将反应液离心,过滤得到固体,最终得到产物0.921g,得率为92.1%,ee值>99%,产物经核磁检测,结果显示,产物的纯度>98%。产物的核磁数据如实施例1所示。
实施例23在反应时间为4h条件下羰基还原酶催化化合物2为化合物1。
向200mL的夹套瓶中加入0.1g的羰基还原酶突变体166、0.2g葡萄糖脱氢酶、0.05gβ-磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐、1g D-葡萄糖和150mL的Tris-H2SO4(pH=7.0)缓冲液,利用磁力搅拌直到酶全部溶解得到均匀的溶液。在37℃条件下加1g的化合物2(50mLDMSO溶解)反应4h。将反应液离心,将反应液离心,过滤得到固体,最终得到产物0.977g,得率为97.7%,ee值>99%,产物经核磁检测,结果显示,产物的纯度>98%。产物的核磁数据如实施例1所示。
实施例24在反应时间为10h条件下羰基还原酶催化化合物2为化合物1。
向200mL的夹套瓶中加入0.1g的羰基还原酶突变体292、0.2g葡萄糖脱氢酶、0.05gβ-磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐、1g D-葡萄糖和150mL的Tris-H2SO4(pH=7.0)缓冲液,利用磁力搅拌直到酶全部溶解得到均匀的溶液。在37℃条件下加1g的化合物2(50mLDMSO溶解)反应10h。将反应液离心,将反应液离心,过滤得到固体,最终得到产物0.937g,得率为93.7%,ee值>99%,产物经核磁检测,结果显示,产物的纯度>98%。产物的核磁数据如实施例1所示。
实施例25
反应条件如实施例1所示,仅将上述的羰基还原酶突变体119替换为突变体2-突变体306和野生型羰基还原酶,其结果如下表1所示:
表1羰基还原酶及其突变体的性能参数
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上述实施例含本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
本申请中SEQ ID NO:1的序列如下所示:
MTTSVFVSGATGYLAQQIIALVLSKGYKVVGSVRSEEKGANLKKLYGDDFSYEVVKVLEQ
KGAFDEALKKHPEVTIFLHTASPVTFEVEDTEKEILIPAINGTKYVLQSIKDVAPQITRV
VYTSSVVAMSVPEELGSPDVVLSEASWSSLSYEQSKTHGVLAYFGSKQFAERAAWEFVEQ
EKPNFALSTVNPVYIFGPQAKDEEVKGTLNLSAEMVNSVLKLNKDDDVPATTGTFIDVRD
VAKAHLAAFEKDEAKGERLLLSNTRFNGQTLLDVVRKNFPQLADKLPVGKPHSDDFSAFK
EWNDKKTKKILGFEYFDFETSVVDSIKQVLKVQG。
相应的DNA序列SEQ ID NO:2:
ATGACCACGAGCGTGTTTGTGAGCGGCGCGACCGGCTATCTGGCGCAGCAGATTATTGCGCTGGTGCTGAGCAAAGGCTATAAAGTGGTGGGCAGCGTGCGCAGCGAAGAAAAAGGCGCGAACCTGAAAAAACTGTATGGAGACGATTTCTCCTATGAGGTGGTGAAAGTGCTGGAACAGAAAGGCGCGTTTGATGAAGCGCTGAAAAAACATCCGGAAGTGACCATTTTTCTGCATACCGCGAGCCCGGTGACCTTTGAAGTGGAAGATACCGAAAAAGAAATTCTGATTCCGGCGATTAACGGCACCAAATATGTGCTGCAGAGCATTAAAGATGTGGCGCCGCAGATTACCCGCGTGGTGTATACGAGCAGCGTGGTGGCGATGAGCGTGCCGGAAGAACTGGGCAGCCCGGATGTGGTGCTGAGCGAAGCGAGCTGGAGCAGCCTGAGCTATGAACAGAGCAAAACCCATGGCGTGCTGGCGTATTTTGGCAGCAAACAGTTTGCGGAACGCGCGGCGTGGGAATTTGTGGAACAAGAAAAACCGAACTTTGCGCTGAGCACCGTGAACCCGGTGTATATTTTTGGCCCGCAAGCGAAAGATGAAGAAGTGAAAGGCACCCTGAACCTGAGCGCGGAAATGGTGAACAGCGTGCTGAAACTGAACAAAGATGATGATGTGCCGGCGACCACCGGCACCTTTATTGATGTGCGCGATGTGGCGAAAGCGCATCTGGCGGCGTTTGAAAAAGATGAAGCGAAAGGCGAACGCCTGCTGCTGAGCAACACCCGCTTTAACGGTCAGACCCTGCTGGATGTGGTGCGCAAAAACTTTCCGCAGCTGGCGGATAAACTGCCGGTGGGCAAACCGCATAGCGATGATTTCTCGGCATTCAAAGAATGGAACGATAAAAAAACCAAAAAAATTCTGGGCTTTGAATATTTTGATTTTGAAACGAGCGTGGTGGATAGCATTAAACAAGTGCTGAAAGTGCAAGGCTAA。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海合全药业股份有限公司
上海合全药物研发有限公司
常州合全药业有限公司
<120> 一种使用羰基还原酶及其突变体对羰基的不对称还原方法
<130> P22010245C
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 334
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 羰基还原酶
<400> 1
Met Thr Thr Ser Val Phe Val Ser Gly Ala Thr Gly Tyr Leu Ala Gln
1 5 10 15
Gln Ile Ile Ala Leu Val Leu Ser Lys Gly Tyr Lys Val Val Gly Ser
20 25 30
Val Arg Ser Glu Glu Lys Gly Ala Asn Leu Lys Lys Leu Tyr Gly Asp
35 40 45
Asp Phe Ser Tyr Glu Val Val Lys Val Leu Glu Gln Lys Gly Ala Phe
50 55 60
Asp Glu Ala Leu Lys Lys His Pro Glu Val Thr Ile Phe Leu His Thr
65 70 75 80
Ala Ser Pro Val Thr Phe Glu Val Glu Asp Thr Glu Lys Glu Ile Leu
85 90 95
Ile Pro Ala Ile Asn Gly Thr Lys Tyr Val Leu Gln Ser Ile Lys Asp
100 105 110
Val Ala Pro Gln Ile Thr Arg Val Val Tyr Thr Ser Ser Val Val Ala
115 120 125
Met Ser Val Pro Glu Glu Leu Gly Ser Pro Asp Val Val Leu Ser Glu
130 135 140
Ala Ser Trp Ser Ser Leu Ser Tyr Glu Gln Ser Lys Thr His Gly Val
145 150 155 160
Leu Ala Tyr Phe Gly Ser Lys Gln Phe Ala Glu Arg Ala Ala Trp Glu
165 170 175
Phe Val Glu Gln Glu Lys Pro Asn Phe Ala Leu Ser Thr Val Asn Pro
180 185 190
Val Tyr Ile Phe Gly Pro Gln Ala Lys Asp Glu Glu Val Lys Gly Thr
195 200 205
Leu Asn Leu Ser Ala Glu Met Val Asn Ser Val Leu Lys Leu Asn Lys
210 215 220
Asp Asp Asp Val Pro Ala Thr Thr Gly Thr Phe Ile Asp Val Arg Asp
225 230 235 240
Val Ala Lys Ala His Leu Ala Ala Phe Glu Lys Asp Glu Ala Lys Gly
245 250 255
Glu Arg Leu Leu Leu Ser Asn Thr Arg Phe Asn Gly Gln Thr Leu Leu
260 265 270
Asp Val Val Arg Lys Asn Phe Pro Gln Leu Ala Asp Lys Leu Pro Val
275 280 285
Gly Lys Pro His Ser Asp Asp Phe Ser Ala Phe Lys Glu Trp Asn Asp
290 295 300
Lys Lys Thr Lys Lys Ile Leu Gly Phe Glu Tyr Phe Asp Phe Glu Thr
305 310 315 320
Ser Val Val Asp Ser Ile Lys Gln Val Leu Lys Val Gln Gly
325 330
<210> 2
<211> 1005
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 编码羰基还原酶的核苷酸
<400> 2
atgaccacga gcgtgtttgt gagcggcgcg accggctatc tggcgcagca gattattgcg 60
ctggtgctga gcaaaggcta taaagtggtg ggcagcgtgc gcagcgaaga aaaaggcgcg 120
aacctgaaaa aactgtatgg agacgatttc tcctatgagg tggtgaaagt gctggaacag 180
aaaggcgcgt ttgatgaagc gctgaaaaaa catccggaag tgaccatttt tctgcatacc 240
gcgagcccgg tgacctttga agtggaagat accgaaaaag aaattctgat tccggcgatt 300
aacggcacca aatatgtgct gcagagcatt aaagatgtgg cgccgcagat tacccgcgtg 360
gtgtatacga gcagcgtggt ggcgatgagc gtgccggaag aactgggcag cccggatgtg 420
gtgctgagcg aagcgagctg gagcagcctg agctatgaac agagcaaaac ccatggcgtg 480
ctggcgtatt ttggcagcaa acagtttgcg gaacgcgcgg cgtgggaatt tgtggaacaa 540
gaaaaaccga actttgcgct gagcaccgtg aacccggtgt atatttttgg cccgcaagcg 600
aaagatgaag aagtgaaagg caccctgaac ctgagcgcgg aaatggtgaa cagcgtgctg 660
aaactgaaca aagatgatga tgtgccggcg accaccggca cctttattga tgtgcgcgat 720
gtggcgaaag cgcatctggc ggcgtttgaa aaagatgaag cgaaaggcga acgcctgctg 780
ctgagcaaca cccgctttaa cggtcagacc ctgctggatg tggtgcgcaa aaactttccg 840
cagctggcgg ataaactgcc ggtgggcaaa ccgcatagcg atgatttctc ggcattcaaa 900
gaatggaacg ataaaaaaac caaaaaaatt ctgggctttg aatattttga ttttgaaacg 960
agcgtggtgg atagcattaa acaagtgctg aaagtgcaag gctaa 1005
Claims (12)
1.一种使用羰基还原酶及其突变体对羰基的不对称还原方法,其包括如下步骤:在辅酶与羰基还原酶或其突变体的存在下,将化合物II在有机溶剂中进行不对称还原反应得到化合物I即可;
R1为H、Br或Cl;
R2、R3独立地为H或
R4独立地为H、OMe或OBn;
所述羰基还原酶为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或其突变体;
所述的突变体的突变位点选自如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第001位、第002位、第003位、第004位、第005位、第007位、第008位、第010位、第011位、第012位、第013位、第014位、第015位、第018位、第019位、第020位、第022位、第026位、第028位、第029位、第031位、第034位、第35位、第036位、第037位、第040位、第041位、第42位、第44位、第045位、第047位、第048位、第049位、第051位、第056位、第060位、第061位、第066位、第067位、第069位、第70位、第072位、第077位、第079位、第080位、第082位、第083位、第084位、第085位、第086位、第087位、第089位、第090位、第091位、第092位、第093位、第94位、第96位、第97位、第100位、第101位、第106位、第107位、第108位、第113位、第118位、第121位、第122位、第123位、第124位、第125位、第128位、第131位、第133位、第135位、第137位、第138位、第139位、第141位、第142位、第143位、第144位、第145位、第146位、第147位、第149位、第152位、第153位、第156位、第157位、第158位、第159位、第163位、第167位、第170位、第171位、第176位、第179位、第180位、第184位、第188位、第189位、第190位、第191位、第192位、第193位、第194位、第195位、第196位、第197位、第200位、第203位、第205位、第206位、第207位、第208位、第209位、第210位、第211位、第212位、第213位、第214位、第216位、第217位、第218位、第219位、第220位、第221位、第222位、第224位、第225位、第226位、第227位、第228位、第229位、第230位、第231位、第232位、第233位、第234位、第236位、第237位、第238位、第239位、第240位、第241位、第245位、第252位、第253位、第254位、第255位、第256位、第257位、第258位、第260位、第261位、第263位、第264位、第265位、第266位、第267位、第268位、第269位、第270位、第271位、第272位、第277位、第278位、第280位、第281位、第282位、第283位、第284位、第285位、第286位、第289位、第292位、第294位、第295位、第297位、第298位、第299位、第300位、第301位、第302位、第304位、第305位、第306位、第307位、第309位、第310位、第311位、第312位、第313位、第314位、第315位、第316位、第317位、第322位、第324位、第325位、第326位、第328位、第329位、第331位、第333位。
2.如权利要求1所述的不对称还原方法,其特征在于,其满足下述条件的一种或多种:
(1)所述化合物II独立地为
(2)所述的化合物I独立地为
(3)所述的突变体的突变位点还包括选自如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列第126位、第127位、第130位、第132位、第136位、第160位、第164位、第165位、第169位、第182位、第215位、第235位、第243位、第290位、第308位或第327位。
3.如权利要求1所述的不对称还原方法,其特征在于,其满足下述条件的一种或多种:
(1)所述有机溶剂为含硫类有机溶剂,例如二甲基亚砜;
(2)所述化合物II与所述有机溶剂的质量体积比为20g/L~100g/L,例如20g/L、66.67g/L或100g/L;
(3)所述羰基还原酶或其突变体与化合物II的质量比为(0.01~5):1,例如0.01:1、0.05:1、0.1:1、0.25:1,2:1或5:1;
(4)所述不对称还原反应温度为0~50℃,例如17~47℃,又例如17℃、27℃、37℃或47℃;
(5)所述不对称还原反应时间为1~16小时,例如2小时、4小时或10小时;
(6)所述辅酶为辅酶II即NAD(P)H,或辅酶I即NADH或其盐,所述NAD(P)H或NADH可由D-葡萄糖、葡萄糖脱氢酶和NADP+或NAD+在缓冲溶液中反应得到;所述D-葡萄糖与所述化合物II的质量比可为0.5:1~2:1,例如1:1;所述NAD(P)H或NADH与所述化合物II的质量比可为(0.01~0.1):1,又例如0.01:1、0.05:1或0.1:1;所述葡萄糖脱氢酶与所述化合物II的质量比可为0.05~0.2:1,又例如0.05:1、0.1:1或0.2:1;所述缓冲溶液可为PBS、TEOA、Tris-HCl、Tris-H2SO4,优选Tris-H2SO4;所述D-葡萄糖与所述缓冲溶液的质量体积比可为5g/L~40g/L,又例如5g/L、6.67g/L、20g/L、28.6g/L或40g/L;所述缓冲溶液的pH值可为6~8;例如6、7或8;所述不对称还原反应的后处理可为离心、过滤。
4.如权利要求1所述的不对称还原方法,其特征在于,所述的突变体的突变位点除选自如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第003位、第011位、第013位、第014位、第041位、第42位、第060位、第086位、第091位、第093位、第94位、第97位、第107位、第108位、第158位、第第176位、第188位、第189位、第193位、第207位、第208位、第210位、第211位、第217位、第218位、第230位、第237位、第254位、第255位、第268位、第270位、第272位、第278位、第281位、第292位、第306位、第309位、第316位、第327位外,进一步还选自如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列第127位、第132位、第136位、第160位、第182位、第215位、第243位或第327位。
5.如权利要求1所述的不对称还原方法,其特征在于,所述的突变体的为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第4位的氨基酸残基突变为第001位氨基酸残基突变为A、E或H,和/或,第002位氨基酸残基突变为A、F或D,和/或,第003位氨基酸残基突变为H、P或T,和/或,第004位氨基酸残基突变为E、G、H或V,和/或,第005位氨基酸残基突变为A、L、P或S,和/或,第007位氨基酸残基突变为A、E、L或M,和/或,第008位氨基酸残基突变为C、F、L或T,和/或,第010位氨基酸残基突变为C、F、L、N或,和/或,第011位氨基酸残基突变为C、G、I、L、N或S,和/或,第012位氨基酸残基突变为D、F、K、L、R、T、V、W或Y,和/或,第013位氨基酸残基突变为A、E、I、S或V,和/或,第014位氨基酸残基突变为A、C、D、G、K、N、R、V、W或Y,和/或,第015位氨基酸残基突变为M、P、S、T或W,和/或,第018位氨基酸残基突变为F、M或N,和/或,第019位氨基酸残基突变为A、N、S或W,和/或,第020位氨基酸残基突变为T,和/或,第022位氨基酸残基突变为T,和/或,第026位氨基酸残基突变为K、P或R,和/或,第028位氨基酸残基突变为A、D、P、T或V,和/或,第029位氨基酸残基突变为A、H、T或V,和/或,第031氨基酸残基突变为H、K或L,和/或,第034氨基酸残基突变为C、M、N、P或Q,和/或,第035氨基酸残基突变为T,和/或,第036位氨基酸残基突变为A、G、I、K、S、V或W,和/或,第037位氨基酸残基突变为E、G、K、R、T或F,和/或,第040位氨基酸残基突变为H、I、L、P或T,和/或,第041位氨基酸残基突变为C、D、F、K或L,和/或,第42位氨基酸残基突变为M,和/或,第44位氨基酸残基突变为A,和/或,第045位氨基酸残基突变为A、E、K、L、N、R或Y,和/或,第047位氨基酸残基突变为H、I、N、R或V,和/或,第048位氨基酸残基突变为I、P或Y,和/或,第049位氨基酸残基突变为A、C或K,和/或,第051位氨基酸残基突变为C或V,和/或,第056位氨基酸残基突变为F、G、H、L、Y,和/或,第060位氨基酸残基突变为E、I、L、M、R、S或Y,和/或,第061位氨基酸残基突变为E、K或M,和/或,第066位氨基酸残基突变为C、K、L或T,第067位氨基酸残基突变为G,和/或,第069位氨基酸残基突变为D或T,和/或,第70位氨基酸残基突变为V或D,和/或,第072位氨基酸残基突变为P或V,和/或,第077位氨基酸残基突变为E、R、T或Y,和/或,第079位氨基酸残基突变为A、F、K、P、S或W,和/或,第080位氨基酸残基突变为D、I、T或V,和/或,第082位氨基酸残基突变为E、I、L、Q、T或V,和/或,第083位氨基酸残基突变为K、Q或W,和/或,第084位氨基酸残基突变为A、C、D、E、I、K、M、P、Q、S、T或W,和/或,第085位氨基酸残基突变为C、H或V,和/或,第086位氨基酸残基突变为A、C、E、F、H、I、K、L、M、P、Q、T、V、W或Y,和/或,第087位氨基酸残基突变为A、C、D、E、F、Q、R、T或Y,和/或,第089位氨基酸残基突变为L,和/或,第090位氨基酸残基突变为A、C、E、I、M、P、R、T、V或Y,和/或,第091位氨基酸残基突变为F、H、P或R,和/或,第092位氨基酸残基突变为D,和/或,第093位氨基酸残基突变为D、G或N,和/或,第94位氨基酸残基突变为D或N,和/或,第96位氨基酸残基突变为R,和/或,第97位氨基酸残基突变为T,和/或,第100位氨基酸残基突变为A、E、F、M、N、S、V或W,和/或,第101位氨基酸残基突变为L、N、S、V或Y,和/或,第106位氨基酸残基突变为E,和/或,第107位氨基酸残基突变为C、D、E、F、H、I、N、P、Q、S或Y,和/或,第108位氨基酸残基突变为H或K,和/或,第113位氨基酸残基突变为S,和/或,第118位氨基酸残基突变为C、D、N或P,和/或,第121位氨基酸残基突变为A、H、P或R,和/或,第122位氨基酸残基突变为D、F、H、M、P、Q、T、V、W或Y,和/或,第123位氨基酸残基突变为K、P、T或V,和/或,第124位氨基酸残基突变为A、F、G、K、L、N、P或R,和/或,第125位氨基酸残基突变为D、H、K、M、P、Q、V、W或Y,和/或,和/或,第128位氨基酸残基突变为G或K,和/或,第131位氨基酸残基突变为E、N、P、T或Y,和/或,第133位氨基酸残基突变为G、N、R或T,和/或,第135位氨基酸残基突变为A、C、E、I、K、M、N或Q,和/或,第137位氨基酸残基突变为A、C、K、M、N、P或Q,和/或,第138位氨基酸残基突变为A、P、T或W,和/或,第139位氨基酸残基突变为F、G、K或P,和/或,第141位氨基酸残基突变为A、C、F或N,和/或,第142位氨基酸残基突变为A、C、F、G、H、M、Q、S、T、V或Y,和/或,第143位氨基酸残基突变为A、H、K、N、Q、S、T、W或Y,和/或,第144位氨基酸残基突变为A、D、E、G、I、L、P或V,和/或,第145位氨基酸残基突变为C、E、H、L、S、T、V或W,和/或,第146位氨基酸残基突变为C、D、H或V,和/或,第147位氨基酸残基突变为A、D、E、F、G、H、K、L、P、R、W或Y,和/或,第149位氨基酸残基突变为C、G、H、K、L或T,和/或,第152位氨基酸残基突变为C或D,和/或,第153位氨基酸残基突变为M或W,和/或,第156位氨基酸残基突变为A、F、L、M、N、R或W,和/或,第157位氨基酸残基突变为D、F、G、I、K、L、N或Q,和/或,第158位氨基酸残基突变为D、G或N,和/或,第159位氨基酸残基突变为C、H、I、N、Q、R或W,和/或,第163位氨基酸残基突变为C、D、E、F、H、K、L、M、N、Q、R、T、V、W或Y,和/或,第167位氨基酸残基突变为A、H、N、T或V,和/或,第170位氨基酸残基突变为E、L或P,和/或,第171位氨基酸残基突变为G、H、L、M或N,和/或,第176位氨基酸残基突变为D、K、N、P、R或S,和/或,第179位氨基酸残基突变为A、I或N,和/或,第180位氨基酸残基突变为D、L或R,和/或,第184位氨基酸残基突变为D、F、H、R或W,和/或,第188位氨基酸残基突变为A、C、E、F、G、K、L、N、T、W或Y,和/或,第189位氨基酸残基突变为C、E、K、M、N、Q、S或V,和/或,第190位氨基酸残基突变为A、C、H、I、K、L、M、N、S或T,和/或,第191位氨基酸残基突变为D、E、F、H、I、L、M、P、S、T或Y,和/或,第192位氨基酸残基突变为A、D、E、I、R或S,和/或,第193位氨基酸残基突变为A、C、E、F、H、K、L、M、N、P、S或T,和/或,第194位氨基酸残基突变为A、C、D、F、G、H、I、P、R、S或V,和/或,第195位氨基酸残基突变为A、D、F、G、H、I、L、N、S、T、V、W或Y,和/或,第196位氨基酸残基突变为G,和/或,第197位氨基酸残基突变为E、F、H、K、L、P、S、T或Y,和/或,第200位氨基酸残基突变为D、L、N、P、Q或W,和/或,第203位氨基酸残基突变为A、D、F、G、I、Q或Y,和/或,第205位氨基酸残基突变为A、C、D或T,和/或,第206位氨基酸残基突变为K、Q、S、T或V,和/或,第207位氨基酸残基突变为F、H、I、S、T、V、W或Y,和/或,第208位氨基酸残基突变为D、E、F、G、H、K、P、R或V,和/或,第209位氨基酸残基突变为A、I、K或M,和/或,第210位氨基酸残基突变为A、E、G、H、K、L、M、R或W,和/或,第211位氨基酸残基突变为A、C、E、G、I、K、M、N、Q、R、S、T或W,和/或,第212位氨基酸残基突变为C、D、F、L、M、N、P、S或W,和/或,第213位氨基酸残基突变为C或N,和/或,第214位氨基酸残基突变为I、N、S或W,和/或,第216位氨基酸残基突变为A、H、L或T,和/或,第217位氨基酸残基突变为A或G,和/或,第218位氨基酸残基突变为A、E、I或L,和/或,第219位氨基酸残基突变为C、F、K、M、N、T、V或W,和/或,第220位氨基酸残基突变为C、E、M、P、T或Y,和/或,第221位氨基酸残基突变为A、K、L、M、P或Y,和/或,第222位氨基酸残基突变为F、K、L、P、S或V,和/或,第224位氨基酸残基突变为A、G、H、N、Q、W或Y,和/或,第225位氨基酸残基突变为Q或W,和/或,第226位氨基酸残基突变为D、E、W或Y,和/或,第227位氨基酸残基突变为D、G、N、T或W,和/或,第228位氨基酸残基突变为I、L、N或V,和/或,第229位氨基酸残基突变为E、G或M,和/或,第230位氨基酸残基突变为A、C、I、L、M、Q、R、S或T,和/或,第231位氨基酸残基突变为A、D、G、H、K、P、R、S、V、W或Y,和/或,第232位氨基酸残基突变为E、F、N、Q、S、V或Y,和/或,第233位氨基酸残基突变为A、C、H、K、L、R、S、W或Y,和/或,第234位氨基酸残基突变为C、H、I、M、Q、S、V或W,和/或,第236位氨基酸残基突变为Q,和/或,第237位氨基酸残基突变为A、C、G、R或S,和/或,第238位氨基酸残基突变为G、L、Q、R、S或Y,和/或,第239位氨基酸残基突变为A、F、G、N或R,和/或,第240位氨基酸残基突变为D、E或R,和/或,第241位氨基酸残基突变为L、N、P或R,和/或,第245位氨基酸残基突变为C、I、M、R或S,和/或,第252位氨基酸残基突变为N、R、W或Y,和/或,第253位氨基酸残基突变为C、H、R或W,和/或,第254位氨基酸残基突变为S,和/或,第255位氨基酸残基突变为A或R,和/或,第256位氨基酸残基突变为G、H、I、T或W,和/或,第257位氨基酸残基突变为A,和/或,第258位氨基酸残基突变为A、I、K、N、Y,和/或,第260位氨基酸残基突变为A、E、N、S、T或Y,和/或,第261位氨基酸残基突变为G、H、I、K、T、W或Y,和/或,第263位氨基酸残基突变为E、H、N、S或V,和/或,第264位氨基酸残基突变为D、F、G、I、K、Q或S,和/或,第265位氨基酸残基突变为A、C、G、K、M、P、Q、R或V,和/或,第266位氨基酸残基突变为A、C、H、N或P,和/或,第267位氨基酸残基突变为I、L、S或Y,和/或,第268位氨基酸残基突变为E、L或R,和/或,第269位氨基酸残基突变为C、F、K、L、N、R或V,和/或,第270位氨基酸残基突变为E、G、H、M、P、S、T、V或Y,和/或,第271位氨基酸残基突变为I、L、W,和/或,第272位氨基酸残基突变为V,和/或,第277位氨基酸残基突变为E,和/或,第278位氨基酸残基突变为T,和/或,第280位氨基酸残基突变为D、I、K、L、R或S,和/或,第281位氨基酸残基突变为W或Y,和/或,第282位氨基酸残基突变为A、E、I、L、N或R,和/或,第283位氨基酸残基突变为C、I、M、R或Y,和/或,第284位氨基酸残基突变为L或R,和/或,第285位氨基酸残基突变为F、L、P、T、W或Y,和/或,第286位氨基酸残基突变为V,和/或,第289位氨基酸残基突变为I、L、N、R、S、T或W,和/或,第294位氨基酸残基突变为D、E、F、K或S,和/或,第295位氨基酸残基突变为A、L或Q,和/或,第297位氨基酸残基突变为D、H、K、M或N,和/或,第298位氨基酸残基突变为E、F、T、W或Y,和/或,第299位氨基酸残基突变为A、E、G、N或Y,和/或,第300位氨基酸残基突变为A、K、Q、T、W或Y,和/或,第301位氨基酸残基突变为E、M或T,和/或,第302位氨基酸残基突变为A、C、G、H、Q、T或V,和/或,第304位氨基酸残基突变为A、D、E、L、S或W,和/或,第305位氨基酸残基突变为D、L、Q、R、S或T,和/或,第306位氨基酸残基突变为E、G、H、I、K、R或V,和/或,第307位氨基酸残基突变为A、C、D、E、G、H、K、N或V和/或,第309位氨基酸残基突变为C、D、H、R、S、T、V,和/或,第310位氨基酸残基突变为H、L、P或Q,和/或,第311位氨基酸残基突变为L或P,和/或,第312位氨基酸残基突变为D、E、H、I、M、Q、R或V,和/或,第313位氨基酸残基突变为E、K、L、N、R或S,和/或,第314位氨基酸残基突变为A、F、K、L、P或W,和/或,第315位氨基酸残基突变为E,和/或,第316位氨基酸残基突变为Q或V,和/或,第317位氨基酸残基突变为E、H、P或R,和/或,第322位氨基酸残基突变为A或K,和/或,第324位氨基酸残基突变为H、I、T或V,和/或,第325位氨基酸残基突变为P、T、V或W,和/或,第326位氨基酸残基突变为D,和/或,第328位氨基酸残基突变为K、N或S,和/或,第329位氨基酸残基突变为A、E、H、M、Q、R、S或V,和/或,第331位氨基酸残基突变为C、G或V,和/或,第333位氨基酸残基突变为P;所述的突变体的还选自如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第126位氨基酸残基突变为A、D、E、F、L、P、Q、R、S、T、或V,和/或,第127位氨基酸残基突变为A、H、K、M、N、Q、S、T或V,第130位氨基酸残基突变为A或S,和/或,第132位氨基酸残基突变为A、D、F、G、H、I、K、L、P、Q、R、S或W,和/或,第136位氨基酸残基突变为A、E、F、G、H、I、L、N、R、S、T或Y,第160位氨基酸残基突变为A、D、E、G、K、M、R、T或V,和/或,第164位氨基酸残基突变为A、C、D、P、R、T或Y,和/或,第165位氨基酸残基突变为D、L或Q,和/或,第182位氨基酸残基突变为G、K、S或T,和/或,第215位氨基酸残基突变为A、C、D、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T或Y,和/或,第235位氨基酸残基突变为A或L,和/或,第243位氨基酸残基突变为F、N、R、S、T、W或Y,和/或,第290位氨基酸残基突变为F、H或T,和/或,第292位氨基酸残基突变为C、E、G、I、K或V,和/或,第308位氨基酸残基突变为A、D、G、K、M、N或S,和/或,第327位氨基酸残基突变为A、H、I、M、Q、R、T或V。
6.如权利要求1所述的不对称法,其特征在于,所述的突变体的突变位置和种类如表1所示:
表1
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7.一种羰基还原酶的突变体,其中所述羰基还原酶为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列,所述的突变体为如权利要求1~6所述的不对称还原方法中所定义的突变体。
8.一种分离的核酸,其中所述核酸编码如权利要求7所述的羰基还原酶的突变体。
9.一种重组表达载体,其中所述重组表达载体包含如权利要求8所述的核酸。
10.一种转化体,其中所述转化体包含如权利要求9所述的重组表达载体。
11.一种制备羰基还原酶突变体的方法,其培养如权利要求10所述的转化体并获得含羰基还原酶突变体的培养物,即得。
12.一种如权利要求7所述的羰基还原酶或其突变体在制备不对称手性还原剂中的应用。
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