CN112961844B

CN112961844B - 一种细胞色素p450单加氧酶突变体及其应用

Info

Publication number: CN112961844B
Application number: CN202110230094.1A
Authority: CN
Inventors: 石金田; 许国超; 贾煊杰; 倪晔; 郑香玉
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2021-03-02
Filing date: 2021-03-02
Publication date: 2022-03-01
Anticipated expiration: 2041-03-02
Also published as: CN112961844A

Abstract

本发明公开了一种细胞色素P450单加氧酶突变体及其应用。本发明提供的细胞色素P450单加氧酶突变体L84Q/D93A对石胆酸的羟化活力为5.6U/mg，是野生型CYP活力的42.4倍，具有较高的催化活性和稳定的催化效果，随着底物浓度的提升至500mmol/L，L84Q/D93A仍然能在24h将石胆酸进行完全转化。因此，本发明所述细胞色素P450单加氧酶及其基因具有很好的工业应用开发前景。

Description

一种细胞色素P450单加氧酶突变体及其应用

技术领域

本发明涉及酶工程技术领域，尤其涉及一种细胞色素P450单加氧酶突变体及其应用。

背景技术

熊去氧胆酸(UDCA)，化学名为3a,7β-二羟基-5β-胆甾烷-24-酸，为白色粉末状固体，分子式为C₂₄H₄₀O₄，分子量为392.57，CAS号为128-13-2，熔点为203℃，沸点为547℃，几乎不溶于水。

熊去氧胆酸已被广泛应用于医药领域，用于治疗治疗胆结石、胆汁淤积性肝病、脂肪肝、各型肝炎、中毒性肝障碍、胆囊炎、胆道炎和胆汁性消化不良、胆汁返流性胃炎、眼部疾病等。熊去氧胆酸的合成有化学法和生物法两种。其中化学合成法一般采用从胆酸出发七步合成或从非胆酸类甾体出发来完成熊去氧胆酸的制备，此两种方法都存在反应收率低、产物纯度低、生产成本高的缺点，难以工业化生产。与化学法相比，生物法具有反应条件温和、转化率高、经济和环境效益较高等优点。生物法包括动力学拆分和合成。

生物合成法研究较多的是用野生菌或重组工程菌的整细胞或游离酶进行催化。Catherine Juste等报道了从人体排泄物中分离得到的五种菌都能将鹅脱氧胆酸转化为熊去氧胆酸，经过基因序列比对确定这五种菌都是Clostridium baratii。五种菌在培养48h后，熊去氧胆酸最高产率为75.9％，最低产率为52.0％；Ian A.Macdonald等人成功分离8种野生菌(Clostridium absonum)，它们都同时包含7α-和7β-HSDH，利用这些野生菌能将胆酸转化成熊胆酸或将鹅脱氧胆酸转化成熊脱氧胆酸。但是整细胞转化胆酸或鹅脱氧胆酸的浓度分别低于1.5mM和0.5mM，更高浓度则会抑制细胞生长和底物转化。分别培养15-22h和9-15h后产率为60-70％；SergioRiva等报道了从胆酸一锅煮合成12-羰基-熊去氧胆酸的方法，反应中混合了五种酶，其中三种酶是：7α-HSDH克隆自B.fragilis菌株、12α-HSDH来源于未知序列的商业途径和7β-HSDH克隆自C.absonum，其中前两种酶起氧化作用，属于NADH依赖型，7β-HSDH起氧化作用，属于NADPH依赖性，通过不同的辅酶依赖性，结合不同的辅酶循环实现一锅煮。为了NAD⁺的再生，采用了乳酸脱氢酶/丙酮酸系统，同样为了NADP⁺的再生，采用了来源于Thermoplasma acidophilum的高度NADPH依赖性的葡萄糖脱氢酶。反应5h之后胆酸完全转化为12-羰基-熊去氧胆酸，但是24h之后又有中间产物出现，所以没有实现真正的一锅煮；DirkWeuster-Botz等研究将3α-HSDH和7β-HSDH以及FDH的基因整合到一个质粒上，研究了他们之间在质粒上不同位置对产酶的影响。利用新构建的整细胞催化脱氢胆酸合成12-羰基-熊去氧胆酸，可以在21h内将70mM的脱氢胆酸99％转化为12-羰基-熊去氧胆酸。该批产品分离后的纯度是95％。

然而，以上方法仅限于实验室规模，且存在羟化酶的自身活力低，产物浓度不高，步骤繁琐以及酶热稳定性差等缺陷，不适合工业化生产熊去氧胆酸。因此，筛选活力高，且能在较短时间内获得较高产物浓度的细胞色素P450单加氧酶，以满足工业化生产熊去氧胆酸的需求具有非常重要的意义，本实验室筛选得到一种细胞色素P450单加氧酶，催化石胆酸生产熊去氧胆酸，底物石胆酸浓度达到50mmol/L，反应24h，产物摩尔收率为95.9％，光学纯度为99％(R)，但是底物浓度依然达不到工业生产的要求。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种细胞色素P450单加氧酶突变体，活力较野生型有较大程度的提高，且底物浓度能够达到500mmol/L。

本发明的第一个目的是提供了一种细胞色素P450单加氧酶突变体，所述的细胞色素P450单加氧酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第二个目的是提供一种编码所述的细胞色素P450单加氧酶突变体的基因。

进一步地，所述的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第三个目的是提供一种携带所述的基因的表达载体。

本发明的第四个目的是提供一种表达所述的细胞色素P450单加氧酶突变体的重组菌。

本发明的第五个目的是提供所述的细胞色素P450单加氧酶突变体在催化石胆酸氧化合成熊去氧胆酸中的应用，具体包括：在缓冲液中，在所述细胞色素P450单加氧酶突变体的催化下，利用石胆酸进行氧化反应，形成熊去氧胆酸。

进一步地，所述的缓冲液为磷酸盐浓度为0.1～0.2mol/L的磷酸盐缓冲液。

进一步地，所述的氧化反应的温度为25～35℃；反应时间为2～24小时。

进一步地，所述的石胆酸的浓度为1～500mmol/L。

进一步地，所述的细胞色素P450单加氧酶突变体的用量为1～100kU/L。

进一步地，所述的细胞色素P450单加氧酶突变体的添加形式为含有细胞色素P450单加氧酶突变体的粗酶液或冻干细胞。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

本发明提供的细胞色素P450单加氧酶突变体L84Q/D93A对石胆酸的羟化活力为5.6U/mg，是野生型CYP活力的42.4倍，具有较高的催化活性和稳定的催化效果，随着底物浓度的提升至500mmol/L，L84Q/D93A仍然能在24h将石胆酸进行完全转化。因此，本发明所述细胞色素P450单加氧酶及其基因具有很好的工业应用开发前景。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例说明如后。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。其中所述室温为本领域常规室温，室温范围是20～40℃。

表达质粒pET28a购自上海Novagen公司。

E.coli DH5α和E.coli BL21(DE3)感受态细胞，2×Taq PCR MasterMix，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，DNAMarker，购自北京天根生化科技有限公司。

限制性内切酶NdeI和XhoI购自大连宝生物有限公司。

实施例1：细胞色素P450单加氧酶L84Q/D93A的构建

根据白色异库茨涅尔氏菌(Allokutzneria albata)的细胞色素P450单加氧酶CYP为模板(登录号：SDN52915.1)，设计定点突变引物如下(SEQ ID NO.3～4)：

L84Q/D93A-F:

ACGCCGCTGCCGCAGGACCCCGAAGGCATCCTGGGCATGGCCGCGCCCGA

L84Q/D93A-R:

TCGGGCGCGGCCATGCCCAGGATGCCTTCGGGGTCCTGCGGCAGCGGCGT

其中，下划线示意突变序列。

以含有白色异库茨涅尔氏菌P450单加氧酶的重组质粒pET28a-CYP为模板，进行全质粒PCR扩增。PCR体系为：上游引物和下游引物各1μL(0.3μmol/L)，pET28a-CYP模板1μL(0.1μg)，dNTP 5.0μL，Mg²⁺3.0μL，PrimeStar Buffer 5.0μL，PrimeStar DNA聚合酶1.0μL，ddH₂O补足至50μL。PCR扩增程序为：(1)96℃，预变性3min；(2)95℃，变性30s；(3)55℃退火30s；(4)72℃延伸6min；步骤(2)～(4)重复20个循环；(5)72℃继续延伸10min，冷却至4℃。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物。获得含有细胞色素P450单加氧酶突变酶L84Q/D93A的全长基因序列，经DNA测序验证正确，命名为L84Q/D93A。所述基因核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。

将上述PCR产物经DpnI消化去除模板，消化体系为：DpnI Buffer 2.0μL，DpnI 1.0μL，PCR产物4.0μL，ddH₂O补足至20μL。吸取10μL消化产物转化到大肠埃希氏菌E.coli DH5α感受态细胞中，在含有卡那霉素的抗性平板上对阳性重组体进行筛选，挑取单克隆，菌落PCR验证阳性克隆。培养重组菌，待质粒扩增后提取质粒，即重组质粒pET28a-L84Q/D93A，基因测序验证阳性克隆。

实施例2：细胞色素P450单加氧酶突变酶L84Q/D93A重组表达转化体的制备

将实施例1所得的带有细胞色素P450单加氧酶突变酶L84Q/D93A的重组质粒pET28a-L84Q/D93A重新转化至大肠埃希氏菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，转化液涂布到含有卡那霉素的LB平板上，37℃倒置培养过夜，即获得阳性重组转化体大肠埃希氏菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-L84Q/D93A，菌落PCR和基因测序验证阳性克隆。

实施例3：细胞色素P450单加氧酶突变酶L84Q/D93A的表达

将实施例2所得的细胞色素P450单加氧酶突变酶L84Q/D93A重组表达转化体，接种至含卡那霉素的LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，pH7.0)中，37℃振荡培养过夜，按1％(v/v)的接种量接入装有100mL LB培养基的500mL三角瓶中，置于37℃、180rpm摇床振摇培养，当培养液的OD₆₀₀达到0.6时，加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG作为诱导剂，25℃诱导12h后，将培养液离心，收集细胞，并用生理盐水洗涤两次，得静息细胞，冷冻干燥24h即可得冻干细胞，收集后4℃保存。还可将所得的静息细胞悬浮于pH7.0的缓冲液中，在冰浴中超声破碎，离心收集上清液，即为重组细胞色素P450单加氧酶突变酶L84Q/D93A的粗酶液。所得粗酶液经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，重组细胞色素P450单加氧酶突变酶L84Q/D93A以可溶的形式存在。

实施例4：细胞色素P450单加氧酶活力的测定

通过检测340nm处吸光值变化的方式，利用酶标仪测定细胞色素P450单加氧酶的活力。细胞色素P450单加氧酶活力测定方法如下：于200μL反应体系(100mg/mLDMSO溶液，pH7.0)中，加入1mmol/L石胆酸，1mmol/LNADPH，加入适量实施例3制备的粗酶液，迅速混匀，检测340nm处吸光值的变化。每单位细胞色素P450单加氧酶的活力(U)定义为在上述条件下，每分钟催化1μmol NADPH的氧化所需的酶量。

经测定，单加氧酶突变酶L84Q/D93A对石胆酸的羟化活力为5.6U/mg，是野生型CYP活力的42.4倍(0.132U/mg)。

实施例5～10：细胞色素P450单加氧酶突变酶L84Q/D93A催化石胆酸反应

在100mg/mL DMSO溶液中加入实施例4制备的细胞色素P450单加氧酶突变酶L84Q/D93A的粗酶液，分别加入终浓度为10，40，80，100，200或500mmol/L的石胆酸，突变酶L84Q/D93A的添加量为1，5，10，20，40和100kU/L。反应都在28℃下进行，通过补充碱液1.0M KOH使反应液pH控制在7.0。反应24小时，通过离心(3000×g，10分钟，4℃)停止反应。转化率的分析结果见表1。突变酶L84Q/D93A具有较高的催化活性和稳定的催化效果，随着底物浓度的提升至500mmol/L，L84Q/D93A仍然能在24h将石胆酸进行完全转化，而野生型在底物浓度超过50mmol/L后，出现明显抑制作用，无法完全转化。因此，突变酶L84Q/D93A表现出了良好的工业应用潜力。

将实施例10反应液的上清转移至新的离心管中，用1.0M HCl调节pH至5.0，移入分液漏斗中，加入2倍体积的乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，加入无水Na₂SO₄过夜干燥后旋蒸至恒重即可得到熊去氧胆酸。所得产物为白色晶体，产物摩尔收率为98％，光学纯度为99％(R)。

表1 P450突变酶L84Q/D93A催化石胆酸氧化合成熊去氧胆酸

以上仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种细胞色素P450单加氧酶突变体及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1212

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 1

atgaccgccg tcgatcccac cacctcggcg ccgtcgtacc cgttcagcct gccgagggca 60

ctcgacctcg acccgatcta cgaacgcctg cgccgcgacg agccgatcac ccgggtccgc 120

atgccctacg gcgagggcac ggcgtggctg gtcacccggc acgccgacgc caaggtcgtg 180

ctcggcgacc cgaggttcag caccgccgcg gggaccacgc cggagacccc gcgcagcacg 240

ccgctgccgc aggaccccga aggcatcctg ggcatggccg cgcccgagca cacccggctg 300

cggcgcttgg tggccaaggc gttcaccgcg cgccgggtcg agcagatgcg gccccggctg 360

cgtgaggtgg tcgacgccgc gctcacggag atggagcagc acggcgcgcc cgccgacctg 420

gtgcacttcc tggcgctgcc gctgcccgtg acggtcatct gcgacatgct cggcgtgccc 480

tacgaggacc ggcacctgtt ccgcgagttc tccgacgccg ccctgtcgac cacgaagtac 540

accccggagc agatccgcga cgcacgggac aagttcctcg cctacatggg cggcctggtc 600

gcgcagcgcc gcgcggagcc caccgacgac ctgctcggcg cactcgtgct ggccagggac 660

aacgacgacc ggctctcgga gatggagctg gtgcggctgg gcatcggtct gctcgtcgcg 720

ggccacgaga ccacggcgaa ccagctcacg aacttcacct acctgctgct cagcgagcgg 780

gagcggtacg aggcgctggt cgccgacccg tcgctggtgc ccgcggccgt ggaggagatg 840

ctgcgcttca ccccgctcgg cgcctccggc ggcttcgtgc gggtcgcgct ggaggacgtg 900

gagctggccg gggtgaccgt gcgcaagggg gagtccgtct tcgcccagct cgcgtcggcc 960

aaccgggacg aggcgatctt cgaccagccg gaccggatcg acttcacccg gcagcacaac 1020

ccgcacatgg ccttcgggca cggcgtgcac cactgcctcg gcgcgcagct tgcccgcttg 1080

gagctgcagg tggcgctgga ggggatgatc gcccgcttcc cgggcctgcg cttcgccgtg 1140

cccgcggagg agctgccctg gcgcacgggg atgctcgtcc ggggactgga agcccttccg 1200

gtgagctggt ga 1212

<210> 2

<211> 403

<212> PRT

<213> （人工序列）

<400> 2

Met Thr Ala Val Asp Pro Thr Thr Ser Ala Pro Ser Tyr Pro Phe Ser

1 5 10 15

Leu Pro Arg Ala Leu Asp Leu Asp Pro Ile Tyr Glu Arg Leu Arg Arg

20 25 30

Asp Glu Pro Ile Thr Arg Val Arg Met Pro Tyr Gly Glu Gly Thr Ala

35 40 45

Trp Leu Val Thr Arg His Ala Asp Ala Lys Val Val Leu Gly Asp Pro

50 55 60

Arg Phe Ser Thr Ala Ala Gly Thr Thr Pro Glu Thr Pro Arg Ser Thr

65 70 75 80

Pro Leu Pro Gln Asp Pro Glu Gly Ile Leu Gly Met Ala Ala Pro Glu

85 90 95

His Thr Arg Leu Arg Arg Leu Val Ala Lys Ala Phe Thr Ala Arg Arg

100 105 110

Val Glu Gln Met Arg Pro Arg Leu Arg Glu Val Val Asp Ala Ala Leu

115 120 125

Thr Glu Met Glu Gln His Gly Ala Pro Ala Asp Leu Val His Phe Leu

130 135 140

Ala Leu Pro Leu Pro Val Thr Val Ile Cys Asp Met Leu Gly Val Pro

145 150 155 160

Tyr Glu Asp Arg His Leu Phe Arg Glu Phe Ser Asp Ala Ala Leu Ser

165 170 175

Thr Thr Lys Tyr Thr Pro Glu Gln Ile Arg Asp Ala Arg Asp Lys Phe

180 185 190

Leu Ala Tyr Met Gly Gly Leu Val Ala Gln Arg Arg Ala Glu Pro Thr

195 200 205

Asp Asp Leu Leu Gly Ala Leu Val Leu Ala Arg Asp Asn Asp Asp Arg

210 215 220

Leu Ser Glu Met Glu Leu Val Arg Leu Gly Ile Gly Leu Leu Val Ala

225 230 235 240

Gly His Glu Thr Thr Ala Asn Gln Leu Thr Asn Phe Thr Tyr Leu Leu

245 250 255

Leu Ser Glu Arg Glu Arg Tyr Glu Ala Leu Val Ala Asp Pro Ser Leu

260 265 270

Val Pro Ala Ala Val Glu Glu Met Leu Arg Phe Thr Pro Leu Gly Ala

275 280 285

Ser Gly Gly Phe Val Arg Val Ala Leu Glu Asp Val Glu Leu Ala Gly

290 295 300

Val Thr Val Arg Lys Gly Glu Ser Val Phe Ala Gln Leu Ala Ser Ala

305 310 315 320

Asn Arg Asp Glu Ala Ile Phe Asp Gln Pro Asp Arg Ile Asp Phe Thr

325 330 335

Arg Gln His Asn Pro His Met Ala Phe Gly His Gly Val His His Cys

340 345 350

Leu Gly Ala Gln Leu Ala Arg Leu Glu Leu Gln Val Ala Leu Glu Gly

355 360 365

Met Ile Ala Arg Phe Pro Gly Leu Arg Phe Ala Val Pro Ala Glu Glu

370 375 380

Leu Pro Trp Arg Thr Gly Met Leu Val Arg Gly Leu Glu Ala Leu Pro

385 390 395 400

Val Ser Trp

<210> 3

<211> 50

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 3

acgccgctgc cgcaggaccc cgaaggcatc ctgggcatgg ccgcgcccga 50

<210> 4

<211> 50

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 4

tcgggcgcgg ccatgcccag gatgccttcg gggtcctgcg gcagcggcgt 50

Claims

1.一种细胞色素P450单加氧酶突变体，其特征在于，所述的细胞色素P450单加氧酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一种编码权利要求1所述的细胞色素P450单加氧酶突变体的基因。

3.一种携带权利要求2所述的基因的表达载体。

4.一种表达权利要求1所述的细胞色素P450单加氧酶突变体的重组菌。

5.权利要求1所述的细胞色素P450单加氧酶突变体在催化石胆酸氧化合成熊去氧胆酸中的应用，其特征在于，具体包括：在缓冲液中，在所述细胞色素P450单加氧酶突变体的催化下，利用石胆酸进行氧化反应，形成熊去氧胆酸。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的缓冲液为磷酸盐浓度为0.1～0.2mol/L的磷酸盐缓冲液。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的氧化反应的温度为25～35℃；反应时间为2～24小时。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的石胆酸的浓度为1～500mmol/L。

9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的细胞色素P450单加氧酶突变体的用量为1～100kU/L。

10.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的细胞色素P450单加氧酶突变体的添加形式为含有细胞色素P450单加氧酶突变体的粗酶液或冻干细胞。