CN117343948A - 硝基还原酶EcNTR的重组表达质粒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种硝基还原酶EcNTR的重组表达质粒及其应用，通过PCR扩增等基因工程手段从Enterobacter cloacae菌株获得硝基还原酶EcNTR基因，将之构建为pET28a(+)‑EcNTR重组质粒，进一步构建E.coli BL21(DE3)‑pET28a(+)‑EcNTR重组工程菌，并用于还原硝基类化合物制备芳香胺，特别用于转化间硝基苯乙酮制备苯肾上腺素药物、抗肿瘤药物及镇静催眠药合成中的重要中间体间氨基苯乙酮。该硝基还原酶EcNTR具有广泛的底物谱，可催化多种硝基化合物的还原反应。

Description

硝基还原酶EcNTR的重组表达质粒及其应用
技术领域
本发明涉及一种硝基还原酶EcNTR的重组表达质粒及其在制备氨基苯衍生物中的应用。
背景技术
间氨基苯乙酮(3-Aminoacetophenone)，CAS号99-03-6，分子式C8H9NO，分子量135.16，密度1.1031g/ml，沸点289-290℃，不溶于水，易溶于有机溶剂。间氨基苯乙酮不仅是一种重要的精细有机合成中间体，而且在苯肾上腺素药物、抗肿瘤药物及镇静催眠药扎来普隆的制备中有重要应用。间氨基苯乙酮下游产品也具有重要用途，例如：间羟基苯乙酮是合成拟肾上腺素药物的中间体；间氯苯乙酮可用于合成支气管扩张新特药、抗癜癞药等药物；3-乙酰胺基苯乙酮则是合成镇静催眠药茚地普隆的中间体。间氨基苯乙酮还可用于间二甲氨基苯乙酮和2-溴苯乙酮的合成。同时，间氨基苯乙酮作为分析试剂还可用于乙酰乙酸的分析，作为光敏性试剂在光敏性材料的制备中也有所应用。
由于间氨基苯乙酮在生产苯肾上腺素药物、抗肿瘤药物及镇静催眠药扎来普隆等药物中的重要性，开发更加经济、高效的方法制备间氨基苯乙酮就显得尤为重要。还原间硝基苯乙酮可以制备间氨基苯乙酮，目前有关间氨基苯乙酮的合成方法可分为化学法和生物法。化学合成一般由铁粉或氢气还原间硝基苯乙酮而得，传统的铁粉还原法历史悠久，工艺简单，技术成熟，但生产过程会产生大量含有芳胺的难以处理的废水和铁泥，易造成环境严重污染。以氢气为还原剂，通过催化还原间硝基苯乙酮制备间氨基苯乙酮的方法产品收率高、纯度高、污染小且产物分离简单，与传统的铁粉还原法相比，具有明显技术和成本优势。但是间硝基苯乙酮结构中硝基官能团、苯环、羰基在加氢过程均可能被还原，产物的选择性控制难度高。总之，化学法合成间氨基苯乙酮存在的问题有：步骤繁琐，催化剂价格昂贵，环境污染，温度苛刻，对设备要求高，且不符合绿色环保的新发展理念等。而生物法因其反应条件温和、环境友好、反应收率高、成本低等特性，成为目前合成间氨基苯乙酮最有效的方法之一。
发明内容
本发明目的是提供一种NAD(P)H依赖型产硝基还原酶EcNTR的菌株及其应用，本发明通过底物富集培养法从土壤中筛选获得一株阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)ZJUT16菌株，从中提取得到一段NAD(P)H依赖型硝基还原酶EcNTR基因，在此基础上重组构建基因工程菌，用于还原间硝基苯乙酮制备医药中间体间氨基苯乙酮。并通过理性设计构建二甲基亚砜(DMSO)-水相(磷酸盐缓冲液)体系来优化反应体系，解决底物水溶性差的问题，并进一步提高酶在该介质体系中的稳定性和活性，从而提高生物催化效率，为间氨基苯乙酮的制备开辟一条绿色、环保、安全、高效的生物催化路径。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
第一方面，本发明提供一种阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)ZJUT16，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General Microbiological CultureCollection Center,CGMCC)，保藏编号：CGMCC NO：28310，保藏日期：2023年8月31日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
第二方面，本发明提供上述阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)ZJUT16在还原硝基苯衍生物制备氨基苯衍生物中的应用；所述硝基苯衍生物为邻硝基苯甲醛、3-硝基邻苯二甲酸、间硝基苯乙酮、对硝基苯乙酮、2-氟硝基苯、5-溴-1，3-二氟-2-硝基苯、2-溴-1-氯-3-硝基苯、2-溴-5-氟硝基苯、5-溴-2-硝基苯甲醛中的一种或两种以上的混合物(优选为3-硝基邻苯二甲酸或间硝基苯乙酮，特别优选为间硝基苯乙酮)。
第三方面，本发明提供一种来源于所述阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)的(NAD(P)H依赖型)硝基还原酶EcNTR，所述硝基还原酶EcNTR的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
第四方面，本发明提供一种硝基还原酶EcNTR的重组表达质粒，所述硝基还原酶EcNTR的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
在本发明的一个实施例中，所述重组表达质粒的载体为pET28a(+)载体。
进一步，所述(NAD(P)H依赖型)硝基还原酶EcNTR的编码基因的核苷酸序列如SEQID NO：3所示。
更进一步，所述重组表达质粒是将SEQ ID NO：3所示核苷酸序列插入pET28a(+)载体的BamHI位点和NdeI位点之间得到的。
具体地，所述重组表达质粒按如下方法构建：
S1:通过以下引物，以阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)ZJUT16的基因组DNA为模板进行PCR，得到目的基因：
F：5’-GGAATTCCATATGATGGATCTTCAACTCA-3’；
R：5’-CGCGGATCCTTAAAGGATGGAA-3’。
S2：用限制性内切酶BamHI和NdeI对步骤S1所述目的基因进行双酶切，得到插入片段；用限制性内切酶BamHI和NdeI对pET28a(+)载体进行双酶切，得到线性化载体；将所述插入片段与所述线性化载体连接，得到所述重组表达质粒。
第五方面，本发明提供一种所述重组表达质粒构建的重组基因工程菌。
在本发明的一个实施例中，所述重组基因工程菌的宿主菌为E.coli BL21(DE3)。
第五方面，本发明提供一种所述重组基因工程菌在还原硝基苯衍生物制备氨基苯衍生物中的应用；所述硝基苯衍生物为邻硝基苯甲醛、3-硝基邻苯二甲酸、间硝基苯乙酮、对硝基苯乙酮、2-氟硝基苯、5-溴-1，3-二氟-2-硝基苯、2-溴-1-氯-3-硝基苯、2-溴-5-氟硝基苯、5-溴-2-硝基苯甲醛中的一种或两种以上的混合物(优选为3-硝基邻苯二甲酸或间硝基苯乙酮，特别优选为间硝基苯乙酮)。
具体地，所述的应用为：以所述重组基因工程菌(E.coli BL21(DE3)-pET28a(+)-EcNTR)经诱导培养获得的湿菌体或所述湿菌体经超声破碎、分离纯化提取的硝基还原酶EcNTR纯酶为催化剂，以硝基苯衍生物为底物，以有机溶剂为助溶剂，以葡萄糖为辅助底物，以NAD(P)H为辅酶，以pH6-10(优选pH7)的缓冲溶液为反应介质构成反应体系，在25-45℃、100-220rpm条件下反应6-30h(优选30℃、180rpm、12h)，所得反应液经分离纯化后获得氨基苯衍生物；所述硝基苯衍生物为邻硝基苯甲醛、3-硝基邻苯二甲酸、间硝基苯乙酮、对硝基苯乙酮、2-氟硝基苯、5-溴-1，3-二氟-2-硝基苯、2-溴-1-氯-3-硝基苯、2-溴-5-氟硝基苯、5-溴-2-硝基苯甲醛中的一种或两种以上的混合物(优选为3-硝基邻苯二甲酸或间硝基苯乙酮，特别优选为间硝基苯乙酮)。进一步，所述有机溶剂为DMSO、甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮中的一种或两种以上(优选DMSO)。
进一步，所述分离纯化为：将所述反应液离心(8000rpm，4℃，10min)，所得上清液用(等体积)乙酸乙酯萃取(3次)，合并有机层，无水Na2SO4干燥，在常温下挥发溶剂，得到氨基苯衍生物。
优选的，所述湿菌体按如下方法制备：
将含硝基还原酶EcNTR编码基因的重组基因工程菌(优选E.coli BL21(DE3)-pET28a(+)-EcNTR)接种至含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37℃、160-200rpm(优选180rpm)培养14-18h(优选16h)，获得种子液；将所述种子液以2％-4％(优选3％)的体积接种量接种至含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37℃、160-200rpm(优选180rpm)培养至OD600在0.6-0.8，加入终浓度为0.4mM的IPTG，23℃、180rpm发酵培养16h，获得发酵液；离心(发酵液经8000rpm、4℃离心10min)，所得菌体沉淀用生理盐水重悬后离心(8000rpm、4℃离心10min)，收集湿菌体。
优选的，所述缓冲溶液为pH7.0、0.1M磷酸缓冲盐溶液(PB)；所述反应体系中，所述底物的终浓度为10-50mM(优选20mM)，所述葡萄糖的终浓度为0.05-0.2M(优选0.1M)，所述NAD(P)H的终浓度为0.2-0.8mM(优选0.5mM)；
当所述催化剂为湿菌体时，所述反应体系中，所述催化剂的终浓度以湿菌体的质量计为50-250g/L(优选100g/L)；当所述催化剂为纯酶时，所述反应体系中，所述催化剂的终浓度以纯酶计为0.5-3g/L(优选2.5g/L)；
所述有机溶剂为DMSO、甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮中的一种或两种以上(优选DMSO)，所述有机溶剂的体积为所述反应体系体积的10％。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：
本发明通过底物富集培养策略从土壤中筛选获得一种具有硝基类化合物(特别是间硝基苯乙酮)还原反应能力的阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)菌属菌株ZJUT16。在此基础之上通过PCR扩增等基因工程手段从Enterobacter cloacae菌株获得硝基还原酶EcNTR基因，将之构建为pET28a(+)-EcNTR重组质粒，进一步构建E.coli BL21(DE3)-pET28a(+)-EcNTR重组工程菌，并用于还原硝基类化合物制备芳香胺，特别用于转化间硝基苯乙酮制备苯肾上腺素药物、抗肿瘤药物及镇静催眠药合成中的重要中间体间氨基苯乙酮。该硝基还原酶EcNTR具有广泛的底物谱，可催化多种硝基化合物的还原反应。
间硝基苯乙酮难溶于水，这阻碍了生物催化制备间氨基苯乙酮的生产过程。为了低成本绿色环保的解决有机底物难溶于水以及其在水相中传质低的问题。本发明在水相介质中引入构建DMSO-水相(磷酸盐缓冲液)体系来增加底物的溶解性进而提高生物催化效率，在未加DMSO的单水相体系中，20mM底物浓度条件下产率仅为12.5％，而其他条件相同情况下，在DMSO-水相(磷酸盐缓冲液)体系中产率提升至99.9％，产率提升7.9倍。
附图说明
图1为阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)菌株平板菌落形态图。
图2为阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)ZJUT16系统发育树。
图3为Enterobacter cloacae菌基因组核酸电泳图，Lane1、2均为Enterobactercloacae菌基因组。
图4为以Enterobacter cloacae菌基因组为模板PCR扩增EcNTR目的基因核酸电泳图。
图5为挑取不同单菌落进行菌落PCR核酸电泳图；各单菌落样品均为从同一平板随机挑选，后进行菌落PCR。
图6为成功构建的pET28a(+)-EcNTR重组质粒核酸电泳图，Lane1、2、3均为pET28a(+)-EcNTR重组质粒。
图7为硝基还原酶EcNTR的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺蛋白电泳图(SDS-PAG E)。硝基还原酶EcNTR分子量大小为28.1kDa，纯化获得的蛋白符合其实际分子量大小。Lane1、2为pET28a(+)-EcNTR破碎上清、破碎沉淀；Lane3为穿流液；Lan e4、5为洗涤液1、5；Lane6、7、8为洗脱液1、2、3。
图8为EcNTR催化反应体系示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明实施例所用阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)菌株由本实验室经土壤富集培养筛菌获得，硝基还原酶EcNTR基因提取自上述所筛Enterobacter cloacae菌株。本发明实施例所用硝基还原酶EcNTR由本实验室依据上述发明内容所构建工程菌制备。
本发明所述LB液体培养基组成：NaCl 10g/L，蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，溶剂为水，pH7.0。
本发明所述LB固体培养基组成：NaCl 10g/L，蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，琼脂20g/L，溶剂为水，pH7.0。
本发明实施例所用PB缓冲液是指0.1M，pH7.0磷酸盐缓冲液。
实施例1：阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)ZJUT16筛选、鉴定
通过底物富集培养从土壤中筛选富含硝基还原酶菌株的流程为：富集培养→平板复筛→种子培养→发酵培养→生物转化→气相色谱检测产物→获得优良菌株→菌种鉴定，具体如下：
1、菌株筛选
(1)土样采集：从中国浙江杭州、湖州等地采集土壤样品，取地表以下约5-10厘米的深层土样。
(2)富集培养：各取1g不同地区的土样分别于10mL的0.9％生理盐水中震荡混匀并静置1h。取土样清液1mL接种至50mL已于115℃、30min灭菌后的初筛液体培养基中，培养基中含10mmol/L的间硝基苯乙酮(已通过0.22μm滤头过滤)，30℃、180rpm恒温摇床培养2-3天，直至液体培养基明显浑浊。
初筛液体培养基：(NH4)2SO4 5g/L，MgSO4 0.25g/L，K2HPO4·3H2O 1g/L，KH2PO4 1g/L，溶剂为水，pH7.0，115℃灭菌30min。
(3)复筛：用接种环蘸取一环步骤(2)培养结束的初筛液体培养基菌液，以平板划线法接种至含10mmol/L的间硝基苯乙酮的复筛固体培养基中，30℃恒温培养箱培养至有大量单菌落长出。从复筛固体培养基平板上挑选单菌落，分别接种至对应编号的液体完全培养基，在30℃，180rpm的恒温摇床中培养至培养基明显浑浊，有大量菌体长出。并接种至固体完全培养基进行斜面保藏。
复筛固体培养基配方为：(NH4)2SO4 5g/L，MgSO4 0.25g/L，K2HPO4·3H2O 1g/L，KH2PO4 1g/L，琼脂20g/L，溶剂为水，pH7.0。
液体完全培养基配方为：葡萄糖30g/L，酵母浸出粉3g/L，(NH4)2SO4 5g/L，MgSO40.25g/L，K2HPO4·3H2O 1g/L，KH2PO4 1g/L，溶剂为水，pH7.0，于115℃下湿热灭菌30min。
固体完全培养基配方为：葡萄糖30g/L，酵母浸出粉3g/L，(NH4)2SO4 5g/L，MgSO40.25g/L，K2HPO4·3H2O 1g/L，KH2PO4 1g/L，琼脂20g/L，溶剂为水，pH7.0，于115℃下湿热灭菌30min。
(4)发酵培养：用接种环从步骤(3)保藏的斜面挑取适量菌体至对应50mL种子培养基中，30℃、180rpm过夜培养至培养基明显浑浊，有大量菌体长出。种子液培养结束后，以体积浓度3％接种量将种子液接种至150mL发酵培养基，于30℃、180rpm培养24h至培养基明显浑浊，有大量菌体长出。发酵液于4℃、8000rpm下离心10min后弃上清。菌体沉淀用20mL生理盐水重悬，4℃、8000rpm下离心10min后弃上清，收集湿菌体，用于后续生物转化反应。
发酵培养基组成：葡萄糖30g/L，酵母浸出粉3g/L，(NH4)2SO4 5g/L，MgSO4 0.25g/L，K2HPO4·3H2O 1g/L，KH2PO4 1g/L，溶剂为水，pH7.0，于115℃下湿热灭菌30min。
(5)生物转化反应：将步骤(4)湿菌体加入pH7.0、0.1M磷酸盐缓冲液(PB)，加入DMSO为助溶剂，添加底物间硝基苯乙酮构成2mL反应体系，其中湿菌体沉淀加入量为100g/L(以缓冲液体积计)，DMSO体积加入量为10％，底物加入量为10mM；在30℃生物转化反应24h，反应完成后，将所述反应液进行离心(8000rpm，4℃，10min)，反应上清液用等体积乙酸乙酯萃取(3次)后合并，收集的萃取液经无水Na2SO4干燥后在常温下挥发掉乙酸乙酯，得到产物间氨基苯乙酮后，进行气相色谱检测，具体采用实施例4方法进行检测。
筛选得到具有高转化率的优良菌株，记为菌株ZJUT16。
2、菌株鉴定：
(1)菌落形态
将菌株ZJUT16接种至固体完全培养基，30℃培养2天，观察菌落形态，经观察可知：菌落较大呈圆形，边缘整齐，表面光滑，中心略突起，颜色为黄白色，菌落质感湿润、粘稠，可轻松挑取，平板菌落观察图见图1所示。
(2)细菌16S鉴定
委托北京擎科生物技术有限公司杭州分公司对菌株ZJUT16进行细菌16S鉴定(鉴定序列见SEQ ID NO：1所示)，NCBI进行序列比对，结合菌落形态，将菌株ZJUT16鉴定为Enterobacter cloacae菌属菌株，命名为阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)ZJUT16，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General Microbiological CultureCollection Center,CGMCC)，保藏编号CGMCC NO：28310，保藏日期2023年8月31日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
SEQ ID NO：1序列：
TGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAACGGTAGCACAGAGAGCTTGCTCTCGGGTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAACGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGTGTTGTGGTTAATAACCACAGCAATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCGAAACTGGCAGGCTGGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGATTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAATCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGTCTTGACATCCACAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTGTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTTAGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGACCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGAATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTTACCACTTTGTGATTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAG。
实施例2：重组基因工程菌E.coli BL21(DE3)-pET28a(+)-EcNTR
(1)根据NCBI数据库中阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)的氧化还原酶基因(Gene ID:75145039，序列见SEQ ID NO：2所示)设计以下引物F和引物R，并交由北京擎科生物技术有限公司杭州分公司合成。
引物F：5’-GGAATTCCATATGATGGATCTTCAACTCA-3’，
引物R：5’-CGCGGATCCTTAAAGGATGGAA-3’。
SEQ ID NO：2序列：
ATGGATCTTCAACTCACCGGTAAGACCGCGCTGGTTACGGGCGCAACCGCAGGCATTGGTTTGGCCATCGCCCGCACGCTCGCTCAAGAAGGGGTTGCCGTCACCCTTACCGGACGCGACCCGGCAAAGCTGCAAAAAGCCGCGGCCACCATCACCGACGCGACGCCTGACGCACAGGTCTCCACCGTTGTCGTTGACCTCGGTACCATGAATGGAGCAGAAGCCCTGTTCGCCGCCTGCCCTGATACCGATATTCTGATTAATAACCTGGGGTTCTACGAAGCCAAAGCCTTCGCGGATATTAACGATGAAGACTGGCTGCGCATGTTCAACACCAATGTGATGTCCGGCGTCCGCCTCTCACGCCACTACTTCCCGCGCATGCTGGAGCGGAACTGGGGACGGGTAATTTTTATATCCAGCGAAGTGGGCGCCTTTACGCCGCCAGACATGGTGCATTACGGCGTCAGCAAATCAGCGCAGCTTGCTGTTTCGCGCGGTATGGCCGAACTGACCCGGGGAACCGGCGTGACGGTTAACAGCGTGCTGCCGTCGGCGACGCGCTCGGACGGCATTATTGAGTACCTTCGCCAGACCGCGCCTGCACCGGATATGACCGATCGGGAGATCGAAGCGCATTTCTTCCAGACCTACCGCCCCAGCTCGTTGATAGCCAGAATGATTGAGGCAGACGAGATCGCGGCGATGGTCGCTCTGTTAGCCAGCCCACTGGGCGCGGCATCCAACGGGGCGGCTGTACGCGTCGAGGGCGGCACGTTCCGTTCCATCCTTTAA。
(2)将实施例1筛选的Enterobacter cloacae ZJUT16单菌落接种至液体完全培养基(组成同实施例1)中，37℃、180rpm过夜培养后，参照翌圣生物科技有限公司的细菌基因组提取试剂盒说明书提取Enterobacter cloacae基因组DNA，通过0.9％核酸琼脂糖凝胶电泳进行验证(图2)。
(3)以步骤(2)中所得基因组DNA为模板，采用步骤(1)中引物F和引物R进行目的片段(EcNTR)的PCR扩增，扩增后片段通过0.9％核酸琼脂糖凝胶电泳进行验证(图3)，并送至北京擎科生物技术有限公司杭州分公司进行测序验证。
PCR扩增体系：反应总体积50μL，其中基因组模板2μL，引物F 2μL，引物R 2μL，2*Hieff PCR Master Mix 25μL，ddH2O 19μL。
PCR扩增程序为：①94℃5min，②94℃30s，③55℃30s，④72℃1min，⑤72℃10min，其中②③④循环35次。2*Hieff PCR Master Mix购自北京擎科生物技术有限公司。
(4)步骤(3)中PCR产物用生工柱式DNA胶回收提取试剂盒将目的片段(EcNTR)回收纯化，然后将目的片段(EcNTR)与pET28a(+)载体分别使用Takara内切酶BamHI及Takara内切酶NdeI进行双酶切，酶切体系于37℃条件下反应3h。
目的片段(EcNTR)双酶切反应体系为：BamHI 3μL，NdeI 3μL，10*K 6μL，EcNTR 33μL，ddH2O 15μL。
pET28a(+)载体双酶切反应体系为：BamHI 3μL，NdeI 3μL，10*K 18μL，pET28a(+)156μL。
目的片段EcNTR的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示：
ATGGATCTTCAACTCACCGGTAAGACCGCGCTGGTTACGGGCGCAACCGCAGGCATTGGTTTGGCCATCGCCCGCACGCTCGCTCAAGAAGGGGTTGCCGTCACCCTTACCGGACGCGACCCGGCAAAGCTGCAAAAAGCCGCGGCCACCATCACCGACGCGACGCCTGACGCACAGGTCTCCACCGTTGTCGTTGACCTCGGTACCATGAATGGAGCAGAAGCCCTGTTCGCCGCCTGCCCTGATACCGATATTCTGATTAATAACCTGGGGTTCTACGAAGCCAAAGCCTTCGCGGATATTAACGATGAAGACTGGCTGCGCATGTTCAACACCAATGTGATGTCCGGCGTCCGCCTCTCACGCCACTACTTCCCGCGCATGCTGGAGCGGAACTGGGGACGGGTAATTTTTATATCCAGCGAAGTGGGCGCCTTTACGCCGCCAGACATGGTGCATTACGGCGTCAGCAAATCAGCGCAGCTTGCTGTTTCGCGCGGTATGGCCGAACTGACCCGGGGAACCGGCGTGACGGTTAACAGCGTGCTGCCGTCGGCGACGCGCTCGGACGGCATTATTGAGTACCTTCGCCAGACCGCGCCTGCACCGGATATGACCGATCGGGAGATCGAAGCGCATTTCTTCCAGACCTACCGCCCCAGCTCGTTGATAGCCAGAATGATTGAGGCAGACGAGATCGCGGCGATGGTCGCTCTGTTAGCCAGCCCACTGGGCGCGGCATCCAACGGGGCGGCTGTACGCGTCGAGGGCGGCACGTTCCGTTCCATCCTTTAA。
目的片段EcNTR编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示：
MDLQLTGKTALVTGATAGIGLAIARTLAQEGVAVTLTGRDPAKLQKAAATITDATPDAQVSTVVVDLGTMNGAEALFAACPDTDILINNLGFYEAKAFADINDEDWLRMFNTNVMSGVRLSRHYFPRMLERNWGRVIFISSEVGAFTPPDMVHYGVSKSAQLAVSRGMAELTRGTGVTVNSVLPSATRSDGIIEYLRQTAPAPDMTDREIEAHFFQTYRPSSLIARMIEADEIAAMVALLASPLGAASNGAAVRVEGGTFRSIL*。
(5)通过生工柱式DNA胶回收试剂盒将酶切后的目的片段及载体回收纯化，然后将酶切后的EcNTR与pET28a(+)载体按照相应酶连体系进行连接，连接体系于25℃条件下反应30min后，获得的pET28a(+)-EcNTR重组质粒转入到E.coli DH5α感受态细胞(购自北京擎科生物技术有限公司)中，涂布于含50μg/mL卡那霉素的LB固体平板，37℃过夜培养。
酶切好的目的基因EcNTR与载体pET28a(+)酶连的体系为：5*Quick LoadingBuffer 2μL，pET28a(+)1.7μL，EcNTR 2.8μL，T4 DNA Quick Ligase 1μL，ddH2O 2.5μL。其中T4 DNA Quick Ligase及5*Quick Loading Buffer购自通用生物公司。
pET28a(+)-EcNTR重组质粒导入E.coli DH5α感受态细胞的方法为：E.coli DH5α感受态细胞冰上融化20-30min后，将10μL重组质粒加入到100μL E.coli DH5α感受态细胞中，轻轻吹打混匀后冰浴20min，再于42℃水浴热击90s，冰浴2min后，加入0.9mL LB无抗液体培养基，37℃、180rpm复苏1h。于离心机中将复苏好的菌液瞬离后弃去900μL上清，余下100μL菌液与沉淀吹打混匀后，涂布于含50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，37℃过夜培养。
(6)从步骤(5)过夜培养的平板中分别挑出8个单菌落，分别在对应编号的30μLddH2O中吹打混匀，各取10μL混匀液转入对应编号含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，于37℃、180rpm下培养过夜，各自余下的20μL分别煮沸10min，冷却后作为模板进行菌落PCR，后通过0.9％核酸琼脂糖凝胶电泳进行验证(图4)，挑选PCR出目的条带的菌落送至北京擎科生物技术有限公司杭州分公司进行测序验证。
所挑单菌落为随机挑选，菌落PCR体系为：反应总体积25μL，其中煮沸菌液模板1μL，引物F1μL，引物R1μL，2*Hieff PCR Master Mix 12.5μL，ddH2O 9.5μL。PCR扩增程序为：①94℃5min，②94℃30s，③55℃30s，④72℃1min，⑤72℃10min，其中②③④循环30次。2*Hieff PCR Master Mix购自北京擎科生物技术有限公司，引物同步骤(1)。
(7)将测序验证正确的E.coli DH5α-pET28a(+)-EcNTR重组菌通过Takara质粒DNA提取试剂盒进行pET28a(+)-EcNTR重组质粒提取，经0.9％核酸琼脂糖凝胶电泳检测验证(图5)后，将之转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞(同步骤5)，即为E.coli BL21(DE3)-pET28a(+)-EcNTR重组基因工程菌。
实施例3：E.coli BL21(DE3)-pET28a(+)-EcNTR湿菌体培养、硝基还原酶EcNTR蛋白的诱导、表达及纯化
(1)发酵培养
实施例2获得的E.coli BL21(DE3)-pET28a(+)-EcNTR重组基因工程菌甘油菌中吸取10μL接种至50mL含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、180rpm培养过夜，获得种子液。
以体积浓度3％的接种量将种子液接种至150mL含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、180rpm培养至OD600为0.6-0.8，加入终浓度为0.4mM的IPTG，23℃、180rpm诱导培养16h，获得发酵液。发酵液经8000rpm、4℃离心10min，所得菌体沉淀用生理盐水重悬后，8000rpm、4℃离心10min，收集湿菌体。
(2)粗酶液
步骤(1)湿菌体用0.1M pH7.0 PB缓冲液重悬，重悬液于冰上放置30min后，进行超声破碎(条件为：超声功率360W，超声3s，间歇7s，超声10min)，超声后的破碎液经8000rpm、4℃离心10min后弃去沉淀，所得上清即为粗酶液。
(3)纯酶
按碧云天His-Tag耐还原螯合型填料说明书处理并纯化粗酶液即可制备EcNTR纯酶液，具体操作如下：
将步骤(2)中所获粗酶液用0.45μm滤膜过滤，去除漂浮沉淀后，将粗酶液体积超滤浓缩至4ml后，粗酶液与BeyoGoldTMHis-tag耐还原螯合型介质(购自上海碧云天生物技术有限公司)按体积比8：1在0℃、40rpm摇床中缓慢摇动1h后，上样到BeyoGoldTMHis-tag填料柱，先用非变性洗涤液洗柱5次去除杂蛋白，每次洗脱1个柱体积；然后用非变性洗脱液洗脱8次，每次1个柱体积，通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)(图6)验证所收集穿流液、洗涤液和洗脱液后，对比酶的纯度及分子量，收集所有含目标蛋白的洗脱液，将洗脱液超滤浓缩，冻干后可获得硝基还原酶EcNTR的纯酶。
非变性裂解液：50mMNaH2PO4·2H2O，300mMNaCl，pH8.0；
非变性洗涤液：50mMNaH2PO4·2H2O，300mMNaCl，2mM咪唑，pH8.0；
非变性洗脱液：50mMNaH2PO4·2H2O，300mMNaCl，50mM咪唑，pH8.0。
(4)酶活鉴定
通过检测340nm处吸光值变化的方式，利用分光光度计测定硝基还原酶活力。还原酶活力测定方法如下：于2mL反应体系(100mM PB缓冲液，pH 7.0)中，加入10mM间硝基苯乙酮，0.5mMNADH，30℃保温1分钟后加入实施例3制备的适量酶液(200μL 0.136mg/mL融合酶纯酶水溶液)，迅速混匀，检测340nm处吸光值的变化。酶活力的计算公式为：酶活力(U)＝EW×V×103/(6220×l)；式中，EW为1min内340nm处吸光度的变化；V为反应液的体积，单位mL；6220为NADPH的摩尔消光系数，单位L/(mol·cm)；l为光程距离，单位cm。硝基还原酶酶活定义为：在上述条件下，每分钟催化消耗1μmol的NADPH的酶量定义为1个酶活单位。经测定，硝基还原酶酶活为0.81U。
实施例4：E.coli BL21(DE3)-pET28a(+)-EcNTR重组菌诱导表达条件优化
E.coli BL21(DE3)-pET28a(+)-EcNTR进行诱导剂(IPTG)浓度的优化，将实施例3步骤(1)中IPTG终浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mM，底物间硝基苯乙酮25mM，其他操作相同，制备得到各个湿菌体。
反应体系总体积2mL：底物间硝基苯乙酮25mM，葡萄糖0.1M，NAD(P)H 0.5mM，不同浓度IPTG诱导培养的湿菌体添加终浓度均为100g/L，DMSO体积浓度10％，反应介质0.1MpH7.0 PB缓冲液补足至2mL。于30℃、180rpm条件下反应12h，反应完成后，将所述反应液进行离心(8000rpm，4℃，10min)，反应上清液用等体积乙酸乙酯萃取3次后合并，萃取液经无水Na2SO4干燥后在常温下挥发掉乙酸乙酯，通过气相色谱(GC)检测底物和产物的含量，计算产率，结果见下表1。
气相色谱检测条件：仪器为岛津GC2014；色谱柱CP7502(25m×0.25mm×0.25μm)；进样口温度250℃，柱温130℃，检测器250℃，流速2mL/min，分流比1：15，进样量1μL。
产率计算公式如下：
式(1)中，MS：底物的分子量；MP：产物的分子量；Q：反应初始时底物的质量；P：反应结束时产物的质量
结果见下表1。
表1.不同浓度IPTG诱导产生的湿菌体催化效果
诱导剂(IPTG)浓度对工程菌表达目的蛋白具有较大影响。诱导剂浓度较低时，产酶量较低，同时诱导剂对细胞有一定毒性，浓度过高时会对细胞生长有影响，因此选定合适的诱导剂浓度很有必要。从表中结果可以看出，IPTG浓度在0.4mM以下时转化率随IPTG浓度增加而增大，IPTG浓度在0.4mM以上时转化率随IPTG浓度增加而减小，故选用0.4mM IPTG浓度为最适诱导剂浓度。
实施例5：反应时间对还原反应的影响
反应体系总体积2mL：底物间硝基苯乙酮25mM，NAD(P)H 0.5mM，葡萄糖0.1M，DMSO体积浓度10％，湿菌体添加终浓度均为100g/L，以0.1M pH7.0 PB缓冲液补足2mL。分别在30℃、180rpm条件下反应6h、12h、18h、24h、30h。反应完成后，将所述反应液进行离心(8000rpm，4℃，10min)，反应上清液用等体积乙酸乙酯萃取3次后合并，萃取液经无水Na2SO4干燥后在常温下挥发掉乙酸乙酯，采用实施例4所述气相色谱GC检测，结果见表5。
表2.不同反应时间对还原反应的影响
为了适应工业化生产，反应过程中达到相同产率所需反应时间越少其时间成本越低，因此为探究不同反应时间下反应体系中产物产率因而设计此反应。由表2可知，反应时间对转化率具有较大影响，在反应6h时，其转化率就已经达到88.1％，可见该酶催化的反应非常快速，但由于相较于12h的转化率仍然较低，故后续反应时间仍选用12h。
实施例6：反应温度对还原反应的影响
反应体系总体积2mL：底物间硝基苯乙酮20mM，NAD(P)H 0.5mM，葡萄糖0.1M，DMSO体积浓度10％，湿菌体添加终浓度为100g/L，以0.1M pH7.0 PB缓冲液补足2mL。分别在25、30、35、40、45℃，180rpm条件下反应12h。反应完成后，将所述反应液进行离心(8000rpm，4℃，10min)，反应上清液用等体积乙酸乙酯萃取3次后合并，萃取液经无水Na2SO4干燥后在常温下挥发掉乙酸乙酯，采用实施例4所述气相色谱GC检测，结果见表3。
表3.不同反应温度对还原反应的影响
在不同温度下检测EcNTR的催化活力，探究不同温度对EcNTR活力的影响，设计还原反应体系。从表3中可以看出，在30℃反应时观察到酶的最大催化活力。虽然在低温范围内温度升高会增加酶与底物分子的碰撞次数，从而使催化速率提高，但当温度大于30℃时，酶的活力开始下降，这可能是由于温度过高会使酶吸收大量能量而造成维持其结构的氢键被破坏，使蛋白空间形态改变而无法发挥有效的催化功能，因此反应最好控制在30℃最有利于催化进行。
实施例7：反应pH对还原反应的影响
反应体系总体积2mL：湿菌体添加终浓度为100g/L，底物间硝基苯乙酮20mM，NAD(P)H 0.5mM，葡萄糖0.1M，DMSO体积浓度10％，以pH分别为6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的缓冲液(其中6.0、7.0为0.1M PB，8.0、9.0为0.1M Tris-HCl，10.0为0.05M甘氨酸-NaOH缓冲液)补足至2mL。分别在30℃、180rpm条件下反应24h。反应完成后，将所述反应液进行离心(8000rpm，4℃，10min)，反应上清液用等体积乙酸乙酯萃取3次后合并，萃取液经无水Na2SO4干燥后在常温下挥发掉乙酸乙酯，采用实施例4所述气相色谱GC检测，结果见表4。
表4.不同pH对还原反应的影响
从表4中可以发现EcNTR在pH7时活力最高。酶在最适pH范围内表现出活性，大于或小于最适pH，都会降低酶的活性。pH过高或过低都能改变底物分子和酶分子的带电状态，引起去折叠化和内部结构的暴露，导致酶活性的丢失，从而影响酶和底物的结合；pH除了对酶活性有很大影响外，对酶的稳定性也有很大影响。过高过低的pH会改变酶的活性中心的构象，或甚至改变整个酶分子的结构使其变性失活。因此EcNTR适合在pH7的PB缓冲液中反应。
实施例8：助溶剂对还原反应的影响
反应体系总体积2mL：底物间硝基苯乙酮20mM，NAD(P)H 0.5mM，葡萄糖0.1M，湿菌体添加终浓度为100g/L，以0.1M pH7.0 PB缓冲液补足2mL。分别以体积浓度10％的DMSO，甲醇，乙醇，异丙醇，丙酮作为助溶剂，30℃，180rpm条件下反应12h。反应完成后，将所述反应液进行离心(8000rpm，4℃，10min)，反应上清液用等体积乙酸乙酯萃取3次后合并，萃取液经无水Na2SO4干燥后在常温下挥发掉乙酸乙酯，采用实施例4所述气相色谱GC检测，结果见表5。
表5.不同助溶剂对还原反应的影响
大多数羰基还原酶的催化反应是在水相中进行的，但底物间硝基苯乙酮的水溶性较差，需要加入助溶剂提高其在水中的溶解度。本实施例总共考察了5种有机溶剂对融合酶催化活性的影响。从表5中可以看出，丙酮对硝基还原酶EcNTR的催化活性影响较大，可能是由于有机溶剂对酶有一定毒性，或导致其蛋白变性。DMSO在促进底物间硝基苯乙酮溶解的同时，对蛋白的毒性也较小，促进了还原反应的正向进行，故选用DMSO为最适助溶剂进行后续反应。
实施例9：底物浓度对还原反应的影响
反应体系总体积2mL：葡萄糖0.1M，NAD(P)H 0.5mM，湿菌体添加终浓度均为100g/L，DMSO体积浓度10％，底物间硝基苯乙酮终浓度分别为10、20、30、40、50mM，反应介质0.1MpH7.0 PB缓冲液补足2mL。于30℃、180rpm条件下反应24h。反应完成后，将所述反应液进行离心(8000rpm，4℃，10min)，反应上清液用等体积乙酸乙酯萃取3次后合并，萃取液经无水Na2SO4干燥后在常温下挥发掉乙酸乙酯，采用实施例4所述气相色谱GC检测，结果见表6。
表6.最适底物浓度的探究
为适应工业化生产需要，需要在保证产物产率及高对映体选择性的情况下尽可能高的提高反应体系中底物浓度。因此设计反应来探究不同底物浓度下的产物转化率。从表6中可知，随着底物间硝基苯乙酮浓度的增加会对体系的酶活力造成一定影响，底物浓度在20mM以上时，底物间硝基苯乙酮在溶液中的浓度越高，体系对底物间硝基苯乙酮转化率越低，说明高浓度的底物对酶蛋白具有致失活作用，而当间硝基苯乙酮的初始浓度在20mM以下时，底物对酶的限制较低，因此在进行间硝基苯乙酮的转化反应时，应选择20mM作为最佳的底物浓度。
实施例10：硝基还原酶EcNTR对不同底物的转化能力
反应体系2mL：不同底物终浓度均为20mM，葡萄糖0.1M，NAD(P)H 0.5mM，湿菌体添加终浓度100g/L，DMSO体积浓度10％，反应介质0.1M pH7.0 PB缓冲液补足2mL。于30℃、180rpm条件下反应24h。反应完成后，将所述反应液进行离心(8000rpm，4℃，10min)，反应上清液用等体积乙酸乙酯萃取3次后合并，萃取液经无水Na2SO4干燥后在常温下挥发掉乙酸乙酯，采用实施例4所述气相色谱GC检测，结果见表7。
表7.硝基还原酶EcNTR对不同底物转化能力的筛选表
本实验考察了硝基还原酶EcNTR的对不同芳香族硝基化合物的催化还原能力，由表7可得出，硝基还原酶EcNTR对大部分芳香族硝基化合物都有较好的还原能力。当硝基相连的苯环间位或对位连有吸电子基团羰基、羧基等时，硝基还原酶EcNTR展现出较强的催化活性；当苯环邻位连有基团时催化活性则会下降，猜测是当邻位连有基团时，硝基还原酶EcNTR活性位点与底物结合时空间位阻增大，导致其转化率降低。

Claims (10)

1.一种硝基还原酶EcNTR的重组表达质粒，其特征在于：所述硝基还原酶EcNTR的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
2.如权利要求1所述的重组表达质粒，其特征在于：所述重组表达质粒的载体为pET28a(+)载体。
3.如权利要求1所述的重组表达质粒，其特征在于：所述硝基还原酶EcNTR的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
4.如权利要求1所述的重组表达质粒，其特征在于：所述重组表达质粒按如下方法构建：
S1:通过以下引物，以阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)ZJUT16的基因组DNA为模板进行PCR，得到目的基因：
F：5’-GGAATTCCATATGATGGATCTTCAACTCA-3’；
R：5’-CGCGGATCCTTAAAGGATGGAA-3’
S2：用限制性内切酶BamHI和NdeI对步骤S1所述目的基因进行双酶切，得到插入片段；用限制性内切酶BamHI和NdeI对pET28a(+)载体进行双酶切，得到线性化载体；将所述插入片段与所述线性化载体连接，得到所述重组表达质粒。
5.如权利要求1所述的重组表达质粒构建的重组基因工程菌。
6.如权利要求5所述的重组基因工程菌，其特征在于：所述重组基因工程菌的宿主菌为E.coli BL21(DE3)。
7.如权利要求5所述的重组基因工程菌在还原硝基苯衍生物制备氨基苯衍生物中的应用；所述硝基苯衍生物为邻硝基苯甲醛、3-硝基邻苯二甲酸、间硝基苯乙酮、对硝基苯乙酮、2-氟硝基苯、5-溴-1，3-二氟-2-硝基苯、2-溴-1-氯-3-硝基苯、2-溴-5-氟硝基苯、5-溴-2-硝基苯甲醛中的一种或两种以上的混合物。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述的应用为：以所述重组基因工程菌经诱导培养获得的湿菌体或所述湿菌体经超声破碎、分离纯化提取的硝基还原酶EcNTR纯酶为催化剂，以硝基苯衍生物为底物，以有机溶剂为助溶剂，以葡萄糖为辅助底物，以NADPH为辅酶，以pH6-10的缓冲溶液为反应介质构成反应体系，在25-45℃、100-220rpm条件下反应6-30h，所得反应液经分离纯化后获得氨基苯衍生物；所述硝基苯衍生物为邻硝基苯甲醛、3-硝基邻苯二甲酸、间硝基苯乙酮、对硝基苯乙酮、2-氟硝基苯、5-溴-1，3-二氟-2-硝基苯、2-溴-1-氯-3-硝基苯、2-溴-5-氟硝基苯、5-溴-2-硝基苯甲醛中的一种或两种以上的混合物。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于：所述分离纯化为：将所述反应液离心，所得上清液用乙酸乙酯萃取，合并有机层，无水Na2SO4干燥，在常温下挥发溶剂，得到氨基苯衍生物。
10.如权利要求8所述的应用，其特征在于：所述反应体系中，所述底物的终浓度为10-50mM，所述葡萄糖的终浓度为0.05-0.2M，所述NADPH的终浓度为0.2-0.8mM；
当所述催化剂为湿菌体时，所述反应体系中，所述催化剂的终浓度以湿菌体的质量计为50-250g/L；当所述催化剂为纯酶时，所述反应体系中，所述催化剂的终浓度以纯酶计为0.5-3g/L；
所述有机溶剂为DMSO、甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮中的一种或两种以上，所述有机溶剂的体积为所述反应体系体积的10％。
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