CN116144617A - NADH依赖型醇脱氢酶CpSADH、编码基因、菌株及应用 - Google Patents
NADH依赖型醇脱氢酶CpSADH、编码基因、菌株及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种NADH依赖型醇脱氢酶CpSADH、编码基因、菌株及应用，本发明筛选获得一种具有强大苯乙酮类化合物还原反应能力的近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)Zjut0512菌株。在此基础之上获得醇脱氢酶CpSADH，具有广泛的底物谱，可高效高选择性催化多种前底物酮的不对称还原反应，并且对不同pH、温度均具有优异的适应能力。本发明在水相介质中引入异丙醇构建异丙醇‑水相体系来增加底物的溶解性进而提高生物催化效率，产率提升至97.5％，产率提升3.1倍。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一类S构型苯乙醇类手性醇的制备，尤其是手性醇(S)-1-(3-三氟甲基苯基)乙醇的制备，特别涉及来源于Candida parapsilosis菌属菌株的具有广泛底物谱的醇脱氢酶CpSADH、编码基因、菌株及应用。
(二)背景技术
手性醇是一类手性碳原子与活性羟基相连的化合物，手性醇(S)-1-(3-三氟甲基苯基)乙醇(S-TMPE)是一种关键手性药物中间体，可以作为手性中间体用于多种类型药物分子(杀菌剂、SOS1抑制剂)的制备。S-TMPE可用于合成广谱杀菌剂MA-20565，该杀菌剂最早由三菱化学集团发现，该化合物带有N-甲氧基亚氨基乙酰胺和取代的醛肟醚侧链作为新型药效团，具有广泛强力的杀菌活性。同时，新近研究将S-TMPE作为手性中间体用于新颖SOS1抑制剂的合成，该抑制剂可结合至SOS1催化位点并同时防止与RAS家族蛋白的相互作用及活化。其对SOS1与RAS家族蛋白，尤其KRAS的作用产生明显抑制性效应，进而降低KRAS突变癌细胞系中的ERK磷酸化以达到治疗的目的。
由于S-TMPE在生产广谱杀菌剂MA-20565等药物中的重要性，开发更加经济、高效的方法制备S-TMPE就显得尤为重要。不对称还原3-三氟甲基苯乙酮(TMAP)可以制备S-TMPE，目前有关S-TMPE的合成方法可分为生物法和化学法。化学合成拆分法存在的问题有：拆分收率较低(小于50％)，步骤繁琐，贵金属催化剂价格昂贵，环境污染，不符合绿色环保的新发展理念，对设备要求高。而生物法因其光学选择性高、反应条件温和、环境友好等特性，成为目前合成S-TMPE最有效的方法之一。但生物拆分法通过拆分外消旋体制备手性S-TMPE的理论收率仅50％，且产物为混合物，分离困难，与生物不对称合成法制备S-TMPE相比处于劣势。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种NADH依赖型醇脱氢酶CpSADH、编码基因、菌株及应用，本发明采用通用和模块化的方法通过底物富集培养从土壤中筛选获得近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)Zjut0512菌株，提取得到NADH依赖型醇脱氢酶CpSADH基因，在此基础上构建重组基因工程菌，用于S构型苯乙醇类手性醇的制备，特别是不对称还原3-三氟甲基苯乙酮(TMAP)制备手性关键中间体(S)-1-(3-三氟甲基苯基)乙醇(S-TMPE)；同时优化催化体系，通过理性设计构建合适的异丙醇-水相(磷酸盐缓冲液)比例来解决疏水底物水溶性差的问题，进一步提高酶在该介质体系中的活性、稳定性，提高生物催化效率，为进一步绿色环保安全高效地进行生物催化制备S-TMPE开辟路径。
本发明采用的技术方案是：
第一方面，本发明提供一种来源于近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)的NADH依赖型醇脱氢酶CpSADH，所述醇脱氢酶CpSADH氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。所述近平滑假丝酵母优选为近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)CCTCCNO:M 20221544。
本发明还提供一种所述醇脱氢酶CpSADH的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明还涉及含所述醇脱氢酶CpSADH的编码基因的重组质粒，以及由重组质粒构建的重组基因工程菌。所述重组质粒优选以pETDuet1载体为基础载体，所述重组基因工程菌以E.coliBL21(DE3)为宿主菌。
第二方面，本发明提供一种所述醇脱氢酶CpSADH在不对称还原苯乙酮类化合物制备S构型苯乙醇类手性醇中的应用，所述的应用为：以含醇脱氢酶CpSADH编码基因的重组基因工程菌经诱导培养获得的湿菌体或湿菌体超声破碎提取的纯酶为催化剂，以苯乙酮类化合物为底物，以异丙醇为助溶剂，以葡萄糖为辅助底物，以NADH为辅酶，以pH 6-9的缓冲溶液为反应介质构成反应体系，在25-45℃、100-220rpm条件下反应12-36h(优选30℃、180rpm、24h)，反应液分离纯化，获得S构型苯乙醇类手性醇；所述底物包括3-三氟甲基苯乙酮(TMAP)、4-氟苯乙酮、3-氟苯乙酮、4-三氟甲基苯乙酮、1-(3,5-双三氟甲基苯基)乙酮、1-(3,5-二氟苯基)乙酮、3-硝基苯乙酮、4-硝基苯乙酮、2-羟基-1-苯基乙酮、1-(4-氯-3-氟苯基)乙酮、1-(2-氟-5-硝基苯基)乙酮、3-(二氟甲氧基)苯乙酮、3-(三氟甲氧基)苯乙酮、1-(3-溴-4-氟苯基)乙酮，优选3-三氟甲基苯乙酮，对应的产物为(S)-1-(3-三氟甲基苯基)乙醇。
优选的，所述缓冲溶液为pH 7、0.1M磷酸缓冲盐溶液(PB)。
优选的，所述反应体系中底物加入终浓度为50～300mM(优选100mM)；葡萄糖加入终浓度为0.05-0.2M(优选0.1M)；NADH加入终浓度为0.2-0.8mM(优选0.5mM)；催化剂加入终浓度以纯酶计为0.4-3g/L(优选2.5g/L)，以湿菌体重量计为80-150g/L，优选120g/L；异丙醇加入体积终浓度为5％-30％(优选10％)。
优选的，所述湿菌体按如下方法制备：
将含醇脱氢酶CpSADH编码基因的重组基因工程菌(优选E.coli BL21(DE3)pETDuet1-CpSADH)接种至含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃、160-200rpm(优选180rpm)培养14-18h(优选16h)，获得种子液；将种子液以体积浓度2％-4％(优选3％)的接种量接种至含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃、160-200rpm(优选180rpm)培养至OD600在0.6～0.8，加入终浓度为0.6mM的IPTG，23℃、180rpm发酵培养16h，获得发酵液；发酵液经8000rpm、4℃离心10min，所得菌体沉淀以生理盐水重悬后8000rpm、4℃离心10min，收集湿菌体。
优选的，所述纯酶按如下方法制备：
(1)粗酶液
将湿菌体以0.1M pH7 PB重悬，重悬液于冰上放置30min，后进行超声破碎，破碎液经9000rpm、4℃离心10min后弃去沉淀，所得上清即为粗酶液；所述超声破碎条件为：超声功率150W，超声3s，间歇6s，超声20min；
(2)纯酶
将步骤(1)中所获粗酶液与BeyoGoldTM His-tag耐还原螯合型介质(购自上海碧云天生物技术有限公司)按体积比8：1混匀(优选在0℃、40rpm摇床中缓慢摇动1h)，然后上样到BeyoGoldtm His-tag填料柱，先用非变性洗涤液洗柱5次去除杂蛋白，每次洗脱1-2个柱体积；然后用非变性洗脱液洗脱5-10次(优选8次)，每次1-2个柱体积，目标蛋白洗脱液置于10000MW超滤管中在4℃、3000g下离心30min后取截留液于-53℃冻干48h，即得醇脱氢酶CpSADH纯酶；非变性洗涤液：300mM NaCl、2mM咪唑的50mM、pH8.0磷酸钠缓冲液；非变性洗脱液：300mM NaCl、50mM咪唑的50mM、pH8.0磷酸钠缓冲液。
第三方面，本发明还提供一种含所述醇脱氢酶CpSADH的编码基因的近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)Zjut0512菌株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO:M 20221544，保藏日期2022年10月07日，保藏地址：中国武汉，武汉大学。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：
本发明通过底物富集培养策略从土壤中筛选获得一种具有强大苯乙酮类化合物(特别是TMAP)还原反应能力的近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)菌属菌株Zjut0512。在此基础之上通过PCR扩增等基因工程手段从Candida parapsilosis菌株获得醇脱氢酶CpSADH基因，将之构建pETDuet1-CpSADH重组质粒，进一步构建E.coli BL21(DE3)-pETDuet1-CpSADH重组工程菌，并用于不对称还原苯乙酮类化合物制备S构型苯乙醇类手性醇，特别用于不对称转化前手性底物TMAP制备广谱杀菌剂MA-20565和SOS1抑制剂合成中的重要手性中间体S-TMPE。该醇脱氢酶CpSADH具有广泛的底物谱，可高效高选择性催化多种前底物酮的不对称还原反应，并且对不同pH、温度均具有优异的适应能力。
水分子的高极性阻碍了其在生物催化有机底物反应中的应用，TMAP难溶于水，这阻碍了生物催化制备手性醇的生产过程。为了低成本绿色环保的解决有机底物难溶于水以及其在水相中低传质的问题。本发明在水相介质中引入异丙醇构建异丙醇-水相(磷酸盐缓冲液)体系来增加底物的溶解性进而提高生物催化效率，在未加异丙醇的单水相体系中100mM底物浓度条件下产率仅为31.5％，而在异丙醇-水相(磷酸盐缓冲液)体系中其他条件相同情况下产率提升至97.5％，产率提升3.1倍。
(四)附图说明
图1为近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)菌株菌体光学显微镜形态图。
图2为Candida parapsilosis菌基因组核酸电泳图，Lane1、2均为Candidaparapsilosis菌基因组。
图3为以Candida parapsilosis菌基因组为模板PCR扩增CpSADH目的基因核酸电泳图。
图4为挑取不同单菌落进行菌落PCR核酸电泳图；各单菌落样品(单菌落1-8)均为从同一平板随机挑选后菌落PCR。
图5为成功构建的pETDuet1-CpSADH重组质粒核酸电泳图，Lane1、2均为pETDuet1-CpSADH重组质粒。
图6为CpSADH催化反应体系示意图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明实施例所用近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)菌株由本实验室经土壤富集培养筛菌获得，醇脱氢酶(CpSADH)基因提取自上述所筛Candida parapsilosis菌株。本发明实施例所用醇脱氢酶(CpSADH)由本实验室依据上述发明内容所构建工程菌制备。
本发明实施例所用PB缓冲液是指0.1M，pH 7.0磷酸盐缓冲液。
所述LB液体培养基组成(g/L)：NaCl 10，蛋白胨10，酵母提取物5，溶剂为水，pH7.0。
所述LB固体培养基是在LB液体培养基中加入18g/L的琼脂。
实施例1、近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)Zjut0512筛选、鉴定
通过底物富集培养从土壤中筛选富含羰基还原酶、醇脱氢酶菌株的流程为：富集培养→平板复筛→种子培养→发酵培养→生物转化→气相色谱检测产物→获得优良菌株→菌种鉴定，具体如下：
1、菌株筛选
(1)土样采集：从中国浙江、安徽、山东、江西等地采集土壤样品，取地表以下约5-10厘米的深层土样。
(2)富集培养：各取1g不同地区的土样分别于10mL的0.9％生理盐水中震荡混匀并静置1h。取土样清液1mL接种至50mL含1g/L的3-三氟甲基苯乙酮(TMAP，TMAP通过0.22μm滤头过滤后加入已于115℃、30min灭菌后的初筛液体培养基中)的初筛液体培养基，30℃、180rpm恒温摇床培养60h至液体培养基明显浑浊。
初筛液体培养基为(g/L)：(NH4)2SO4 5，MgSO4 0.25，K2HPO4·3H2O 1，KH2PO41，溶剂为水，pH7.0；115℃灭菌30min。
(3)复筛：用接种环取步骤(2)培养结束的初筛液体培养基菌液以平板划线法接种至含1g/L的3-三氟甲基苯乙酮(加入方法同步骤2)的复筛固体培养基，30℃恒温培养箱培养至有大量单菌落长出。分别从复筛固体培养基平板上挑选单菌落，接种至对应编号的液体完全培养基，30℃、180rpm培养24h，并接种至固体完全培养基进行斜面保藏。
复筛固体培养基配方为(g/L)：(NH4)2SO4 5，MgSO4 0.25，K2HPO4·3H2O 1，KH2PO41，琼脂15，溶剂为水，pH7.0。
液体完全培养基配方为(g/L)：葡萄糖30，酵母浸出粉3，(NH4)2SO4 5，MgSO40.25，K2HPO4·3H2O 1，KH2PO4 1，溶剂为水，pH7.0；于115℃下湿热灭菌30min。
固体完全培养基是在液体完全培养基中加入18g/L的琼脂。
(4)发酵培养：用接种环分别从步骤(3)保藏的斜面挑取适量菌体至对应50mL种子培养基中，30℃、180rpm培养过夜。种子液培养结束后种子液以体积浓度3％接种量接种至125mL发酵培养基，于30℃、180rpm培养24h。发酵液于4℃、8500rpm下离心10min后弃上清。菌体沉淀以20mL生理盐水复溶，4℃、8500rpm下离心10min后弃上清，收集湿菌体，用于生物转化反应。
发酵培养基组成：葡萄糖30，酵母浸出粉3，(NH4)2SO4 5，MgSO4 0.25，K2HPO4·3H2O1，KH2PO4 1，溶剂为水，pH7.0；于115℃下湿热灭菌30min。
(5)生物转化反应：将步骤(4)湿菌体加入pH 7.0、0.1M磷酸盐缓冲液(PB)，加入异丙醇为助溶剂，添加底物TMAP构成2mL反应体系，其中湿菌体沉淀加入量以缓冲液体积计为200g/L，异丙醇体积加入量为10％，底物加入量为20mM；在30℃生物转化反应24h，取反应液采用实施例3方法检测产物产率和对映体过剩值(e.e.％)。
筛选得到具有高转化率、高立体选择性的优良菌株，记为菌株ZJUT0512。
2、菌株鉴定：
(1)菌落形态
将菌株ZJUT0512接种至固体完全培养基，30℃培养2天，观察菌落形态为表面光滑湿润易挑起，菌落大而厚，显微镜观察图见图1所示，结果显示该菌株细胞形态较大，呈球状或椭圆状。
(2)真菌ITS鉴定
委托北京擎科生物技术有限公司杭州分公司对菌株Zjut0512进行真菌ITS鉴定(鉴定序列见SEQ ID NO.1所示)，NCBI进行序列比对，结合菌落形态，将菌株Zjut0512鉴定为Candida parapsilosis菌属菌株，命名为近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)Zjut0512，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO:M20221544，保藏日期2022年10月07日，保藏地址：中国武汉，武汉大学。
SEQ ID NO.1序列：
AATCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACAGAATGAA
AAGTGCTTAACTGCATTTTTTCTTACACATGTGTTTTTCTTTTTTTGAAAACTTTG
CTTTGGTAGGCCTTCTATATGGGGCCTGCCAGAGATTAAACTCAACCAAATTTTA
TTTAATGTCAACCGATTATTTAATAGTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTT
CTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATATGAATTGCAGATAT
TCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTTTGGTATTCCAAAGGGC
ATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCCCTCAAACCCTCGGGTTTGGTGTTGAGCGAT
ACGCTGGGTTTGCTTGAAAGAAAGGCGGAGTATAAACTAATGGATAGGTTTTTT
CCACTCATTGGTACAAACTCCAAAACTTCTTCCAAATTCGACCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATA。
实施例2、重组基因工程菌E.coliBL21(DE3)pETDuet1-CpSADH
(1)根据NCBI数据库中近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)的醇脱氢酶CpSADH基因(GenBank:AB010636.1，序列见SEQ ID NO.2所示)设计以下引物F和引物R，并交由北京擎科生物技术有限公司杭州分公司合成。
引物F：5’-CGCGGATCCATGTCAATTCCATC-3’，
引物R：5’-CCGCTCGAGGGATTCTATGGATT-3’。
SEQ ID NO.2序列：
ATGCAACATCAATAGGCACAGCATAAAAATAATCTGGAGTTTCACCCACCGTCA
AATATAAAAGCTAAAAAAAGAATGCAACTTAAAACTATCAGTTGCATTATTCACA
AGGGGGTGTTTGATTAAACGGATTTAGTTTCTAACAAAAGAACGGACTATTATTT
GAAATTTCTTGGGGTAGAACGCTACAACATACCTATAAATATCTGTTGTCGCTCTC
CTTTTTAAATGTTTAAAACCATATCAATTTTGAAATCTTTAAGATCAACAACTTCA
ACCTCCCATTACAATTTATCAAGATCTTTATATCGAAGTATGTCAATTCCATCAAG
CCAGTACGGATTCGTATTCAATAAGCAATCAGGACTTAATTTGAGAAATGATTTG
CCTGTCCACAAGCCCAAAGCGGGTCAATTGTTGTTGAAAGTTGATGCTGTTGGA
TTGTGTCATTCTGATTTACATGTCATTTACGAAGGGTTGGATTGTGGTGATAATTA
TGTCATGGGACATGAAATTGCTGGAACTGTTGCTGCTGTGGGTGATGATGTCATT
AACTACAAGGTTGGTGATCGTGTTGCCTGTGTCGGACCCAATGGATGTGGTGGG
TGCAAGTATTGTCGTGGTGCCATTGACAATGTATGTAAAAACGCATTTGGTGATT
GGTTCGGATTGGGGTACGATGGTGGGTATCAACAGTACTTGTTGGTTACTAGACC
ACGTAACTTGTCTCGTATCCCAGATAACGTATCTGCAGACGTGGCTGCGGCTTCA
ACTGATGCTGTATTGACACCATATCACGCAATCAAGATGGCTCAAGTGTCACCAA
CTTCGAATATCTTGCTTATTGGTGCTGGTGGATTGGGTGGAAATGCAATTCAAGT
TGCCAAGGCATTTGGTGCGAAAGTTACTGTTTTGGACAAAAAAAAGGAGGCTC
GTGACCAAGCAAAGAAGTTGGGTGCTGATGCAGTTTATGAAACATTGCCAGAAT
CCATTTCTCCTGGCTCTTTTTCAGCATGTTTTGATTTTGTTTCAGTGCAAGCTACA
TTTGATGTATGTCAAAAGTATGTTGAACCAAAGGGTGTAATTATGCCCGTGGGAC
TCGGTGCTCCTAATTTATCGTTTAATTTGGGAGATTTGGCATTGAGAGAAATTCG
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GTTAGTGAAGGTAAAGTTAAACCCGTTGTGAGAAGTGCCAAATTGAAGGAATTG
CCAGAGTATATTGAAAAATTGAGAAACAATGCTTATGAAGGTAGAGTTGTTTTTA
ATCCATAGAATGGGGGAGAGGCTAGGTTAAGAGGGAGTTGCGGACATAGGCTTG
GTAATTGTGGAGTTACAGGTTGAGAAAAGGTTTTGGGGTTGATTGTTTTGGAGT
TTGGGTAAGGAGATTATATAGCAATTGGGGGTTTTTCAATATGACAAGTTTTAATA
CTAGATGATGTAGCACATGTCTATTTTAGCTCTAGCTGATACCTTTCAACCACCAG
TTGAATTAAACCCAAATGAAACTGATTAGCATCATTTACAAAATCAACAAAATTG
CCATCAAGTTGGATATACTTGTGAAAATGGCCTAGATGATTCAATTGACAATTGA
TGCAAAGATTATAAAGCAACGAGTCAATCAAATCATCAGTTTTATCCCCCTTCGG
TAAATGTAGATGCTCAAGTAGTTGATGTATTGCCAATGGCGCCAGTGTTTCATGT
CGATACCCTTTTAATTGATAAAGTTTACCAAACCATGAGAGAATCAAATCACGTCGTATAA。
(2)将实施例1筛选的Candida parapsilosis Zjut0512单菌落接种液体完全培养基(组成同实施例1)中，37℃、180rpm过夜培养后，参照翊圣生物科技有限公司的真菌基因组提取试剂盒说明书提取Candida parapsilosis基因组DNA，通过0.9％核酸琼脂糖凝胶电泳进行验证(图2)。
(3)以步骤(2)中所得基因组DNA为模板，采用步骤(1)中引物F和引物R进行目的片段(CpSADH)的PCR扩增，扩增后片段通过0.9％核酸琼脂糖凝胶电泳进行验证(图3)，并送北京擎科生物技术有限公司杭州分公司进行测序验证。
PCR扩增体系：反应总体积50μL，其中基因组模板2μL，引物F 2μL，引物R 2μL，2*Hieff PCR Master Mix 25μL，ddH2O 19μL。
PCR扩增程序为：①94℃5min，②94℃30s，③55℃30s，④72℃1min，⑤72℃10min，其中②③④循环35次。2*Hieff PCR Master Mix购自北京擎科生物技术有限公司。
(4)步骤(3)中PCR产物用生工柱式DNA胶回收提取试剂盒将目的片段(CpSADH)回收纯化，然后将目的片段(CpSADH)与pETDuet1载体分别使用Takara内切酶BamHI及Takara内切酶XhoI进行双酶切，酶切体系于37℃条件下反应6h。
目的片段(CpSADH)双酶切反应体系为：BamHI 1μL，XhoI 1μL，10*K 2μL，CpSADH12μL，ddH2O 4μL。
pETDuet1载体双酶切反应体系为：BamHI 10μL，XhoI 10μL，10*K 20μL，pETDuet1158μL，ddH2O 2μL。
目的片段CpSADH的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：
ATGTCAATTCCATCAAGCCAGTACGGATTCGTATTCAATAAGCAATCAGGACTTAATTTGAGAAATGATTTGCCTGTCCACAAGCCCAAAGCGGGTCAATTGTTGTTGAAAGTTGATGCTGTTGGATTGTGTCATTCTGATTTACATGTCATTTACGAAGGGTTGGATTGTGGTGATAATTATGTCATGGGACATGAAATTGCTGGAACTGTTGCTGCTGTGGGTGATGATGTCATTAACTACAAGGTTGGTGATCGTGTTGCCTGTGTCGGACCCAATGGATGTGGTGGGTGCAAGTATTGTCGTGGTGCCATTGACAATGTATGTAAAAACGCATTTGGTGATTGGTTCGGATTGGGGTACGATGGTGGGTATCAACAGTACTTGTTGGTTACTAGACCACGTAACTTGTCTCGTATCCCAGATAACGTATCTGCAGACGTGGCTGCGGCTTCAACTGATGCTGTATTGACACCATATCACGCAATCAAGATGGCTCAAGTGTCACCAACTTCGAATATCTTGCTTATTGGTGCTGGTGGATTGGGTGGAAATGCAATTCAAGTTGCCAAGGCATTTGGTGCGAAAGTTACTGTTTTGGACAAAAAAAAGGAGGCTCGTGACCAAGCAAAGAAGTTGGGTGCTGATGCAGTTTATGAAACATTGCCAGAATCCATTTCTCCTGGCTCTTTTTCAGCATGTTTTGATTTTGTTTCAGTGCAAGCTACATTTGATGTATGTCAAAAGTATGTTGAACCAAAGGGTGTAATTATGCCCGTGGGACTCGGTGCTCCTAATTTATCGTTTAATTTGGGAGATTTGGCATTGAGAGAAATTCGAATCTTGGGTAGTTTTTGGGGAACTACTAATGATTTGGATGATGTTTTGAAATTGGTTAGTGAAGGTAAAGTTAAACCCGTTGTGAGAAGTGCCAAATTGAAGGAATTGCCAGAGTATATTGAAAAATTGAGAAACAATGCTTATGAAGGTAGAGTTGTTTTTAATCCATAG。
目的片段CpSADH编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示：MSIPSSQYGFVFNKQSGLNLRNDLPVHKPKAGQLLLKVDAVGLCHSDLHVIYEGLDCGDNYVMGHEIAGTVAAVGDDVINYKVGDRVACVGPNGCGGCKYCRGAIDNVCKNAFGDWFGLGYDGGYQQYLLVTRPRNLSRIPDNVSADVAAASTDAVLTPYHAIKMAQVSPTSNILLIGAGGLGGNAIQVAKAFGAKVTVLDKKKEARDQAKKLGADAVYETLPESISPGSFSACFDFVSVQATFDVCQKYVEPKGVIMPVGLGAPNLSFNLGDLALREIRILGSFWGTTNDLDDVLKLVSEGKVKPVVRSAKLKELPEYIEKLRNNAYEGRVVFNP。
(5)通过生工柱式DNA胶回收试剂盒将酶切后目的片段及载体回收纯化，然后按照相应酶连体系将酶切后的CpSADH与pETDuet1载体进行连接，连接体系于25℃条件下反应30min后，获得的pETDuet1-CpSADH重组质粒转入到E.coli DH5α感受态细胞(购自北京擎科生物技术有限公司)，并涂布于含100μg/mL氨苄青霉素(Amp)的LB固体平板，37℃过夜培养。
pETDuet1-CpSADH重组质粒导入E.coli DH5α感受态细胞的方法均为：100μLE.coli DH5α感受态细胞中加入10μL重组质粒，轻轻吹打后冰浴20min，再于42℃热击90s，冰浴2min，加入0.9mL LB无抗培养基，37℃、180rpm复苏1h。复苏好的菌液离心机瞬离后弃去900μL上清，余下100μL与沉淀混匀后涂布于含100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃过夜培养。
酶切好的目的基因CpSADH与载体pETDuet1酶连的酶连体系为：5*Quick LoadingBuffer 2μL，pETDuet1 2.3μL，CpSADH 2.6μL，T4 DNA Quick Ligase 1μL，ddH2O 2.1μL。其中T4 DNA Quick Ligase及5*Quick Loading Buffer购自通用生物公司。
(6)从步骤(5)过夜培养的平板中分别挑出8个单菌落溶于对应编号的20μLddH2O中，并各取10μL分别煮沸5min后作为模板进行菌落PCR，后通过0.9％核酸琼脂糖凝胶电泳进行验证(图4)，各自余下的10μL转入对应编号含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基后，于37℃、180rpm下培养过夜，并送北京擎科生物技术有限公司杭州分公司进行测序验证。
所挑单菌落为随机挑选，菌落PCR体系为：反应总体积25μL，其中煮沸菌液1μL，引物F1μL，引物R1μL，2*Hieff PCR Master Mix 25μL，ddH2O 9.5μL。PCR扩增程序为：①94℃5min，②94℃30s，③55℃30s，④72℃1min，⑤72℃10min，其中②③④循环35次。2*HieffPCR Master Mix购自北京擎科生物技术有限公司，引物同步骤(1)。
(7)将测序验证正确的E.coli DH5αpETDuet1-CpSADH重组菌通过Takara质粒DNA提取试剂盒进行pETDuet1-CpSADH重组质粒提取，经0.9％核酸琼脂糖凝胶电泳检测验证(图5)，后将之转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞(同步骤5)，即为E.coli BL21(DE3)pETDuet1-CpSADH重组基因工程菌。
实施例3、E.coli BL21(DE3)pETDuet1-CpSADH湿菌体培养、醇脱氢酶CpSADH纯化
(1)发酵培养
将实施例2获得的E.coli BL21(DE3)pETDuet1-CpSADH重组基因工程菌甘油菌10μL接种至30mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃、180rpm培养过夜，获得种子液。
将种子液以体积浓度3％的接种量接种至150mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃、180rpm培养至OD600在0.6～0.8，加入终浓度为0.6mM的IPTG，23℃、180rpm发酵培养16h，获得发酵液。发酵液经8000rpm、4℃离心10min，所得菌体沉淀以生理盐水重悬后8000rpm、4℃离心10min，收集湿菌体。
(2)粗酶液
步骤(1)湿菌体以0.1M pH7.1PB重悬，重悬液于冰上放置30min，后进行超声破碎(条件为：超声功率400W，超声3s，间歇6s，超声20min)，超声后的破碎液经9000rpm、4℃离心10min后弃去沉淀，所得上清即为粗酶液。
(3)纯酶
粗酶液按碧云天His-Tag耐还原螯合型填料说明书处理并纯化即可制备CpSADH纯酶液，具体操作如下：
将步骤(2)中所获粗酶液4mL与BeyoGoldTM His-tag耐还原螯合型介质(购自上海碧云天生物技术有限公司)按体积比8：1在0℃、40rpm摇床中缓慢摇动1h，然后上样到BeyoGoldTM His-tag填料柱，先用非变性洗涤液洗柱5次去除杂蛋白，每次洗脱1个柱体积；然后用非变性洗脱液洗脱8次，每次1个柱体积，目标蛋白洗脱液置于10000MW超滤管中在4℃、3000g下离心30min后取截留液于-53℃冻干48h，即得醇脱氢酶CpSADH纯酶，酶活为10.72U/mg。
酶活定义：每分钟催化反应生成1μmoL S-TMPE所需的酶量为1U。
非变性洗涤液：300mM NaCl、2mM咪唑的50mM、pH8.0磷酸钠缓冲液；非变性洗脱液：300mM NaCl、50mM咪唑的50mM、pH8.0磷酸钠缓冲液。
实施例4：醇脱氢酶CpSADH对不同底物选择性的筛选
筛选反应体系2mL：不同底物终浓度均为50mM，葡萄糖0.1M，NADH 0.5mM，实施例3制备的湿菌体终浓度120g/L，异丙醇10％(v/v)，反应介质0.1M pH7 PB补足2mL。于30℃、180rpm条件下反应24h。反应结束后，反应液以等体积乙酸乙酯萃取3次，乙酸乙酯层萃取液合并后用无水Na2SO4干燥并通过气相色谱(GC)检测底物和产物(S)-1-(3-三氟甲基苯基)乙醇的含量，计算产率和对映体过剩值(e.e.％)，结果见下表1。
气相色谱检测条件：仪器为岛津GC2014；手性色谱柱CP7502(25m×0.25mm×0.25μm)；进样口温度250℃，柱温120℃，检测器250℃，流速1mL/min，分流比1：15，进样量1μL。
产率计算公式如下：
式(1)中MS和MP分别为底物和产物的分子量。P和Q分别表示反应结束时产物的质量和底物的初始质量。
本发明中对映体过剩值(e.e.)计算公式如下：
式(2)中CS和CR分别代表S-TMPE和R-TMPE的浓度。
表1.醇脱氢酶CpSADH对不同底物选择性的筛选表
表1中可以看出该醇脱氢酶CpSADH对TMAP及其他多种不同底物的催化产率均高于95％，并保持了较高的e.e.值(>98％)，这表明CpSADH对多种不同模式底物酮均有较好的催化效果，具有较广泛的底物谱。且从表中可以看出当羰基相连的苯环间位和对位连有吸电子基团时的产率较连有给电子基团会提升。当苯环邻位连有基团时产率会下降，猜测是受空间位阻的影响。羰基碳相连的非苯环侧连有给电子基团时产率较连有吸电子基团会提升。
实施例5：E.coli BL21(DE3)pETDuet1-CpSADH重组菌诱导表达条件优化
将实施例3步骤(1)中IPTG终浓度分别改为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mM，其他操作相同，制备得到各个湿菌体。
将E.coli BL21(DE3)pETDuet1-CpSADH进行诱导剂(IPTG)浓度的优化，反应体系2mL：底物TMAP 100mM，葡萄糖0.1M，NADH 0.5mM，不同浓度IPTG诱导培养的湿菌体添加终浓度均为120g/L，异丙醇10％(v/v)，反应介质0.1M pH7 PB补足至2mL。于30℃、180rpm条件下反应24h后，反应液以等体积乙酸乙酯萃取3次，萃取液(上层)用无水Na2SO4干燥后采用实施例4所述气相色谱(GC)检测底物和产物含量，结果见下表2。
表2.不同浓度IPTG诱导产生的湿菌体催化效果
诱导剂(IPTG)浓度对工程菌表达目的蛋白具有较大影响。诱导剂浓度较低时，产酶量较低，同时诱导剂对细胞有一定毒性，浓度过高时会对细胞生长有影响，因此选定合适的诱导剂浓度很有必要。从表中结果可以看出，在0.6mM以下时产率随IPTG浓度增加而增大，0.6mM以上时产率随IPTG浓度增加而减小，故选用IPTG浓度0.6mM为最适诱导剂浓度进行后续反应。
实施例6：pH对还原反应的影响
使用从pH 5至pH 9的不同缓冲液作为反应体系的溶液，探究不同pH对CpSADH活力的影响，反应体系总体积2mL：实施例3步骤(3)所获得的醇脱氢酶CpSADH纯酶5mg，底物TMAP75mM，NADH 0.5mM，葡萄糖100mM，异丙醇体积浓度10％，以pH分别为5、6、7、8、9的缓冲液(其中5、6、7为0.1M PB，8、9为0.1M Tris-HCl)补足至2mL。分别在30℃、180rpm条件下反应24h。反应结束后，反应液以等体积乙酸乙酯萃取3次，萃取液(上层)用无水Na2SO4干燥后采用实施例4所述GC检测，结果见表3。
表3.不同pH对还原反应的影响
从表3中可以发现CpSADH在弱酸性至弱碱性(pH 5-9)缓冲液中表现出较高的活力，在pH 7时活力最高。pH的改变会使酶分子不同部位间的静电作用力发生变化，pH过高或过低都能破坏酶分子的稳定构象，引起去折叠化和内部结构的暴露，导致酶活性的丢失。因此CpSADH适合在pH 7的PB缓冲液中反应。
实施例7：反应时间对还原反应的影响
反应体系总体积2mL：底物TMAP 100mM，NADH 0.5mM，葡萄糖100mM，异丙醇体积浓度10％，实施例3步骤(3)所获得的醇脱氢酶CpSADH纯酶5mg，以0.1M pH7 PB补足2mL。分别在30℃、180rpm条件下反应3、6、12、18、24h。反应结束后，反应液以等体积乙酸乙酯萃取3次，萃取液(上层)用无水Na2SO4干燥后采用实施例4所述气相色谱GC检测，结果见表4。
表4.不同反应时间对还原反应的影响
反应时间对反应体系具有较大影响。为了适应工业化生产，反应过程中达到相同产率所需反应时间越少其时间成本越低，因此为探究不同反应时间下反应体系中产物产率及e.e.值而设计此反应。由表4可知，在反应3h时，其产率就已经达到91.2％，可见该酶催化的反应非常快速，但由于相较于24h的产率仍然较低，故后续反应时间仍选用24h。
实施例8：反应温度对还原反应的影响
反应体系总体积2mL：底物TMAP 100mM，NADH 0.5mM，葡萄糖100mM，异丙醇体积浓度10％，实施例3步骤(3)所获得的醇脱氢酶CpSADH纯酶5mg，以0.1M pH7 PB补足2mL。分别在25、30、35、40、45℃，180rpm条件下反应24h。反应结束后，反应液以等体积乙酸乙酯萃取3次，萃取液(上层)用无水Na2SO4干燥后采用实施例4所述气相色谱GC检测，结果见表5。
表5.不同反应温度对还原反应的影响
在不同温度下检测CpSADH的催化活力，探究不同温度对CpSADH活力的影响，设计还原反应体系。从表5中可以看出，在30℃反应时观察到最大活力，且该酶在25～45℃范围内均可以保持85％以上的最大活力，同时温度升高与降低并未影响其对映体选择性。当温度大于30℃时，酶的活力开始下降，虽然在低温范围内温度升高会增加酶与底物分子的碰撞次数而使催化速率提高，但温度过高会使酶吸收大量能量而造成维持其结构的氢键被破坏，使蛋白空间形态改变而无法发挥有效的催化功能，因此反应最好控制在30℃最有利于催化进行。
实施例9：底物浓度对还原反应的影响
反应体系总体积2mL：葡萄糖0.1M，NADH 0.5mM，实施例3步骤(3)所获得的醇脱氢酶CpSADH纯酶5mg，异丙醇体积浓度10％，底物TMAP终浓度分别为50、100、150、200、250、300mM，反应介质0.1 M pH7 PB补足2 mL。于30℃、180rpm条件下反应24 h。反应结束后，反应液以等体积乙酸乙酯萃取3次，萃取液(上层)用无水Na2SO4干燥后采用实施例4所述GC检测，结果见表6。
表6.最适底物浓度的探究
为适应工业化生产需要，需要在保证产物产率及高对映体选择性的情况下尽可能高的提高反应体系中底物浓度。因此设计反应以探究不同底物浓度下反应体系中产物产率及选择性。从上表5中可知，底物TMAP的存在会对体系的酶活力造成一定影响，在浓度100mM以上时，TMAP在溶液中的浓度越高，体系对底物TMAP转化率越低，说明高浓度的底物对酶蛋白具有致失活作用，而当TMAP的初始浓度在100mM以下时，底物对酶的限制较低，在100mM浓度时仍保持最大的转化率，因此在进行TMAP的转化反应时，应选择100mM作为最佳的底物浓度。
Claims (10)
1.一种来源于近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)的NADH依赖型醇脱氢酶CpSADH，其特征在于，所述醇脱氢酶CpSADH氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
2.一种权利要求1所述醇脱氢酶CpSADH的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
3.一种含权利要求1所述醇脱氢酶CpSADH的编码基因的重组基因工程菌。
4.一种权利要求1所述醇脱氢酶CpSADH在不对称还原苯乙酮类化合物制备S构型苯乙醇类手性醇中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的应用为：以含醇脱氢酶CpSADH编码基因的重组基因工程菌经诱导培养获得的湿菌体或湿菌体超声破碎提取的纯酶为催化剂，以苯乙酮类化合物为底物，以异丙醇为助溶剂，以葡萄糖为辅助底物，以NADH为辅酶，以pH 6-9的缓冲溶液为反应介质构成反应体系，在25-45℃、100-220rpm条件下反应12-36h，反应液分离纯化，获得S构型苯乙醇类手性醇；所述底物包括3-三氟甲基苯乙酮、4-氟苯乙酮、3-氟苯乙酮、4-三氟甲基苯乙酮、1-(3,5-双三氟甲基苯基)乙酮、1-(3,5-二氟苯基)乙酮、3-硝基苯乙酮、4-硝基苯乙酮、2-羟基-1-苯基乙酮、1-(4-氯-3-氟苯基)乙酮、1-(2-氟-5-硝基苯基)乙酮、3-(二氟甲氧基)苯乙酮、3-(三氟甲氧基)苯乙酮、1-(3-溴-4-氟苯基)乙酮。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述反应体系中底物加入终浓度为50～300mM；葡萄糖加入终浓度为0.05-0.2M；NADH加入终浓度为0.2-0.8mM；催化剂加入终浓度以纯酶计为0.4-3g/L，以湿菌体重量计为80-150g/L；异丙醇加入体积终浓度为5％-30％。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述缓冲溶液为pH 7、0.1M磷酸缓冲盐溶液。
8.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述湿菌体按如下方法制备：
将含醇脱氢酶CpSADH编码基因的重组基因工程菌接种至含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃、160-200rpm培养14-18h，获得种子液；将种子液以体积浓度2％-4％的接种量接种至含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃、160-200rpm培养至OD600在0.6～0.8，加入终浓度为0.6mM的IPTG，23℃、180rpm发酵培养16h，获得发酵液；发酵液经8000rpm、4℃离心10min，所得菌体沉淀以生理盐水重悬后8000rpm、4℃离心10min，收集湿菌体。
9.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述纯酶按如下方法制备：
(1)粗酶液
将湿菌体以0.1M pH7磷酸缓冲盐溶液重悬，重悬液于冰上放置30min，后进行超声破碎，破碎液经9000rpm、4℃离心10min后弃去沉淀，所得上清即为粗酶液；所述超声破碎条件为：超声功率150W，超声3s，间歇6s，超声20min；
(2)纯酶
将步骤(1)中所获粗酶液与BeyoGoldTMHis-tag耐还原螯合型介质按体积比8：1混匀，然后上样到BeyoGoldTMHis-tag填料柱，先用非变性洗涤液洗柱5次去除杂蛋白，每次洗脱1-2个柱体积；然后用非变性洗脱液洗脱5-10次，每次1-2个柱体积，目标蛋白洗脱液置于10000MW超滤管中在4℃、3000g下离心30min后取截留液于-53℃冻干48h，即得醇脱氢酶CpSADH纯酶；非变性洗涤液：300mM NaCl、2mM咪唑的50mM、pH8.0磷酸钠缓冲液；非变性洗脱液：300mM NaCl、50mM咪唑的50mM、pH8.0磷酸钠缓冲液。
10.一种含权利要求1所述醇脱氢酶CpSADH的编码基因的近平滑假丝酵母(Candidaparapsilosis)Zjut0512菌株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M20221544，保藏日期2022年10月07日，保藏地址：中国武汉，武汉大学。
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