CN117757826A

CN117757826A - 短链脱氢酶的重组表达质粒、重组基因工程菌及其应用

Info

Publication number: CN117757826A
Application number: CN202311851386.2A
Authority: CN
Inventors: 欧志敏; 王延妮; 邓立霞; 王娜娜; 刘美; 陶紫娟; 戴艳梅; 张清宇; 黄长顺; 罗亮丽; 唐岚; 杜理华
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2023-12-29
Filing date: 2023-12-29
Publication date: 2024-03-26

Abstract

本发明公开一种短链脱氢酶的重组表达质粒、重组基因工程菌及其应用，所述应用为以所述重组基因工程菌经诱导培养获得的湿菌体或所述湿菌体经超声破碎、分离纯化提取的短链脱氢酶纯酶为催化剂在不对称还原羰基类化合物制备醇类化合物中的应用，尤其是在不对称还原4‑氯乙酰乙酸乙酯制备(R)‑4‑氯‑3‑羟基丁酸乙酯中的应用。该催化剂具有广泛的底物谱，可高效高选择性催化多种前底物酮的不对称还原反应，并且对不同pH、温度均具有优异的适应能力。

Description

短链脱氢酶的重组表达质粒、重组基因工程菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种短链脱氢酶的重组表达质粒、重组基因工程菌及其在制备手性醇(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用，尤其涉及一种该短链脱氢酶BcSDR4的基因构建的工程菌在不对称还原制备(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用。

背景技术

将羰基不对称还原为光学仲醇以制备重要医药中间体是当下医药研发的一个重要途径，例如，4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)可以被不对称还原为(R)-CHBE与(S)-CHBE两种对映异构体，其中(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯((R)-CHBE)可以不对称合成抗生素、大环内酯类药物、γ-氨基羟基丁酸、环己二烯酮药物、肉碱等，广泛用于抗菌消炎、阿尔兹海默症、心血管疾病、膳食疲劳环节等相关药物的合成。其中大环内酯A和负霉素抗生素能抑制细菌蛋白合成和细菌增殖，R-(-)-肉碱是一种促进脂肪氧化分解、缓解疲劳的膳食成分，也可以通过(R)-CHBE合成。

(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的合成方法主要包括化学法与生物催化法。化学法是指在一定条件下，加入钌等金属手性催化剂，但由于该方法存在着催化剂价格昂贵、反应条件苛刻、反应设备精密度要求高、环境污染等缺点，发展存在局限性。和化学合成法相比，生物法制备由于具有反应条件温和、反应步骤简单、环境污染小、成本低等优点，能够解决化学制备法中的一些弊端而受到关注。其中生物法又包括不对称还原法和外消旋体拆分法，外消旋体拆分法是利用酶催化剂选择性的和其中一个对映体反应，生成其他物质，另一个对映体不参与反应或者反应速率相对较小，进而实现对映异构体的分离。而生物不对称催化法可以获得较高的立体选择性与较好的转化效果，从而减少拆分的环节。

本发明通过土壤筛菌获得了一株可以高效转化4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)为(R)-CHBE的野生菌株Burkholderia cepacia，并通过基因工程菌构建获得BL21(DE3)-pET-28a(+)-BcSDR4重组大肠杆菌，最后将BcSDR4用于酶催化不对称还原COBE制备重要手性关键中间体(R)-CHBE的反应。本发明的研究工作为通过基因挖掘与BL21(DE3)-pET-28a(+)-BcSDR4重组大肠杆菌构建实现对底物COBE催化效果的提高，以期实现低成本、绿色高效的催化模式。

发明内容

本发明的目的是提供一种大量土壤筛菌分离策略，筛选出一种可不对称还原COBE制备生成(R)-CHBE的菌株Burkholderia cepacia(CGMCC NO:28566)，以及一种基因工程重组菌的构建及其在不对称还原COBE制备手性关键中间体(R)-CHBE的应用。本发明通过土壤富集筛菌与限制性筛选的模式将筛得的野生菌株Burkholderia cepacia进行新型羰基还原酶基因的挖掘并在此基础上构建基因工程菌，并通过优化获得一种由异丙醇和水组成的体系，进一步提高酶在催化体系中的活性、稳定性，提高生物催化效率。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

第一方面，本发明提供一种洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)WZ-5，所述洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)WZ-5保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO:28566，保藏日期2023年9月27日，保藏地址：中国北京，中国科学院微生物研究所。

本发明还提供上述洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)WZ-5在不对称还原4-氯乙酰乙酸乙酯制备(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用。

第二方面，本发明提供一种短链脱氢酶的重组表达质粒，所述短链脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

在本发明的一个实施例中，所述重组表达质粒的载体为pET28a(+)载体。

进一步，所述短链脱氢酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

更进一步，所述重组表达质粒是将SEQ ID NO：3所示核苷酸序列插入pET28a(+)载体的NcoI位点和NdeI位点之间得到的。

具体地，所述重组表达质粒按如下方法构建：

S1:通过以下引物，以洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia WZ-5)的基因组DNA为模板进行PCR，得到目的基因：

F：5’-AAGAAGGAGATATACCATGGATGATTTCATTCAACGGCAAGACC-3’

R：5’-CAGTCATGCTAGCCATATGTCAGAAATTGAAGCCGTTGCCC-3’

S2：用限制性内切酶NcoI和NdeI对步骤S1所述目的基因进行双酶切，得到插入片段；用限制性内切酶NcoI和NdeI对pET28a(+)载体进行双酶切，得到线性化载体；将所述插入片段与所述线性化载体连接，得到所述重组表达质粒。

在本发明的一个实施例中，步骤S2中所述连接的方式为无缝克隆。

第三方面，本发明提供一种所述重组表达质粒构建的重组基因工程菌。

在本发明的一个实施例中，所述重组基因工程菌的宿主菌为E.coli BL21(DE3)。

第四方面，本发明还提供上述重组基因工程菌在不对称还原羰基类化合物制备醇类化合物中的应用，所述羰基类化合物为式a-l中的一种(优选为b、f、k)。尤其优选在不对称还原4-氯乙酰乙酸乙酯(k)制备(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用。

具体地，所述应用为：

以羰基类化合物为底物，以pH 7.0、0.1M磷酸缓冲盐溶液(PB)为反应介质，以异丙醇为助溶剂，以葡萄糖为辅助底物，以NAD(P)H为辅酶，以所述重组基因工程菌经诱导培养获得的湿菌体或所述湿菌体经超声破碎、分离纯化提取的短链脱氢酶纯酶为催化剂，构建反应体系，25-45℃、100-220rpm条件下反应12-36h(优选30℃、180rpm、24h)，得到含醇类化合物的反应液。

优选地，所述应用为：以4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)为底物，以pH 7.0、0.1M磷酸缓冲盐溶液(PB)为反应介质，以异丙醇为助溶剂，以葡萄糖为辅助底物，以NAD(P)H为辅酶，以所述重组基因工程菌经诱导培养获得的湿菌体或所述湿菌体经超声破碎、分离纯化提取的短链脱氢酶纯酶为催化剂，构建反应体系，25-45℃、100-220rpm条件下反应12-36h(优选30℃、180rpm、24h)，得到含(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的反应液。

进一步，所述反应体系中，底物的终浓度为10～40mM(优选40mM)，葡萄糖的终浓度为0.01-0.1g/mL(优选0.1g/mL)，NAD(P)H的终浓度为0.2-0.8mM(优选0.2mM)，所述催化剂的用量以湿菌体的质量计，终浓度为80-120g/L(优选120g/L)，异丙醇的体积浓度为5％-30％(优选5％)。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：

本发明通过底物富集培养策略从土壤中筛选获得一种具有高效催化COBE还原反应的Burkholderia cepacia菌属菌株，在此基础之上通过PCR扩增等基因工程手段从Burkholderia cepacia菌株获得短链脱氢酶BcSDR4基因，将之构建pET-28a(+)-BcSDR4重组质粒，进一步构建BL21(DE3)-pET-28a(+)-BcSDR4重组工程菌，并用于不对称转化前手性底物酮COBE制备抗生素、大环内酯类药物合成中的重要手性中间体R-CHBE。该醇脱氢酶BcSDR4具有广泛的底物谱，可高效高选择性催化多种前底物酮的不对称还原反应，并且对不同pH、温度均具有优异的适应能力。

水分子的高极性阻碍了其在生物催化有机底物反应中的应用，COBE微溶于水，这阻碍了生物催化制备手性醇的生产过程。为了低成本绿色环保的解决有机底物难溶于水以及其在水相中低传质的问题，本发明在水相介质中引入异丙醇构建异丙醇-水体系来增加底物的溶解性进而提高生物催化效率。

附图说明

图1为洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)菌体光学显微镜形态图

图2为菌株Burkholderia cepacia系统发育树构建示意图

图3为Burkholderia cepacia菌基因组核酸电泳图，Lane1、2均为Burkholderiacepacia菌基因组，Lane3、4均为以Burkholderia cepacia菌基因组为模板PCR扩增BCSDR4目的基因核酸电泳图

图4为双酶切后质粒pET-28a(+)的核酸电泳图，Lane1、2均为pET-28a(+)双酶切后的线性化载体

图5为BcSDR4催化反应体系示意图

具体实施方式

下述部分结合具体实施例对本发明所做内容进行进一步描述，但正如所知本发明的保护范围并不仅限于此：

本发明实施例所用洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)菌株由本实验室经土壤富集培养筛菌获得，短链脱氢酶(BcSDR4)基因提取自上述所筛Burkholderiacepacia菌株。本发明实施例所用短链脱氢酶(BcSDR4)由本实验室依据上述发明内容所构建工程菌制备。

本发明实施例所用PB缓冲液是指0.1M，pH 7.0磷酸盐缓冲液。

所述LB液体培养基组成(g/L)：NaCl 10，蛋白胨10，酵母提取物5，溶剂为水，pH7.0。

所述LB固体培养基是在LB液体培养基中加入16g/L的琼脂。

实施例1：洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)WZ筛选、鉴定

通过底物富集培养从土壤中筛选富含羰基还原酶、醇脱氢酶菌株的流程为：土样处理→富集培养→富集初筛→平板初筛→平板复筛→种子培养→平板划线→菌种编号保藏→种子培养→发酵培养→生物催化→气相色谱检测产物→筛得优势菌株→菌种保藏→菌种鉴定，具体如下：

1、菌株筛选

(1)土样获取：分别从天津、云南、上海、南京、浙江、山东等地的工厂、绿化带、果园、树林等地点采集土壤样品35份，采集时先将表面杂草等表面覆盖物进行清除，再用铲子将表层3-8厘米的土样铲出，进行深层土样的采集，大约每份土样采集10g。

(2)菌株筛选：将上述采集的土样分别称取约0.5g置于干净的试管中，加入5mL0.9％的生理盐水，涡旋振荡静置取上清于富集液体培养基中，再通过富集初筛与平板初复筛等操作，最终将单菌落进行种子液培养并编号与甘油菌保存。

富集培养基为(g/L)：葡萄糖25g/L，酵母提取物3g/L，硫酸铵5g/L，硫酸镁0.25g/L，三水合磷酸氢二钾1.5g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，溶剂为去离子水，最终用1M的氢氧化钠溶液调节pH为7.0左右，115℃，灭菌30min。

初筛液体培养基为(g/L)：硫酸铵5g/L，硫酸镁0.25g/L，三水合磷酸氢二钾1.5g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，COBE 10mM，溶剂为去离子水，最终用1M的氢氧化钠溶液调节pH为7.0左右。121℃，灭菌20min。

初筛固体培养基为(g/L)：葡萄糖25g/L，酵母提取物3g/L，硫酸铵5g/L，硫酸镁0.25g/L，三水合磷酸氢二钾1.5g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，琼脂粉16g/L，溶剂为去离子水，最终用1M的氢氧化钠溶液调节pH为7.0左右。115℃，灭菌30min。

初筛条件为取土样清液0.5mL接种于20mL初筛培养基中，在30℃，180rpm的恒温摇床培养72h，至液体培养基明显浑浊。用接种环取培养结束的初筛液体培养基菌液以平板划线法接种于初筛固体平板上，在30℃恒温培养箱中培养至有大量单菌落长出。

固体完全培养基为(g/L)：葡萄糖25g/L，酵母提取物3g/L，硫酸铵5g/L，硫酸镁0.25g/L，三水合磷酸氢二钾1.5g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，琼脂粉16g/L，溶剂为去离子水，最终用1M的氢氧化钠溶液调节pH为7.0左右。115℃，灭菌30min

固体复筛限制性培养基为(g/L)：硫酸铵5g/L，硫酸镁0.25g/L，三水合磷酸氢二钾1.5g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，COBE 10mM，琼脂粉16g/L，溶剂为去离子水，最终用1M的氢氧化钠溶液调节pH为7.0左右。121℃，灭菌20min。

种子液体培养基为(g/L)：葡萄糖25g/L，蛋白胨5g/L，酵母提取物3g/L，硫酸铵5g/L，硫酸镁0.25g/L，三水合磷酸氢二钾1.5g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，溶剂为去离子水，最终用1M的氢氧化钠溶液调节pH为7.0左右，115℃，灭菌30min。

(1)发酵培养：分别取(2)中保藏的甘油菌20μL接种至20mL种子培养基中，在30℃、180rpm恒温摇床培养16h。再以3％接种量接种至150mL发酵培养基，并于30℃、180rpm培养24h。

发酵液体培养基为(g/L)：葡萄糖25g/L，蛋白胨5g/L，酵母提取物3g/L，硫酸铵5g/L，硫酸镁0.25g/L，三水合磷酸氢二钾1.5g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，溶剂为去离子水，最终用1M的氢氧化钠溶液调节pH为7.0左右，115℃，灭菌30min。

(2)生物催化：发酵培养基发酵液9000rpm，10min离心后获得湿菌体，两次0.9％生理盐水重悬洗涤，用适量pH 8.0的Tris-HCl重悬于试管中，反应体系为5mL，底物添加之前先溶于5％(v/v)的异丙醇中助溶，底物添加适量，葡萄糖添加终浓度为0.1g/mL，湿菌体终浓度为120g/L。30℃，180rpm恒温摇床条件培养24h后，离心取上清萃取，最终制得的样品按照实施例4方法进行气相色谱检测。

从浙江工业大学莫干山校区药学院百草园的土壤中筛选得到具有高转化率、高立体选择性的优良菌株，记为菌株WZ-5。

2、菌株鉴定

(1)菌落形态

将菌株WZ-5接种至固体完全培养基，30℃培养2-3天，观察菌落形态为菌落隆起，呈现不规则圆形，表面淡黄色，质地较粘稠，有微微泥土腥臭味。显微镜观察图见图1所示，结果呈现状态较密集，菌体似棒状，体积较小。

(2)细菌16S rDNA鉴定

委托北京擎科生物技术有限公司杭州分公司对菌株WZ-5进行细菌16SrDNA鉴定(鉴定序列见SEQ ID NO：1所示)，NCBI进行序列比对，结合菌落形态，将菌株WZ-5鉴定为Burkholderia cepacia菌属菌株，命名为洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)WZ-5，并构建菌种发育树(图2)，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCCNO:28566，保藏日期2023年9月27日，保藏地址：中国北京，中国科学院微生物研究所。

SEQ ID NO：1序列：

AACCCTCTGTTCCGACCATTGTATGACGTGTGAAGCCCTACCCATAAGGGCCAGGAGGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCCTTAGAGCGCTCTTGCGTATCAACTAAGGACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGTGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTGCGCCGGTTCTCTTTCGAGCACTCCCACCTCTCAGCGGGATTCCGACCATGTCAAGGGTAGGTAAGGTTTTTCGCGTTGCATCGAATTAATCCACATCATCCACCGCTTGTGCGGGTCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTTAATCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGTCAACTTCACGCGTTAGCTACGTTACTAAGGAAATGAATCCCCAACAACTAGTTGACATCGTTTAGGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGTGCATGAGCGTCAGTATTGGCCCAGGGGGCTGCCTTCGCCATCGGTATTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACTGCTACACGTGGAATTCTACCCCCCTCTGCCATACTCTAGCCTGCCAGTCACCAATGCAGTTCCCAGGTTGAGCCCGGGGATTTCACATCGGTCTTAGCAAACCGCCTGCGCACGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTTGCACCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGTGCTTATTCTTCCGGTACCGTCATCCCCCGACTGTATTAGAGCCAAGGATTTCTTTCCGGACAAAAGTGCTTTACAACCCGAAGGCCTTCTTCACACACGCGGCATTGCTGGATCAGGCTTTCGCCCATTGTCCAAAATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCTGGTCGTCCTCTCAGACCAGCTACTGATCGTCGCCTTGGTAGGCCTTTACCCCACCAACTAGCTAATCAGCCATCGGCCAACCCTATAGCGCGAGGCCCGAAGGTCCCCCGCTTTCATCCGTAGATCGTATG

CGGTATTAATCCGGCTTTCGCCGGGCTATCCCCCACTACAGGACATGTTCCG

ATGTATTACTCACCCGTTCGCCACTCGCCACCAGGTGCAAGCACCCGTGCT

GCCGTTCGACTTGCATGTGTAAGGCATGCCGCCAGCGT

实施例2、重组基因工程菌E.coliBL21(DE3)-pET-28a(+)-BcSDR4

根据NCBI数据库中洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)的短链脱氢酶BcSDR4基因(Gene ID:56664023，序列见SEQ ID NO:2所示)设计以下引物F和引物R，并交由北京擎科生物技术有限公司杭州分公司合成。

引物F：

5’-AAGAAGGAGATATACCATGGATGATTTCATTCAACGGCAAGACC-3’，引物R：

5’-CAGTCATGCTAGCCATATGTCAGAAATTGAAGCCGTTGCCC-3’

SEQ ID NO:2序列：

ATGATTTCATTCAACGGCAAGACCGTGCTGGTCACCGGCGGCGGCGCGGGCATCGGCCGTGCGTGTGCGGAAACGTTCGGCGCGGCCGGCGCGCGCGTCGCGGTAGCCGAGATCGACCCGGCCCGCGCGCAGGACGTGCGCCAGGCGCTCGAGGCGGCGGGCGTCGACGCGCTCGTCGGCACCGTCGACGTCACGCGCCGCGACCAGGTCGATGCGTTCGCACGAACCGTCGACGCGCGCTTCGGCGGCCTCGACGTGCTCGTCAACAATGTGGGCGACTTCCTGCAGATCGCGAAACCGTTCGACGACTGCACCGACGACGACATCGCGCGGCTGTTCGACGCGAACCTGCGCCAGGTGTTCGTCGTCACGCGCGCGATGCTGCCGTTGCTGCGCAAGCGCGGCGCGGGCGGCAGCATCGTCGGCGTGTCGTCGATCGAAGGCTTTCGCGCCATTCCGAACTGCACCGTGTACGCGTCGTTCAAGGCCGCGCTGACCGGCTTCACGAAAAGCCTCGCGCTCGAACTCGGGCCGGCCGGCATTCGCGTGAACCAGATCGCCCCCGAAACCACCGAGACACCGCAGGTGCCCGTCAGCGCGATGGTCGCGGCCGAGCATCGCGAGCACATCCCGCGCTGGATCCCGCTCGGGCGCTTCGGCGCGGCCGGCGATATCGCGGGTGCCGCGCTGTTCCTCGCGAGCCCGCTCGCCGCGTGGGTCACCGGCACGACGCTGCATGTCGACGGCGGCGCGCTCGCGGCGGCCGGCTGGTATCGCGACCCGAACGGCTTCTGGACCAACATGCCCGTCGTCACGGGCAACGGCTTCAATTTCTGA

(2)将实施例1筛选的Burkholderia cepaciaWZ-5单菌落接种液体完全培养基(组成同实施例1)中，37℃、180rpm过夜培养后，参照翊圣生物科技有限公司的真菌基因组提取试剂盒说明书提取Burkholderia cepacia基因组DNA，通过0.9％核酸琼脂糖凝胶电泳进行验证(图3)。

(3)以步骤(2)中所得基因组DNA为模板，采用步骤(1)中引物F和引物R进行目的片段(BcSDR4)的PCR扩增，扩增后片段通过0.9％核酸琼脂糖凝胶电泳进行验证(图3)，并送北京擎科生物技术有限公司杭州分公司进行测序验证。

PCR扩增体系：反应总体积50μL，其中基因组模板2μL，引物F 2μL，引物R 2μL，2*Hieff PCR Master Mix 25μL，ddH₂O 19μL。

PCR扩增程序为：①94℃5min，②94℃30s，③55℃30s，④72℃1min，⑤72℃10min，其中②③④循环35次。2*Hieff PCR Master Mix购自北京擎科生物技术有限公司。

(4)步骤(3)中PCR产物用生工柱式DNA胶回收提取试剂盒将目的片段(BcSDR4)回收纯化，然后将pET-28a(+)载体使用Takara内切酶NcoI及Takara内切酶NdeI进行双酶切，酶切体系于37℃条件下反应3h。

pET-28a(+)载体双酶切反应体系为：NcoI 2μL，NdeI 2μL，10*K 10μL，BSA 10μL，pET-28a(+)70μL，ddH₂O 6μL，通过0.9％核酸琼脂糖凝胶电泳进行验证(图4)。

目的片段BcSDR4的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示：

ATGATTTCATTCAACGGCAAGACCGTGCTGGTCACCGGCGGCGGCGCGGGCATCGGCCGTGCGTGTGCGGAAACGTTCGGCGCGGCCGGCGCGCGCGTCGCGGTAGCCGAGATCGACCCGGCCCGCGCGCAGGACGTGCGCCAGGCGCTCGAGGCGGCGGGCGTCGACGCGCTCGTCGGCACCGTCGACGTCACGCGCCGCGACCAGGTCGATGCGTTCGCACGAACCGTCGACGCGCGCTTCGGCGGCCTCGACGTGCTCGTCAACAATGTGGGCGACTTCCTGCAGATCGCGAAACCGTTCGACGACTGCACCGACGACGACATCGCGCGGCTGTTCGACGCGAACCTGCGCCAGGTGTTCGTCGTCACGCGCGCGATGCTGCCGTTGCTGCGCAAGCGCGGCGCGGGCGGCAGCATCGTCGGCGTGTCGTCGATCGAAGGCTTTCGCGCCATTCCGAACTGCACCGTGTACGCGTCGTTCAAGGCCGCGCTGACCGGCTTCACGAAAAGCCTCGCGCTCGAACTCGGGCCGGCCGGCATTCGCGTGAACCAGATCGCCCCCGAAACCACCGAGACACCGCAGGTGCCCGTCAGCGCGATGGTCGCGGCCGAGCATCGCGAGCACATCCCGCGCTGGATCCCGCTCGGGCGCTTCGGCGCGGCCGGCGATATCGCGGGTGCCGCGCTGTTCCTCGCGAGCCCGCTCGCCGCGTGGGTCACCGGCACGACGCTGCATGTCGACGGCGGCGCGCTCGCGGCGGCCGGCTGGTATCGCGACCCGAACGGCTTCTGGACCAACATGCCCGTCGTCACGGGCAACGGCTTCAATTTCTGA。

目的片段BcSDR4编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示：MISFNGKTVLVTGGGAGIGRACAETFGAAGARVAVAEIDPARAQDVRQALEAAGVDALVGTVDVTRRDQVDAFARTVDARFGGLDVLVNNVGDFLQIAKPFDDCTDDDIARLFDANLRQVFVVTRAMLPLLRKRGAGGSIVGVSSIEGFRAIPNCTVYASFKAALTGFTKSLALELGPAGIRVNQIAPETTETPQVPVSAMVAAEHREHIPRWIPLGRFGAAGDIAGAALFLASPLAAWVTGTTLHVDGGALAAAGWYRDPNGFWTNMPVVTGNGFNF。

(5)通过生工柱式DNA胶回收试剂盒将酶切后载体回收纯化，然后按照相应酶连体系将BcSDR4与酶切后的pET-28a(+)载体进行连接，连接体系于25℃条件下反应30min后，获得的pET-28a(+)-BcSDR4重组质粒转入到E.coli DH5α感受态细胞(购自北京擎科生物技术有限公司)，并涂布于含100μg/mL卡那霉素(Kan)的LB固体平板，37℃过夜培养。

酶切好的载体pET-28a(+)酶连的酶连体系为：2×Seamless Cloning Mix 5μL，pET-28a(+)2μL，BcSDR4 2μL，ddH₂O 1μL。其中2×Seamless Cloning Mix购自北京擎科生物技术有限公司杭州分公司。

pET-28a(+)-BcSDR4重组质粒导入E.coli DH5α感受态细胞的方法均为：100μLE.coli DH5α感受态细胞中加入10μL重组质粒，轻轻吹打后冰浴20min，再于42℃热击90s，冰浴2min，加入0.9mL LB无抗培养基，37℃、180rpm复苏1h。复苏好的菌液离心机瞬离后弃去900μL上清，余下100μL与沉淀混匀后涂布于含100μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，37℃过夜培养。

(6)从步骤(5)中过夜培养的平板中分别挑出12个单菌落溶于对应编号的20μLddH₂O中，并各取10μL分别煮沸5min后作为模板进行菌落PCR，后通过0.9％核酸琼脂糖凝胶电泳进行验证，各自余下的10μL转入对应编号LB(含Kan)后于37℃、180rpm下培养过夜，并送北京擎科生物技术有限公司杭州分公司进行测序验证。

所挑单菌落为随机挑选，菌落PCR体系为：反应总体积25μL，其中煮沸菌液1μL，引物F1μL，引物R1μL，2*Hieff PCR Master Mix 25μL，ddH₂O 9.5μL。PCR扩增程序为：①94℃5min，②94℃30s，③55℃30s，④72℃1min，⑤72℃10min，其中②③④循环35次。2*HieffPCR Master Mix购自北京擎科生物技术有限公司，引物同步骤(1)

(7)将测序验证正确的E.coli DH5αpET-28a(+)-BcSDR4重组菌通过Takara质粒DNA提取试剂盒进行pET-28a(+)-BcSDR4重组质粒提取，经0.9％核酸琼脂糖凝胶电泳检测后将之转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞，即为E.coli BL21(DE3)pET-28a(+)-BcSDR4重组质粒工程菌。

实施例3、E.coli DH5αpET-28a(+)-BcSDR4湿菌体培养、短链脱氢酶BcSDR4纯化

(1)发酵培养

将实施例2获得的E.coli DH5αpET-28a(+)-BcSDR4重组基因工程菌甘油菌10μL接种至20mL含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37℃、180rpm培养过夜，获得种子液。

将种子液以体积浓度3％的接种量接种至150mL含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37℃、180rpm培养至OD₆₀₀在0.6～0.8，加入终浓度为0.4mM的IPTG，25℃、180rpm发酵培养18h，获得发酵液。发酵液经8000rpm、4℃离心10min，所得菌体沉淀以生理盐水重悬两次后8000rpm、4℃离心10min，收集湿菌体。

(2)粗酶液

步骤(1)湿菌体以0.1M pH7.1PB重悬，重悬液于冰上放置30min，后进行超声破碎(条件为：超声功率400W，超声3s，间歇7s，超声15min)，超声后的破碎液经8000rpm、4℃离心10min后弃去沉淀，所得上清即为粗酶液。

(3)纯酶

粗酶液按碧云天His-Tag耐还原螯合型填料说明书处理并纯化即可制备BcSDR4纯酶液，具体操作如下：

将步骤(2)中所获粗酶液5mL与BeyoGold^TMHis-tag耐还原螯合型介质(购自上海碧云天生物技术有限公司)按体积比8：1在0℃、40rpm摇床中缓慢摇动1h，然后上样到BeyoGold^TMHis-tag填料柱，先用非变性洗涤液洗柱5次去除杂蛋白，每次洗脱1个柱体积；然后用非变性洗脱液洗脱8次，每次1个柱体积，目标蛋白洗脱液置于10000MW超滤管中在4℃、3000g下离心30min后取截留液于-53℃冻干48h，即得醇脱氢酶CpSADH纯酶，酶活为4.71U/mg。

酶活定义：每分钟催化反应生成1μmoL R-CHBE所需的酶量为1U。

非变性洗涤液：300mM NaCl、2mM咪唑的50mM、pH8.0磷酸钠缓冲液；非变性洗脱液：300mM NaCl、50mM咪唑的50mM、pH8.0磷酸钠缓冲液。

实施例4：短链脱氢酶BcSDR4对不同底物选择性的筛选

将实施例2所获得的BL21(DE3)-pET-28a(+)-BcSDR4重组工程菌进行底物谱的筛选，筛选反应体系(反应总体积5mL)：不同底物终浓度均为40mM，葡萄糖0.1g/mL，NAD(P)H0.2mM，BL21(DE3)-pET-28a(+)-BcSDR4重组工程菌湿菌体终浓度120g/L，异丙醇5％(v/v)，反应介质0.1M pH7 PB补足5mL。于30℃、180rpm条件下反应24h。反应结束后，反应液以等体积乙酸乙酯萃取3次，乙酸乙酯层萃取液合并后用无水Na₂SO₄干燥并通过气相色谱(GC)检测反应结果，结果见下表1。

气相色谱检测条件：仪器为岛津GC2014；手性色谱柱CP7502(25m×0.25mm×0.25μm)；进样口温度250℃，柱温110℃，检测器250℃，流速1mL/min，分流比1：15，进样量2μL。

产率计算公式如下：

式(1)中M_S和M_P分别为底物和产物的分子量。P和Q分别表示反应结束时产物的质量和底物的初始质量。

本发明中对映体过剩值(e.e.)计算公式如下：

式(2)中C_S和C_R分别代表S-CHBE和R-CHBE的浓度。BcSDR4催化COBE反应体系示意图见图5。

表1.短链脱氢酶BcSDR4对不同底物选择性的筛选表

表中可以看出该短链脱氢酶BcSDR4对COBE及其他多种不同底物的催化产率，其中对某些底物表现出较高的产率，并保持了较高的e.e.值，这表明BcSDR4对多种不同模式底物酮均有较好的催化效果，具有较广泛的底物谱。且从表中可以看出发现酶BcSDR4对酯类、苯乙酮以及氟苯乙酮、氯苯乙酮类均有不对称催化还原的能力。

实施例5：不同质粒载体对还原反应的影响

对重组工程菌进行质粒载体的筛选。

(1)除BL21(DE3)-pET-28a(+)-BcSDR4重组工程菌外，其余四种工程菌构建所用载体、引物与内切酶见表2。

(2)其中pACYCduet载体抗性为氯霉素，pET22b(+)载体与pETDuet载体抗性为氨苄，pET30a(+)载体抗性为卡纳，酶连接体系与相关PCR体系中只需要将相应载体、引物与内切酶进行替换即可，其余步骤同实施例2。

(3)分别取构建好的终浓度为120g/L的BL21(DE3)-pET-28a(+)-BcSDR4重组工程菌、BL21(DE3)-pETDuet-BcSDR4重组工程菌、BL21(DE3)-pACYCduet-BcSDR4重组工程菌、BL21(DE3)-pET22b(+)-BcSDR4重组工程菌、BL21(DE3)-pET30a(+)-BcSDR4重组工程菌湿菌体，添加5％(v/v)异丙醇，反应介质0.1M pH7 PB补足5mL，筛选反应体系(反应总体积5mL)，底物终浓度均为40mM，葡萄糖0.1g/mL，NAD(P)H 0.2mM。于30℃、180rpm条件下反应24h。反应结束后，反应液以等体积乙酸乙酯萃取3次，乙酸乙酯层萃取液合并后用无水Na₂SO₄干燥并通过气相色谱(GC)检测反应结果，结果见下表3。

表2.载体所用引物与内切酶

表3.不同质粒载体对还原反应的影响

不同载体的选择对目的蛋白酶BcSDR4的表达具有不同的影响，由表中结果可以看出，由pET-28a(+)载体构建的BL21(DE3)-pET-28a(+)-BcSDR4重组工程菌表现出89.1％的产率和90.3％的ee值，优于其他载体。由此推测相较于pETDuet、pACYCduet、pET22a(+)、pET30a(+)为载体构建的工程菌，pET-28a(+)载体更有利于酶BcSDR4的表达，故选用BL21(DE3)-pET-28a(+)-BcSDR4重组工程菌进行后续反应。

实施例6：BL21(DE3)-pET-28a(+)-BcSDR4重组菌诱导表达条件优化

将实施例2所获得的BL21(DE3)-pET-28a(+)-BcSDR4重组工程菌进行诱导剂(IPTG)浓度的优化，优化反应体系(反应总体积5mL)：底物40mM，葡萄糖0.1g/mL，NAD(P)H0.2mM，pET-28a(+)-BcSDR4工程菌(分别添加IPTG至终浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mM)，湿菌体添加终浓度为120g/L，异丙醇5％(v/v)，反应介质0.1M pH7 PB补足5mL。于30℃、180rpm条件下反应24h。反应结束后，以等体积乙酸乙酯萃取3次，萃取液(上层)用无水Na₂SO₄干燥后气相色谱(GC)检测反应结果，结果见下表4。

表4.pET-28a(+)-BcSDR4重组菌IPTG诱导浓度优化

诱导剂(IPTG)浓度对工程菌表达目的蛋白具有较大影响。诱导剂浓度较低时，产酶量较低，同时诱导剂对细胞有一定毒性，浓度过高时会对细胞生长有影响，因此选定合适的诱导剂浓度很有必要。从表中结果可以看出，在0.4mM以下时产率随IPTG浓度增加而增大，0.4mM以上时产率随IPTG浓度增加而减小，故选用IPTG浓度0.4mM为最适诱导剂浓度进行后续反应。

实施例7：异丙醇-水介质体系pH对还原反应的影响

将实施例2所获得的BL21(DE3)-pET-28a(+)-BcSDR4重组工程菌进行pH条件的优化，反应体系(反应总体积5mL)：湿菌体终浓度120g/L，底物COBE 40mM，NAD(P)H(货号：BS123-100mg，厂家：北京擎科生物科技股份有限公司杭州分公司)0.2mM，葡萄糖0.1g/mL，异丙醇5％，反应液pH分别为5、6、7、8、9、10(其中5、6、7为0.1M PB，8、9、10为0.1M Tris-HCl)。分别在30℃、180rpm条件下反应24h。反应结束后，以等体积乙酸乙酯萃取3次，萃取液(上层)用无水Na₂SO₄干燥后GC检测反应结果，结果见表5。

表5.异丙醇-水介质体系下不同pH对还原反应的影响

使用从pH 5至pH 10的不同缓冲液作为反应体系的溶液，探究不同pH对BcSDR4活力的影响，设计还原反应体系，结果如上表。从表中可以发现BcSDR4在中性或者弱碱性条件(pH 7-8)缓冲液中表现出较高的活力，在这个范围内BcSDR4在pH 7时活力最高。pH的改变会使酶分子不同部位间的静电作用力发生变化，pH过高或过低都能破坏酶分子的稳定构象，引起去折叠化和内部结构的暴露，导致酶活性的丢失。因此BcSDR4适合在pH 7的PB缓冲液中反应。

实施例8：异丙醇-水介质体系反应时间对还原反应的影响

将实施例2所获得的BL21(DE3)-pET-28a(+)-BcSDR4重组工程菌添加到异丙醇-水介质反应体系中进行反应时间的优化，反应体系(反应总体积5mL)：底物COBE 40mM，NAD(P)H 0.2mM，葡萄糖0.1g/mL，异丙醇5％，湿菌体终浓度120g/L，反应介质0.1M pH7.0 PB补足5mL。分别在30℃、180rpm条件下反应6、12、18、24、30、36、42、48h。反应结束后，以等体积乙酸乙酯萃取3次，萃取液(上层)用无水Na₂SO₄干燥后气相色谱GC检测反应结果，结果见表6。

表6.异丙醇-水介质体系下不同反应时间对还原反应的影响

反应时间对反应体系具有较大影响。为了适应工业化生产，反应过程中达到相同产率所需反应时间越少其时间成本越低，因此为探究不同反应时间下反应体系中产物产率及e.e.值而设计此反应。由表可知，在反应24h之前，产率逐渐升高，最高达到88.5％，故反应时间选用24h。

实施例9：异丙醇-水介质反应温度对还原反应的影响

将实施例2所获得的BL21(DE3)-pET-28a(+)-BcSDR4重组工程菌添加到异丙醇-水介质反应体系中进行反应温度的优化。反应体系(反应总体积5mL)：底物COBE 40mM，NAD(P)H 0.2mM，葡萄糖0.1g/mL，异丙醇5％，湿菌体终浓度120g/L，反应介质0.1M pH7.0 PB补足5mL。分别在25、30、35、40、45℃，180rpm条件下反应24h。反应结束后，以等体积乙酸乙酯萃取3次，萃取液(上层)用无水Na₂SO₄干燥后气相色谱GC检测反应结果，结果见表7。

表7.异丙醇-水介质体系下不同反应温度对还原反应的影响

在不同温度下检测BcSDR4的催化活力，探究不同温度对BcSDR4活力的影响，设计还原反应体系，结果如上表。从表中可以看出，在30℃反应时观察到最大产率87.8％，同时温度升高与降低并未影响其对映体选择性。当温度大于30℃时，酶的活力开始下降，虽然在低温范围内温度升高会增加酶与底物分子的碰撞次数而使催化速率提高，但温度过高会使酶吸收大量能量而造成维持其结构的氢键被破坏，使蛋白空间形态改变而无法发挥有效的催化功能，因此反应最好控制在30℃最有利于催化进行。

实施例10：有机溶剂添加介质对还原反应的影响

将实施例2所获得的BL21(DE3)-pET-28a(+)-BcSDR4重组工程菌进行底物浓度的优化，反应体系(反应总体积5mL)：底物COBE 40mM，NAD(P)H 0.2mM，葡萄糖0.1g/mL，不同有机溶剂(DMSO，甘油，甲醇，乙醇，异丙醇)5％，湿菌体终浓度120g/L，反应介质0.1M pH7.0PB补足5mL。于30℃、180rpm条件下反应24h。反应结束后，以等体积乙酸乙酯萃取3次，萃取液(上层)用无水Na₂SO₄干燥后GC检测反应结果，结果见表8。

表8.不同有机溶剂-水介质体系下最适底物浓度的探究

生物催化前手性酮底物生成手性醇的过程中，往往因底物是难溶或微溶于水的有机物，从而大大降低了底物与酶催化剂的结合机会，所以会出现转化率低甚至无法转化的现象，而有机溶剂相较于普通水性溶剂给予疏水性底物更高的负载量和酶催化反应的稳定性。虽然有机溶剂的加入加速了酶催化的这一进程，但是同样带来了细胞毒性，催化不稳定性等不利影响。COBE为微溶于水的有机化合物，为了筛选出能够较好辅助酶BcSDR4催化COBE生成(R)-CHBE，在底物转化阶段，分别添加5％(v/v)的DMSO，甘油，甲醇，乙醇，异丙醇作为辅助溶剂进行共反应，从表中结果中可以看出，添加有异丙醇与DMSO的实验组分别获得了87.5％与80.3％的产率，其次分别是产率甘油＞甲醇＞乙醇，其中乙醇辅助催化效果较差，ee值没有受到较大影响，所以最终选择异丙醇作为有机辅助溶剂进行共反应。

Claims

1.一种短链脱氢酶的重组表达质粒，其特征在于：所述短链脱氢酶的氨基酸序列如SEQID NO：4所示。

2.如权利要求1所述的重组表达质粒，其特征在于：所述重组表达质粒的载体为pET28a(+)载体。

3.如权利要求1所述的重组表达质粒，其特征在于：所述短链脱氢酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

4.如权利要求1-3任一项所述的重组表达质粒，其特征在于：所述重组表达质粒是将SEQ ID NO：3所示核苷酸序列插入pET28a(+)载体的NcoI位点和NdeI位点之间得到的。

5.如权利要求4所述的重组表达质粒，其特征在于：所述重组表达质粒按如下方法构建：

S1:通过以下引物，以洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)WZ-5菌的基因组DNA为模板进行PCR，得到目的基因：

F：5’-AAGAAGGAGATATACCATGGATGATTTCATTCAACGGCAAGACC-3’R：5’-CAGTCATGCTAGCCATATGTCAGAAATTGAAGCCGTTGCCC-3’

6.如权利要求1所述的重组表达质粒构建的重组基因工程菌。

7.如权利要求6所述的重组基因工程菌，其特征在于：所述重组基因工程菌的宿主菌为E.coli BL21(DE3)。

8.如权利要求6所述的重组基因工程菌在不对称还原4-氯乙酰乙酸乙酯制备(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述应用为：

以4-氯乙酰乙酸乙酯为底物，以pH 7.0、0.1M磷酸缓冲盐溶液为反应介质，以异丙醇为助溶剂，以葡萄糖为辅助底物，以NAD(P)H为辅酶，以所述重组基因工程菌经诱导培养获得的湿菌体或所述湿菌体经超声破碎、分离纯化提取的短链脱氢酶纯酶为催化剂，构建反应体系，25-45℃、100-220rpm条件下反应12-36h(优选30℃、180rpm、24h)，得到含(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的反应液。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于：所述反应体系中，底物的终浓度为10～40mM，葡萄糖的终浓度为0.01-0.1g/mL，NAD(P)H的终浓度为0.2-0.8mM，所述催化剂的用量以湿菌体的质量计，终浓度为80-120g/L，异丙醇的体积浓度为5％-30％。