CN114150036B - 一种用于制备光学纯的6-氟-色满-2-羧酸的连续双相分批拆分工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于制备光学纯的6‑氟‑色满‑2‑羧酸的连续双相分批拆分工艺，以外消旋6‑氟‑色满‑2‑羧酸甲酯为底物，进行两批次或多批次反应，相邻批次反应交替使用表达EstS的重组大肠杆菌或表达EstR的重组大肠杆菌作为催化剂；在有机相和水相的双相体系中反应；每批次反应完成后，回收有机相，纯化水相，去除溶剂，获得(S)‑6‑氟‑色满‑2‑羧酸或(R)‑6‑氟‑色满‑2‑羧酸；在每个批次后补充水相，用于下一批次反应；在每两个批次后补充底物6‑氟‑色满‑2‑羧酸甲酯，用于下一批次反应如此循环，实现6‑氟色满‑2‑羧酸甲酯的连续分批拆分。本发明的方法，具有总拆分效率高、立体选择性强、工艺相对简单等特点。

Description

一种用于制备光学纯的6-氟-色满-2-羧酸的连续双相分批拆 分工艺
技术领域
本发明属于医药生物化工技术领域，具体地说，是关于一种用于制备光学纯的6-氟-色满-2-羧酸的连续双相分批拆分工艺。
背景技术
6-氟-色满-2-羧酸是重要医药中间体。化学名称是6-氟-3，4-二氢-2H-1-苯并吡喃-2-甲酸，化学分子式是C10H9O3F分子量是196.18，结构式为：
在许多具有生物活性的分子结构中，都能发现6-氟-色满的色满结构单元的存在。譬如，该结构广泛包含在维生素E及许多拮抗β受体的抗高血压药中。光学纯的6-氟-色满-2-羧酸用于新型降血压药物(S,R,R,R)-奈必洛尔的合成。(S,R,R,R)-奈必洛尔是第三代兼有血管扩张作用的心脏高度选择性β1受体阻滞剂，主要用于治疗原发性高血压，能有效地控制高血压和保持左心室功能，并且具有剂量低、副作用少，耐受性好等优点。
杨森制药有限公司提供了一种以6-氟-色满-2-羧酸为起始原料来制备(S,R,R,R)-奈必洛尔的合成路线，合成路线如图1所示。
从奈必洛尔的合成路线图中可知，6-氟-色满-2-羧酸的拆分是第一步也是关键的一步。6-氟-色满-2-羧酸的拆分效率是影响合成奈必洛尔的关键环节。因此提高其拆分效率也是值得研究的问题。
6-氟-色满-2-羧酸是制备奈必洛尔的关键中间体，其拆分效率决定制备奈必洛尔合成方法的最终结果。但是关于6-氟-色满-2-羧酸(R)-，(S)-光学异构体拆分方法文献报道较少。迄今为止，化学方法、生物拆分法等是几种拆分有机酸常用的办法。化学拆分方法均以外消旋的6-氟色满-2-羧酸化合物为原料，通过与不同手性有机胺反应，形成非对映异构体的酰胺或铵盐，利用非对映异构体酰胺或铵盐在溶剂中的溶解度差异，经重结晶分离出R或S构型的6-氟色满-2-羧酸。但是此方法存在生产成本高，过程较冗长，拆分效率较低，环境污染严重等问题。
为此，市面上有部分利用脂肪酶或酯酶选择性水解6-氟色满-2-羧酸甲酯或乙酯，得到光学纯的(R)-6-氟-色满-2-羧酸。此类方法具有操作简便，条件温和，立体选择性高等优点。EP2646426报道过利用来源于真菌Ophiostoma novo-ulmi的酯酶拆分外消旋的6-氟-色满-2-羧酸乙酯，分离纯化得到(R)-6-氟-色满-2-羧酸，ee值是90.72％，转化率是50.28％,其中立体选择性不高。但是目前没有文献关于利用脂肪酶或酯酶拆分制备(S)-6-氟-色满-2-羧酸的报道；因此急需找到其他的高活性和高立体选择性的脂肪酶/酯酶。
发明内容
本发明以外消旋6-氟-色满-2-羧酸甲酯为底物，在两相反应中，利用高效表达酯酶EstS的重组大肠杆菌的冻干菌体(lycEstS)作为催化剂，选择性催化(S)-6-氟-色满-2-羧酸甲酯的水解反应，反应结束后，将未反应完底物的有机相投入下一批次反应，投入高效表达酯酶EstR的重组大肠杆菌的冻干菌体(lycEstR)，选择性催化(R)-6-氟-色满-2-羧酸甲酯的水解。由此制备获得(S)-6-氟-色满-2-羧酸，其转化率>46％,ee值99％；(R)-6-氟-色满-2-羧酸，其转化率>47％,ee值99％。并依此，本发明继续研究，通过分批投入底物以及交替投入固定化表达酯酶EstS的重组大肠杆菌细胞(imcEstS)和固定化表达酯酶EstR的重组大肠杆菌细胞(imcEstR)，实现底物最大的拆分效率，以及循环使用甲苯相。因此，本发明的目的是提供一种用于制备光学纯的6-氟-色满-2-羧酸的连续双相分批拆分工艺。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种用于制备光学纯的6-氟-色满-2-羧酸的连续双相分批拆分工艺，以外消旋6-氟-色满-2-羧酸甲酯为底物，进行两批次或多批次反应，相邻批次反应交替使用表达EstS的重组大肠杆菌或表达EstR的重组大肠杆菌作为催化剂，在有机相和水相的双相体系中反应；
每批次反应完成后，分离有机相和水相，回收未反应完全底物的有机相用于下一批反应；纯化水相，去除溶剂，获得(S)-6-氟-色满-2-羧酸或(R)-6-氟-色满-2-羧酸；
在每个批次后补充水相，用于下一批次反应；在每两个批次后补充底物6-氟-色满-2-羧酸甲酯，用于下一批次反应；如此循环，实现6-氟色满-2-羧酸甲酯的连续分批拆分。
根据本发明，双水相体系的反应温度为30℃，反应时间为2～40小时。
根据本发明，每批次反应完成后，采用过滤方法去除菌体或回收固定化细胞后，其中imcEstS或imcEstR用生理盐水洗涤3遍作为下一批次的催化剂。
根据本发明，每批次反应完成后，反应液中加入氢氧化钠溶液调节pH至11-12后，分离有机相和水相，然后在水相中加入盐酸溶液调节pH至1-2，用乙酸乙酯萃取3遍，旋蒸蒸发除去溶剂，得到(S)-6-氟-色满-2-羧酸白色固体或(R)-6-氟-色满-2-羧酸白色固体，未反应完全底物的有机相用于下一批次反应。
根据本发明，所述的双相体系，有机相与水相的体积比为1:3，其中，有机相为甲苯，水相为磷酸缓冲液。
根据本发明，表达EstR的重组大肠杆菌的催化剂为表达EstR的重组大肠杆菌的冻干菌体或固定化表达EstR的重组大肠杆菌细胞；表达EstS的重组大肠杆菌的催化剂为表达EstS的重组大肠杆菌的冻干菌体或固定化表达EstS的重组大肠杆菌细胞。
根据本发明，当使用表达EstS的重组大肠杆菌进行拆分时，反应体系的pH控制在7.0-7.1；当使用表达EstR的重组大肠杆菌进行拆分时，反应体系的pH控制在7.4-7.5。
优选的，当使用表达EstS的重组大肠杆菌进行拆分时，双水相体系中流加0.5-1M的NaOH，控制pH恒定为7.1；当使用表达EstR的重组大肠杆菌进行拆分时，双水相体系中流加0.5-1M的NaOH，控制pH恒定为7.4。
根据本发明，所述有机相的含量的体积百分比为20％-30％。
进一步的，所述有机相为甲苯。
根据本发明，所述表达EstS的重组大肠杆菌或表达EstR的重组大肠杆菌的浓度为10g/L。
优选的，外消旋6-氟-色满-2-羧酸甲酯的浓度是100-200mM。
根据本发明，分批反应时，先投入表达EstS的重组大肠杆菌进行拆分反应；下一批次反应，再投入表达EstR的重组大肠杆菌进行拆分反应。
根据本发明，表达EstS的重组大肠杆菌是将具有序列如SEQ ID NO.3所示的EstS基因序列的目的片段克隆到表达载体中，获得重组质粒，然后将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中制备获得。
进一步的，所述表达载体为pET-28a(+)表达载体。
根据本发明，表达EstR的重组大肠杆菌将具有序列如SEQ ID NO.7所示的EstS基因序列的目的片段克隆到表达载体中，获得重组质粒，然后将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中制备获得。
进一步的，所述表达载体为pET-28a(+)表达载体。
本发明的连续双相分批拆分工艺，其有益效果是：具有总拆分效率高、立体选择性强、工艺相对简单等特点，具体如下：
1、通过交替投入表达酯酶EstS的重组大肠杆菌和表达酯酶EstR的重组大肠杆菌，实现底物最大的拆分效率。
2、有机相可以循环使用，同时可以回收各批次的表达酯酶EstS的重组大肠杆菌和表达酯酶EstR的重组大肠杆菌，催化剂利用率高。
3、底物转化率高，当交替投入催化剂(即交替投入表达酯酶EstS的重组大肠杆菌和表达酯酶EstR的重组大肠杆菌)的次数为6次时，底物转化率高达99.1％。
附图说明
图1为奈必洛尔的合成路线图。
图2为实施例3的有机溶剂比例对反应的影响。
图3为实施例3的温度对反应的影响。
图4为实施例3的pH对反应的影响。
图5为实施例4的(S)-6-氟-色满-2-羧酸的液相图。
图6为实施例7的有机溶剂比例对反应的影响。
图7为实施例7的温度对反应的影响。
图8为实施例7的pH对反应的影响。
图9为实施例8的(S)-6-氟-色满-2-羧酸的液相图。
图10为实施例9的6-氟色满-2-羧酸甲酯的两步拆分结果图。
图11为实施例10的6-氟色满-2-羧酸甲酯的连续分批拆分结果图。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或厂商提供的条件进行。
实施例1表达酯酶EstS的大肠杆菌基因工程菌的构建及酯酶EstS的高效表达
1.将热链状地芽孢杆菌Geobacillus thermocatenulatus strain BGSC 93A1使用培养基(Peptone 5g,Meat extract 3g,蒸馏水1L)复苏，在60℃恒温摇床中需氧培养12小时，使用紫外分光光度计测量细菌浓度。
2.细菌DNA提取，使用细菌基因组DNA快速提取试剂盒(Generay Biotech,Shanghai,China)进行提取，获得Geobacillus thermocatenulatus基因组DNA。
3.根据Geobacillus thermocatenulatus菌株的酯酶EstS基因序列设计引物，所设计上游引物和下游引物如下：
上游引物：5’CGCGGATCCATGGTCATTGTTGAAACAGA 3’，SEQ ID NO.1，其中，下划线部分为BamH I识别位点；
下游引物：5’CGCAAGCTTTTACACATGCTCGCGAAACC 3’，SEQ ID NO.2，其中，下划线部分为Hind III识别位点；
4.然后以热链状地芽孢杆菌Geobacillus thermocatenulatus的基因组DNA为模板，利用聚合酶链式反应(PCR)进行基因扩增，获得包含酯酶EstS全长基因的PCR产物，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。其中，PCR扩增体系为PrimerSTAR Max 25μL；正向引物和反向引物各1.5μL；水22μL；模板0.5μL。
核苷酸序列：
ATGGTCATTGTTGAAACAGAACGGCTGGCTGATGTGCCGGTGCTTCATGTTGTCAAGCCGGAAAAGCGGGACGCACGGCTGCCGCTCATTTTCTTTATTCACGGCTTTACAAGCGCGAAAGAGCATAATTTGCATTTCGGCTACTTGCTTGCCGAGGCAGGCTATCGCGTTGTGCTTCCCGACGCGCTGTTTCACGGCGAGCGGGACGAAGGTTTGAGCGAGCGGAAATTGCAGCTGTCGTTTTGGGACATTGTCGTGCGCACGATCACCGAAATCGAGGAGATGAAAAACGACCTTGTCAGCCGCGGGCTGGCTGACCAAGAACGGATTGGGCTCGCTGGGACATCGATGGGCGGCATCGTCACATTCGGCGCGCTCGCCGTCTATCCGTGGGTGAAGGCGGCGGTGGCGCTTATGGGCTGCCCGAACTACAGCGCCTTTTTTGACGCGATGATGGAAGAAGCGAAGCGGCGTCAGATCGACATCCCGATGCCGCCGACGCTGTTGGCGCTTGAAAGAGAAAAGCTCGCTCGCTACGATTTATCCAAGCAGCCGGAAACACTCGCCGGGCGGCCGTTGTTCATCTGGCACGGGAAAGCCGACCAAGTCGTCCCGTATAGTTATACATATGAATTTTACCAGCAAATTAAGCCGCTTTATGAAGGAAACGAAGACCGGCTGCAATTCATCGCCGACCCGCACGCCGGCCATAAAGTGACGCGCGAGGCGTTTTTGGAAACGGTGCGCTGGTTTCGCGAGCATGTGTAA，SEQ ID NO.3。
氨基酸序列：
MVIVETERLADVPVLHVVKPEKRDARLPLIFFIHGFTSAKEHNLHFGYLLAEAGYRVVLPDALFHGERDEGLSERKLQLSFWDIVVRTITEIEEMKNDLVSRGLADQERIGLAGTSMGGIVTFGALAVYPWVKAAVALMGCPNYSAFFDAMMEEAKRRQIDIPMPPTLLALEREKLARYDLSKQPETLAGRPLFIWHGKADQVVPYSYTYEFYQQIKPLYEGNEDRLQFIADPHAGHKVTREAFLETVRWFREHV，SEQ ID NO.4。
5.将pET-28a(+)空载质粒，以及步骤4得到的带有BamH I和Hind III酶切位点的基因(序列如SEQ ID NO.3所示)，分别用BamH I和Hind III进行双酶切。回收大片段，用T4DNA连接酶连接，热激法转化大肠杆菌BL21，用含50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基进行筛选，PCR法挑取阳性克隆，试剂盒提取阳性克隆质粒，经基因测序鉴定，获得正确的克隆质粒，从而构建得到酯酶EstS基因工程菌株lycEstS。
6.将阳性重组菌株(步骤5的酯酶EstS基因工程菌株lycEstS)接种于含有50μg/mL卡那霉素的5mL LB培养基中37℃过夜培养，随后以1％转接量接入50mL含有50μg/mL卡那霉素的新鲜LB培养基中继续繁殖，当OD600达到0.6～0.8时，加入IPTG至终浓度0.1mM。在20℃下诱导16～18小时后，离心收集菌体，然后放在冷冻干燥机冷冻12小时，制备冻干菌粉储存冰箱，备用。
实施例2(S)-6-氟-色满-2-羧酸的分离纯化以及液相检测方法
在0.1M磷酸盐缓冲液中，用实施例1制备的冻干菌粉(lycEstS)进行(±)-6-氟-色满-2-羧酸甲酯的水解动力学拆分，但是没有观察到良好的活性和选择性。因此，反应在包含不同有机溶剂的双相体系(有机溶剂与磷酸盐缓冲液)中进行。
反应完成后，采用过滤方法去除菌体后，加入5M氢氧化钠溶液调节pH至11-12后，分离有机相和水相，然后在水相中加入盐酸溶液调节pH至1-2，用乙酸乙酯萃取3遍，旋蒸蒸发除去溶剂即可得到(S)-6-氟-色满-2-羧酸白色固体。高效液相色谱(手性柱Chirasil-AD-H)分析，测定底物转化率和产物的ee值。具体分析条件为：柱温度25℃，流动相为正己烷:异丙醇(90:10)，流速1.0mL/mL，检测波长254nm。
实施例3以冻干大肠杆菌菌体(lycEstS)为催化剂，考察(S)-6-氟-色满-2-羧酸制备的条件
反应体系包括：菌体，(±)-6-氟-色满-2-羧酸甲酯，有机溶剂，反应温度，反应时间，反应pH，底物浓度，buffer，(±)-6-氟-色满-2-羧酸甲酯即底物。
以上述实例1中的重组大肠杆菌菌体(步骤5的酯酶EstS基因工程菌株)为酶源，考察有机溶剂的选择、有机溶剂添加的比例、反应温度、反应pH、底物浓度等因素，以提高目标产物(S)-6-氟-色满-2-羧酸的时空产率。
1、考察所选有机溶剂对反应的影响
在10mL的反应体系中，菌体浓度10g/L；(±)-6-氟-色满-2-羧酸甲酯用量为100mM；有机溶剂与PB Buffer(pH7.4)的比例是1:4；反应温度为30℃；反应时间为6h。所选的有机溶剂包括异丙醇、丁醇、甲苯、正己烷、正庚烷、异辛烷。结果见表1。
表1有机溶剂对反应的影响
有机溶剂 log P 转化率(％) ee(％)
异丙醇 0.38 65.3 21.3
丁醇 0.88 10.2 2.7
甲苯 2.5 46.6 99.0
正己烷 3.5 38.4 81.4
正庚烷 4.0 71.7 27.5
异辛烷 4.5 87.8 24.6
结果显示：所选的有机溶剂中，甲苯的转化率和ee值均良好。
2、考察甲苯与PB Buffer(pH7.4)对反应的影响。
在10mL的反应体系中，菌体浓度10g/L；(±)-6-氟-色满-2-羧酸甲酯用量为100mM；反应温度为30℃；反应pH是7.4；反应时间为6h。所选甲苯占总体积的比例是10％、20％、30％、40％，50％(v/v)。结果如图2所示。
图2结果显示，甲苯占总体积的比例为20％和30％时的ee值良好。
3、考察温度对反应的影响。
在10mL的反应体系中，菌体浓度10g/L；(±)-6-氟-色满-2-羧酸甲酯用量为100mM；甲苯与PB Buffer(pH7.4)的比例是1:3；反应时间为6h。所选反应温度是20～60℃。结果如图3所示。
图3结果显示，当反应温度为30℃和40℃时，ee值和转化率均良好。
4、考察pH对反应的影响。
在10mL的反应体系中，菌体浓度10g/L；(±)-6-氟-色满-2-羧酸甲酯用量为100mM；甲苯与Buffer的比例是1:3；反应时间为6h。所选反应pH是6、6.5、7、7.5、8、8.5。结果如图4所示。
图4结果显示，当反应pH是7.0时，ee值和转化率均良好。
5、考察底物浓度对反应的影响。在10mL的反应体系中，甲苯与Buffer的比例是1:3；反应温度为30℃；反应pH是7.0。所选底物浓度是100、200、300、400mM。结果见表2。
表2底物浓度对反应的影响
底物浓度 反应时间 转化率(％) ee(％)
100mM 1.5h 48.9 99.2
200mM 4h 49.1 99.1
300mM 6h 45.7 98.8
400mM 8h 38.0 98.5
表2结果显示，当底物浓度为100mM、200mM和300mM时，转化率和ee值均良好。
实施例4
以大肠杆菌菌体(步骤5的酯酶EstS基因工程菌株)为酶源，酶法拆分(±)-6-氟-色满-2-羧酸甲酯生产(S)-6-氟-色满-2-羧酸
根据实施例3确定的最佳拆分条件，以上述实例1中冻干大肠杆菌菌体为催化剂，在0.2升反应液中加入菌体2g，(±)-6-氟-色满-2-羧酸甲酯200mM，甲苯与PB Buffer(pH7.0)的比例是1:3；反应温度30℃，转化时间6h，进行(±)-6-氟-色满-2-羧酸甲酯的水解拆分。采用实施例2的(S)-6-氟-色满-2-羧酸的分离纯化以及液相检测方法，(S)-6-氟-色满-2-羧酸的液相图如图5所示。
结果，测定(S)-6-氟-色满-2-羧酸含量为89.3mM；转化率为46.9％；ee值是99.07％。
实施例5表达酯酶EstR的大肠杆菌基因工程菌的构建及酯酶EstR的高效表达
1.将热链状地芽孢杆菌Geobacillus thermocatenulatus strain BGSC 93A1使用培养基(Peptone 5g,Meat extract 3g,蒸馏水1L)复苏，在60℃恒温摇床中需氧培养12小时，使用紫外分光光度计测量细菌浓度。
2.细菌DNA提取，使用细菌基因组DNA快速提取试剂盒(Generay Biotech,Shanghai,China)进行提取，获得Geobacillus thermocatenulatus基因组DNA。
3.根据Geobacillus thermocatenulatus菌株的酯酶ESTR基因序列设计引物，所设计上游引物和下游引物如下：
上游引物：5’CGCGGATCCGTGCAAGACCAGTTTTTTTC 3’，SEQ ID NO.5，其中，下划线部分为BamH I识别位点；
下游引物：5’CGCAAGCTTTCATTGTTCACCCTCCTCCG 3’，SEQ ID NO.6，其中，下划线部分为Hind III识别位点；
4.然后以热链状地芽孢杆菌Geobacillus thermocatenulatus的基因组DNA为模板，利用聚合酶链式反应(PCR)进行基因扩增，获得包含酯酶EstR全长基因的PCR产物，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。其中，其中，PCR扩增体系为Primer STAR Max 25μL；正向引物和反向引物各1.5μL；水22μL；模板0.5μL。
核苷酸序列：
GTGCAAGACCAGTTTTTTTCGGTCGCCAAGCCGCCGACAAAAGAACAACGGCCGCCGACGGCTGAAACAAGGCAACATGACGAGAAAATGGATATTGTTGCTCTTGGCGATTCGTTGACGAGAGGAACGGGCGATGAAAGCGGCAAAGGGTATGTTGGCTATATGGTCGATGCGCTTCGCCGGCAAACGGATCGGCCGATCCGTGTGACGAATTTGGCCATCCGCGGCCTTCGCTCCGACGGGCTGCTTCGCCAGCTTGGCCAGCCTGAGATTCAACGGCAAGTCGCCATGGCGGATTTGATCGTGATGACGATCGGCGGCAACGACTTGTTTCAAGGGGGGGAAGCGCTTCGGTTGAACGCCAAGCAGCTGGATGAAGCGAAGCGCCGGTATGCAGCCAACCTAGACCACATTTTCGCCGCGCTGCGCCGCTTCAACAGCGAAGCGGTCATTTTTGCAATCGGTTTGTACAACCCGTTTGGCGATTTAAACGATGCCAAACGGACGTCGGCCGTTGTGCGCGATTGGAATTTTGCATCAGCGGAAGTGGCGGCCCGCTATCCGAACATCGTCGCGGTGCCGACGTTTGATTTGTTTGCCCTCCATGTCAATGACTATTTGTACAGCGACCATTTTCATCCAAACGCGGCAGGCTACAAGCGGATTGGAGAGCGCGTCGCCTCGCTCATCACGTTGACGGAGGAGGGTGAACAATGA，SEQ ID NO.7。
氨基酸序列：
VQDQFFSVAKPPTKEQRPPTAETRQHDEKMDIVALGDSLTRGTGDESGKGYVGYMVDALRRQTDRPIRVTNLAIRGLRSDGLLRQLGQPEIQRQVAMADLIVMTIGGNDLFQGGEALRLNAKQLDEAKRRYAANLDHIFAALRRFNSEAVIFAIGLYNPFGDLNDAKRTSAVVRDWNFASAEVAARYPNIVAVPTFDLFALHVNDYLYSDHFHPNAAGYKRIGERVASLITLTEEGEQ，SEQ ID NO.8。
5.将pET-28a(+)空载质粒，以及步骤4得到的带有BamH I和Hind III酶切位点的基因(序列如SEQ ID NO.3所示)，分别用BamH I和Hind III进行双酶切。回收大片段，用T4DNA连接酶连接，热激法转化大肠杆菌BL21，用含50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基进行筛选，PCR法挑取阳性克隆，试剂盒提取阳性克隆质粒，经基因测序鉴定，获得正确的克隆质粒，从而构建得到酯酶EstR基因工程菌株lycEstR。
6.将阳性重组菌株(步骤5的酯酶EstR基因工程菌株lycEstR)接种于含有50μg/mL卡那霉素的5mL LB培养基中37℃过夜培养，随后以1％转接量接入50mL含有50μg/mL卡那霉素的新鲜LB培养基中继续繁殖，当OD600达到0.6～0.8时，加入IPTG至终浓度0.1mM。在20℃下诱导16～18小时后，离心收集菌体，然后放在冷冻干燥机冷冻12小时，制备冻干菌粉储存冰箱，备用。
实施例6(R)-6-氟-色满-2-羧酸的分离纯化以及液相检测方法
在0.1M磷酸盐缓冲液中，用实施例1制备的冻干菌粉(lycEstR)进行(±)-6-氟-色满-2-羧酸甲酯的水解动力学拆分，但是没有观察到良好的活性和选择性。因此，反应在包含不同有机溶剂的双相体系(有机溶剂与磷酸盐缓冲液)中进行。
反应完成后，采用过滤方法去除菌体后，加入5M氢氧化钠溶液调节pH11-12后，分离有机相和水相，然后在水相中加入盐酸溶液调节pH1-2，用乙酸乙酯萃取3遍，旋蒸蒸发除去溶剂即可得到(R)-6-氟-色满-2-羧酸白色固体。高效液相色谱(手性柱Chirasil-AD-H)分析，测定底物转化率和产物的ee值。具体分析条件为：柱温度25℃，流动相为正己烷:异丙醇(90:10)，流速1.0mL/mL，检测波长254nm。
实施例7以冻干大肠杆菌菌体(lycEstR)为催化剂，考察(R)-6-氟-色满-2-羧酸制备的条件
反应体系包括：菌体，(±)-6-氟-色满-2-羧酸甲酯，有机溶剂，反应温度，反应时间，反应pH，底物浓度，buffer，(±)-6-氟-色满-2-羧酸甲酯即底物。
以上述实施例5中的重组大肠杆菌菌体(步骤5的酯酶ESTR基因工程菌株)为酶源，考察有机溶剂的选择、有机溶剂添加的比例、反应温度、反应pH、底物浓度等因素，以提高目标产物(R)-6-氟-色满-2-羧酸的时空产率。
1、考察所选有机溶剂对反应的影响
在10mL的反应体系中，菌体浓度10g/L；(±)-6-氟-色满-2-羧酸甲酯用量为100mM；有机溶剂与PB Buffer(pH7.4)的比例是1:4；反应温度为30℃；反应时间为12h。所选的有机溶剂包括异丙醇、丁醇、甲苯、正己烷、正庚烷、异辛烷。结果见表3。
表3有机溶剂对反应的影响
有机溶剂 log P 转化率(％) ee(％)
异丙醇 0.38 52.3 45.3
丁醇 0.88 7.8 1.6
甲苯 2.5 48.6 95.6
正己烷 3.5 42.5 89.7
正庚烷 4.0 26.6 11.6
异辛烷 4.5 5.4 2.1
结果显示：所选的有机溶剂中，甲苯的转化率和ee值均良好。
2、考察甲苯与PB Buffer(pH7.4)对反应的影响。
在10mL的反应体系中，菌体浓度10g/L；(±)-6-氟-色满-2-羧酸甲酯用量为100mM；反应温度为30℃；反应pH是7.4；反应时间为12h。所选甲苯占总体积的比例是10％、20％、30％、40％，50％(v/v)。结果如图6所示。
图6结果显示，甲苯占总体积为20-30％时，转化率和ee值均良好。
3、考察温度对反应的影响。
在10mL的反应体系中，菌体浓度10g/L；(±)-6-氟-色满-2-羧酸甲酯用量为100mM；甲苯与PB Buffer(pH7.4)的比例是1:3；反应时间为6h。所选反应温度是10～50℃。结果如图7所示。
图7结果显示，反应温度为30℃时，转化率和ee值均良好。
4、考察pH对反应的影响。
在10mL的反应体系中，菌体浓度10g/L；(±)-6-氟-色满-2-羧酸甲酯用量为100mM；甲苯与Buffer的比例是1:3；反应时间为6h。结果如图8所示。
图8结果显示，所选反应pH是6、6.5、7、7.5、8、8.5，优选为7.5。
5、考察底物浓度对反应的影响。在10mL的反应体系中，甲苯与Buffer的比例是1:3；反应温度为30℃；反应pH是7.5。所选底物浓度是100、200、300、400mM，结果见表4。
表4底物浓度对反应的影响
底物浓度 反应时间 转化率(％) ee(％)
100mM 2.5h 50.2 95.6
200mM 4h 50.9 95.4
300mM 7h 49.2 94.7
400mM 12h 36.6 93.5
表4结果显示，所选底物浓度为100mM、200mM和300mM时，转化率和ee值均良好。
实施例8
以大肠杆菌菌体(步骤5的酯酶ESTR基因工程菌株)为酶源，酶法拆分(±)-6-氟-色满-2-羧酸甲酯生产(R)-6-氟-色满-2-羧酸
根据实施例6确定的最佳拆分条件，以上述实施例5中冻干大肠杆菌菌体为催化剂，在0.2升反应液中加入菌体2g，(±)-6-氟-色满-2-羧酸甲酯300mM，甲苯与PB Buffer(pH7.5)的比例是1:3；反应温度30℃，转化时间12h，进行(±)-6-氟-色满-2-羧酸甲酯的水解拆分。采用与实施例2的(R)-6-氟-色满-2-羧酸的分离纯化以及液相检测方法，(R)-6-氟-色满-2-羧酸的液相图如图9所示。
结果，测定(R)-6-氟-色满-2-羧酸含量为138.8mM；转化率为48.7％；ee值是95.47％。
实施例9 6-氟色满-2-羧酸甲酯的两步拆分
在200mL的反应体系中，称取实施例1制备的冻干菌粉lycEstS 2g，投入底物6-氟色满-2-羧酸甲酯0.04mol(相当于200mM)，甲苯与PB Buffer(磷酸盐缓冲液，0.2M，pH7.1)的比例是1:3，反应温度30℃，并且控制pH7.1恒定，磁力搅拌反应3h，进行(±)-6-氟-色满-2-羧酸甲酯的选择性水解拆分。反应完成后，采用过滤方法去除菌体后，加入5M氢氧化钠溶液调节pH至11-12后，分离有机相和水相，然后在水相中加入盐酸溶液调节pH至1-2，用乙酸乙酯萃取3遍，旋蒸蒸发除去溶剂即可得到(S)-6-氟-色满-2-羧酸白色固体。高效液相色谱(手性柱Chirasil-AD-H)分析，测定底物转化率和产物的ee值。具体分析条件为：柱温度25℃，流动相为正己烷:异丙醇(90:10)，流速1.0mL/mL，检测波长254nm。测定(S)-6-氟-色满-2-羧酸含量为0.01786mol；转化率为46.9％；ee值是97.47％(见图10)。
2.将未反应完全底物的甲苯相转移到下一次反应体系，投入实施例5制备的冻干菌粉lycEstR 2g，加入PB Buffer(0.2M pH7.5)150mL,反应温度30℃，并且控制pH7.5恒定，磁力搅拌反应5h。反应完成后，采用上述的分离纯化以及液相检测方法，测定(R)-6-氟-色满-2-羧酸含量为0.01872mol；转化率为49.3％；ee值是99.07％(见图10)。
实施例10 6-氟色满-2-羧酸甲酯的连续分批拆分
本实施例采用固定化细胞进行试验。固定化细胞流程如下:
在实施例1的步骤6获得表达酯酶EstS的基因工程菌和实施例5的步骤6获得表达酯酶EstS的基因工程菌后，即分别离心收菌，将4g聚乙烯醇和1g海藻酸钠添加到50mL盐溶液中，在80℃恒温水浴中搅拌溶解。待溶液完全溶解并冷却至20℃后，将溶液与质量浓度为20％的相同体积的细菌液体均匀混合，获得混合物。然后通过注射器将混合物滴入含质量浓度为2％氯化钙的饱和硼酸溶液中，并储存4h以形成凝胶微球。形成的凝胶微球用生理盐水冲洗三次，分别获得表达酯酶EstS的基因工程菌细胞imcEstS和表达酯酶EstR的基因工程菌细胞imcEstR，然后在4℃的磷酸盐缓冲液中储存，备用。
第一批次反应：在100mL的反应体系中，包含75mL磷酸盐缓冲液(0.2M，pH7.0)，25mL甲苯，100mM底物6-氟色满-2-羧酸甲酯，表达酯酶EstS的基因工程菌细胞imcEstS10g,反应温度30℃，并且控制pH7.1恒定，磁力搅拌反应3h，在反应结束后，imcEstS通过过滤收集并用生理盐水洗涤3遍作为第三批次的催化剂。反应液是加氢氧化钠溶液调节pH至10-11，分离水相和有机相，水相是通过加盐酸调节pH至1-2，用乙酸乙酯萃取3遍获得(S)-6-氟-色满-2-羧酸，未反应完全底物的甲苯相用于下一批次反应。
第二批次反应：包含上批次未反应完全底物的甲苯相，75mL磷酸盐缓冲液(0.2MpH7.4)，表达酯酶EstR的基因工程菌细胞imcEstR 10g，反应温度30℃，并且控制pH7.5恒定，磁力搅拌反应5h。反应完成后，imcEstR通过过滤收集并用生理盐水洗涤3遍作为第四批次的催化剂。采用实施例9中的分离纯化方法从水相中得到(R)-6-氟-色满-2-羧酸。包含少量底物的有机相重新加入100mM底物(6-氟色满-2-羧酸甲酯)用于下批次反应,第三和第四批次反应分别是通过imcEstS(第一批次回收)和imcEstR(第二批次回收)催化的。反应过程和产物分离过程与前面反应一致。如此循环，实现6-氟色满-2-羧酸甲酯的连续分批拆分。
如图11所示，重复利用5批次后，imcEstS剩余最初活力的65％，imcEstR由于在双相反应中细胞裂解而显著失去活性。在经过总的10批次反应，获得了229.3mM(S)-6-氟-色满-2-羧酸(96.9％ee)和224.1mM(R)-6-氟-色满-2-羧酸(99.1％ee)，总的转化率达到93.5％。其中，在前6批次反应，转化率高达99.1％。
综上所述，本发明提供了一种用于制备光学纯的6-氟-色满-2-羧酸的连续双相分批拆分工艺，其通过交替投入表达酯酶EstS的重组大肠杆菌和表达酯酶EstR的重组大肠杆菌，实现了底物最大的拆分效率。且其有机相可以循环使用，同时可以回收各批次的表达酯酶EstS的重组大肠杆菌和表达酯酶EstR的重组大肠杆菌，催化剂利用率高。
以上所述仅是本发明的实施方式的举例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 华东理工大学
<120> 一种用于制备光学纯的6-氟-色满-2-羧酸的连续双相分批拆分工艺
<130> 211158
<141> 2021-12-23
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgcggatcca tggtcattgt tgaaacaga 29
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgcaagcttt tacacatgct cgcgaaacc 29
<210> 3
<211> 768
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atggtcattg ttgaaacaga acggctggct gatgtgccgg tgcttcatgt tgtcaagccg 60
gaaaagcggg acgcacggct gccgctcatt ttctttattc acggctttac aagcgcgaaa 120
gagcataatt tgcatttcgg ctacttgctt gccgaggcag gctatcgcgt tgtgcttccc 180
gacgcgctgt ttcacggcga gcgggacgaa ggtttgagcg agcggaaatt gcagctgtcg 240
ttttgggaca ttgtcgtgcg cacgatcacc gaaatcgagg agatgaaaaa cgaccttgtc 300
agccgcgggc tggctgacca agaacggatt gggctcgctg ggacatcgat gggcggcatc 360
gtcacattcg gcgcgctcgc cgtctatccg tgggtgaagg cggcggtggc gcttatgggc 420
tgcccgaact acagcgcctt ttttgacgcg atgatggaag aagcgaagcg gcgtcagatc 480
gacatcccga tgccgccgac gctgttggcg cttgaaagag aaaagctcgc tcgctacgat 540
ttatccaagc agccggaaac actcgccggg cggccgttgt tcatctggca cgggaaagcc 600
gaccaagtcg tcccgtatag ttatacatat gaattttacc agcaaattaa gccgctttat 660
gaaggaaacg aagaccggct gcaattcatc gccgacccgc acgccggcca taaagtgacg 720
cgcgaggcgt ttttggaaac ggtgcgctgg tttcgcgagc atgtgtaa 768
<210> 4
<211> 255
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Val Ile Val Glu Thr Glu Arg Leu Ala Asp Val Pro Val Leu His
1 5 10 15
Val Val Lys Pro Glu Lys Arg Asp Ala Arg Leu Pro Leu Ile Phe Phe
20 25 30
Ile His Gly Phe Thr Ser Ala Lys Glu His Asn Leu His Phe Gly Tyr
35 40 45
Leu Leu Ala Glu Ala Gly Tyr Arg Val Val Leu Pro Asp Ala Leu Phe
50 55 60
His Gly Glu Arg Asp Glu Gly Leu Ser Glu Arg Lys Leu Gln Leu Ser
65 70 75 80
Phe Trp Asp Ile Val Val Arg Thr Ile Thr Glu Ile Glu Glu Met Lys
85 90 95
Asn Asp Leu Val Ser Arg Gly Leu Ala Asp Gln Glu Arg Ile Gly Leu
100 105 110
Ala Gly Thr Ser Met Gly Gly Ile Val Thr Phe Gly Ala Leu Ala Val
115 120 125
Tyr Pro Trp Val Lys Ala Ala Val Ala Leu Met Gly Cys Pro Asn Tyr
130 135 140
Ser Ala Phe Phe Asp Ala Met Met Glu Glu Ala Lys Arg Arg Gln Ile
145 150 155 160
Asp Ile Pro Met Pro Pro Thr Leu Leu Ala Leu Glu Arg Glu Lys Leu
165 170 175
Ala Arg Tyr Asp Leu Ser Lys Gln Pro Glu Thr Leu Ala Gly Arg Pro
180 185 190
Leu Phe Ile Trp His Gly Lys Ala Asp Gln Val Val Pro Tyr Ser Tyr
195 200 205
Thr Tyr Glu Phe Tyr Gln Gln Ile Lys Pro Leu Tyr Glu Gly Asn Glu
210 215 220
Asp Arg Leu Gln Phe Ile Ala Asp Pro His Ala Gly His Lys Val Thr
225 230 235 240
Arg Glu Ala Phe Leu Glu Thr Val Arg Trp Phe Arg Glu His Val
245 250 255
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cgcggatccg tgcaagacca gtttttttc 29
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cgcaagcttt cattgttcac cctcctccg 29
<210> 7
<211> 717
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gtgcaagacc agtttttttc ggtcgccaag ccgccgacaa aagaacaacg gccgccgacg 60
gctgaaacaa ggcaacatga cgagaaaatg gatattgttg ctcttggcga ttcgttgacg 120
agaggaacgg gcgatgaaag cggcaaaggg tatgttggct atatggtcga tgcgcttcgc 180
cggcaaacgg atcggccgat ccgtgtgacg aatttggcca tccgcggcct tcgctccgac 240
gggctgcttc gccagcttgg ccagcctgag attcaacggc aagtcgccat ggcggatttg 300
atcgtgatga cgatcggcgg caacgacttg tttcaagggg gggaagcgct tcggttgaac 360
gccaagcagc tggatgaagc gaagcgccgg tatgcagcca acctagacca cattttcgcc 420
gcgctgcgcc gcttcaacag cgaagcggtc atttttgcaa tcggtttgta caacccgttt 480
ggcgatttaa acgatgccaa acggacgtcg gccgttgtgc gcgattggaa ttttgcatca 540
gcggaagtgg cggcccgcta tccgaacatc gtcgcggtgc cgacgtttga tttgtttgcc 600
ctccatgtca atgactattt gtacagcgac cattttcatc caaacgcggc aggctacaag 660
cggattggag agcgcgtcgc ctcgctcatc acgttgacgg aggagggtga acaatga 717
<210> 8
<211> 238
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Val Gln Asp Gln Phe Phe Ser Val Ala Lys Pro Pro Thr Lys Glu Gln
1 5 10 15
Arg Pro Pro Thr Ala Glu Thr Arg Gln His Asp Glu Lys Met Asp Ile
20 25 30
Val Ala Leu Gly Asp Ser Leu Thr Arg Gly Thr Gly Asp Glu Ser Gly
35 40 45
Lys Gly Tyr Val Gly Tyr Met Val Asp Ala Leu Arg Arg Gln Thr Asp
50 55 60
Arg Pro Ile Arg Val Thr Asn Leu Ala Ile Arg Gly Leu Arg Ser Asp
65 70 75 80
Gly Leu Leu Arg Gln Leu Gly Gln Pro Glu Ile Gln Arg Gln Val Ala
85 90 95
Met Ala Asp Leu Ile Val Met Thr Ile Gly Gly Asn Asp Leu Phe Gln
100 105 110
Gly Gly Glu Ala Leu Arg Leu Asn Ala Lys Gln Leu Asp Glu Ala Lys
115 120 125
Arg Arg Tyr Ala Ala Asn Leu Asp His Ile Phe Ala Ala Leu Arg Arg
130 135 140
Phe Asn Ser Glu Ala Val Ile Phe Ala Ile Gly Leu Tyr Asn Pro Phe
145 150 155 160
Gly Asp Leu Asn Asp Ala Lys Arg Thr Ser Ala Val Val Arg Asp Trp
165 170 175
Asn Phe Ala Ser Ala Glu Val Ala Ala Arg Tyr Pro Asn Ile Val Ala
180 185 190
Val Pro Thr Phe Asp Leu Phe Ala Leu His Val Asn Asp Tyr Leu Tyr
195 200 205
Ser Asp His Phe His Pro Asn Ala Ala Gly Tyr Lys Arg Ile Gly Glu
210 215 220
Arg Val Ala Ser Leu Ile Thr Leu Thr Glu Glu Gly Glu Gln
225 230 235

Claims (10)

1.一种用于制备光学纯的6-氟-色满-2-羧酸的连续双相分批拆分工艺，其特征在于，以外消旋6-氟-色满-2-羧酸甲酯为底物，进行两批次或多批次反应，相邻批次反应交替使用表达EstS的重组大肠杆菌或表达EstR的重组大肠杆菌作为催化剂，在有机相和水相的双相体系中反应；
每批次反应完成后，分离有机相和水相，回收未反应完全底物的有机相用于下一批反应；纯化水相，去除溶剂，获得(S)-6-氟-色满-2-羧酸或(R)-6-氟-色满-2-羧酸；
在每个批次后补充水相，用于下一批次反应；在每两个批次后补充底物6-氟-色满-2-羧酸甲酯，用于下一批次反应；如此循环，实现6-氟色满-2-羧酸甲酯的连续分批拆分；
其中，所述表达EstS的重组大肠杆菌克隆有如SEQ ID NO.3所示的EstS基因序列，所述表达EstR的重组大肠杆菌克隆有如SEQ ID NO.7所示的EstR基因序列。
2.如权利要求1所述的用于制备光学纯的6-氟-色满-2-羧酸的连续双相分批拆分工艺，其特征在于，每批次反应完成后，采用过滤方法去除菌体或回收固定化细胞后，其中，表达EstS的重组大肠杆菌或表达EstR的重组大肠杆菌用生理盐水洗涤3遍作为下一批次的催化剂。
3.如权利要求1所述的用于制备光学纯的6-氟-色满-2-羧酸的连续双相分批拆分工艺，其特征在于，每批次反应完成后，反应液中加入氢氧化钠溶液调节pH至11-12后，分离有机相和水相，然后在水相中加入盐酸溶液调节pH至1-2，用乙酸乙酯萃取3遍，旋蒸蒸发除去溶剂，得到(S)-6-氟-色满-2-羧酸白色固体或(R)-6-氟-色满-2-羧酸白色固体，未反应完全底物的有机相用于下一批次反应。
4.如权利要求1所述的用于制备光学纯的6-氟-色满-2-羧酸的连续双相分批拆分工艺，其特征在于，所述的双相体系，有机相为甲苯，水相为磷酸缓冲液。
5.如权利要求1所述的用于制备光学纯的6-氟-色满-2-羧酸的连续双相分批拆分工艺，其特征在于，表达EstR的重组大肠杆菌的催化剂为表达EstR的重组大肠杆菌的冻干菌体或固定化表达EstR的重组大肠杆菌细胞；表达EstS的重组大肠杆菌的催化剂为表达EstS的重组大肠杆菌的冻干菌体或固定化表达EstS的重组大肠杆菌细胞。
6.如权利要求1所述的用于制备光学纯的6-氟-色满-2-羧酸的连续双相分批拆分工艺，其特征在于，当使用表达EstS的重组大肠杆菌进行拆分时，反应体系的pH控制在7.0-7.1；当使用表达EstR的重组大肠杆菌进行拆分时，反应体系的pH控制在7.4-7.5。
7.如权利要求1所述的用于制备光学纯的6-氟-色满-2-羧酸的连续双相分批拆分工艺，其特征在于，双水相体系的反应温度为30℃，反应时间为2～40小时。
8.如权利要求1所述的用于制备光学纯的6-氟-色满-2-羧酸的连续双相分批拆分工艺，其特征在于，所述有机相的含量的体积百分比为20%-30%。
9.如权利要求1所述的用于制备光学纯的6-氟-色满-2-羧酸的连续双相分批拆分工艺，其特征在于，所述表达EstS的重组大肠杆菌或表达EstR的重组大肠杆菌的浓度为10g/L；外消旋6-氟-色满-2-羧酸甲酯的浓度是100-200mM。
10.如权利要求1-9任一项所述的用于制备光学纯的6-氟-色满-2-羧酸的连续双相分批拆分工艺，其特征在于，分批反应时，先投入表达EstS的重组大肠杆菌进行拆分反应；下一批次反应，再投入表达EstR的重组大肠杆菌进行拆分反应。
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Citations (3)

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