CN114149956B - 一种表达酯酶EstR的大肠杆菌基因工程菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种表达酯酶EstR的大肠杆菌基因工程菌，其是将具有序列如SEQ ID NO.3所示的EstR基因序列的目的片段克隆到表达载体中，然后转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中制备获得。本发明公开了该表达酯酶EstR的大肠杆菌基因工程菌的应用。本发明还公开了一种微生物酶法拆分制备(R)‑6‑氟‑色满‑2‑羧酸的方法，其是以所述的表达酯酶EstR的大肠杆菌基因工程菌为催化剂，以外消旋6‑氟‑色满‑2‑羧酸甲酯为底物，进行反应，该方法提供了出色的立体选择性。

Description

一种表达酯酶EstR的大肠杆菌基因工程菌及其应用
技术领域
本发明属于医药生物化工技术领域，具体地说，是关于一种表达酯酶EstR的大肠杆菌基因工程菌及其拆分制备(R)-6-氟-色满-2-羧酸的方法。
背景技术
6-氟-色满-2-羧酸是重要医药中间体。化学名称是6-氟-3，4-二氢-2H-1-苯并吡喃-2-甲酸，化学分子式是C10H9O3F分子量是196.18，结构式为：
在许多具有生物活性的分子结构中，都能发现6-氟-色满的色满结构单元的存在。譬如，该结构广泛包含在维生素E及许多拮抗β受体的抗高血压药中。光学纯的6-氟-色满-2-羧酸用于新型降血压药物(S,R,R,R)-奈必洛尔的合成。(S,R,R,R)-奈必洛尔是第三代兼有血管扩张作用的心脏高度选择性β1受体阻滞剂，主要用于治疗原发性高血压，能有效地控制高血压和保持左心室功能，并且具有剂量低、副作用少，耐受性好等优点。
6-氟-色满-2-羧酸是制备奈必洛尔的关键中间体，其拆分效率决定制备奈必洛尔合成方法的最终结果。但是关于6-氟-色满-2-羧酸(R)-，(S)-光学异构体拆分方法文献报道较少。迄今为止，化学方法、生物拆分法等是几种拆分有机酸常用的办法。文献曾有报道使用脱氢枞胺拆分外消旋的6-氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-2-甲酸，总拆分收率经实验证明约为32％。此化学拆分方法过程较冗长，并且脱氢枞胺手性拆分试剂价格较贵，效率不高。EP2646426报道过利用来源于真菌Ophiostoma novo-ulmi的酯酶拆分外消旋的6-氟-色满-2-羧酸乙酯，分离纯化得到(R)-6-氟-色满-2-羧酸，ee值是90.72％，转化率是50.28％。此类方法操作简便，条件温和。但是立体选择性不高。因此急需找到其他的高活性和高立体选择性的脂肪酶/酯酶。。基于此，开发了脂肪酶拆分制备(R)-6-氟-色满-2-羧酸的方法。
发明内容
本发明以外消旋6-氟-色满-2-羧酸甲酯为底物，利用离体的酯酶EstR或高效表达EstR的重组大肠杆菌的冻干菌体(fdcEstR)作为催化剂，选择性催化(R)-6-氟-色满-2-羧酸甲酯的水解反应，由此制备获得光学纯的(R)-6-氟-色满-2-羧酸，具有转化率高、立体旋转性强。因此本发明的第一个目的是提供一种表达酯酶ESTR的大肠杆菌基因工程菌。本发明的第二个目的是提供一种表达酯酶ESTR的大肠杆菌基因工程菌的应用。本发明的第三个目的是提供一种微生物酶法拆分制备(R)-6-氟-色满-2-羧酸的方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
作为本发明的第一个方面，一种表达酯酶EstR的大肠杆菌基因工程菌，其是将具有序列如SEQ ID NO.3所示的EstR基因序列的目的片段克隆到表达载体中，获得重组质粒，然后将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中制备获得。
根据本发明，所述表达载体为pET-28a(+)表达载体。
作为本发明的第二个方面，一种表达酯酶ESTR的大肠杆菌基因工程菌的制备方法，包括如下步骤：
步骤一、提取热链状地芽孢杆菌Geobacillus thermocatenulatus strain BGSC93A1的基因组DNA；
步骤二、以热链状地芽孢杆菌的EstR序列设计上下游引物，上游引物序列如SEQID NO.1所示，下游引物序列如SEQ ID NO.2所示；
步骤三、以步骤一的热链状地芽孢杆菌Geobacillus thermocatenulatus strainBGSC 93A1的基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到目的DNA片段，序列如SEQ ID NO.3所示；
步骤四、将目的DNA片段克隆到pET-28a(+)表达载体，得重组质粒；
步骤五、将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，获得重组菌株。
作为本发明的第三个方面，一种含酯酶EstR基因的重组质粒，其是将具有序列如SEQ ID NO.3所示的EstR基因序列的目的片段克隆到表达载体中制备获得。
根据本发明，所述表达载体为pET-28a(+)表达载体。
作为本发明的第四个方面，一种含酯酶ESTR基因的重组质粒的制备方法，包括如下步骤：
步骤一、提取热链状地芽孢杆菌Geobacillus thermocatenulatus strain BGSC93A1的基因组DNA；
步骤二、以热链状地芽孢杆菌的EstR序列设计上下游引物，上游引物序列如SEQID NO.1所示，下游引物序列如SEQ ID NO.2所示；
步骤三、以步骤一的热链状地芽孢杆菌Geobacillus thermocatenulatus strainBGSC 93A1的基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到目的DNA片段，序列如SEQ ID NO.3所示；
步骤四、将目的DNA片段克隆到pET-28a(+)表达载体，得重组质粒。
步骤五、将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，获得重组菌株。
作为本发明的第五个方面，一种酯酶EstR基因，其具有序列如SEQ ID NO.3所示的EstR基因序列。
作为本发明的第六个方面，一种酯酶EstR基因的制备方法，包括如下步骤：
步骤一、提取热链状地芽孢杆菌Geobacillus thermocatenulatus strain BGSC93A1的基因组DNA；
步骤二、以热链状地芽孢杆菌的EstR序列设计上下游引物，上游引物序列如SEQID NO.1所示，下游引物序列如SEQ ID NO.2所示；
步骤三、以步骤一的热链状地芽孢杆菌Geobacillus thermocatenulatus strainBGSC 93A1的基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到目的DNA片段，序列如SEQ ID NO.3所示。
作为本发明的第七个方面，一种如上述所述的表达酯酶EstR的大肠杆菌基因工程菌在酶法拆分制备(R)-6-氟-色满-2-羧酸的方法中的应用。
进一步，一种如上述所述的表达酯酶EstR的大肠杆菌基因工程菌用作酶法拆分制备(R)-6-氟-色满-2-羧酸的方法中的催化剂。
作为本发明到第八个方面，一种微生物酶法拆分制备(R)-6-氟-色满-2-羧酸的方法，其是以上述所述的表达酯酶EstR的大肠杆菌基因工程菌为催化剂，以外消旋6-氟-色满-2-羧酸甲酯为底物，在pH为6.0-8.5的缓冲液中，加入有机溶剂，在20-60℃温度下反应1-12小时，接着，进行分离纯化。
根据本发明，所述的有机溶剂为异丙醇、丁醇、甲苯、正己烷、正庚烷或异辛烷中的一种。
进一步的，所述的有机溶剂为甲苯。
根据本发明，所述的甲苯的体积百分比为10-50％。
优选的，甲苯的体积百分比为20-30％。
根据本发明，所述的表达酯酶EstR的大肠杆菌基因工程菌的浓度为10g/L，所述的外消旋6-氟-色满-2-羧酸甲酯的浓度为100-40OmM。
优选的，所述的外消旋6-氟-色满-2-羧酸甲酯的浓度为300mM。
根据本发明，所述的分离纯化，其是在反应完成后，采用过滤方法去除表达酯酶ESTR的大肠杆菌基因工程菌后，加入5M氢氧化钠溶液调节pH至11-12后，分离有机相和水相，然后在水相中加入盐酸溶液调节pH至1-2，用乙酸乙酯萃取3遍，旋蒸蒸发除去溶剂即可得到(R)-6-氟-色满-2-羧酸白色固体。
本发明的表达酯酶EstR的大肠杆菌基因工程菌，其有益效果是，可以用作酶法拆分制备(R)-6-氟-色满-2-羧酸的方法中的催化剂，使得酶法拆分制备(R)-6-氟-色满-2-羧酸的方法可以提供高的立体选择性。
本发明的微生物酶法拆分制备(R)-6-氟-色满-2-羧酸的方法，其有益效果是：转化率>46％，ee值95-96％，具有反应效率高、立体选择性高、工艺相对简单等特点。
附图说明
图1为有机溶剂比例对反应的影响。
图2为温度对反应的影响。
图3为pH对反应的影响。
图4为(R)-6-氟-色满-2-羧酸的液相图。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或厂商提供的条件进行。
实施例1大肠杆菌基因工程菌的构建及酯酶ESTR的高效表达
1.将热链状地芽孢杆菌Geobacillus thermocatenulatus strain BGSC 93A1使用培养基(Peptone 5g,Meat extract 3g,蒸馏水1L)复苏，在60℃恒温摇床中需氧培养12小时，使用紫外分光光度计测量细菌浓度。
2.细菌DNA提取，使用细菌基因组DNA快速提取试剂盒(Generay Biotech,Shanghai,China)进行提取，获得Geobacillus thermocatenulatus基因组DNA。
3.根据Geobacillus thermocatenulatus菌株的酯酶ESTR基因序列设计引物，所设计上游引物和下游引物如下：
上游引物：5’CGCGGATCCGTGCAAGACCAGTTTTTTTC 3’，SEQ ID NO.1，其中，下划线部分为BamH I识别位点；
下游引物：5’CGCAAGCTTTCATTGTTCACCCTCCTCCG 3’，SEQ ID NO.2，其中，下划线部分为Hind III识别位点；
4.然后以热链状地芽孢杆菌Geobacillus thermocatenulatus的基因组DNA为模板，利用聚合酶链式反应(PCR)进行基因扩增，获得包含酯酶EstR全长基因的PCR产物，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。其中，其中，PCR扩增体系为Primer STAR Max 25μL；正向引物和反向引物各1.5μL；水22μL；模板0.5μL。
核苷酸序列：
GTGCAAGACCAGTTTTTTTCGGTCGCCAAGCCGCCGACAAAAGAACAACGGCCGCCGACGGCTGAAACAAGGCAACATGACGAGAAAATGGATATTGTTGCTCTTGGCGATTCGTTGACGAGAGGAACGGGCGATGAAAGCGGCAAAGGGTATGTTGGCTATATGGTCGATGCGCTTCGCCGGCAAACGGATCGGCCGATCCGTGTGACGAATTTGGCCATCCGCGGCCTTCGCTCCGACGGGCTGCTTCGCCAGCTTGGCCAGCCTGAGATTCAACGGCAAGTCGCCATGGCGGATTTGATCGTGATGACGATCGGCGGCAACGACTTGTTTCAAGGGGGGGAAGCGCTTCGGTTGAACGCCAAGCAGCTGGATGAAGCGAAGCGCCGGTATGCAGCCAACCTAGACCACATTTTCGCCGCGCTGCGCCGCTTCAACAGCGAAGCGGTCATTTTTGCAATCGGTTTGTACAACCCGTTTGGCGATTTAAACGATGCCAAACGGACGTCGGCCGTTGTGCGCGATTGGAATTTTGCATCAGCGGAAGTGGCGGCCCGCTATCCGAACATCGTCGCGGTGCCGACGTTTGATTTGTTTGCCCTCCATGTCAATGACTATTTGTACAGCGACCATTTTCATCCAAACGCGGCAGGCTACAAGCGGATTGGAGAGCGCGTCGCCTCGCTCATCACGTTGACGGAGGAGGGTGAACAATGA，SEQ ID NO.3。
氨基酸序列：
VQDQFFSVAKPPTKEQRPPTAETRQHDEKMDIVALGDSLTRGTGDESGKGYVGYMVDALRRQTDRPIRVTNLAIRGLRSDGLLRQLGQPEIQRQVAMADLIVMTIGGNDLFQGGEALRLNAKQLDEAKRRYAANLDHIFAALRRFNSEAVIFAIGLYNPFGDLNDAKRTSAVVRDWNFASAEVAARYPNIVAVPTFDLFALHVNDYLYSDHFHPNAAGYKRIGERVASLITLTEEGEQ，SEQ ID NO.4。
5.将pET-28a(+)空载质粒，以及步骤4得到的带有BamH I和Hind III酶切位点的基因(序列如SEQ ID NO.3所示)，分别用BamH I和Hind III进行双酶切。回收大片段，用T4DNA连接酶连接，热激法转化大肠杆菌BL21，用含50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基进行筛选，PCR法挑取阳性克隆，试剂盒提取阳性克隆质粒，经基因测序鉴定，获得正确的克隆质粒，从而构建得到酯酶EstR基因工程菌株lycEstR。
6.将阳性重组菌株(步骤5的酯酶EstR基因工程菌株lycEstR)接种于含有50μg/mL卡那霉素的5mL LB培养基中37℃过夜培养，随后以1％转接量接入50mL含有50μg/mL卡那霉素的新鲜LB培养基中继续繁殖，当OD600达到0.6～0.8时，加入IPTG至终浓度0.1mM。在20℃下诱导16～18小时后，离心收集菌体，然后放在冷冻干燥机冷冻12小时，制备冻干菌粉储存冰箱，备用。
实施例2(R)-6-氟-色满-2-羧酸的分离纯化以及液相检测方法
在0.1M磷酸盐缓冲液中，用实施例1制备的冻干菌粉(lycEstR)进行(±)-6-氟-色满-2-羧酸甲酯的水解动力学拆分，但是没有观察到良好的活性和选择性。因此，反应在包含不同有机溶剂的双相体系(有机溶剂与磷酸盐缓冲液)中进行。
反应完成后，采用过滤方法去除菌体后，加入5M氢氧化钠溶液调节pH11-12后，分离有机相和水相，然后在水相中加入盐酸溶液调节pH1-2，用乙酸乙酯萃取3遍，旋蒸蒸发除去溶剂即可得到(R)-6-氟-色满-2-羧酸白色固体。高效液相色谱(手性柱Chirasil-AD-H)分析，测定底物转化率和产物的ee值。具体分析条件为：柱温度25℃，流动相为正己烷:异丙醇(90:10)，流速1.0mL/mL，检测波长254nm。
实施例3以冻干大肠杆菌菌体(lycEstR)为催化剂，考察(R)-6-氟-色满-2-羧酸制备的条件
反应体系包括：菌体，(±)-6-氟-色满-2-羧酸甲酯，有机溶剂，反应温度，反应时间，反应pH，底物浓度，buffer，(±)-6-氟-色满-2-羧酸甲酯即底物。
以上述实例1中的重组大肠杆菌菌体(步骤5的酯酶ESTR基因工程菌株)为酶源，考察有机溶剂的选择、有机溶剂添加的比例、反应温度、反应pH、底物浓度等因素，以提高目标产物(R)-6-氟-色满-2-羧酸的时空产率。
1、考察所选有机溶剂对反应的影响
在10mL的反应体系中，菌体浓度10g/L；(±)-6-氟-色满-2-羧酸甲酯用量为100mM；有机溶剂与PB Buffer(pH7.4)的比例是1:4；反应温度为30℃；反应时间为12h。所选的有机溶剂包括异丙醇、丁醇、甲苯、正己烷、正庚烷、异辛烷。结果见表1。
表1有机溶剂对反应的影响
有机溶剂 log P 转化率(％) ee(％)
异丙醇 0.38 52.3 45.3
丁醇 0.88 7.8 1.6
甲苯 2.5 48.6 95.6
正己烷 3.5 42.5 89.7
正庚烷 4.0 26.6 11.6
异辛烷 4.5 5.4 2.1
结果显示：所选的有机溶剂中，甲苯的转化率和ee值均良好。
2、考察甲苯与PB Buffer(pH7.4)对反应的影响。
在10mL的反应体系中，菌体浓度10g/L；(±)-6-氟-色满-2-羧酸甲酯用量为100mM；反应温度为30℃；反应pH是7.4；反应时间为12h。所选甲苯占总体积的比例是10％、20％、30％、40％，50％(v/v)。结果如图1所示。
图1结果显示，甲苯占总体积为20-30％时，转化率和ee值均良好。
3、考察温度对反应的影响。
在10mL的反应体系中，菌体浓度10g/L；(±)-6-氟-色满-2-羧酸甲酯用量为100mM；甲苯与PB Buffer(pH7.4)的比例是1:3；反应时间为6h。所选反应温度是10～50℃。结果如图2所示。
图2结果显示，反应温度为30℃时，转化率和ee值均良好。
4、考察pH对反应的影响。
在10mL的反应体系中，菌体浓度10g/L；(±)-6-氟-色满-2-羧酸甲酯用量为100mM；甲苯与Buffer的比例是1:3；反应时间为6h。结果如图3所示。
图3结果显示，所选反应pH是6、6.5、7、7.5、8、8.5，优选为7.5。
5、考察底物浓度对反应的影响。在10mL的反应体系中，甲苯与Buffer的比例是1:3；反应温度为30℃；反应pH是7.5。所选底物浓度是100、200、300、400mM，结果见表2。
表2底物浓度对反应的影响
表2结果显示，所选底物浓度为100mM、200mM和300mM时，转化率和ee值均良好。
实施例4
以大肠杆菌菌体(步骤5的酯酶ESTR基因工程菌株)为酶源，酶法拆分(±)-6-氟-色满-2-羧酸甲酯生产(R)-6-氟-色满-2-羧酸
根据实施例3确定的最佳拆分条件，以上述实例1中冻干大肠杆菌菌体为催化剂，在0.2升反应液中加入菌体2g，(±)-6-氟-色满-2-羧酸甲酯300mM，甲苯与PB Buffer(pH7.5)的比例是1:3；反应温度30℃，转化时间12h，进行(±)-6-氟-色满-2-羧酸甲酯的水解拆分。采用与实施例2的(R)-6-氟-色满-2-羧酸的分离纯化以及液相检测方法，(R)-6-氟-色满-2-羧酸的液相图如图4所示。
结果，测定(R)-6-氟-色满-2-羧酸含量为138.8mM；转化率为48.7％；ee值是95.47％。
以上所述仅是本发明的实施方式的举例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 华东理工大学
<120> 一种表达酯酶EstR的大肠杆菌基因工程菌及其应用
<130> 211156
<141> 2021-12-23
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgcggatccg tgcaagacca gtttttttc 29
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgcaagcttt cattgttcac cctcctccg 29
<210> 3
<211> 717
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtgcaagacc agtttttttc ggtcgccaag ccgccgacaa aagaacaacg gccgccgacg 60
gctgaaacaa ggcaacatga cgagaaaatg gatattgttg ctcttggcga ttcgttgacg 120
agaggaacgg gcgatgaaag cggcaaaggg tatgttggct atatggtcga tgcgcttcgc 180
cggcaaacgg atcggccgat ccgtgtgacg aatttggcca tccgcggcct tcgctccgac 240
gggctgcttc gccagcttgg ccagcctgag attcaacggc aagtcgccat ggcggatttg 300
atcgtgatga cgatcggcgg caacgacttg tttcaagggg gggaagcgct tcggttgaac 360
gccaagcagc tggatgaagc gaagcgccgg tatgcagcca acctagacca cattttcgcc 420
gcgctgcgcc gcttcaacag cgaagcggtc atttttgcaa tcggtttgta caacccgttt 480
ggcgatttaa acgatgccaa acggacgtcg gccgttgtgc gcgattggaa ttttgcatca 540
gcggaagtgg cggcccgcta tccgaacatc gtcgcggtgc cgacgtttga tttgtttgcc 600
ctccatgtca atgactattt gtacagcgac cattttcatc caaacgcggc aggctacaag 660
cggattggag agcgcgtcgc ctcgctcatc acgttgacgg aggagggtga acaatga 717
<210> 4
<211> 238
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Val Gln Asp Gln Phe Phe Ser Val Ala Lys Pro Pro Thr Lys Glu Gln
1 5 10 15
Arg Pro Pro Thr Ala Glu Thr Arg Gln His Asp Glu Lys Met Asp Ile
20 25 30
Val Ala Leu Gly Asp Ser Leu Thr Arg Gly Thr Gly Asp Glu Ser Gly
35 40 45
Lys Gly Tyr Val Gly Tyr Met Val Asp Ala Leu Arg Arg Gln Thr Asp
50 55 60
Arg Pro Ile Arg Val Thr Asn Leu Ala Ile Arg Gly Leu Arg Ser Asp
65 70 75 80
Gly Leu Leu Arg Gln Leu Gly Gln Pro Glu Ile Gln Arg Gln Val Ala
85 90 95
Met Ala Asp Leu Ile Val Met Thr Ile Gly Gly Asn Asp Leu Phe Gln
100 105 110
Gly Gly Glu Ala Leu Arg Leu Asn Ala Lys Gln Leu Asp Glu Ala Lys
115 120 125
Arg Arg Tyr Ala Ala Asn Leu Asp His Ile Phe Ala Ala Leu Arg Arg
130 135 140
Phe Asn Ser Glu Ala Val Ile Phe Ala Ile Gly Leu Tyr Asn Pro Phe
145 150 155 160
Gly Asp Leu Asn Asp Ala Lys Arg Thr Ser Ala Val Val Arg Asp Trp
165 170 175
Asn Phe Ala Ser Ala Glu Val Ala Ala Arg Tyr Pro Asn Ile Val Ala
180 185 190
Val Pro Thr Phe Asp Leu Phe Ala Leu His Val Asn Asp Tyr Leu Tyr
195 200 205
Ser Asp His Phe His Pro Asn Ala Ala Gly Tyr Lys Arg Ile Gly Glu
210 215 220
Arg Val Ala Ser Leu Ile Thr Leu Thr Glu Glu Gly Glu Gln
225 230 235

Claims (4)

1.一种表达酯酶EstR的大肠杆菌基因工程菌在酶法拆分制备(R)-6-氟-色满-2-羧酸的方法中的应用，其特征在于：
所述表达酯酶EstR的大肠杆菌基因工程菌的制备方法包括以下步骤：
将如SEQ ID NO.3所示的EstR基因序列克隆到表达载体中，获得重组质粒，然后将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，制备获得表达酯酶EstR的大肠杆菌基因工程菌；
所述的表达酯酶EstR的大肠杆菌基因工程菌为催化剂，以外消旋6-氟-色满-2-羧酸甲酯为底物，在包含有机溶剂和磷酸盐缓冲液的体系中制备(R)-6-氟-色满-2-羧酸；
所述的有机溶剂为甲苯或正己烷。
2.一种表达酯酶EstR的大肠杆菌基因工程菌在制备酶法拆分制备(R)-6-氟-色满-2-羧酸的方法中的催化剂中的应用，其特征在于：
所述表达酯酶EstR的大肠杆菌基因工程菌的制备方法包括以下步骤：
将如SEQ ID NO.3所示的EstR基因序列克隆到表达载体中，获得重组质粒，然后将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，制备获得表达酯酶EstR的大肠杆菌基因工程菌；
所述酶法拆分制备(R)-6-氟-色满-2-羧酸的方法包括以所述的表达酯酶EstR的大肠杆菌基因工程菌为催化剂，以外消旋6-氟-色满-2-羧酸甲酯为底物，在包含有机溶剂和磷酸盐缓冲液的体系中制备(R)-6-氟-色满-2-羧酸；
所述的有机溶剂为甲苯或正己烷。
3.一种微生物酶法拆分制备(R)-6-氟-色满-2-羧酸的方法，其特征在于，其是以表达酯酶EstR的大肠杆菌基因工程菌为催化剂，以外消旋6-氟-色满-2-羧酸甲酯为底物，在pH为6.0-8.5的磷酸盐缓冲液中，加入有机溶剂，在20-60℃温度下反应1-12小时，接着，进行分离纯化；
所述表达酯酶EstR的大肠杆菌基因工程菌的制备方法包括以下步骤：
将如SEQ ID NO.3所示的EstR基因序列克隆到表达载体中，获得重组质粒，然后将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，制备获得表达酯酶EstR的大肠杆菌基因工程菌；
所述的有机溶剂为甲苯或正己烷。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的分离纯化，其是在反应完成后，采用过滤方法去除表达酯酶EstR的大肠杆菌基因工程菌后，加入5M氢氧化钠溶液调节pH至11-12后，分离有机相和水相，然后在水相中加入盐酸溶液调节pH至1-2，用乙酸乙酯萃取3遍，旋蒸蒸发除去溶剂即可得到(R)-6-氟-色满-2-羧酸白色固体。
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