CN116121216A - 羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的融合酶、编码基因、工程菌及应用 - Google Patents

羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的融合酶、编码基因、工程菌及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的融合酶、编码基因、工程菌及应用，本发明实现了羰基还原酶(SRED)和葡萄糖脱氢酶(GDH)的融合表达，节约了发酵成本，降低了发酵废液的产生量，对环境友好。融合表达不影响羰基还原酶的光学选择性，大幅降低了反应中所使用的辅酶因子，节约了反应成本。该羰基还原酶有广泛的底物谱和良好的立体选择性，用本发明方法制备所得的含羰基还原酶SRED和葡萄糖脱氢酶GDH的重组酶具有对环境友好、操作简单、反应条件温和等优点，具有良好的工业应用前景。

Description

羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的融合酶、编码基因、工程菌及应用
(一)技术领域
本发明涉及一种羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的融合酶、编码基因、工程菌及应用。
(二)背景技术
(S)-1-(3-(三氟甲基)苯基)乙醇，CAS号96789-80-9，密度1.234g/cm3，分子量190.162，易溶于有机溶剂如乙酸乙酯，微溶于水，具有特殊的生物活性，是合成手性药物(S)-MA20565的重要手性中间体。(S)-MA20565最先由三菱化学集团报道，因其带有N-甲基甲氧基亚氨基乙酰胺作为药效团和取代的醛肟醚侧链，显示出对多种病害菌的有效杀菌活性，为广谱农业杀菌剂。(S)-MA20565重要商用应用价值促使我们对其手性中间体(S)-1-(3-(三氟甲基)苯基)乙醇进行研究。
目前，(S)-1-(3-(三氟甲基)苯基)乙醇的合成多以化学方式为主，以潜手性酮为原料，使用昂贵的稀有金属钌络合物为催化剂制备。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的融合酶、编码基因、工程菌及应用，通过连接肽使羰基还原酶(SRED)与葡萄糖脱氢酶(GDH)融合表达，作为生物催化剂用于不对称还原手性酮制备手性醇，在不影响羰基还原酶的高催化活性和高光学选择性的基础上，降低了反应所需成本，解决了反应中辅酶消耗问题，建立了一条反应条件温和、绿色环保、光学选择性高的生物合成路线，提高了原子经济性。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的融合酶，所述融合酶氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明所述融合酶是将羰基还原酶SRED和葡萄糖脱氢酶GDH通过连接肽融合而成，所述羰基还原酶氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
所述融合酶按如下方法构建：将来源于近平滑假丝酵母菌(Candidaparapsilosis)ATCC 7330的基因组经PCR扩增获得带有连接肽的羰基还原酶SRED编码基因片段；再将来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的葡萄糖脱氢酶GDH的基因经PCR扩增获得带有连接肽的葡萄糖脱氢酶GDH编码基因片段；以无缝克隆技术融合连接带有连接肽的羰基还原酶SRED编码基因片段和带有连接肽的葡萄糖脱氢酶GDH编码基因片段至线性化载体pET-Duet1，导入E.coli DH5α感受态细胞中，挑选单菌落测序验证成功后将质粒导入表达宿主细胞E.coli BL21(DE3)构建重组菌，诱导重组菌产酶，经超声破碎处理后，离心后弃去沉淀得到粗酶液，经镍柱纯化得到融合酶纯酶。
本发明还提供一种所述羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的融合酶的编码基因，所述编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明还涉及含所述羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的融合酶的编码基因的重组载体，由重组载体构建获得的重组菌；所述重组载体以pET-Duet1为基础载体，所述重组菌以E.coli BL21(DE3)为宿主菌。
本发明还提供一种所述羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的融合酶在不对称还原手性酮制备手性醇中的应用，所述的应用为：以含羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的融合酶编码基因的重组基因工程菌发酵培养获得的湿菌体超声破碎提取的纯酶为催化剂，以手性酮为底物，加入助溶剂、葡萄糖和辅助因子NADP+，以pH5.5-7.5(优选pH6.0)缓冲液为反应介质构建反应体系，在25-45℃、100-200rpm(优选30℃、180rpm)条件下震荡反应6-36h(优选18h)，反应液分离纯化，获得手性醇；所述底物包括间三氟甲基苯乙酮、3-氟苯乙酮、2-羟基-1-苯基乙酮、间硝基苯乙酮、2-溴-4-氟苯乙酮；所述助溶剂包括乙醇、甲醇、异丙醇、甘油，优选异丙醇。
优选的，所述反应体系中，催化剂以纯酶质量计为1-20g/L，优选10g/L；底物加入终浓度为10-50mM，优选20mM；助溶剂体积加入终浓度为5-20％，优选10％；葡萄糖加入终浓度为20-60g/L，优选40g/L；NADP+加入终浓度为0.01-1.0mM，优选0.1mM。
优选的，所述催化剂按如下方法制备：
(1)将含羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的融合酶编码基因的重组基因工程菌(优选E.coli BL21(DE3)-pET-Duet1-SRED-Linker-GDH)接种于含50μg/mL卡那霉素的LB固体平板上，37℃，16h倒置培养，挑选平板上单菌落接种于含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37℃、180rpm培养16h后，将种子液以体积浓度3％的接种量接种于LB液体培养基中，37℃，180rpm培养至OD600到0.6-0.8后，加入终浓度0.1-1.0mM(优选0.1mM)的IPTG，23℃、180rpm诱导16h，4℃离心(8000rpm，10min)发酵液，生理盐水洗涤两次，收集菌体沉淀；
(2)将步骤(1)菌体沉淀加入100mM，pH 6.0磷酸缓冲液重悬菌体，超声破碎15分钟(功率120W，工作3秒，暂停5秒)，破碎液离心(8000rpm，4℃离心10min)后，取上清液，即得到融合酶粗酶液；
(3)用0.45μm滤膜将步骤(2)粗酶液过滤，去除漂浮沉淀，超滤(优选10kDa超滤管，3000g离心1h)浓缩至超滤前体积的20-30％(优选25％)，将超滤后的融合酶粗酶液与His标签蛋白纯化层析介质(按说明书使用非变性洗涤液预处理)按体积比8:1混匀(优选在40rpm，4℃水平摇床中缓慢摇动1h)，然后上样到BeyoGoldTM His-tag层析柱(购自碧云天)，先用非变性洗涤液洗柱5次去除杂蛋白，每次洗脱使用1-2个柱体积；然后用非变性洗脱液洗脱6-10次(优选9次)，每次洗脱使用1-2个柱体积，通过蛋白电泳验证，收集所有含有目标蛋白的洗脱液；将洗脱液超滤浓缩后(优选10kDa超滤管，3000g离心20min)，冻干(优选-53℃，冻干36h)，获得融合酶的纯酶；非变性洗涤液是含300mM NaCl和2mM咪唑的pH8.0、50mM磷酸钠缓冲液；非变性洗脱液是含300mM NaCl和50mM咪唑的pH8.0、50mM磷酸钠缓冲液。
本发明构建了含羰基还原酶(SRED)和葡萄糖脱氢酶(GDH)基因的重组大肠杆菌，实现了(S)-1-(3-(三氟甲基)苯基)乙醇等手性醇的生物催化合成，同时通过融合表达葡萄糖脱氢酶，实现了辅酶NADPH的再生。在整个不对称还原反应过程中，一方面羰基还原酶SRED催化底物酮生成手性醇，并消耗还原性辅酶NADPH，另一方面，葡萄糖脱氢酶将葡萄糖氧化为葡萄糖酸，同时消耗氧化型辅酶NADP+，生成还原型辅酶NADPH，形成辅因子的再生循环系统，不断推进主反应的进行。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明在不影响羰基还原酶的高催化活性和高光学选择性的基础上，实现了羰基还原酶(SRED)和葡萄糖脱氢酶(GDH)的融合表达，融合酶活性为羰基还原酶催化活性的85％，较大程度上保证了羰基还原酶的活性。本发明节约了发酵成本，降低了发酵废液的产生量，对环境友好。融合表达不影响羰基还原酶的光学选择性，大幅降低了反应中所使用的辅酶因子，节约了反应成本。该羰基还原酶有广泛的底物谱和良好的立体选择性，用本发明方法制备所得的含羰基还原酶SRED和葡萄糖脱氢酶GDH的重组酶具有对环境友好、操作简单、反应条件温和等优点，具有良好的工业应用前景。
(四)附图说明
图1为本发明双酶构建的级联反应催化间三氟甲基苯乙酮生成(S)-1-(3-(三氟甲基)苯基)乙醇反应机理示图。
图2为本发明构建双酶融合表达载体酶切后琼脂粉凝胶电泳图；M：标准分子量DNA；lane1：双酶切载体pETDuet1-SRED-linker-GDH。
图3为本发明融合酶和单酶的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺蛋白电泳对比图(SDS-PAGE)；M：标准分子量蛋白；lane1：纯化后SRED单酶；Lane2：纯化后融合酶SRED-Linker-GDH。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：羰基还原酶SRED和葡萄糖脱氢酶GDH的融合克隆
(1)SRED基因片段
将近平滑假丝酵母菌(Candida parapsilosis)ATCC 7330菌种接于YPD培养基，30℃，180rpm过夜培养，离心收集适量菌体，使用翊圣真菌基因组提取盒提取全基因组DNA(Gene ID：59385528)。以提取的全基因组DNA为模板，采用表1中引物SRED-F1和引物SRED-R1进行PCR克隆SRED基因片段(编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)。扩增结束后，0.9％琼脂糖电泳分析，使用生工胶回收试剂盒回收SRED目的片段，4℃暂存。PCR反应体系：基因组DNA 2μL，SRED-F1 1μL，SRED-R1 1μL，2×Hieff PCR Master Mix 12.5μL(购自翊圣)，ddH2O 8.5μL。扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，循环30次，72℃终延伸7min，4℃保温。
以上一步骤中回收的SRED目的片段为模板，采用表1中引物SRED-F2和引物SRED-R2进行PCR扩增，获取带连接肽(linker)片段的SRED-linker目的片段，其中linker片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。扩增结束后，0.9％琼脂糖电泳分析，使用生工胶回收试剂盒回收带linker的SRED目的片段，4℃暂存。PCR反应体系：SRED目的片段1μL，SRED-F2 1μL，SRED-R2 1μL，2×Hieff PCR Master Mix12.5μL，ddH2O 9.5μL。扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，循环30次，72℃终延伸7min，4℃保温。
SEQ ID NO:1
MGEIESYCNKELGPLPTKAPTLSKNVLDLFSLKGKVASVTGSSGGIGWAVAEAYAQAGADVAIWYNSHPADEKAEHLQKTYGVHSKAYKCNISDPKSVEETISQQEKDFGTIDVFVANAGVTWTQGPEIDVDNYDSWNKIISVDLNGVYYCSHNIGKIFKKNGKGSLIITSSISGKIVNIPQLQAPYNTAKAACTHLAKSLAIEWAPFARVNTISPGYIDTDITDFASKDMKAKWWQLTPLGREGLTQELVGGYLYLASNASTFTTGSDVVIDGGYTCP
SEQ ID NO:5
GGCGGTGGTGGCTCTGGCGGTGGTGGCTCTGGCGGTGGTGGCTCT。
SEQ ID NO:6
GGGGSGGGGSGGGS。
(2)GDH基因片段
将GenBank中来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus halotolerans)的葡萄糖脱氢酶GDH(Sequence ID：WP_044161863.1)，交由北京擎科生物公司合成，并与质粒pET28a(+)连接后转入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞，获得含有葡萄糖脱氢酶基因质粒的大肠杆菌。
将含有葡萄糖脱氢酶基因质粒的大肠杆菌接于含50μg/mL卡那霉素的LB固体平板上，37℃，16h倒置培养，挑选平板上单菌落于含50μg/mL卡那霉素LB液体培养基中，37℃，180rpm活化培养16h，取4ml菌体离心，使用质粒提取试剂盒提取质粒pET28a(+)-GDH。
以质粒pET28a(+)-GDH模板，采用表1中引物GDH-F3和引物GDH-R3进行PCR克隆获取带linker的GDH基因片段。扩增结束后，0.9％琼脂糖电泳分析，使用生工胶回收试剂盒回收带连接肽(linker)的GDH目的片段，其中linker的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，GDH目的片段的编码蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示，4℃暂存。PCR反应体系：pET28a(+)-GDH 1μL，GDH-F3 1μL，GDH-R3 1μL，2×HieffPCR Master Mix 12.5μL，ddH2O 9.5μL。扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，循环30次，72℃终延伸7min，4℃保温。
SEQ ID NO:2
MYPDLKGKVVAITGAASGLGKAMAIRFGKEQAKVVINYYSNKQDPNEVKEEVIKAGGEAIVVQGDVTKEEDVKNIVQTAIKEFGTLDIMINNAGLENPVPSHEMPLKDWEKVISTNLTGAFLGSREAIKYFVENDIKGNVINMSSVHEVIPWPLFVHYAASKGGIKLMTETLALEYAPKGIRVNNIGPGAINTPINAEKFADPKQRADVESMIPMGYIGEPEEIAAVAAWLASKEASYVTGITLFADGGMTQYPSFQAGRG。
(3)融合蛋白
使用Takara内切酶BamHⅠ和XholⅠ处理空载体pET-Duet1，0.9％琼脂糖电泳后切胶回收。
酶连体系1：酶切后pET-Duet1 6μL，SRED-linker片段2μL，linker-GDH片段2μL，2×In-Fusion Cloning Mix(购自武汉塞维尔生物有限公司)10μL；酶连体系2：酶切后pET-Duet1 5μL，SRED片段2μL，T4连接酶(购自通用生物有限公司)1μL，T4 Buffer 2μL。酶连体系1置于冰水混合物上反应10min后，导入E.coli DH5α感受态细胞。酶连体系2置于16℃保温箱，反应30min，导入E.coli DH5α感受态细胞。
冰浴细胞20min后42℃热激90s，冰浴2min后加入0.9ml无抗LB培养基，37℃，180rpm摇床中复苏1h，涂布于LB氨苄青霉素(100μg/mL)抗性平板，37℃过夜培养。挑取平板菌落使用通用引物进行PCR(图2)，测序验证正确后命名为pET-Duet1-SRED-Linker-GDH和pET-Duet1-SRED，并转入E.coli BL21(DE3)中，获得E.coli BL21(DE3)-pET-Duet1-SRED-Linker-GDH和E.coli BL21(DE3)-pET-Duet1-SRED，甘油保存。
融合蛋白SRED-Linker-GDH的氨基酸序如SEQ ID NO.3所示，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
SEQ ID NO:3
MGEIESYCNKELGPLPTKAPTLSKNVLDLFSLKGKVASVTGSSGGIGWAVAEAYAQAGADVAIWYNSHPADEKAEHLQKTYGVHSKAYKCNISDPKSVEETISQQEKDFGTIDVFVANAGVTWTQGPEIDVDNYDSWNKIISVDLNGVYYCSHNIGKIFKKNGKGSLIITSSISGKIVNIPQLQAPYNTAKAACTHLAKSLAIEWAPFARVNTISPGYIDTDITDFASKDMKAKWWQLTPLGREGLTQELVGGYLYLASNASTFTTGSDVVIDGGYTCPGGGGSGGGGSGGGGSMYPDLKGKVVAITGAASGLGKAMAIRFGKEQAKVVINYYSNKQDPNEVKEEVIKAGGEAIVVQGDVTKEEDVKNIVQTAIKEFGTLDIMINNAGLENPVPSHEMPLKDWEKVISTNLTGAFLGSREAIKYFVENDIKGNVINMSSVHEVIPWPLFVHYAASKGGIKLMTETLALEYAPKGIRVNNIGPGAINTPINAEKFADPKQRADVESMIPMGYIGEPEEIAAVAAWLASKEASYVTGITLFADGGMTQYPSFQAGRG。
SEQ ID NO:4
ATGGGCGAAATCGAATCTTATTGTAACAAAGAGTTGGGACCATTGCCAACAAAAGCTCCAACTTTGTCAAAGAACGTGCTTGACTTGTTTTCCCTTAAGGGTAAAGTTGCTTCTGTGACTGGATCATCTGGTGGTATTGGTTGGGCTGTTGCTGAAGCTTACGCTCAAGCTGGTGCAGATGTAGCCATTTGGTACAACTCCCATCCAGCTGATGAGAAAGCCGAACACTTGCAAAAGACATATGGGGTCCATTCGAAAGCTTACAAGTGTAACATTAGTGACCCAAAGAGCGTTGAAGAAACCATCTCTCAACAAGAAAAAGACTTTGGAACCATCGACGTGTTTGTCGCTAATGCTGGTGTTACTTGGACACAAGGACCAGAGATTGATGTTGACAACTACGATTCATGGAATAAGATAATTAGTGTTGATTTGAATGGCGTATACTACTGCTCACACAATATCGGTAAGATCTTCAAAAAAAACGGCAAAGGGTCTTTGATCATAACATCATCGATATCCGGCAAGATTGTCAATATCCCTCAGCTTCAAGCTCCATATAACACGGCTAAAGCTGCTTGTACACATTTGGCAAAATCCTTGGCCATCGAGTGGGCACCATTTGCTAGAGTGAACACCATTTCACCAGGTTATATTGATACTGATATTACAGATTTTGCAAGCAAAGATATGAAAGCTAAGTGGTGGCAATTGACACCATTGGGAAGGGAGGGGCTTACTCAAGAGCTAGTTGGTGGATATTTGTACTTGGCATCGAATGCGTCTACATTCACAACTGGTTCTGATGTTGTTATTGACGGTGGATACACGTGTCCAGGCGGTGGTGGCTCTGGCGGTGGTGGCTCTGGCGGTGGTGGCTCTATGTACCCGGACCTGAAAGGCAAAGTTGTTGCAATTACCGGTGCCGCCAGCGGTCTGGGTAAAGCAATGGCTATTCGTTTTGGCAAAGAACAGGCAAAAGTTGTGATTAACTACTACAGCAATAAACAGGACCCTAATGAAGTTAAAGAAGAAGTTATTAAAGCAGGAGGTGAAGCAATTGTTGTGCAGGGCGATGTGACCAAAGAAGAAGATGTGAAAAATATCGTGCAGACCGCAATCAAAGAATTTGGTACGCTGGATATCATGATTAATAACGCAGGACTGGAAAATCCGGTCCCGAGTCACGAAATGCCGCTGAAAGATTGGGAAAAAGTGATCAGCACCAATCTGACCGGTGCATTTCTGGGTAGCCGTGAGGCAATTAAATACTTCGTTGAAAATGATATCAAAGGGAACGTTATTAACATGAGCTCTGTTCATGAAGTGATTCCGTGGCCGCTGTTTGTTCATTATGCAGCCTCTAAAGGAGGTATTAAACTGATGACCGAGACCCTGGCACTGGAATATGCACCAAAAGGGATTCGCGTTAATAATATTGGCCCGGGCGCAATTAATACCCCGATTAACGCCGAAAAATTTGCAGATCCTAAACAACGTGCGGACGTGGAAAGCATGATCCCGATGGGTTATATCGGTGAGCCTGAGGAAATCGCAGCAGTTGCAGCATGGCTGGCAAGCAAAGAAGCAAGCTATGTTACAGGGATCACCCTGTTTGCAGATGGTGGAATGACCCAGTATCCGAGCTTTCAGGCGGGACGTGGT。
表1.引物序列
Figure BDA0003943568890000071
实施例2：SRED-Linker-GDH融合蛋白的诱导、表达及纯化
(1)取实施例1获得的E.coli BL21(DE3)-pET-Duet1-SRED-Linker-GDH接种于20ml含50μg/mL卡那霉素的LB固体平板上，37℃，16h倒置培养，挑选平板上单菌落接种于含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37℃、180rpm培养16h，将种子液以体积浓度3％的接种量接种于LB液体培养基中，37℃，180rpm培养3h至OD600到0.6-0.8后，加入IPTG(终浓度0.1mM)，23℃、180rpm诱导16h。4℃离心(8000rpm，10min)发酵液，生理盐水洗涤两次，收集菌体沉淀。
(2)将步骤(1)菌体沉淀加入适量100mM，pH 6.0磷酸缓冲液重悬菌体。超声破碎15分钟(功率120W，工作3秒，暂停5秒)，破碎液离心(8000rpm，4℃离心10min)后，取上清液，即得到融合酶粗酶液。
(3)用0.45μm滤膜将步骤(2)粗酶液16mL过滤，去除漂浮沉淀，超滤浓缩(使用10kDa超滤管，3000g离心1h)粗酶液体积至4ml(即浓缩前体积的25％)，将超滤后的融合酶粗酶液4ml与His标签蛋白纯化层析介质(按说明书使用非变性洗涤液预处理)0.5ml在40rpm，4℃水平摇床中缓慢摇动1h混匀，然后上样到BeyoGoldTM His-tag层析柱(购自碧云天)，先用非变性洗涤液洗柱5次去除杂蛋白，每次洗脱使用1个柱体积；然后用非变性洗脱液洗脱9次，每次洗脱使用1个柱体积，蛋白电泳验证，收集所有含有目标蛋白的洗脱液。将洗脱液超滤浓缩(使用10kDa超滤管，3000g离心20min)，-53℃下冻干36h，获得融合酶的纯酶粉末60mg。
同样条件下，制备E.coli BL21(DE3)-pET-Duet1-SRED的纯酶粉末60mg。
非变性洗涤液是含300mM NaCl和2mM咪唑的pH8.0、50mM磷酸钠缓冲液；非变性洗脱液是含300mM NaCl和50mM咪唑的pH8.0、50mM磷酸钠缓冲液。
E.coli BL21(DE3)-pET-Duet1-SRED重组菌株用相同的方法获得SRED单酶纯酶。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对比融合酶和单酶的纯度及分子量，结果见图3所示。
实施例3：温度对融合酶活性的影响
在1ml反应体系中，加入终浓度20mM底物间三氟甲基苯乙酮，100μL异丙醇作为助溶剂(助溶剂的量为总体积的10％)、0.04g葡萄糖、终浓度0.1mM辅助因子NADP+、10mg实施例2方法制备的融合酶纯酶粉末，PB缓冲液(0.1mM，pH6.0)补足至1mL。将反应瓶置于不同温度(表2)，180rpm条件下反应18h。反应结束后，4℃，8000rpm离心10min，收集上清液并向其中加入等体积乙酸乙酯萃取，重复萃取三次后，收集的萃取液加入适量无水硫酸镁干燥后，气相色谱法检测底物间三氟甲基苯乙酮、产物(S)-1-(3-(三氟甲基)苯基)乙醇峰面积，采用内标法(添加十二烷为内标物)计算含量，通过公式(1)和公式(2)计算(S)-1-(3-(三氟甲基)苯基)乙醇的转化率和对映体过剩值(e.e.)，结果见表2。
气相色谱法(GC)检测条件：手性色谱柱CP7502(25m×0.25mm×0.25μm)；进样口温度250℃，柱温120℃，检测器250℃，流速1mL/min，分流比1：15，进样量1μL。
产物(S)-1-(3-(三氟甲基)苯基)乙醇的转化率和对映体过剩值(e.e.)通过公式(1)、公式(2)计算，
Figure BDA0003943568890000091
式(1)中，MS：底物的分子量；MP：产物的分子量；Q：反应初始时底物的质量；P：反应结束时产物的质量。
Figure BDA0003943568890000092
式(2)中，CR：R型产物浓度，CR：S型产物浓度。
表2.温度对融合酶催化活性的影响
Figure BDA0003943568890000093
融合酶在30℃-40℃下，酶活基本不受温度变化影响，具有良好的耐热性，在35℃时酶的催化活性达到最优，而在较低温25℃和较高温45℃的影响下，酶活力急剧下降。因此，在选择温度反应条件时，因控制在30℃-40℃范围内，保证反应温度的最优条件。
实施例4：pH对融合酶活性的影响
在1mL反应体系中，加入终浓度20mM底物间三氟甲基苯乙酮，100μL异丙醇作为助溶剂、0.04g葡萄糖、终浓度0.1mM辅助因子NADP+、10mg实施例2方法制备的融合酶纯酶粉末，用不同pH(表3)的PB补足至1mL。将反应瓶置于30℃，180rpm条件下反应24h。反应结束后，4℃，8000rpm离心10min，收集上清液并向其中加入等体积乙酸乙酯萃取，重复萃取三次后，收集的萃取液用适量无水硫酸钠干燥，按实施例3中GC法检测(S)-1-(3-(三氟甲基)苯基)乙醇转化率和对映体过剩值，结果见表3。
表3.pH对融合酶催化活性的影响
Figure BDA0003943568890000101
反应介质的pH可以显著影响酶的活力及立体选择性，这可能是通过改变酶的构象和基团的解离引起的。通过考察不同pH值下融合酶的酶活变化，我们得到了融合酶最适pH为6.0，在此条件下，融合酶表现出较高的催化活性和高度的光学选择性。从表3中可以看出，pH的变化对融合酶的活性有较大影响，在低于6.0或高于6.0的情况下，融合酶的催化活性都急剧下降，因此，控制反应过程中的pH变化对保持融合酶的催化活性尤其重要。
实施例4：反应时间对融合酶活性的影响
在1mL反应体系中，加入终浓度20mM底物间三氟甲基苯乙酮，100μL异丙醇作为助溶剂、0.04g葡萄糖、终浓度0.2mM辅助因子NADP+、10mg实施例2方法制备的融合酶纯酶粉末，用pH 6.0的0.1mM PB缓冲液补足至1mL。将反应瓶置于30℃，180rpm条件下反应不同时间(表4)。反应结束后，4℃，8000rpm离心10min，收集上清液并向其中加入等体积乙酸乙酯萃取，重复萃取三次后，收集的萃取液用无适量水硫酸钠干燥，按实施例3中GC法检测(S)-1-(3-(三氟甲基)苯基)乙醇转化率和对映体过剩值，结果见表4。
表4.反应时间对融合酶催化活性的影响
Figure BDA0003943568890000102
反应时间也是影响目标产物(S)-1-(3-(三氟甲基)苯基)乙醇最终含量的重要因素，由表4可知，从6h-18h，随着反应时间的延长，产物(S)-1-(3-(三氟甲基)苯基)乙醇含量逐渐上升，在18h时达到最大，继续延长反应时间则无较大变化，这可能是由于产物(S)-1-(3-(三氟甲基)苯基)乙醇在反应体系中的不断积累，对酶的活性产生了一定得抑制作用。
实施例5：助溶剂对融合酶活性的影响
在1mL反应体系中，加入终浓度20mM底物间三氟甲基苯乙酮，100μL的助溶剂(表5)，0.04g葡萄糖、终浓度0.2mM辅助因子NADP+、10mg实施例2方法制备的融合酶纯酶粉末，用pH6.0的0.1mM PB缓冲液补足至2mL。将反应瓶置于30℃，180rpm条件下反应18h。反应结束后，4℃，8000rpm离心10min，收集上清液并向其中加入等体积乙酸乙酯萃取，重复萃取三次后，收集的萃取液用无水硫酸钠干燥后常温下挥发掉乙酸乙酯，按实施例3中GC法检测(S)-1-(3-(三氟甲基)苯基)乙醇转化率和对映体过剩值，结果见表5。
表5.助溶剂对融合酶催化活性的影响
Figure BDA0003943568890000111
大多数羰基还原酶的催化反应是在水相中进行的，但底物间三氟甲基苯乙酮的水溶性较差，需要加入助溶剂提高其在水中的溶解度。本实施例总共考察了5种有机溶剂对融合酶催化活性的影响。其中二甲基亚枫对融合酶的催化活性影响较大，可能是由于有机溶剂对酶有一定毒性造成的，也有可能亲水性有机溶剂夺走了酶的活性中心的水分子造成的。另一部分有机溶剂如异丙醇，甘油等，在促进底物间三氟甲基苯乙酮溶解的同时，对蛋白的毒性也较小，促进了还原反应的正向进行。
实施例6：底物浓度对融合酶活性的影响
在1mL反应体系中，加入不同浓度(表6)底物间三氟甲基苯乙酮，100μL异丙醇作为助溶剂、0.04g葡萄糖、终浓度0.2mM辅助因子NADP+、10mg实施例2方法制备的融合酶纯酶粉末，用pH 6.0的0.1mM PB缓冲液补足至1mL。将反应瓶置于30℃，180rpm条件下反应18h。反应结束后，4℃，8000rpm离心10min，收集上清液并向其中加入等体积乙酸乙酯萃取，重复萃取三次后，收集的萃取液用无水硫酸钠干燥后常温下挥发掉乙酸乙酯，按实施例3中GC法检测(S)-1-(3-(三氟甲基)苯基)乙醇转化率和对映体过剩值，结果见表6。
表6.底物浓度对融合酶催化活性的影响
Figure BDA0003943568890000112
酶在作为催化剂催化有机反应时，非天然的底物和产物会对其催化活性产生较大影响，在底物浓度越高的条件下，对酶促反应的抑制作用越剧烈。本实施例考察了不同底物浓度对酶活力的影响，随着底物浓度提高，酶的催化活性逐渐下降，在40mM时降至最小，而在10mM～20mM的范围内，融合酶表现出了良好的底物耐受性，对间三氟甲基苯乙酮转化维持在较高的水平。
实施例7：融合酶的底物谱筛选
在1mL反应体系中，加入不同的潜手性底物酮(表7)，100μL异丙醇作为助溶剂、0.04g葡萄糖、终浓度0.2mM辅助因子NADP+、10mg实施例2方法制备的融合酶纯酶粉末，用pH6.0的0.1mM PB缓冲液补足至1mL。将反应瓶置于30℃，180rpm条件下反应18h。反应结束后，4℃，8000rpm离心10min，收集上清液并向其中加入等体积乙酸乙酯萃取，重复萃取三次后，收集的萃取液用适量无水硫酸钠干燥后，按实施例3中GC法检测产物的转化率和对映体过剩值，结果见表7。
表7.融合酶底物谱筛选
Figure BDA0003943568890000121
Figure BDA0003943568890000131
本实施例考察了融合酶的对不同潜手性酮的催化还原能力，由上表可得出，融合酶对大部分苯乙酮衍生物都有较好的还原能力。当其苯环上有吸电子取代基团如三氟甲基，硝基等，融合酶展现出较强的催化活性和高度光学选择性；而当苯环上带有供电子基团如甲氧基，或多个取代基团时，则会影响融合酶的催化活性或光学选择性。
实施例8：融合酶与单酶催化活性对比
在1mL反应体系中，加入15mM间三氟甲基苯乙酮，100μL异丙醇作为助溶剂、0.04g葡萄糖、不同的终浓度的辅助因子NADP+或NADPH，加入10mg实施例2方法制备的单酶或融合酶的纯酶粉末(见表8)，用pH 6.0的0.1mM PB缓冲液补足至1mL。将反应瓶置于30℃，180rpm条件下反应18h。反应结束后，4℃，8000rpm离心10min，收集上清液并向其中加入等体积乙酸乙酯萃取，重复萃取三次后，收集的萃取液用适量无水硫酸钠干燥后，按实施例3中GC法检测产物的转化率和对映体过剩值，结果见表8。
表8.融合酶与单酶催化活性对比
Figure BDA0003943568890000132
本实施例考察了融合酶和单酶在最优条件下的催化活性，通过将SRED和GDH的基因连接融合，克隆表达出既具备催化间三氟甲基苯乙酮能力，又使辅酶循环的融合蛋白，但是蛋白融合后酶的结构性质可能发生一些变化，产率略有降低。如表8所示，在低浓度辅酶因子(0.2mM NADP+)参与下，融合酶的催化活性仍能达到单酶的85％以上，同时，融合酶的获得只需要诱导发酵一种工程菌，相比使用两个游离酶，发酵成本更低，纯化步骤更加简洁。
实施例9：不同Linker对融合酶催化活性的影响
本实施例对比了三种连接肽对融合酶催化活性的影响，融合基因构建方法同实施例1，纯化方法同实施例2。三种连接肽分别为柔性Linker GGGGSGGGGS，GGGGS GGGGSGGGGS，刚性Linker EAAAKEAAAK。引物如表9所示。
表9.引物列表
Figure BDA0003943568890000141
在1mL反应体系中，加入15mM间三氟甲基苯乙酮，100μL异丙醇作为助溶剂、0.04g葡萄糖、0.2mM NADP+，分别添加三种按实施例2方法制备的10mg融合酶纯酶粉末，用pH 6.0的0.1mM PB缓冲液补足至1mL。将反应瓶置于30℃，180rpm条件下反应18h。反应结束后，4℃，8000rpm离心10min，收集上清液并向其中加入等体积乙酸乙酯萃取，重复萃取三次后，收集的萃取液用适量无水硫酸钠干燥后，按实施例3中GC法检测产物的转化率和对映体过剩值，结果见表10。
表10.不同Linker对融合酶催化活性的影响
Figure BDA0003943568890000142
连接肽可以提高蛋白二级结构的稳定性并在保持二级结构的完整性中发挥重要的作用，同时也可以提高催化结构的稳定性。由于蛋白质结构域之间结构的扰动，融合蛋白可能会被错误地折叠，从而导致低的表达量。而连接肽可以使得两个域之间保持适当的距离并且允许它们独立地折叠。若功能域不用连接肽直接进行融合会导致一些不良结果，如融合蛋白的错误折叠，产量低或者活性受损等。因此，连接肽选择对于融合蛋白的构建十分重要。本实施例选取了三种不同的连接肽，包括两个柔性linke r(GGGGSGGGGSGGGGS,GGGGSGGGGS)和一个刚性linker(AEAAAKEAAAKA)，由表10可知，柔性linker(GGGGSGGGGSGGGGS)对酶的活性影响较小，最大程度上保证了融合酶形成正确的构象，各个蛋白保持原有的活性。而刚性linker(AEAAA KEAAAKA)使得酶活损失较大，可能造成了蛋白结构域的损坏。

Claims (8)

1.一种羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的融合酶，其特征在于，所述融合酶氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.如权利要求1所述羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的融合酶，其特征在于，所述融合酶按如下方法构建：将来源于近平滑假丝酵母菌(Candida parapsilosis)ATCC 7330的基因组经PCR扩增获得带有连接肽的羰基还原酶SRED编码基因片段；再将来源于枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶GDH的基因经PCR扩增获得带有连接肽的葡萄糖脱氢酶GDH编码基因片段；以无缝克隆技术融合连接带有连接肽的羰基还原酶SRED编码基因片段和带有连接肽的葡萄糖脱氢酶GDH编码基因片段至线性化载体pET-Duet1，导入E.coli DH5α感受态细胞中，挑选单菌落测序验证成功后将质粒导入表达宿主细胞E.coli BL21(DE3)构建重组菌，诱导重组菌产酶，经超声破碎处理后，离心后弃去沉淀得到粗酶液，经镍柱纯化得到融合酶纯酶；所述羰基还原酶氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示，所述连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
3.一种权利要求1所述羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的融合酶的编码基因。
4.一种含权利要求1所述羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的融合酶的编码基因的重组基因工程菌。
5.一种权利要求1所述羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的融合酶在不对称还原手性酮制备手性醇中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的应用为：以含羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的融合酶编码基因的重组基因工程菌发酵培养获得的湿菌体超声破碎提取的纯酶为催化剂，以手性酮为底物，加入助溶剂、葡萄糖和辅助因子NADP+，以pH5.5-7.5缓冲液为反应介质构建反应体系，在25-45℃、100-200rpm条件下震荡反应6-36h，反应液分离纯化，获得手性醇；所述底物包括间三氟甲基苯乙酮、3-氟苯乙酮、2-羟基-1-苯基乙酮、间硝基苯乙酮、2-溴-4-氟苯乙酮；所述助溶剂包括乙醇、甲醇、异丙醇、甘油。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述反应体系中，催化剂以纯酶质量计为1-20g/L；底物加入终浓度为10-50mM；助溶剂体积加入终浓度为5-20％；葡萄糖加入终浓度为20-60g/L；NADP+加入终浓度为0.01-1.0mM。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述催化剂按如下方法制备：
(1)将含羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的融合酶编码基因的重组基因工程菌接种于含50μg/mL卡那霉素的LB固体平板上，37℃，16h倒置培养，挑选平板上单菌落接种于含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37℃、180rpm培养16h后，将种子液以体积浓度3％的接种量接种于LB液体培养基中，37℃，180rpm培养至OD600到0.6-0.8后，加入终浓度0.1-1.0mM的IPTG，23℃、180rpm诱导16h，4℃离心发酵液，生理盐水洗涤两次，收集菌体沉淀；
(2)将步骤(1)菌体沉淀加入100mM，pH 6.0磷酸缓冲液重悬菌体，超声破碎15分钟，破碎液离心后，取上清液，即得到融合酶粗酶液；所述超声功率120W，工作3秒，暂停5秒；
(3)用0.45μm滤膜将步骤(2)粗酶液过滤，去除漂浮沉淀，超滤浓缩至超滤前体积的20-30％，将超滤后的融合酶粗酶液与His标签蛋白纯化层析介质按体积比8:1混匀，然后上样到BeyoGoldTMHis-tag层析柱，先用非变性洗涤液洗柱5次去除杂蛋白，每次洗脱使用1-2个柱体积；然后用非变性洗脱液洗脱6-10次，每次洗脱使用1-2个柱体积，通过蛋白电泳验证，收集所有含有目标蛋白的洗脱液；将洗脱液超滤浓缩后，冻干，获得融合酶的纯酶；非变性洗涤液是含300mM NaCl和2mM咪唑的pH8.0、50mM磷酸钠缓冲液；非变性洗脱液是含300mMNaCl和50mM咪唑的pH8.0、50mM磷酸钠缓冲液。
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