CN115851641A - 高效生产(r)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的融合酶及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的融合酶，所述羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的融合酶包括依次连接的葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列和羰基还原酶的氨基酸序列。本发明构建含羰基还原酶CpCR和含葡糖糖脱氢酶GDH的融合酶应用于催化还原OPBE；葡萄糖脱氢酶的表达提高了NADPH的再生效率，为生物催化反应提供了充足的NADPH，该辅酶NADPH再生系统的应用避免了生物催化反应中额外添加昂贵的辅酶。且该羰基还原酶CpCR具有广泛的底物谱和优良的光学选择性。

Description

高效生产(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的融合酶及其应用

一、技术领域

本发明属于不对称合成技术领域，涉及一种高效生产(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯重组菌的构建及其在手性醇合成中的应用。

二、背景领域

(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯(Ethyl(R)-2-hydroxy-4-phenylbutyrate，R-HPBE)，CAS号90315-82-5，分子式C₁₂H₁₆O₃，分子量208.25，密度为1.075g/mL，沸点为212℃，不溶于水，易溶于有机溶剂。(R)-HPBE是合成血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂的重要前体，用于合成依那普利、贝那普利、利辛普利等抗高血压和充血性心力衰竭药物，常用于治疗充血性心力衰竭和高血压。到目前为止，已经开发了一系列制备(R)-HPBE的方法，包括化学多步合成、外消旋体的动力学拆分和2-羟基-4-苯基丁酸的酶法酯化等。由于(R)-HPBE是生产普利类药物的重要中间体，故R-HPBE的制备方法在国内外引起众多关注，其中不对称还原2-氧代-4-苯基丁酸乙酯(OPBE)的途径因其产量高、反应条件温和、绿色环保、经济可行等优点而备受关注，以期获得一条经济、原子利用率高的绿色合成工艺。

近年来，利用微生物细胞生物催化制备手性醇越来越多的关注，微生物细胞(含有羰基还原酶)作为一种高选择性的催化潜手性羰基化合物合成手性醇的生物催化剂，在制备手性化合物领域中已取得了一定成就。但绝大对数氧化还原酶是复合型酶，在催化反应过程中需要添加辅酶NADH或NADPH，反应才能顺利进行。在不对称还原潜手性羰基化合物的生物反应过程中，需要消耗大量的NADPH来参与为其传递电子，如辅酶被消耗彻底，反应将会停止。虽然在细胞生长过程中会有少量的还原性辅酶参与自身代谢，但无法达到不对称还原反应的生产需求。辅酶NADPH由于的价格昂贵，额外添加辅酶不适于工业化生产，并且辅酶的稳定性差；因此需要建立高效、经济的辅酶再生体系以适应工业化、大批量生产。

本发明构建了含有羰基还原酶CpCR基因的重组菌，同时引入葡萄糖脱氢酶GDH基因，利用该重组菌催化还原OPBE，高效、高立体选择性(e.e.>99％)地生成(R)-HPBE。与传统的化学方法相比，该方法具有反应条件温和、反应收率高、成本低等优点。

三、发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种高效生产(R)-HPBE的重组酶的构建方法及其应用。包括构建重组羰基还原酶质粒，同时引入葡萄糖脱氢酶基因，构建了一株具有高选择性的重组菌，并利用该重组菌所产生的酶作为生物催化剂催化潜手性羰基化合物OPBE不对称还原合成手性醇(R)-HPBE。进一步研究一系列反应因素(助溶剂、温度、pH、离子种类等)对不对称还原反应的影响。

本发明采用的技术方案是：

第一方面，本发明提供一种羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的融合酶，所述羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的融合酶包括依次连接的如SEQ ID NO:2所示葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列和如SEQ ID NO:1所示羰基还原酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO:1(Candida parapsilosis，近平滑假丝酵母)

MTKAVPDKFQGFAVSDPKNWNRPKLASYERKQINPHDVVLKNEVCGLCYSDIHTLSAGWQPLQRDNLVVGHEIIGEVIAVGDEVTEFKVGDRVGIGAASSSCRSCQRCDSDNEQYCKQGAATYNSKDVRSNNYVTQGGYSSHSIADEKFVFAIPEDLPSSYGAPLMCAGITVFSPLIRNLGLDARGKNVGIIGIGGLGHLALQFANAMGANVTAFSRSSSKKEQAMKLGAHDFVATGEDKTWYKNYDDHFDFILNCASGIDGLNLSEYLSTLKVDKKFVSVGLPPSEDKFEVSPFTFLQQGASFGSSLLGSKTEVKEMLNLAAKHNVRPMIEEVPISEENCAKALDRCHAGDVRYRFVFTDFDKAFKA

SEQ ID NO:2(Bacillus subtilis，枯草芽孢杆菌，Gene ID为AAA22463.1)

MYPDLKGKVVAITGAASGLGKAMAIRFGKEQAKVVINYYSNKQDPNEVKEEVIKAGGEAVVVQGDVTKEEDVKNIVQTAIKEFGTLDIMINNAGLENPVPSHEMPLKDWDKVIGTNLTGAFLGSREAIKYFVENDIKGNVINMSSVHAFPWPLFVHYAASKGGIKLMTETLALEYAPKGIRVNNIGPGAINTPINAEKFADPKQKADVESMIPMGYIGEPEEIAAVAAWLASKEASYVTGITLFADGGMTQYPSFQAGRG

优选地，所述羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的融合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

SEQ ID NO:3

MYPDLKGKVVAITGAASGLGKAMAIRFGKEQAKVVINYYSNKQDPNEVKEEVIKAGGEAV

VVQGDVTKEEDVKNIVQTAIKEFGTLDIMINNAGLENPVPSHEMPLKDWDKVIGTNLTGA

FLGSREAIKYFVENDIKGNVINMSSVHAFPWPLFVHYAASKGGIKLMTETLALEYAPKGI

RVNNIGPGAINTPINAEKFADPKQKADVESMIPMGYIGEPEEIAAVAAWLASKEASYVTG

ITLFADGGMTQYPSFQAGRGGGGGSGGGGSMTKAVPDKFQGFAVSDPKNWNRPKLASYER

KQINPHDVVLKNEVCGLCYSDIHTLSAGWQPLQRDNLVVGHEIIGEVIAVGDEVTEFKVG

DRVGIGAASSSCRSCQRCDSDNEQYCKQGAATYNSKDVRSNNYVTQGGYSSHSIADEKFV

FAIPEDLPSSYGAPLMCAGITVFSPLIRNLGLDARGKNVGIIGIGGLGHLALQFANAMGA

NVTAFSRSSSKKEQAMKLGAHDFVATGEDKTWYKNYDDHFDFILNCASGIDGLNLSEYLS

TLKVDKKFVSVGLPPSEDKFEVSPFTFLQQGASFGSSLLGSKTEVKEMLNLAAKHNVRPM

IEEVPISEENCAKALDRCHAGDVRYRFVFTDFDKAFKA

第二方面，本发明还提供一种上述羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的融合酶的编码基因。优选所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

SEQ ID NO:4

ATGTATCCGGATCTGAAAGGTAAAGTTGTGGCAATTACGGGTGCCGCAAGCGGTCTGGGTAAAGCAATGGCTATCCGTTTTGGTAAAGAACAGGCAAAAGTTGTTATTAACTATTATAGCAACAAACAGGACCCTAATGAAGTTAAAGAAGAAGTTATTAAAGCAGGTGGTGAAGCAGTGGTAGTTCAGGGCGATGTTACC

AAAGAAGAAGATGTGAAAAATATCGTGCAGACCGCAATTAAAGAATTTGGTACGCTGGATATTATGATTAATAACGCAGGTCTGGAAAATCCGGTTCCGAGTCATGAAATGCCGCTGAAAGATTGGGATAAAGTGATCGGTACCAATCTGACCGGTGCATTTCTGGGTAGCCGTGAAGCAATTAAATATTTTGTTGAAAACGATATCAAAGGTAACGTTATCAATATGTCCTCTGTGCATGCGTTTCCGTGGCCGCTGTTTGTGCATTATGCGGCATCTAAAGGTGGTATTAAACTGATGACCGAAACCCTGGCACTGGAATATGCACCGAAAGGTATTCGTGTTAATAATATTGGCCCGGGTGCTATTAATACCCCGATTAACGCCGAAAAATTTGCAGATCCTAAACAGAAAGCGGATGTGGAAAGCATGATTCCGATGGGTTATATCGGTGAACCTGAAGAAATCGCAGCAGTTGCAGCATGGCTGGCAAGTAAAGAAGCAAGCTATGTGACAGGTATTACCCTGTTTGCAGATGGTGGTATGACCCAGTATCCGAGCTTTCAGGCGGGTCGTGGTGGTGGTGGAGGCAGCGGAGGTGGAGGTTCCATGACTAAAGCAGTACCAGACAAGTTTCAAGGATTCGCAGTTTCCGACCCAAAGAATTGGAACAGACCAAAATTGGCATCATATGAGAGAAAACAAATCAATCCACACGATGTTGTTTTAAAGAATGAAGTCTGCGGCTTATGTTATTCAGATATTCACACATTGTCAGCTGGATGGCAACCATTGCAAAGAGACAACTTGGTTGTTGGTCATGAAATCATTGGTGAAGTCATTGCGGTTGGTGATGAAGTAACCGAATTCAAGGTTGGAGACCGTGTTGGAATTGGTGCGGCTTCTTCCTCATGTCGTAGCTGTCAAAGATGCGATTCTGACAATGAGCAATACTGCAAACAAGGTGCAGCCACATACAACTCCAAGGATGTCAGATCAAACAATTATGTCACCCAAGGTGGATACTCCTCGCACTCTATTGCTGATGAAAAGTTTGTATTTGCAATTCCAGAAGACTTGCCATCATCTTATGGTGCTCCACTCATGTGCGCTGGTATTACCGTGTTTTCTCCATTGATTAGAAACTTGGGATTAGATGCAAGGGGCAAGAATGTTGGTATTATTGGTATTGGAGGATTGGGTCACTTGGCTTTGCAATTTGCTAATGCTATGGGTGCCAATGTCACTGCATTCTCTAGATCCTCTTCCAAAAAGGAACAAGCTATGAAATTGGGTGCTCACGATTTCGTTGCAACTGGTGAAGACAAGACTTGGTACAAGAACTATGATGACCATTTTGACTTTATTTTGAACTGTGCTAGTGGAATTGATGGTTTGAACTTGTCTGAGTACTTGTCCACTTTGAAGGTTGACAAAAAGTTTGTCTCTGTTGGTTTACCACCAAGTGAAGACAAGTTCGAGGTTAGTCCCTTCACCTTTTTGCAACAAGGTGCTAGTTTTGGATCCTCTTTGTTGGGTTCCAAGACAGAAGTCAAGGAAATGTTGAATTTGGCTGCCAAACACAACGTCAGACCAATGATCGAAGAAGTGCCAATCAGTGAAGAAAACTGTGCAAAGGCATTGGACAGATGTCACGCTGGTGATGTGAGATATAGATTTGTTTTCACTGATTTCGACAAAGCATTCAAAGCT

第三方面，本发明还提供一种包含上述编码基因的重组表达质粒。优选地，所述重组表达质粒的载体是pETDuet-1。

第四方面，本发明还提供一种包含上述重组表达质粒的工程菌。优选地，所述工程菌的宿主为大肠杆菌BL21(DE3)。

第五方面，本发明还提供一种上述羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的融合酶在不对称还原2-氧代-4-苯基丁酸乙酯制备(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯中的应用。

进一步，所述应用为：以表达所述羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的融合酶的工程菌经诱导表达、分离纯化、冷冻干燥获得的酶粉为催化剂，以2-氧代-4-苯基丁酸乙酯为底物，以葡萄糖为辅助底物，以NADP⁺为辅助因子，以有机溶剂为助溶剂，以pH6.0-8.5(优选pH7.5)磷酸盐缓冲液(PB)为反应介质构建反应体系，25-45℃(优选30℃)搅拌(优选180rpm)反应6-36h(优选24h)进行不对称还原，获得(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯；

所述反应体系中，所述催化剂的终浓度为1.5-5mg/mL(优选2.5mg/mL)，所述底物的终浓度为2-50mM(优选2-20mM，尤其优选2-10mM)，所述辅助底物的终浓度为30-100g/L(优选50g/L)，所述辅助因子的终浓度为0.1-1mM(优选0.1mM)；所述有机溶剂为乙醇、甲醇、异丙醇、丙酮、DMSO中的一种或两种的混合溶剂(优选乙醇)，所述助溶剂的体积为所述反应体系体积的10％。

本发明提供一种羰基还原酶(CpCR)与葡萄糖脱氢酶(GDH)偶联合成(R)-HPBE的方法，所述方法按如下步骤进行；

(1)利用PCR技术扩增羰基还原酶基因CpCR，构建含羰基还原酶基因的工程菌；

(2)利用重叠延伸PCR技术，获得含有羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶基因融合表达的基因片段；

(3)将步骤2获得的重组质粒导入表达宿主菌中，得到重组菌；

(4)制备重组工程菌的静息细胞悬浊液并破碎得到粗酶液后纯化；

(5)重组酶与OPBE、溶剂、辅助底物、辅因子混合，进行不对称还原反应，制备(R)-HPBE；其反应式如图1。

进一步，步骤(1)中，所述羰基还原酶基因来源于近平滑假丝酵母ATCC 7330，GeneID为KC525950.1。

进一步，步骤(2)中，所述羰基还原酶基因和葡萄糖脱氢酶基因通过柔性连接肽连接，基因序列为GGTGGTGGAGGCAGCGGAGGTGGAGGTTCC，蛋白序列为GGGGSGGGGS。

进一步，步骤(3)中，所述表达载体为pETDuet-1。

进一步，步骤(3)中，所述表达宿主菌为大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。

进一步，所述缓冲液为0.1M磷酸缓冲液(PB)，pH为6.5-8.5。

本发明步骤(4)中，所述制备的工程菌的粗酶液，具体步骤为：将工程菌接种到含有50μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37℃摇床活化后，扩大培养至OD₆₀₀到0.6-0.8，加入诱导剂，低温诱导；离心收集细胞，用0.9％(w/v)生理盐水洗涤细胞，用100mM磷酸缓冲液(pH8.0)重悬(优选50g/L)，获得静息细胞悬浊液。超声破碎5分钟(功率400W，工作3秒，破碎7秒)，破碎液离心(优选8000rpm，4℃离心10min)后，取上清液，即得到融合酶粗酶液。进一步，所述诱导剂为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，诱导剂浓度为0.2mM-1.0mM；加入诱导剂后的培养条件为：培养温度为23℃，培养时间为8-24h。

进一步，羰基还原酶与葡萄糖脱氢酶融合酶的纯化步骤如下：将融合酶粗酶液与His标签蛋白纯化介质(镍柱)层析介质按体积比8：1混匀(优选置于冰块中，在40rpm摇床中缓慢摇动1h)，然后上样到BeyoGold^TMHis-tag层析柱，先用非变性洗涤液洗柱5次去除杂蛋白，每次洗脱1-2个柱体积；然后用非变性洗脱液洗脱6～10次(优选8次)，每次洗脱1-2个柱体积，收集含有目标蛋白的洗脱液，超滤浓缩，冻干，获得羰基还原酶与葡萄糖脱氢酶融合酶的纯酶；非变性洗涤液是含300mM NaCl和2mM咪唑的pH8.0、50mM磷酸钠缓冲液；非变性洗脱液是含300mM NaCl和50mM咪唑的pH8.0、50mM磷酸钠缓冲液。

本发明构建了含羰基还原酶(CpCR)和葡萄糖脱氢酶(GDH)基因的重组大肠杆菌，实现了手性醇(R)-HPBE的生物催化合成。同时通过表达葡萄糖脱氢酶，实现了辅酶NADPH的再生。

在整个不对称还原反应过程中，一方面羰基还原酶CpCR催化OPBE生成(R)-HPBE，另一方面，葡萄糖脱氢酶将葡萄糖氧化为葡萄糖酸，同时消耗氧化型辅酶NADP⁺，生成还原型辅酶NADPH，形成辅因子的再生循环系统，推进主反应的进行。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明构建含羰基还原酶CpCR和含葡糖糖脱氢酶GDH的融合酶应用于催化还原OPBE；葡萄糖脱氢酶的表达提高了NADPH的再生效率，为生物催化反应提供了充足的NADPH，该辅酶NADPH再生系统的应用避免了生物催化反应中额外添加昂贵的辅酶。且该羰基还原酶CpCR具有广泛的底物谱和优良的光学选择性，用本发明方法制备所得的含羰基还原酶CpCR和葡萄糖脱氢酶GDH的重组酶具有对环境友好、操作简单、反应条件温和等优点，具有良好的工业应用前景。

附图说明

图1为本发明双酶构建的级联反应催化OPBE生成R-HPBE反应机理示意图。

图2为本发明中扩增的融合基因片段(Lane 1-3)与酶切处理后的质粒(Lane 4-6)琼脂糖凝胶电泳图。

图3为本发明中纯化前后的羰基还原酶-葡萄糖脱氢融合酶十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)图。

具体实施方式

为了是本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，结合以下实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。本发明实施例仅用于说明本发明，而不是限制本发明的范围。

实施例1：羰基还原酶CpCR和葡萄糖脱氢酶GDH的克隆

将近平滑假丝酵母ATCC 7330菌株复苏并培养，后收集菌体用作基因组DNA的提取。使用翌圣真菌DNA提取试剂盒按说明书所述方式提取全基因组DNA。将含有葡萄糖脱氢酶基因(委托北京擎科生物公司合成)插入到pET28a(+)质粒BamH I和Xho I位点之间，导入大肠杆菌DH5α中。

优化后的葡萄糖脱氢酶基因核苷酸序列SEQ ID NO:5：

ATGTATCCGGATCTGAAAGGTAAAGTTGTGGCAATTACGGGTGCCGCAAGCGGTCTGGGTAAAGCAATGGCTATCCGTTTTGGTAAAGAACAGGCAAAAGTTGTTATTAACTATTATAGCAACAAACAGGACCCTAATGAAGTTAAAGAAGAAGTTATTAAAGCAGGTGGTGAAGCAGTGGTAGTTCAGGGCGATGTTACCAAAGAAGAAGATGTGAAAAATATCGTGCAGACCGCAATTAAAGAATTTGGTACGCTGGATATTATGATTAATAACGCAGGTCTGGAAAATCCGGTTCCGAGTCATGAAATGCCGCTGAAAGATTGGGATAAAGTGATCGGTACCAATCTGACCGGTGCATTTCTGGGTAGCCGTGAAGCAATTAAATATTTTGTTGAAAACGATATCAAAGGTAACGTTATCAATATGTCCTCTGTGCATGCGTTTCCGTGGCCGCTGTTTGTGCATTATGCGGCATCTAAAGGTGGTATTAAACTGATGACCGAAACCCTGGCACTGGAATATGCACCGAAAGGTATTCGTGTTAATAATATTGGCCCGGGTGCTATTAATACCCCGATTAACGCCGAAAAATTTGCAGATCCTAAACAGAAAGCGGATGTGGAAAGCATGATTCCGATGGGTTATATCGGTGAACCTGAAGAAATCGCAGCAGTTGCAGCATGGCTGGCAAGTAAAGAAGCAAGCTATGTGACAGGTATTACCCTGTTTGCAGATGGTGGTATGACCCAGTATCCGAGCTTTCAGGCGGGTCGTGGT

将菌种复苏培养，后收集菌体用作质粒DNA的提取。使用质粒提取试剂盒所述方式提取质粒DNA。分别以提取到的基因组DNA和质粒为模板进行PCR扩增目的基因cpcr和gdh，根据目的基因和质粒载体序列在Primer Premier5软件中设计引物。

以ATCC 7330基因组DNA，进行PCR克隆cpcr基因片段，胶回收基因片段。PCR反应体系1：ATCC 7330基因组DNA 2μL，CpCR-F1 2μL，CpCR-R1 2μL，2×Hieff PCR Master Mix 25μL，ddH₂O 19μL。扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s,55℃退火30s，72℃延伸45s，循环35次，72℃终延伸10min，4℃保温。扩增结束后经Pst I与Xho I双酶切后进行1％的琼脂糖凝胶电泳并回收酶切产物。

将pETDuet-1质粒经Pst I与Xho I双酶切后，回收酶切产物，并与纯化后的cpcr基因按照载体与基因片段摩尔比1:3混合，加入T4 DNA连接酶1μL，10×Buffer 1μL，ddH₂O补足10μL，25℃保温30min，加入到感受态细胞，热击90s，冰浴2min，加入1mL LB培养基，37℃，180rpm复苏一小时。取100μL转化产物涂布于含100μg/mL氨苄青霉素固体培养基上，37℃过夜培养。取挑取阳性克隆子测序验证并命名为pETDuet-CpCR。

将含有葡萄糖脱氢酶质粒的重组菌在LB液体培养基中过夜培养后，提取质粒pET28a-GDH。以pETDuet-CpCR质粒和pET28a-GDH质粒DNA为模板，PCR扩增带有连接肽Linker的Linker-CpCR与GDH-Linker融合基因。PCR体系2：pETDuet-CpcR质粒DNA 2μL，CpCR-R1 2μL，Linker-CpCR-F 2μL，2×Hieff Canace PCR Master Mix 25μL，ddH₂O 19μL。回收目的基因Linker-CpCR。PCR体系3：pET28a-GDH质粒DNA 2μL，GDH-F 2μL，GDH-Linker-R2μL，2×Hieff Canace PCR Master Mix 25μL，ddH₂O 19μL。回收目的基因GDH-Linker。以Linker-CpCR和GDH-Linker为模板，利用重叠延伸PCR技术扩增CpCR与GDH融合目的基因GDH-L-CpCR。PCR体系4：Linker-CpCR融合基因1μL，GDH-Linker融合基因1μL，GDH-L-CpCR-F2μL，GDH-L-CpCR-R 2μL，2×Hieff Canace PCR Master Mix 25μL，ddH₂O 19μL。得到目的基因GDH-L-CpCR。

以同样的方法得到CpCR与GDH融合目的基因CpCR-L-GDH。体系5：pETDuet-CpcR质粒DNA 2μL，CpCR-F1 2μL，CpCR-Linker-R 2μL，2×Hieff Canace PCR Master Mix 25μL，ddH₂O 19μL。回收目的基因CpCR-Linker。体系6：pET28a-GDH质粒DNA 2μL，GDH-R 2μL，Linker-GDH-F 2μL，2×Hieff Canace PCR Master Mix 25μL，ddH₂O 19μL。回收目的基因Linker-GDH。体系7：CpCR-Linker融合基因1μL，Linker-GDH融合基因1μL，CpCR-L-GDH-F 2μL，CpCR-L-GDH-R 2μL，2×Hieff Canace PCR Master Mix 25μL，ddH₂O 19μL。得到目的基因CpCR-L-GDH。

扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s,55℃退火30s，72℃延伸45s，循环35次，72℃终延伸10min，4℃保温。

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扩增结束后，纯化PCR产物，与经PstⅠ与XhoⅠ双酶切处理过后的pETDuet-1质粒按照摩尔比3：1混合，加入无缝克隆试剂1μL，2×Buffer 5μL，ddH₂O补足10μL，冰水浴10分钟，导入感受态细胞。热击90s，冰浴2min，加入1mL LB培养基，37℃，180rpm复苏一小时。取100μL转化产物涂布于含100μg/mL氨苄青霉素固体培养基上，37℃过夜培养。取挑取阳性克隆子测序验证并命名为pETDuet-GDH-L-CpCR质粒、pETDuet-CpCR-L-GDH质粒。

实施例2：融合蛋白的诱导、表达及纯化

(1)将重组质粒转化到表达宿主BL21(DE3)，将BL21-pETDuet-GDH-L-CpCR接种到100μg/mL含氨苄青霉素的5mL液体LB试管培养基种，置于37℃的摇床活化12小时，将活化后的培养物按2％转接量转接到含100μg/mL氨苄青霉素的液体LB摇瓶培养基中，恒温振荡培养3小时，培养温度为37℃，转速为180rpm。待菌体浓度长到OD₆₀₀＝0.6-0.8时，加入总浓度为1mM IPTG，23℃诱导15h，9000rpm离心10min收集细胞，用0.9％(w/v)生理盐水洗涤菌体三次后备用；用pH 7.0，100mM的磷酸钠缓冲液重悬，工作2s，间歇5s，50％的超声功率破碎15分钟，离心后对上清液与沉淀进行12％SDS-PAGE电泳，结果如图3所示。从SDS-PAGE中可以看出Lane1-2分为别未经IPTG诱导的重组菌的上清液与沉淀；Lane3-4分为别经IPTG诱导的重组菌的上清液与沉淀，可以看出Lane3中含有少量目标蛋白，Lane4中含有大量目标蛋白，由此可得，GDH-L-CpCR融合酶大部分以包涵体不可溶形式表达，极少量可溶性表达。

(2)收集菌体破碎后的沉淀，经纯水洗涤1次，4℃下8000rpm离心15min，收获的沉淀即为纯化的GDH-L-CpCR包涵体。包涵体经包涵体溶解液(包涵体溶解液：50mM Tris-HCl，150mM NaCl，8M尿素，5M EDTA，pH 8.0；按质量体积比100mg/mL)4℃下溶解12h，8000rpm离心10min收集上清。将包涵体溶解液上清置于8000-14000Da的透析袋中分次(分三次，每次间隔8h)加入到含4M，3M，2M尿素的复性液(50mM Tris-HCl，150mM NaCl，5mM EDTA，0.5mM精氨酸，2mM谷胱甘肽，0.5mM还原性谷胱甘肽，pH 8.0)中，使包涵体溶解液中的尿素逐渐降低，于4℃下复性，最后在不含尿素的透析液(50mM Tris-HCl，150mM NaCl，5mM EDTA，0.5mM精氨酸，2mM谷胱甘肽，0.5mM还原性谷胱甘肽，pH 8.0)中透析12h。

(3)将1mL 50％BeyoGold^TMHis-tag Purification Resin 4℃，8000rpm离心1min弃去储存液，得到0.5mL凝胶。将装有0.5mL凝胶的3mL亲和层析柱用非变性裂解液(pH 8.0，50mM磷酸钠缓冲液和300mM NaCl)进行预平衡，8000rpm，4℃离心1min弃去液体，重复平衡两次，弃上清液，即为预平衡后的层析住。

将上述包涵体透析液4mL(粗酶液与步骤1装柱凝胶体积比8：1)，上样至预平衡后的层析柱中，振荡混匀，置于冰块中，在40rpm摇床中缓慢摇动1h后，转移至新的层析柱中，用非变性洗涤液(pH 8.0、50mM磷酸钠缓冲液，300mM NaCl和2mM咪唑)依赖重力下降进行洗脱以去除杂蛋白，洗柱5次，每次用量为1个柱体积，洗脱速度约0.5mL/min。然后再用非变性洗脱液(pH 8.0、50mM磷酸钠缓冲液，300mM NaCl和50mM咪唑)进行洗脱用于纯化葡萄糖脱氢酶-羰基还原酶目的蛋白，洗脱8次，每次洗脱1个柱体积，收集洗脱液，用12％SDS-PAGE监测，结果如图3中Lane 6所示。合并洗脱液，置于8000-14000Da的透析袋中在0.01mM pH为8的PB缓冲液中，4℃下透析24h。透析后的酶液在-80℃冰箱中预冻8h后放入冷冻干燥机-65℃真空干燥12h，获得葡萄糖脱氢酶-羰基还原酶-纯酶15mg。

(4)酶活鉴定：

通过检测340nm处吸光值变化的方式，利用分光光度计测定羰基还原酶活力。还原酶活力测定方法如下：于1mL反应体系(100mM PB缓冲液，pH 7.0)中，加入2mM OPBE，0.1mMNADPH，30℃保温2分钟后加入实施例2制备的适量酶液(100μL 5mg/mL融合酶纯酶水溶液)，迅速混匀，检测340nm处吸光值的变化酶活力的计算公式为：酶活力(U)＝EW×V×10³/(6220×l)；式中，EW为1min内340nm处吸光度的变化；V为反应液的体积，单位mL；6220为NADPH的摩尔消光系数，单位L/(mol·cm)；l为光程距离，单位cm。每单位还原酶的定义为在上述条件下，每分钟催化1μmol NADPH氧化所需的酶量。经测定，羰基还原酶酶活为0.11U。

实施例3：比较两种融合酶对OPBE的选择性

在2mL反应体系中，加入终浓度10mM底物OPBE，200μL无水乙醇作为助溶剂、50g/L葡萄糖、终浓度0.1mM辅助因子NADP⁺、5mg实施例2中融合酶，用PB缓冲液补足至2mL。将反应瓶置于30℃的不同温度下，180rpm条件下反应24h。反应结束后，4℃，8000rpm离心10min，收集上清液并向其中加入等体积乙酸乙酯萃取，重复萃取三次后，收集的萃取液用无水硫酸钠干燥后常温下挥发掉乙酸乙酯，气相色谱法检测底物OPBE、产物(R)-HPBE峰面积，采用内标法(添加十二烷为内标物)计算含量，通过公式(1)和公式(2)计算(R)-HPBE的转化率和对映体过剩值(ee)，结果见表1。

气相色谱法(GC)检测条件：手性色谱柱CP7502(25m×0.25mm×0.25μm)；进样口温度250℃，柱温130℃，检测器250℃，流速2mL/min，分流比1：15，进样量1μL。

产物(R)-HPBE的转化率和对映体过剩值(ee)通过公式(1)、公式(1)计算，：

式(1)中，M_S：底物的分子量；M_P：产物的分子量；q：反应初始时底物的质量；P：反应结束时产物的质量

/>

式(1)中，C_R：R型产物浓度，C_R：S型产物浓度。

表1两种融合酶催化OPBE的选择性

由上表可知，两种融合酶在同样反应条件下，对底物的催化效率基本一致，但对映体选择性有明显差异。因此在后续实施例中选用葡萄糖脱氢酶-羰基还原酶融合酶GDH-L-CpCR作为催化剂。

实施例4：pH对融合酶活性的影响

在2mL反应体系中，加入终浓度10mM底物OPBE，200μL无水乙醇作为助溶剂(助溶剂的量为总体积的10％)、50g/L葡萄糖、终浓度0.1mM辅助因子NADP⁺、5mg实施例2中融合酶，用不同pH的PB补足至2mL。将反应瓶置于30℃，180rpm条件下反应24h。反应结束后，4℃，8000rpm离心10min，收集上清液并向其中加入等体积乙酸乙酯萃取，重复萃取三次后，收集的萃取液用无水硫酸钠干燥后常温下挥发掉乙酸乙酯，按实施例3中GC法检测R-HPBE转化率和对映体过剩值，结果见表2。

表2pH对羰基还原融合酶催化反应的影响

在pH 6-pH 8.5范围内，考察了缓冲液pH值对CpCR-L-GDH催化性能的影响，在pH6-pH 7.5内，转化率随着pH值的增大呈现逐步提高的趋势，到pH 8.5时转化率略有下降，但仍维持较高水平。从表1中可以看出缓冲液的pH对酶的活性有一定的影响，这可能是由于pH的改变影响了酶活性位点的立体构象。由转化率的趋势可以看出，该酶在弱碱环境中活性最大，且对映体过剩值达到最大。故确定0.1M pH 7.5PB为体系的最佳缓冲液。

实施例5：温度对融合酶活性的影响

在2mL反应体系中，加入终浓度10mM底物OPBE200μL乙醇作为助溶剂、50g/L葡萄糖、终浓度0.1mM辅助因子NADP⁺、5mg实施例2中融合酶，用PB缓冲液补足至2mL。将反应瓶置于25-45℃的不同温度下，180rpm条件下反应24h。反应结束后，4℃，8000rpm离心10min，收集上清液并向其中加入等体积乙酸乙酯萃取，重复萃取三次后，收集的萃取液用无水硫酸钠干燥后常温下挥发掉乙酸乙酯，按实施例3中GC法检测R-HPBE转化率和对映体过剩值，结果见表3。

表3温度对羰基还原融合酶催化反应的影响

温度对融合酶活性有明显的影响，其活性随着温度的变化而改变。从表中可以看出，在一定的温度范围(25-30℃)内，融合酶催化反应的产率呈上升趋势，温度超过35℃后，活力急剧下降。因此，对于融合酶催化的级联反应体系的反应最佳的温度为30℃。

实施例6：反应时间对融合酶活性的影响

在2mL反应体系中，加入终浓度10mM底物OPBE，200μL乙醇作为助溶剂、50g/L葡萄糖、终浓度0.1mM辅助因子NADP⁺、5mg实施例2中融合酶，用PB缓冲液补足至2mL。将反应瓶置于30℃下，180rpm条件下反应。反应结束后，4℃，8000rpm离心10min，收集上清液并向其中加入等体积乙酸乙酯萃取，重复萃取三次后，收集的萃取液用无水硫酸钠干燥后常温下挥发掉乙酸乙酯，按实施例3中GC法检测R-HPBE转化率和对映体过剩值，结果见表4。

表4反应时间对羰基还原融合酶催化反应的影响

由上表可知，随着反应时间的延长，产物的得率逐渐上升，并且在24h达到最高97.6％。随着反应时间的增加，产物的得率出现了微弱的下降趋势，因此确定反应的最佳时间为24h。

实施例7：助溶剂对融合酶活性的影响

考虑到底物溶解性影响，该实施例评估了各种助溶剂，如甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、和DMSO对融合酶催化反应的影响。

在2mL反应体系中，加入终浓度10mM底物OPBE，200μL不同助溶剂溶解，50g/L葡萄糖、终浓度0.1mM辅助因子NADP⁺、5mg实施例2中融合酶，用PB缓冲液补足至2mL。将反应瓶置于30℃下，180rpm条件下反应24h。反应结束后，4℃，8000rpm离心10min，收集上清液并向其中加入等体积乙酸乙酯萃取，重复萃取三次后，收集的萃取液用无水硫酸钠干燥后常温下挥发掉乙酸乙酯，按实施例3中GC法检测R-HPBE转化率和对映体过剩值，结果见表5。

表5助溶剂对羰基还原融合酶催化反应的影响

不同助溶剂对底物的溶解性能有较明显的差异性，从表4中可以看出在无助溶剂情况下，底物的溶解性差，产率明显低于添加助溶剂组。且溶剂的种类对产率有一定程度的影响，对R-HPBE的对映体过剩值也有一定影响。在产率和ee(％)两个角度看，乙醇、甲醇和丙酮都较适宜作为OPBE不对称还原为R-HPBE反应的助溶剂。其中，乙醇的效果最佳。故将乙醇选为级联反应的助溶剂。

实施例8：底物浓度对融合酶活性的影响

在2mL反应体系中，加入不同浓度的底物OPBE，200μL乙醇作为助溶剂、50g/L葡萄糖、终浓度0.1mM辅助因子NADP⁺、5mg实施例2中融合酶，用PB缓冲液补足至2mL。将反应瓶置于30℃下，180rpm条件下反应24h。反应结束后，4℃，8000rpm离心10min，收集上清液并向其中加入等体积乙酸乙酯萃取，重复萃取三次后，收集的萃取液用无水硫酸钠干燥后常温下挥发掉乙酸乙酯，按实施例3中GC法检测R-HPBE转化率和对映体过剩值，结果见表6。

表6底物浓度对羰基还原融合酶催化反应的影响

由上表可知,底物浓度对不对称催化还原反应有一定的影响。在底物浓度小于10mM时，产率达到了99.9％；当底物浓度大于10mM时，产率有一定的下降，且底物浓度达到30mM时，产率仍有65％。说明，虽然底物OPBE本身对转化体系有较大的影响，但本说明构建的催化体系对高浓度的OPBE具有了一定的耐受性。

实施例9：辅助底物浓度对融合酶活性的影响

在2mL反应体系中，加入终浓度20mM底物OPBE，200μL乙醇作为助溶剂、50g/L葡萄糖、终浓度0.1mM辅助因子NADP⁺、5mg实施例2中融合酶，用PB缓冲液补足至2mL。将反应瓶置于30℃下，180rpm条件下反应24h。反应结束后，4℃，8000rpm离心10min，收集上清液并向其中加入等体积乙酸乙酯萃取，重复萃取三次后，收集的萃取液用无水硫酸钠干燥后常温下挥发掉乙酸乙酯，按实施例3中GC法检测R-HPBE转化率和对映体过剩值，结果见表7。

表7辅底物浓度对羰基还原融合酶催化反应的影响

由上表可知，辅助底物的浓度对重组酶的生物转化效率有影响。随着葡萄糖浓度的升高，产物得率逐渐升高，当葡萄糖浓度达到50g/L时，产物得率达到97.2％，光学纯度99.9％；随着葡萄糖浓度继续增加，产物得率逐渐下降。故辅助底物浓度以50g/L为最佳。

Claims (10)

1.一种羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的融合酶，其特征在于：所述羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的融合酶包括依次连接的如SEQ ID NO:2所示葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列和如SEQID NO:1所示羰基还原酶的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的融合酶，其特征在于：所述羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的融合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

3.如权利要求1所述的羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的融合酶的编码基因。

4.如权利要求3所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:4所示。

5.包含如权利要求3所述的编码基因的重组表达质粒。

6.如权利要求5所述的重组表达质粒，其特征在于：所述重组表达质粒的载体是pETDuet-1。

7.包含如权利要求5所述的重组表达质粒的工程菌。

8.如权利要求7所述的工程菌，其特征在于：所述工程菌的宿主为大肠杆菌BL21(DE3)。

9.如权利要求1所述的羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的融合酶在不对称还原2-氧代-4-苯基丁酸乙酯制备(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于所述应用为：以表达所述羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的融合酶的工程菌经诱导表达、分离纯化、冷冻干燥获得的酶粉为催化剂，以2-氧代-4-苯基丁酸乙酯为底物，以葡萄糖为辅助底物，以NADP⁺为辅助因子，以有机溶剂为助溶剂，以pH6.0-8.5磷酸盐缓冲液为反应介质构建反应体系，25-45℃搅拌反应6-36h进行不对称还原，获得(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯；

所述反应体系中，所述催化剂的终浓度为1.5-5mg/mL，所述底物的终浓度为2-50mM，所述辅助底物的终浓度为30-100g/L，所述辅助因子的终浓度为0.1-1mM；所述有机溶剂为乙醇、甲醇、异丙醇、丙酮、DMSO中的一种或两种的混合溶剂，所述助溶剂的体积为所述反应体系体积的10％。

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