JP5175845B2 - 光学活性1,2−ジオール類の製造に用いられる不斉酸化酵素 - Google Patents
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Description
(a)配列番号1の第112塩基〜第2184塩基、
(b)配列番号1の第112塩基〜第2184塩基と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、S体1,2-プロパンジオールを立体選択的に酸化する不斉酸化活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
(c)配列番号1の第112塩基〜第2184塩基において、1または数個の塩基が欠失、付加または置換されている塩基配列であって、S体1,2-プロパンジオールを立体選択的に酸化する不斉酸化活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、
(d)配列番号5のアミノ酸配列をコードする塩基配列、
(e)配列番号5のアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されているアミノ酸配列であって、S体1,2-プロパンジオールを立体選択的に酸化する不斉酸化活性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列、および、
(f)配列番号5のアミノ酸配列と少なくとも75%以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、S体1,2-プロパンジオールを立体選択的に酸化する不斉酸化活性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列。
(a’)配列番号5のアミノ酸配列からなるタンパク質、
(b’)配列番号5のアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されているアミノ酸配列からなり、S体1,2-プロパンジオールを立体選択的に酸化する不斉酸化活性を有するタンパク質。
(c’)配列番号5のアミノ酸配列と少なくとも75%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、S体1,2-プロパンジオールを立体選択的に酸化する不斉酸化活性を有するタンパク質も包含する。
本発明はまた、本発明のタンパク質を基質である3-クロロ-1,2-プロパンジオールまたは3-クロロ-2-メチル-1,2-プロパンジオールのR体もしくは両エナンチオマー混合物へ作用させることを含む、S体3-クロロ-1,2-プロパンジオールまたはS体3-クロロ-2-メチル-1,2-プロパンジオールの製造方法に関する。
本発明の完成までに、シュードモナス ニトロレデューセンスDS-S-RP8株は少なくとも5種類の酸化酵素を発現していることが判明した。かかる5種類の酵素は酸化能が相違し、また基質に対する立体選択性もそれぞれに相違する。従って、野生株を用いて上記1,2-ジオール類の一方の一方のエナンチオマーを得ようとしても効率が悪く、また使用する培地組成や野生株の成長のステージによって各酸化酵素の発現の程度が変化する。
(a)配列番号1の第112塩基〜第2184塩基、
(b)配列番号1の第112塩基〜第2184塩基と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、S体1,2-プロパンジオールを立体選択的に酸化する不斉酸化活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
(c)配列番号1の第112塩基〜第2184塩基において、1または数個の塩基が欠失、付加または置換されている塩基配列であって、S体1,2-プロパンジオールを立体選択的に酸化する不斉酸化活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、
(d)配列番号5のアミノ酸配列をコードする塩基配列、
(e)配列番号のアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されているアミノ酸配列であって、S体1,2-プロパンジオールを立体選択的に酸化する不斉酸化活性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列、および、
(f)配列番号5のアミノ酸配列と少なくとも75%以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、S体1,2-プロパンジオールを立体選択的に酸化する不斉酸化活性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列。
(a’)配列番号5のアミノ酸配列からなるタンパク質、
(b’)配列番号5のアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されているアミノ酸配列からなり、S体1,2-プロパンジオールを立体選択的に酸化する不斉酸化活性を有するタンパク質、および
(c’)配列番号5または6に記載のアミノ酸配列と少なくとも75%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、S体1,2-プロパンジオールを立体選択的に酸化する不斉酸化活性を有するタンパク質
からなる群から選択される不斉酸化酵素であるタンパク質が提供される。
グリセリン10g/l、酵母エキス10g/l、ペプトン10g/lを含む栄養培地100ml(pH7.2)を入れた500ml容バッフル付き三角フラスコに、あらかじめ同栄養培地プレートで生育させたシュードモナスニトロレデューセンスDS-S-RP8株の菌体を1白金耳分植菌し、30℃で24hr培養を行ない種培養液を得た。次いで、5L容のジャーファーメンターに上記栄養培地2.5Lを調製、および下記表1に示す1,2-プロパンジオールを単一炭素源とする最少培地2.5Lを調製し、30℃で24hr培養を行なった。各培養液を遠心分離し、菌体を調製した。
各画分の酵素活性を、Tetrahedron Asymmetry Vol.5, pp.239-246, 1994の方法にて確認した。具体的には50mMトリス-HCl(pH7.5)バッファーに0.25mMフェナジンメソサルフェート(PMS)、0.25mM 2,6−ジクロロフェノールインドフェノール(DCIP)および0.2%(v/v)S体プロパンジオールを加えた反応液を調製し、この反応液2.7mlに酵素液300μlを加え、30℃で10分間反応させDCIPの還元による600nmの吸光度の減少を利用した比色定量により行なった。
得られた酵素液を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(Native PAGE)に供し、泳動後に活性染色を行った。反応液として、50mMトリス-HCl(pH7.5)バッファーに0.5mMフェナジンメソサルフェート(PMS)、0.5mMテトラニトロテトラゾリウムブルー、および基質であるS体1,2−プロパンジオール0.2%(v/v)を添加した溶液を調製し、電気泳動後のゲルを20分間浸して活性染色を行なった(Tetrahedron Asymmetry Vol.5,pp.239-246, 1994)。
得られた両酵素の(S)-1,2-プロパンジオール及び(R)-1,2-プロパンジオールに対する活性を(1)に示した方法で調べた。その結果、両酵素とも(S)-1,2-プロパンジオールを優先的に分解することが確認された。
PnE1について各基質に対する反応性を確認した。反応性は上記活性染色法に基づいて行った。染色度合いの強い程、該基質に対する酸化分解活性が強い。結果を表2に示す。
実施例1で得られた2種類の不斉酸化酵素溶液をSDS-PAGEに供し、PVDF膜にブロッティングし、プロテインシークエンサーにてN末端アミノ酸配列の解析を行った結果、配列番号7および8に記載のアミノ酸配列が得られた。
(1)シュードモナス ニトロレデューセンスDS-S-RP8株からの染色体DNAの調製
DS-S-RP8株をグリセリン10g/l、酵母エキス10g/l、ペプトン10g/lを含む液体培地5ml中で20時間培養し、遠心分離により菌体を回収した。
実施例2で決定したPnE1およびPnE2それぞれのN末端アミノ酸配列を元に、アミノ酸配列から予想されるDNA配列についてコドン縮重を考慮してPCRプライマーを合成した(配列番号9、10)。また、実施例2で決定したPnE1およびPnE2それぞれのアミノ酸配列をもとに相同性の検索を行った結果、PQQを補酵素とする各種アルコール脱水素酵素との相同性がみられた。その保存領域を検索し、その保存領域の内部アミノ酸配列を元に、アミノ酸配列から予想されるDNA配列についてコドン縮重を考慮してPCRプライマー(配列番号11、12)を合成した。なお縮重プライマーは配列表に記載の配列においてhがa、cまたはt、nがa、c、gまたはt、rがaまたはg、yがcまたはtを示すものそれぞれの組合せの混合プライマーである。
抽出したDS-S-RP8株の染色体DNAを種々の制限酵素で切断し、1%アガロースゲルを用いて電気泳動後、ニトロセルロースメンブレンに転写させた。風乾後、(2)で作製したプローブを用いて、65℃で20時間ハイブリダイゼーション反応を行った。
(3)で作製した制限酵素地図から目的とする不斉酸化酵素遺伝子の全長が含まれることを考慮して、プラスミドpBluescriptII KS(東洋紡績株式会社製)のNotI-KpnI部位に約6200塩基対のDS-S-RP8株の染色体DNAに由来する多種類のDNA断片を挿入したゲノムライブラリーを作製した。これを大腸菌JM109株に導入して得られた形質転換体160個体をニトロセルロースメンブレンにレプリカした後、0.5N NaOHにメンブレンを浸して溶菌し、1M トリス-HCl(pH7.5)にメンブレンを浸して中和した。風乾後、(2)で作製したプローブを用いて、65℃で20時間ハイブリダイゼーション反応を行なった。
上記陽性株から常法によりプラスミドを抽出し、PnE1遺伝子を得た。次いで、実施例3の(2)で決定したプローブの塩基配列を元に、プライマーウォーキング法により不斉酸化酵素遺伝子の塩基配列をジデオキシ法により決定した。決定した塩基配列を配列番号1に、またその塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号2に示す。また、配列番号1に示す塩基配列のうち第1〜第111塩基はシグナルペプチドをコードするものである。配列番号5にPnE1の成熟タンパク質のアミノ酸配列を示す。
プラスミドpUC19のEcoRI-KpnI部位に約6800塩基対のDS-S-RP8株の染色体DNAに由来する多種類のDNA断片を挿入したゲノムライブラリーを作製し、使用した以外は、(3)-(5)の同じ手法を用いて、PnE2の遺伝子クローニングおよび塩基配列の決定を行なった。決定した塩基配列を配列番号3に、またその塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号4に示す。配列番号3に示す塩基配列のうち、第1から第87塩基はシグナルペプチドをコードするものである。配列番号6にPnE2の成熟タンパク質のアミノ酸配列を示す。
(1)PnE1遺伝子のサブクローニング
配列番号1の塩基配列より配列番号13及び14に示すPCRプライマーを設計し、実施例3の(5)で得られたプラスミド1ngを鋳型にしてPCR(熱変性94℃、15秒、アニーリング60℃、30秒、伸長反応68℃、3分)を30サイクル行なった。4℃まで冷却後、アガロースゲル電気泳動により増幅DNAを確認し、DNA断片を常法によりアガロースゲルより回収した。次いで、そのDNA断片をPCR産物クローニングキットであるTArget Clone(東洋紡績製)にて、キットのプロトコール通りにpTA2ベクター(2.96Kbp)へのクローニングを実施し、ライゲーション混液にてEscherichia coli DH5αコンピテントセル(東洋紡績製)を形質転換した。
特開2001−204473に記載のシュードモナス(Pseudomonas)用プラスミドpTM33(15.8Kbp)をBamHI及びXhoIで37℃、2時間切断反応し、アガロースゲル電気泳動後、13.7Kbpの断片を回収した。この断片を、ゲル中DNA抽出キット(MagExtractor-PCR&Gel Clean-up,東洋紡績製)にてキットのプロトコール通りに抽出し、50μL水溶液として回収した。
一方、実施例4の(1)で調製したpTA−PnE1、をBamHI及びXhoIで37℃、2時間切断反応し、アガロースゲル電気泳動後、2.27Kbpの断片を回収した。これらの断片を、MagExtractor-PCR&Gel Clean-upにて抽出し、50μL水溶液として回収した。
回収したプラスミドpTM33由来13.7Kbp断片とPnE1遺伝子を含む2.27Kbp断片を等モル量ずつ混合し、ライゲーションキット(Ligation high:東洋紡績製)にてキットのプロトコール通りに16℃、1時間のライゲーション反応を行った。その後、ライゲーション混液10μLを用いてEscherichia coli DH5αコンピテントセル(東洋紡績製)を形質転換した。30℃、18時間培養して得られた複数のコロニーを、再度アンピシリンを100μg/ml含む4mLのLB培地にて30℃、18時間培養し、培養液よりMagExtractor-Plasmidにてコロニーのプラスミドを抽出した。得られたプラスミドをBamHI及びXhoIで37℃、2時間切断反応し、アガロースゲル電気泳動により目的のPCR産物がクローニングされたものを選択した。更に、DNAシーケンシングにより、PnE1遺伝子を確認し、pTM−PnE1S(16.0Kbp)とした。
(1)PnE2遺伝子のサブクローニング
配列番号3の配列より配列番号15及び16に示すPCRプライマーを設計し、実施例3の(6)で得られたプラスミド1ngを鋳型にした以外は、実施例4記載の方法と同じ方法にてPnE2遺伝子のサブクローニングを行い、PnE2遺伝子がBamHIからXhoIの方向にクローニングされているプラスミドを選択し、pTA−PnE2(4.90Kbp)とした。
実施例5の(1)で得たプラスミドpTA−PnE2(4.90Kbp)を使用した以外は、実施例4の(2)記載の方法と同じ方法にてPnE2発現プラスミドの構築を行った。pTM33由来13.7Kbp断片とPnE2遺伝子を含む1.94Kbp断片を等モル量ずつ混合し、ライゲーション反応を実施後、ライゲーション混液10μLを用いてEscherichia coli DH5αコンピテントセルを形質転換した。コロニーのプラスミドを抽出し、得られたプラスミドをBamHI及びXhoIで37℃、2時間切断反応し、アガロースゲル電気泳動により目的のPCR産物がクローニングされたものを選択した。更に、DNAシーケンシングにより、PnE2遺伝子を確認し、pTM−PnE2S(15.7Kbp)とした。
(1)コンピテントセルの調製
シュードモナス(Pseudomonas sp. TE3493 :茨城県つくば市東1丁目1番3号 通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所(現 郵便番号305−8566 茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6 独立行政法人産業技術総合研究所特許性物寄託センター)に平成3年6月10日に国際寄託、国際寄託番号FERM BP−4169)菌株の培養液10mlより菌体を遠心分離(12,000rpm,5分間)し、8mlのバッファー(5mMリン酸カリウム(pH7.0),300mMシュークロース)で懸濁後、遠心分離で菌体を回収した。この操作を再度繰り返し、菌体を洗浄後、0.4mlのバッファーに懸濁することによりエレクトロポレーション用コンピテントセルを調製した。
エレクトロポレーション用セルに、(1)で調製したコンピテントセルと実施例4あるいは5で作製したプラスミドDNA(pTM−PnE1SあるいはpTM−PnE2S)0.5μgを混合し、エレクトロポレーション装置(ジーンパルサー:Bio−Rad製)にセットして、25μF、200Ωのパルスを与えた。その後、混合液に5mlのLB培地を追加し、30℃、1時間振とう培養後、ストレプトマイシンを100μg/ml含むLB寒天培地にプレーティングし、30℃、18時間培養して、目的の形質転換体TE3493/pTM−PnE1S及びTE3493/pTM−PnE2Sを得た。
(1)培養液の調製
ペプトン10g/L、酵母エキス10g/L、グリセリン10g/Lからなる組成の培地100ml(pH7.0)を、500ml容のバッフル付き三角フラスコに入れ、121℃で15分間、加圧蒸気滅菌した。次いで、ストレプトマイシンを100μg/mLとなるように添加し、あらかじめ同栄養培地プレートで生育させた実施例6で得た組換えシュードモナス株を1白金耳分植菌し、30℃で24時間培養を行った。得られた培養液にラセミ体3−クロロ−2−メチル−1,2−プロパンジオールを1.0%(v/v)とCaCO3を1.5%とを加え、30℃、120rpmで48時間反応させた。反応液中に残存する3−クロロ−2−メチル−1,2−プロパンジオールをガスクロマトグラフィー(GLサイエンス社製のカラム担体:PEG20M,60−80メッシュ(0.31−0.42mm)で分析した。反応終了後、反応液を取り出し、遠心操作により菌体を除去し、上清液を得た。この上清液をエバポレーターで濃縮し、エーテルにより抽出した。続いて無水硫酸マグネシウムにより脱水後、減圧下でエーテルを除去し、3−クロロ−2−メチル−1,2−プロパンジオールのシロップを得た。
PnE1遺伝子およびPnE2遺伝子で組換えることにより、各エナンチオマーの相対反応速度比であるエナンチオマー過剰度(e.e)が向上した。しかしながら、PnE2組換体で得られる光学純度はPnE1組換体にて得られる値と比して低く、またPnE1とPnE2は同じ基質に作用することからPnE1とPnE2の両方を含む系より、PnE1のみを含む系の方がより高い立体選択性をもって1,2-プロパンジオール類の光学分割を可能とすると解される。
ペプトン10g/L、酵母エキス10g/L、グリセリン10g/Lからなる組成の培地100ml(pH7.0)を、500ml容のバッフル付き三角フラスコに入れ、121℃で15分間、加圧蒸気滅菌した。次いで、あらかじめ同栄養培地プレートで生育させたPnE1及びPnE2遺伝子供与株であるシュードモナスニトロレデューセンス(Pseudomonas nitroreducens) DS−S−RP8株を1白金耳分植菌し、30℃で24時間培養を行った。得られた培養液にラセミ体3−クロロ−2−メチル−1,2−プロパンジオールを1.0%(v/v)とCaCO3を1.5%とを加え、30℃、120rpmで48時間反応させ、実施例7と同様にして、残存率及び光学純度を測定した。その結果、DS−S−RP8株よりも遺伝子組換え体TE3493/pTM−PnE1Sの方が光学純度>99%e.e. での残存率すなわち収率が高かった。
Claims (11)
- 以下の(a)または(b)のいずれかの塩基配列からなる遺伝子:
(a)配列番号1の第112塩基〜第2184塩基、
(b)配列番号1の第112塩基〜第2184塩基と90%以上の相同性を有し、S体1,2−プロパンジオールを同化合物のR体に比して立体選択的に酸化する活性、およびR体3−クロロ-2-メチル−1,2−プロパンジオールを、同化合物のS体に比して選択的に酸化する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。 - 配列番号1の第112塩基〜第2184塩基からなる遺伝子。
- 以下の(a’)または(b’)のいずれかのタンパク質:
(a’)配列番号5に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、
(b’)配列番号5に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有し、S体1,2−プロパンジオールを同化合物のR体に比して立体選択的に酸化する活性、およびR体3−クロロ-2-メチル−1,2−プロパンジオールを同化合物のS体に比して選択的に酸化する活性を有するタンパク質。 - 配列番号5に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
- 請求項1または2に記載の遺伝子を含むベクター。
- 請求項1または2の遺伝子もしくは請求項5のベクターを含む形質転換体。
- 請求項1または2に記載の遺伝子を微生物に発現させることを含む、請求項3または4に記載のタンパク質の製造方法。
- 請求項3または4に記載のタンパク質を、1,2-プロパンジオールの両エナンチオマー混合物またはS体に接触させることを含む、R体1,2-プロパンジオールの製造方法。
- 請求項3または4に記載のタンパク質を、3-クロロ-1,2-プロパンジオールまたは3-クロロ-2-メチル-1,2-プロパンジオールの両エナンチオマー混合物もしくはR体に接触させることを含む、S体3-クロロ-1,2-プロパンジオールまたはS体3-クロロ-2-メチル-1,2-プロパンジオールのエナンチオマーの製造方法。
- 請求項3または4記載のタンパク質を発現する微生物を用いる、請求項8または9記載の方法。
- 微生物が、請求項6記載の形質転換体である、請求項10記載の方法。
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