EA013412B1 - Новый ген sms 27 - Google Patents

Abstract

Данное изобретение относится к недавно идентифицированным генам, которые кодируют белки, которые участвуют в синтезе L-аскорбиновой кислоты (далее называемой также витамином С). Это изобретение описывает также полинуклеотиды, содержащие полноразмерные полинуклеотидные последовательности этих новых генов и их фрагментов, новые полипептиды, кодируемые этими полинуклеотидами и их фрагментами, а также их функциональные эквиваленты. Данное изобретение относится также к применению указанных полинуклеотидов и полипептидов в качестве биотехнологических инструментов в получении витамина С из микроорганизмов, посредством чего модификация указанных полинуклеотидов и/или кодируемых полипептидов оказывает прямое или опосредованное действие на выход, продуктивность и/или эффективность продуцирования этого продукта ферментации в указанном микроорганизме. Также описаны способы/процессы использования этих полинуклеотидов и модифицированных полинуклеотидных последовательностей для трансформации микроорганизмов-хозяев. Это изобретение относится также к генетически сконструированным микроорганизмам и их применению для непосредственного получения витамина С.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Данное изобретение относится к недавно идентифицированным генам, которые кодируют белки, которые участвуют в синтезе Ь-аскорбиновой кислоты (далее называемой здесь витамином С) и/или 2кето-Ь-гулоновой кислоты (далее называемой здесь 2-К6А). Данное изобретение описывает также полинуклеотиды, содержащие полноразмерные полинуклеотидные последовательности новых генов и их фрагментов, новые полинуклеотиды, кодируемые этими полинуклеотидами и их фрагментами, а также их функциональные эквиваленты. Данное изобретение относится также к применению указанных полинуклеотидов и полипептидов в качестве биотехнологических инструментов в получении витамина С и/или 2-Κ6Ά из микроорганизмов, посредством чего модификация указанных полинуклеотидов и/или кодируемых полипептидов оказывает прямое или непрямое действие на выход, продукцию и/или эффективность продуцирования продукта ферментации в указанном микроорганизме. В изобретение включены также способы/процессы использования этих полинуклеотидов и модифицированных полинуклеотидных последовательностей для трансформации микроорганизмов-хозяев. Данное изобретение относится также к генетически сконструированным микроорганизмам и их применению для прямого получения витамина С и 2-Κ6Ά.

Уровень техники

Витамин С является одним из очень важным и незаменимых факторов питания людей. Витамин С используют также в корме животных, даже хотя сельскохозяйственные животные могут синтезировать его в собственном теле.

В течение последних 70 лет витамин С получали промышленным путем из Ό-глюкозы хорошо известным способом Райхштайна. Все стадии в этом процессе являются химическими, за исключением одной (превращения Ό-сорбита в Ь-лактозу), которую проводят микробным превращением. С его первоначального воплощения для промышленного получения витамина С, использовали несколько химических и технических модификаций для улучшения эффективности способа Райхштайна. Недавние разработки получения Витамина С суммированы в ийтапи'к Еисус1ореб1а οί 1пби51па1 СйетШту, 5'¹' Εάίίίοη, Уо1. А27 (1996), рр. 547ίί.

Различные промежуточные стадии получения витамина С выполняли с использованием микроорганизмов или выделенных из них ферментов. Так, 2-кето-Ь-Ы8/31.08.2006 гулоновая кислота (2-К6А), промежуточное соединение, которое может быть химически превращено в витамин С реакцией щелочной перегруппировки, может быть получена ферментационным процессом из Ь-сорбозы или Ό-сорбита в качестве исходных продуктов с использованием штаммов, принадлежащих, например, к родам Ке1оди1ошсщепшт или 61исоиоЬас1ет, или альтернативным ферментационным процессом из Ό-глюкозы в качестве исходного продукта с использованием рекомбинантных штаммов, принадлежащих к родам 61исоиоЬас1ег или Рап1оеа.

Существующие химические способы получения для витамина С имеют некоторые нежелательные характеристики, такие как высокое потребление энергии и использование больших количеств органических и неорганических растворителей. Таким образом, на протяжении последних десятилетий исследовались другие подходы к производству витамина С с использованием микробных превращений, которые могли бы быть более экономичными, а также более экологическими.

Прямое продуцирование витамина С из ряда субстратов, включающих в себя Ό-сорбит, Ь-сорбозу и Ь-сорбозон, сообщалось в нескольких микроорганизмах, таких как водоросли, дрожжи и уксуснокислые бактерии, с использованием различных способов культивирования. Примеры известных бактерий, способных к прямому продуцированию витамина С, включают в себя, например, штаммы из родов 61исоиоЬас1ег, 61исоиасе1оЬас1ет, Асе1оЬас1ет, Ке1оди1оп1с1депшт, РаШоеа, Ркеиботоиак или ЕксйепсЫа. Примеры известных дрожжей или водорослей включают в себя, например, Саиб1ба, Зассйаготусек, 2удокассйаготусек, ЗсЫ/окассйаготусек, К1иууеготусе§ или СЫоге11а.

Микроорганизмы, способные ассимилировать Ό-сорбит для роста, обычно имеют ферменты, способные окислять это соединение в универсальный субстрат ассимиляции, такой как Ό-фруктоза. Микроорганизмы, способные расти на Ь-сорбозе, имеют фермент, НАД(Ф)Н-зависимую Ь-сорбозоредуктазу, которая способна восстанавливать это соединение до Ό-сорбита, который затем окисляется далее в Όфруктозу. Ό-фруктоза является превосходным субстратом для роста многих микроорганизмов, после того как она фосфорилируется Ω-фруктозокиназой.

Например, в случае уксуснокислых бактерий, которые являются облигатно-аэробными, грамотрицательными микроорганизмами, принадлежащими к роду Асе1оЬас1ег, 61исоиоЬас1ег и 61исоиасе1оЬас1ег, эти микроорганизмы способны транспортировать Ό-сорбит в цитозоль и превращать его в Ω-фруктозу при помощи цитозольной НАД-зависимой Ω-сорбитолдегидрогеназы. Некоторые отдельные штаммы, такие как 61исоиоЬас1ег охубаик ΙΕΟ 3292 и ΙΕΟ 3293, способны также транспортировать Ь-сорбозу в цитозоль и восстанавливать ее в Ό-сорбит при помощи НАД(Ф)Н-зависимой Ь-сорбозоредуктазы, которая затем окисляется далее в Ό-фруктозу. В этих бактериях путь Эмбдена-Мейергофа-Парнаса, а также цикл трикарбоновых кислот являются не полностью активными, и основным путем прохождения сахаров в центральный метаболизм является пентозофосфатный путь. Ω-фруктозо-б-фосфат, полученный из Όфруктозы в результате реакции фосфорилирования, вступает в пентозофосфатный путь, дополнительно

- 1 013412 метаболизируясь и продуцируя восстанавливающую активность в форме НАД(Ф)Н и трикарбоновые соединения, необходимые для роста и поддержания.

Уксуснокислые бактерии хорошо известны в отношении их способности неполно окислять различные субстраты, такие как спирты, сахара, сахароспирты и альдегиды. Эти процессы обычно известны как окислительные ферментации или неполные окисления, и они были хорошо установлены на протяжении продолжительного времени в пищевой и химической промышленности, в частности, в производстве уксуса и Ь-сорбозы. Полезным продуктом, который, как известно, получают из неполных окислений Όсорбита или Ь-сорбозы с использованием штаммов, принадлежащих к роду С1исоиоЬас1ег является 2КСА.

Уксуснокислые бактерии выполняют эти реакции неполного окисления при помощи различных дегидрогеназ, локализованных в периплазматическом пространстве, на периплазматической мембране, а также в цитоплазме. Различные кофакторы используются этими различными дегидрогеназами, причем наиболее обычными являются РОО (пирролохинолинхинол) и РАО (флавинадениндинуклеотид) для мембраносвязанных или периплазматических ферментов и ХАЭ/ХАЭР (НАД/НАДФ) для цитоплазматических ферментов.

Хотя все продукты этих реакций окисления диффундируют обратно во внешнюю водную среду через наружную мембрану, некоторые из них могут пассивно или активно транспортироваться в клетку и дополнительно использоваться в метаболических путях, ответственных за рост и образование энергии. Внутри клетки окисленные продукты могут много раз восстанавливаться обратно в их исходный субстрат редуктазами и затем переноситься обратно в центральный метаболизм.

Белки, в частности, ферменты и транспортеры, которые являются активными в метаболизации Эсорбита или Ь-сорбозы, называются здесь участвующими в системе метаболизации сорбита/сорбозы. Такие белки сокращенно называют белками 8М8, и они функционируют в прямой метаболизации Эсорбита или Ь-сорбозы.

Метаболизация Ώ-сорбита или Ь-сорбозы включает в себя, с одной стороны, ассимиляцию этих соединений в цитозоле и последующее превращение в метаболиты, используемые для таких путей ассимиляции, как путь Эмбдена-Мейергофа-Парнаса, пентозофосфатный путь, путь Энтнера-Дудорова и цикл трикарбоновых кислот, все из которых участвуют во всех образующих жизненную энергию и анаболических реакциях, необходимых для роста и поддержания живых клеток. С другой стороны, метаболизация Э-сорбита или Ь-сорбозы включает в себя также превращение этих соединений в дополнительные окисленные продукты, такие как Ь-сорбозон, 2-КСА и витамин С так называемыми процессами неполного окисления.

Раскрытие изобретения

Целью этого изобретения является улучшение выходов и/или продуктивности получения Витамина С и/или 2-КСА.

Неожиданно, теперь было показано, что белки 8М8 или субъединицы таких белков, которые имеют активность в отношении ассимиляции или превращения Ώ-сорбита, Ь-сорбозы или Ь-сорбозона или которые участвуют в ассимиляции или превращении Ώ-сорбита, Ь-сорбозы или Ь-сорбозона, играют важную роль в биотехнологическом получении Витамина С и/или 2-КСА.

В одном варианте осуществления белки 8М8 данного изобретения выбраны из оксидоредуктаз [ЕС 1], предпочтительно оксидоредуктаз, действующих на группу СН-ОН доноров [ЕС 1.1], более предпочтительно оксидоредуктаз с ХАЭ' или ХАЭР' в качестве акцептора [ЕС 1.1.1] и оксидоредуктаз с другими акцепторами [ЕС 1.1.99], наиболее предпочтительно выбраны из оксидоредуктаз, принадлежащих к классам ферментов [ЕС 1.1.1.1], [ЕС 1.1.1.15] или [ЕС 1.2.1.-], или предпочтительно оксидоредуктаз, действующих на альдегидную группу или оксогруппу доноров [ЕС 1.2], более предпочтительно оксидоредуктаз с ХАЭ' или ХАЭР' в качестве акцептора [ЕС 1.2.1].

Кроме того, белки 8М8 этого изобретения могут быть выбраны из группы, состоящей из мембраносвязанной РОО-зависимой Ώ-сорбитолдегидрогеназы, мембраносвязанной Ь-сорбозодегидрогеназы, мембраносвязанной Ь-сорбозондегидрогеназы, мембраносвязанной РАО-зависимой Эсорбитолдегидрогеназы, цитозольной ΝΛΟ-зависимой О-сорбитолдегидрогеназы, ХАО(Р)-зависимой Эсорбитолдегидрогеназы, (также называемой ХАОРН-зависимой сорбозоредуктазой), ΝΛΟ-зависимой ксилитолдегидрогеназы, ХАЭ-зависимой алкогольдегидрогеназы, мембраносвязанной Ьсорбозодегидрогеназы, ХАО(Р)Н-зависимой Ь-сорбозоредуктазы, цитозольной ХАЭР-зависимой сорбозондегидрогеназы, цитозольной ХАО(Р)Н-зависимой Ь-сорбозонредуктазы, мембраносвязанной альдегиддегидрогеназы, цитозольной альдегиддегидрогеназы, глицерол-3-фосфатдегидрогеназы, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и других участвующих в 8М8 белков, включающих в себя белки, участвующие в регуляции генов, кодирующих эти ферменты, такие как факторы транскрипции, в частности, репрессоры.

В частности, теперь было обнаружено, что белки 8М8, кодируемые полинуклеотидами, имеющими нуклеотидную последовательность, которая гибридизуется предпочтительно при условиях высокой строгости с последовательностью, показанной в 8ЕЦ 10 N0:1, играют важную роль в биотехнологическом получении Витамина С и/или 2-КСА. Было также обнаружено, что посредством генетического измене

- 2 013412 ния уровня экспрессии нуклеотидов в соответствии с этим изобретеним в микроорганизме, способном прямо продуцировать витамин С, таком как, например, С1исопоЬас1сг. прямое ферментирование витамина С и/или 2-КСА указанным микроорганизмом может быть даже в сильной степени улучшено.

Таким образом, это изобретение относится к полинуклеотиду, выбранному из группы, состоящей из:

(a) полинуклеотидов, кодирующих полипептид, содержащий аминокислотную последовательность в соответствии с 8ЕЦ ΙΌ N0:2;

(b) полинуклеотидов, содержащих нуклеотидную последовательность в соответствии с 8ЕЦ ΙΌ N0:1;

(c) полинуклеотидов, содержащих нуклеотидную последовательность, получаемую амплификацией нуклеиновой кислоты, например, полимеразной цепной реакцией, с использованием геномной ДНК из микроорганизма в качестве матрицы и набора праймеров в соответствии с 8ЕЦ ΙΌ N0:3 и 8ЕЦ ΙΌ N0:4;

(ά) полинуклеотидов, содержащих нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент или производное полипептида, кодируемого полинуклеотидом любого из (а)-(с), где в указанном производном один или несколько аминокислотных остатков консервативно заменены в сравнении с указанным полипептидом, и указанный фрагмент или указанное производное имеет активность регулятора транскрипции, предпочтительно репрессора Ь-сорбозодегидрогеназы (8ΌΗ) и/или Ь-сорбозондегидрогеназы (§N04) (8М8 27);

(е) полинуклеотидов, комплементарная цепь которых гибридизуется при условиях строгой гибридизации с полинуклеотидом, определенным в одном из (а)-(ф, и которые кодируют регулятор транскрипции, предпочтительно репрессор Ь-сорбозодегидрогеназы (8ΌΗ) и/или Ь-сорбозондегидрогеназы (8X1)11) (§М§ 27); и (1) полинуклеотидов, которые по меньшей мере на 60%, например 70, 85, 90 или 95%, идентичны полинуклеотиду, определенному в любом из (а)-(ф, и которые кодируют регулятор транскрипции, предпочтительно репрессор Ь-сорбозодегидрогеназы (8ΌΗ) и/или Ь-сорбозондегидрогеназы (§N04) (8М8 27);

или комплементарной цепи такого полинуклеотида.

Было обнаружено, что белок §М§, выделенный из 01исопоЬас!ет охуйапк ΙΤ0 3293, показанный в 8Е0 ΙΌ N0:2 и описанный здесь, является особенно полезным белком §М§, так как он, по-видимому, выполняет решающую функцию в прямом получении витамина С в микроорганизмах, в частности, в бактериях, таких как уксуснокислые бактерии, такие как О1исопоЬас!ет, Асе!оЬас!ет и О1исопасе!оЬас!ет. Таким образом, это изобретение относится к полинуклеотиду, кодирующему полипептид в соответствии с 8Е0 ΙΌ N0:2. Этот белок может кодироваться нуклеотидной последовательностью, показанной в 8ЕЦ ΙΌ N0:1. Таким образом, это изобретение относится также к полинуклеотидам, содержащим нуклеотидную последовательность в соответствии с 8ЕЦ ΙΌ N0:1.

Нуклеотидная и аминокислотная последовательности, определенные выше, использовали в качестве «запрашиваемой последовательности» для выполнения поиска с программой В1аь(2 (версией 2 или ВЬА8Т из национального Центра биологической информации [ЫСВГ| в отношении базы данных РК.0 8^-8^15&Рго! (полной версии плюс инкрементальных модификаций). Из этих поисков полинуклеотид §М§ 27 в соответствии с 8ЕЦ ΙΌ N0:1 был аннотирован как полинуклеотид, кодирующий регулятор транскрипции, относящийся к семейству ТеЖ/АстК Этот белок, кодируемый 8ЕЦ ΙΌ N0:2, действует как репрессор посредством связывания с промоторным районом соответствующих генов, в том числе генов, кодирующих Ь-сорбозодегидрогеназу (8ΌΗ), таких как, например, ген, показанный в 8ЕЦ ΙΌ N0:11, кодирующий белок, показанный в 8ЕЦ ΙΌ N0:12, Ь-сорбозондегидрогеназу (8N^Η), таких как, например, ген, показанный в 8ЕЦ ΙΌ N0:13, кодирующий белок, показанный в 8ЕЦ ΙΌ N0:14, и экспортер Ь-сорбазона, такой как, например, ген, показанный в 8ЕЦ ΙΌ N0:15, кодирующий белок, показанный в 8ЕО ΙΌ N0:16.

Нуклеиновая кислота в соответствии с этим изобретением может быть получена амплификацией нуклеиновой кислоты с использованием кДНК, мРНК или, альтернативно, геномной ДНК в качестве матрицы и подходящих олигонуклеотидных праймеров, таких как нуклеотидные праймеры в соответствии с 8ЕЦ ΙΌ N0:3 и 8ЕЦ ΙΌ N0:4, в соответствии со стандартными способами ПЦР-амплификации. Амплифицированная таким образом нуклеиновая кислота может быть клонирована в подходящий вектор и охарактеризована анализом ДНК-последовательности.

Матрицей для этой реакции может быть кДНК, полученная обратной транскрипцией мРНК, полученной из штаммов, о которых известно или в отношении которых предполагают, что они содержат полинуклеотид в соответствии с данным изобретением. Продукт ПЦР может быть субклонирован и секвенирован для гарантии, что амплифицированные последовательности представляют последовательности нуклеиновых кислот, описанные здесь, или их функциональный эквивалент.

Этот ПЦР-фрагмент может быть затем использован для выделения клона полноразмерной ДНК различными способами. Например, этот амплифицированный фрагмент может быть помечен и использован для скрининга библиотеки кДНК бактериофага или космиды. Альтернативно, этот меченый фрагмент может быть использован для скрининга геномной библиотеки.

- 3 013412

Таким образом, это изобретение относится к полинуклеотидам, содержащим нуклеотидную последовательность, получаемую амплификацией нуклеиновых кислот, например, полимеразной цепной реакцией, с использованием ДНК, такой как геномная ДНК из микроорганизма, в качестве матрицы и набора праймеров в соответствии с БЕО ΙΌ N0:3 и БЕО ΙΌ N0:4.

Это изобретение относится также к полинуклеотидам, содержащим нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент или производное, кодируемые полинуклеотидом, описанным здесь, где в указанном производном один или несколько аминокислотных остатков консервативно заменены в сравнении с указанным полипептидом, и указанный фрагмент или указанное производное имеет активность полипептида БМБ, предпочтительно полипептида БМБ 27.

Это изобретение относится также к полинуклеотидам, комплементарная цепь которых гибридизуется при строгих условиях с полинуклеотидом, определенным здесь, и которые кодируют полипептид БМБ, предпочтительно полипептид БМБ 27.

Это изобретение относится также к полинуклеотидам, которые по меньшей мере на 60% идентичны полинуклеотиду, определенному здесь, и которые кодируют полипептид БМБ; и это изобретение относится также к полинуклеотидам, являющимся комплементарной цепью полинуклеотида, описанного здесь выше.

Это изобретение относится также к праймерам, зондам и фрагментам, которые могут быть использованы для амплификации или детектирования ДНК по данному изобретению и для идентификации родственных видов или семейств микроорганизмов, также несущих такие гены.

Это изобретение относится также к векторам, которые включают в себя полинуклеотиды этого изобретения, и микроорганизмам, которые сконструированы генетически с этими полинуклеотидами или указанными векторами.

Это изобретение относится также к способам получения микроорганизмов, способных экспрессировать полипептид, кодируемый определенным выше полинуклеотидом, и полипептиду, кодируемому определенным выше полинуклеотидом.

Это изобретение относится также к микроорганизмам, в которых активность полипептида БМБ, предпочтительно полипептида БМБ 27, уменьшена или устранена, так что выход Витамина С и/или 2КОЛ, которые прямо продуцируются из Ό-сорбита или Ь-сорбозы, является увеличенным.

Квалифицированному в данной области специалисту будет известно, как уменьшить или устранить активность белка БМБ, предпочтительно белка БМБ 27. Это может быть, например, выполнено либо генетической модификацией организма-хозяина таким образом, что он продуцирует меньше копий или не продуцирует копии белка БМБ, предпочтительно белка БМБ 27, в сравнении с организмом дикого типа, или устранением специфической активности белка БМБ, предпочтительно белка БМБ 27.

В следующем описании подробно описаны процедуры для достижения этой задачи, т.е. увеличения выхода и/или продукции Витамина С, который образуется непосредственно из Ό-сорбита или Ь-сорбозы, уменьшением или устранением активности белка БМБ 27. Эти процедуры применимы ши1аЙ5 ши1апй15 (с соответствующими изменениями) для других белков БМБ.

Модификации с целью получения организма, продуцирующего меньше копий или не продуцирующего копий гена БМБ 27 и/или белка могут включать в себя применение слабого промотора или мутации (например, инсерции, делеции или точковой мутации) (частей) гена БМБ 27 или его регуляторных элементов. Уменьшение или элиминация специфической активности белка БМБ 27 могут быть также выполнены способами, известными в данной области. Такие способы могут включать в себя мутацию (например, инсерцию, делецию или точковую мутацию) (частей) гена БМБ 27. Это может, например, влиять на взаимодействие с ДНК, которое опосредовано Ν-концевым районом БМБ 27, или взаимодействие с другими эффекторными молекулами.

В данной области известны также способы уменьшения или устранения активности данного белка контактированием белка БМБ 27 со специфическими ингибиторами или другими веществами, которые специфически взаимодействуют с белком БМБ 27. Для идентификации таких специфических ингибиторов белок БМБ 27 может экспрессироваться и тестироваться на активность в присутствии соединений, которые предположительно ингибируют активность белка БМБ 27. Потенциально ингибирующие соединения могут быть, например, моноклональными или поликлональными антителами против белка БМБ 27. Такие антитела могут быть получены рутинными протоколами иммунизации подходящих лабораторных животных.

Это изобретение может быть выполнено в любом микроорганизме или с любым микроорганизмом, несущим ген БМБ 27 или его эквивалент или гомолог. Подходящие микроорганизмы могут быть выбраны из бактерий, либо в виде штаммов дикого типа, мутантных штаммов, произведенных классическими способами мутагенеза и отбора, либо в виде рекомбинантных штаммов. Примерами таких бактерий могут быть, например, О1исопоЬас1ег, О1исопасе1оЬас1ег, ЛесЮЬае1сг. Ке1оди1оп1С1дешит, РаШоеа, РЫхоЬшт. Бшойп/оЬшт, такой как, например, БшогЫхоЬшт тей1ой, ВтайугЫ/оЬшт, такой как, например, ВгайугЫхоЬшт (арошсит, Во8еоЬас1ег, Калоша, Ркеийотопак, такой как, например, Ркеийотопак риййа, и ЕксйейсЫа, такая как, например, ЕксйейсЫа сой. Предпочтительными являются О1исопоЬас1ег или Лсе1оЬас1ег асей, такие как, например, О. охуйапк, О. сеппик, О. 1га1еиш, А. асей киЬкр. хуйпит или

- 4 013412

А. асеб киЬкр. ог1еапик, предпочтительно С. охубапк ΙΕΟ 3293, и их производные, несущие гены, участвующие в путях образования Витамина С, и смежные районы, в которых могут быть локализованы ген 8М8 27 или его эквивалент.

Микроорганизмы, которые могут быть использованы для данного изобретения, могут быть публично доступны из различных источников, например, ОеШксйе 8атт1цпд νοη М1кгоогдашктеп ипб 2е11ки11игеп (Ό8ΜΖ), Макскегобег Аед 1В, Ό-38124 Втаипкскете1д, Сегтапу, Атепсап Туре Сикиге Собесбоп (АТСС), Р.О. Вох 1549, Мапаккак, УА 20108 И8А или СиИшс Собесбоп ОМкюп, ΝΙΤΕ Вю1одюа1 Рекоигсе Сеп1ет, 2-5-8, Кахикаката1ап. Кткагахи-кЫ. СЫЬа, 292-0818, 1арап (ранее: 1пк1Ил1е £от Ееттеп1абоп, Окака (ΙΡΟ), 17-85, 1ико-коптаск1 2-скоте,Уободаета-ки, Окака 532-8686, 1арап). Примерами предпочтительных бактерий, депонированных ΙΕΟ, являются, например, С1исопоЬас1ет охубапк (ранее известный как С. те1аподепик) ΙΕΟ 3293, С1исопоЬас1ет охубапк (ранее известный как С. те1аподепик) ΙΕΟ 3292, С1исопоЬас1ет охубапк (ранее известный как ак С. тиЫдшокик) ΙΕΟ 3244, С1исопоЬас1ет 1га1еиш (ранее известный как С, шбикбшк) ΙΕΟ 3260, С1исопоЬас1ет себпик ΙΕΟ 3266, С1исопоЬас1ет охубапк ΙΕΟ 3287, и Асе1оЬас1ет асеб киЬкр. ог1еапик ΙΕΟ 3259, которые, все, были депонированы 05 апреля 1954 г.; Асе1оЬас1ет асеб киЬкр. хубпит ΙΕΟ 13693, депонированный 22 октября 1975 г., и Асе1оЬас1ет асеб киЬкр. хубпит ΙΕΟ 13773, депонированный 08 декабря 1977 г. Штамм Асе1оЬас1ет кр. АТСС 15164, который также является примером предпочтительной бактерии, был депонирован АТСС.

Микроорганизм данного изобретения может нести дополнительные модификации либо на уровне ДНК, либо на уровне белка (см. выше), пока такая модификация не оказывает прямого действия на выход, продуктивность и/или эффективность прямого получения витамина С и/или 2-КСА из таких субстратов, как, например, Ό-сорбит или Ь-сорбоза. Такие дополнительные модификации могут, например, влиять на другие гены, кодирующие белки 8М84, описанные выше, в частности, гены, кодирующие мембраносвязанные Ь-сорбозондегидрогеназы, такие как Ь-сорбозондегидрогеназа δΝΟΗπί, мембраносвязанные РОО-связанные Ό-сорбитолдегидрогеназы, и/или другие гены, кодирующие белки, участвующие в транспорте сахаров и/или сахароспиртов, такие как, например, экспортеры, в частности, экспортеры сорбозона, предпочтительно ген, показанный в 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ:15. Способы выполнения таких модификаций известны в данной области, с некоторыми примерами, дополнительно описанными здесь. В отношении использования 8ΝΌΗηί для прямого получения витамина С, а также его нуклеотидной и аминокислотной последовательности авторы ссылаются на ΑΟ 2005/017159, который включен здесь в качестве ссылки.

Согласно следующему предмету данного изобретения обеспечено применение определенного выше полинуклеотида или микроорганизма, который генетически сконструирован с использованием таких полинуклеотидов, в получении витамина С и/или 2-КСА.

Данное изобретение относится также к способам экспрессии эндогенных генов в микроорганизме, к способам продуцирования полипептидов, определенных выше, в микроорганизме и к способам получения микроорганизмов, способных продуцировать витамин С и/или 2-КСА. Все эти способы могут предусматривать стадию изменения микроорганизма, где «изменение» включает в себя, в данном контексте, способ «генетического изменения» или «изменения состава клеточных культуральных сред и/или способов, используемых для культивирования», таким образом, что выход и/или продуктивность продукта ферментации могут быть улучшены в сравнении с организмом дикого типа. В данном контексте, «улучшенный выход витамина С» обозначает увеличение по меньшей мере на 5, 10, 25, 30, 40, 50, 75, 100, 200% или даже более, чем 500%, в сравнении с микроорганизмом дикого типа, т.е. микроорганизмом, который не был генетически изменен.

Термин «генетически сконструирован» или «генетически изменен» обозначает научное изменение структуры генетического материала в живом организме. Оно включает в себя образование и применение рекомбинантной ДНК. Более конкретно, такое изменение используют для трансдифференцировки генетически сконструированного или модифицированного организма из природно-встречающегося организма. Генетическая инженерия может выполняться рядом способов, известных в данной области, таких как, например, замена генов, амплификация генов, разрушение генов, трансфекция, трансформация с использованием плазмид, вирусов или других векторов. Генетически модифицированный организм, например, генетически модифицированный микроорганизм часто называют также рекомбинантым организмом, например, рекомбинантным микроорганизмом.

Согласно еще одному аспекту этого изобретения обеспечен способ получения витамина С и/или 2КСА прямой ферментацией.

Несколько субстратов могут быть использованы в качестве источника углерода в способе данного изобретения, т.е. способе прямого превращения рассматриваемого субстрата в витамин С, например, способе, упомянутом выше. Особенно подходящими источниками углерода являются источники, которые могут быть легко получены из пути метаболизации Ό-глюкозы или Ό-сорбита, такие как, например, Ό-глюкоза, Ό-сорбит, Ь-сорбоза, Ь-сорбозон, 2-кето-Ь-гулонат, Ό-глюконат, 2-кето-О-глюконат или 2,5дикетоглюконат. Предпочтительно этот субстрат выбран, например, из Ό-глюкозы, Ό-сорбита, Ьсорбозы или Ь-сорбозона, более предпочтительно из Ό-глюкозы, Ό-сорбита или Ь-сорбозы, и наиболее предпочтительно из Ό-сорбита, Ь-сорбозы или Ь-сорбозона. Термин «субстрат» и «продукционный суб

- 5 013412 страт» в связи с вышеуказанным способом, использующим микроорганизм, используется взаимозаменяемо.

Средой, используемой для вышеуказанного способа, использующего микроорганизм, может быть любая среда для получения витамина С и/или 2-КСЛ. Обычно этой средой является водная среда, содержащая, например, соли, субстрат (субстраты) и имеющая определенный рН. Среду, в которой этот субстрат превращается в витамин С и/или 2-КОЛ, также называют продукционной средой.

«Ферментация» или «продуцирование» или «ферментационный способ», в данном контексте, может быть применением растущих клеток с использованием сред, условий и процедур, известных квалифицированному специалисту, или применением нерастущих, так называемых покоящихся клеток, после того как их культивировали с использованием сред, условий и процедур, известных квалифицированному специалисту, при подходящих условиях для превращения подходящих субстратов в желаемые продукты, такие как витамин С и/или 2-КОЛ. Предпочтительно для получения витамина С используют покоящиеся клетки. Пример такого способа получения витамина С описан в \УО 2005/017159 (включенном здесь в качестве ссылки). Предпочтительно 2-КОЛ получают с использованием растущих клеток (см., например, ЕР 0518136 В1).

Термин «прямая ферментация», «прямое продуцирование», «прямое превращение» и т.п. предназначен для обозначения того, что микроорганизм способен превращать определенный субстрат в указанный продукт посредством одной или нескольких стадий биологического превращения, без необходимости какой-либо химической стадии превращения. Например, термин «прямое превращение Ό-сорбита в витамин С» предназначен для описания способа, в котором микроорганизм продуцирует витамин С и в котором Ό-сорбит предоставляется в качестве источника углерода без необходимости промежуточной стадии химического превращения. Предпочтительным является единственный микроорганизм, способный прямо ферментировать витамин С. Указанный микроорганизм культивируют в условиях, которые делают возможным такое превращение из субстрата, определенного выше.

В связи с вышеуказанным способом с использованием микроорганизма понятно, что вышеуказанные микроорганизмы также включают в себя синонимы и базонимы таких видов, имеющие одни и те же физиологические свойства, как определено Международным Кодом Номенклатуры Прокариот. Номенклатура микроорганизмов, используемая здесь, является номенклатурой, официально признанной (на дату заявки приоритета) 1п!егпа!юиа1 СоттШсс оп ЗуЧстабех о£ Ргокагуо1е§ аиб 1Нс Вас1спо1оду аиб Лррйсб МюгоЬю1оду Э|\35юп о£ 111с 1п1сгпа1юпа1 Ишоп о£ МюгоЬю1ощса1 8ос1сбс5, и опубликована его официальным печатным изданием 1п!ста1юпа1 1оигпа1 о£ ЗуЧстабс апб ЕуокШопагу МюгоЬю1оду (Н8ЕМ). Приводится конкретная ссылка на игЬапсс с1 а1., Н8ЕМ (2001) уо1 51:1059-1070, с корректирующим сообщением в Н8ЕМ (2001) уо1 51:1231-1233, описывающим таксономически измененную классификацию О. охубапк Э8М 4025 как Кс1оди1ошсщспшт уи1дагс.

В данном контексте покоящимися клетками называют клетки микроорганизма, которые, например, являются жизнеспособными, но не растущими активно, или клетки микроорганизма, которые растут при низких скоростях видового роста, например, при скоростях роста, которые являются более низкими, чем 0,02 ч^-1, предпочтительно более низкими, чем 0,01 ч^-1. Клетки, которые обнаруживают вышеуказанные скорости роста, называют клетками, находящимися в «режиме покоящихся клеток».

Описанный выше способ данного изобретения с использованием микроорганизма может выполняться в различных стадиях или фазах: предпочтительно этот микроорганизм культивируют в первой стадии (также называемой стадией (а) или фазой роста) в условиях, позволяющих рост. Эта фаза заканчивается изменением условий, так что скорость роста этого микроорганизма уменьшается, приводя к покоящимся клеткам, причем эту стадию называют также стадией (Ь), с последующим продуцированием Витамина С из субстрата с использованием (Ь), также называемой продукционной фазой.

Стадия роста и продукционная фаза, выполняемые в вышеуказанном способе с использованием микроорганизма, могут выполняться в одном и том же сосуде, т. е. только в одном сосуде или в двух и более различных сосудах с необязательной стадией разделения между этими двумя фазами. Полученный витамин С может быть извлечен из клеток любым подходящим способом. Способом извлечения является, например, способ, заключающийся в том, что продуцированный витамин С может быть выделен из продукционной среды. Необязательно полученный таким образом витамин С может быть дополнительно обработан.

Для цели данного изобретения, относящегося к вышеуказанному способу с использованием микроорганизма, термины «фаза роста», «стадия выращивания», «стадия роста» и «период роста» используются здесь взаимозаменяемо. То же самое относится к терминам «продукционная фаза», «продукционная стадия», «продукционный период».

Одним путем выполнения вышеуказанного способа с использованием микроорганизма, описанного в данном изобретении, может быть способ, в котором этот микроорганизм выращивают в первом сосуде, так называемом сосуде для роста, в качестве источника для покоящихся клеток и по меньшей мере часть этих клеток переносят во второй сосуд, так называемый продукционный сосуд. Условия в продукционном сосуде могут быть такими, что перенесенные из сосуда для роста клетки становятся покоящимися клетками, определенными выше. Витамин С продуцируют во втором сосуде и извлекают из него.

- 6 013412

В связи с описанным выше способом с использованием микроорганизма в одном аспекте стадия выращивания может выполняться в водной среде, т.е. среде для выращивания, дополненной подходящими питательными веществами для роста при анаэробных условиях. Культивирование может проводиться, например, в периодическом режиме, периодическом режиме с подпиткой, полунепрерывном или непрерывном режиме. Период культивирования может варьироваться в зависимости, например, от хозяина, рН, температуры и питательной среды, которые должны использоваться, и могут быть, например, приблизительно 10 ч - приблизительно 10 дней, предпочтительно приблизительно 1 день - приблизительно 10 дней, более предпочтительно приблизительно 1 день - приблизительно 5 дней при проведении культивирования в периодическом режиме или периодическом режиме с подпиткой, в зависимости от микроорганизма. Если клетки выращивают в непрерывном режиме, время пребывания в сосуде может быть, например, приблизительно 2 - приблизительно 100 ч, предпочтительно приблизительно 2 ч - приблизительно 50 ч, в зависимости от микроорганизма. Если микроорганизм выбран из бактерий, культивирование может проводиться, например, при рН приблизительно 3,0 - приблизительно 9,0, предпочтительно приблизительно 4,0 - приблизительно 9,0, более предпочтительно приблизительно 4,0 - приблизительно 8,0, даже более предпочтительно приблизительно 5,0 - приблизительно 8,0. При использовании водорослей или грибов культивирование может проводиться, например при рН ниже приблизительно 7,0, предпочтительно ниже приблизительно 6,0, более предпочтительно ниже приблизительно 5,5 и наиболее предпочтительно ниже приблизительно 5,0. Подходящий диапазон температур для проведения культивирования с использованием бактерий может быть, например, приблизительно 13 °С - приблизительно 40°С, предпочтительно приблизительно 18°С - приблизительно 37°С, более предпочтительно приблизительно 13°С - приблизительно 36°С и наиболее предпочтительно приблизительно 18°С -приблизительно 33°С. При использовании водорослей или дрожжей подходящий диапазон температур для проведения культивирования может быть, например, приблизительно 15°С - приблизительно 40°С, предпочтительно приблизительно 20°С - приблизительно 45°С, более предпочтительно приблизительно 25°С приблизительно 40°С, даже более предпочтительно приблизительно 25°С - приблизительно 38°С и наиболее предпочтительно приблизительно 30°С - приблизительно 38°С. Культуральная среда для выращивания обычно может содержать такие питательные вещества, как ассимилируемые источники углерода, например, глицерин, Ό-маннит, Ό-сорбит, Ь-сорбоза, эритрит, рибит, ксилит, арабит, инозит, дульцит, Ό-рибоза, Όфруктоза, Ό-глюкоза, сахароза и этанол, предпочтительно Ь-сорбоза, Ό-глюкоза, Ό-сорбит, Ό-маннит, глицерин и этанол; и перевариваемые источники азота, такие как органические вещества, например, пептон, дрожжевой экстракт и аминокислоты. Среды могут содержать или могут не содержать мочевину, и/или жидкий кукурузный экстракт и/или хлебопекарные дрожжи. В качестве источников азота могут быть использованы различные неорганические вещества, например, нитраты и соли аммония. Кроме того, среда для выращивания может обычно содержать неорганические соли, например, сульфат магния, сульфат марганца, фосфат калия и карбонат кальция. Клетки, полученные с использованием описанных выше процедур, могут затем дополнительно инкубироваться по существу при тех же самых режимах, температурных условиях и рН, какие описаны выше, в присутствии таких субстратов, как Ό-сорбит, Ьсорбоза или Ό-глюкоза, таким образом, что они превращают эти субстраты непосредственно в Витамин С и/или 2-КСА. Инкубирование может выполняться в богатой азотом среде, содержащей, например, источники органического азота, например, пептон, дрожжевой экстракт, хлебопекарные дрожжи, мочевину, аминокислоты и жидкий кукурузный экстракт, или неорганические источники азота, например, нитраты и соли аммония, и в этом случае клетки будут способны расти далее, продуцируя Витамин С и/или 2-КОА. Альтернативно, инкубирование может выполняться в бедной азотом среде, и в этом случае клетки по существу не будут расти и будут находиться в режиме покоящихся клеток, или режиме биотрансформации. Во всех случаях, инкубационная среда может также содержать неорганические соли, например, сульфат магния, сульфат марганца, фосфат калия и хлорид кальция.

В связи с вышеуказанным способом с использованием микроорганизма в фазе роста конкретные скорости роста равны, например, по меньшей мере 0,02 ч^-1. Для клеток, растущих в периодическом, периодическом с подпиткой или полунепрерывном режиме, скорость роста зависит, например, от состава среды для выращивания, рН, температуры и т.п. Обычно скорости роста могут быть, например, в диапазоне приблизительно 0,05 -приблизительно 0,2 ч^-1, предпочтительно приблизительно 0,06 - приблизительно 0,15 ч^-1, и наиболее предпочтительно приблизительно 0,07 - приблизительно 0,13 ч^-1 .

В другом аспекте вышеуказанного способа с использованием микроорганизма покоящиеся клетки могут быть обеспечены культивированием соответствующего микроорганизма на чашках с агаром, служащих таким образом в качестве сосуда для выращивания, с использованием по существу тех же самых условий, например, периода культивирования, рН, температуры, питательной среды, что и описанные выше, с добавлением агара.

В связи с вышеуказанным сцособом с использованием микроорганизма, если фазу роста и продукционную фазу выполняют в двух отдельных сосудах, то клетки из фазы роста могут быть собраны или сконцентрированы и перенесены во второй сосуд, так называемый продукционный сосуд. Этот сосуд может содержать водную среду, дополненную любым применимым продукционным субстратом, который может быть превращен в витамин С этими клетками. Клетки из сосуда для роста могут быть собра

- 7 013412 ны и сконцентрированы любой подходящей операцией, такой как, например, центрифугирование, ультрафильтрация или микрофильтрация в поперечном потоке через мембрану, фильтрация, декантация, флокуляция. Полученные таким образом клетки могут быть перенесены в продукционный сосуд в форме исходного бульона из сосуда для роста, без сбора, концентрирования или промывания, т.е. в форме суспензии клеток. В предпочтительном варианте осуществления, эти клетки переносят из сосуда для выращивания в продукционный сосуд в форме суспензии клеток без какой-либо стадии промывания или выделения между ними.

Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления вышеуказанного способа с использованием микроорганизма стадия (а) и стадия (с) способа данного изобретения, описанного выше, не разделены никакой стадией промывания и/или разделения.

В связи с вышеуказанным способом с использованием микроорганизма, если фазу роста и продукционную фазу выполняют в одном и том же сосуде, клетки могут быть выращены при подходящих условиях до желаемой плотности клеток с последующей заменой среды для выращивания продукционной средой, содержащей продукционный субстрат. Такой заменой может быть, например, подача продукционной среды в сосуд одновременно и при той же скорости, при которой отбирают или собирают супернатант из этого сосуда. Для поддерживания покоящихся клеток в этом сосуде могут быть использованы операции для рециркуляции или удерживания клеток, такие как, например, стадии рециркуляции. Такие стадии рециркуляции включают в себя, например, но не ограничиваются ими, способы, использующие центрифуги, фильтры, стадии микрофильтрации или ультрафильтрации в поперечном потоке через мембрану, мембранные реакторы, флокуляцию или иммобилизацию клеток в подходящих, пористых, непористых или полимерных матриксах. После переходной стадии сосуд подвергают условиям способа, при которых эти клетки находятся в режиме покоящихся клеток, определенном выше, а продукционный субстрат эффективно превращается в витамин С.

Водная среда в продукционном сосуде, используемая для продукционной стадии в связи с описанным выше способом, далее называемая продукционной средой, может содержать только продукционный субстрат (продукционные субстраты), подлежащие превращению в витамин С, или может содержать, например, дополнительные неорганические соли, например, хлорид натрия, хлорид кальция, сульфат магния, сульфат марганца, фосфат калия, фосфат кальция и карбонат кальция. Продукционная среда может содержать также перевариваемые источники азота, такие как, например, органические вещества, например, пептон, дрожжевой экстракт, мочевину, аминокислоты, жидкий кукурузный сироп, и неорганические вещества, например, аммиак, сульфат аммония и нитрат натрия, в таких концентрациях, что эти клетки поддерживаются в режиме покоящегося состояния, описанном выше. Эта среда может содержать или может не содержать мочевину и/или жидкий кукурузный сироп и/или хлебопекарные дрожжи. Продукционная стадия может проводиться, например, в периодическом режиме, периодическом режиме с подпиткой, полунепрерывном или непрерывном режиме. В случае периодического режима с подпиткой, полунепрерывного или непрерывного режима как клетки из сосуда для выращивания, так и продукционная среда могут подаваться непрерывно или периодически в продукционный сосуд при подходящих скоростях подачи. Альтернативно, только продукционная среда может подаваться непрерывно или периодически в продукционный сосуд, в то время как клетки, поступающие из сосуда для выращивания, переносятся сразу же в продукционный сосуд. Клетки, поступающие из сосуда для выращивания, могут быть использованы в виде суспензии клеток в продукционном сосуде или могут быть использованы, например, в виде флоккулированных или иммобилизованных клеток в любой твердой фазе, такой как пористые или полимерные матриксы. Продукционный период, определенный как период, прошедший между вхождением субстрата в продукционный сосуд и сбором супернатанта, содержащего витамин С, так называемого потока собранного продукта, может варьироваться в зависимости, например, от типа и концентрации клеток, рН, температуры и питательной среды, которые должны использоваться, и предпочтительно равен приблизительно 2 - приблизительно 100 ч. рН и температура могут отличаться от рН и температуры стадии роста, но по существу являются теми же самыми, что и рН и температура стадии роста.

В предпочтительном варианте осуществления вышеуказанного способа с использованием микроорганизма продукционную стадию проводят в непрерывном режиме, что означает, что первый подаваемый поток, содержащий клетки из сосуда роста, и второй подаваемый поток, содержащий субстрат, подают непрерывно или периодически в продукционный сосуд. Первый поток может содержать только клетки, выделенные/отделенные из продукционной среды, или суспензии клеток, приходящие из стадии роста, т.е. клетки, суспендированные в среде для выращивания, без промежуточной стадии отделения, промывания и/или выделения клеток. Второй подаваемый поток, как определено здесь, может включать в себя все другие подаваемые потоки, необходимые для операции (режима работы) продукционной стадии, например, продукционную среду, содержащую субстрат, в форме одного или нескольких различных потоков, воду для разбавления и основание для контроля рН.

В связи с вышеуказанным способом с использованием микроорганизма, когда оба потока подают непрерывно, отношение скорости подачи первого потока к скорости подачи второго потока может варьироваться между приблизительно 0,01 и приблизительно 10, предпочтительно между приблизительно 0,01 и приблизительно 5, наиболее предпочтительно между приблизительно 0,02 и приблизительно 2.

- 8 013412

Это отношение зависит от концентрации клеток и субстрата в первом и втором потоке, соответственно.

Другим путем выполнения способа, описанного выше, с использованием микроорганизма данного изобретения может быть способ с использованием определенной плотности покоящихся клеток в продукционном сосуде. Плотность клеток измеряют в виде единиц оптической плотности (оптическая плотность) при 600 нм способами, известными квалифицированному в данной области специалисту. В предпочтительном варианте осуществления плотность клеток в продукционной стадии равна по меньшей мере приблизительно 10, более предпочтительно приблизительно 10 - приблизительно 200, даже более предпочтительно приблизительно 15 - приблизительно 200, еще более предпочтительно 15 - приблизительно 120 и наиболее предпочтительно приблизительно 20 - приблизительно 120.

В связи с вышеуказанным способом с использованием микроорганизма для поддержания этих клеток в продукционном сосуде при желаемой плотности клеток во время продукционной фазы, выполняемой, например, в непрерывном или полунепрерывном режиме, могут быть использованы любые средства, известные в данной области, такие как, например, рециркуляция клеток центрифугированием, фильтрация, ультрафильтрация или микрофильтрация в поперечном потоке через мембрану, декантация, флокуляция, удерживание клеток в сосуде мембранными устройствами или иммобилизацией клеток. Кроме того, в случае выполнения продукционной стадии в непрерывном или полунепрерывном режиме и при непрерывной или периодической подаче клеток из сосуда для выращивания плотность клеток в продукционном сосуде может поддерживаться при константном уровне, например, сбором количества клеток из продукционного сосуда, соответствующего количеству клеток, подаваемому из сосуда для выращивания.

В связи с вышеуказанным способом с использованием микроорганизма, продуцированный витамин С, содержащийся в так называемом потоке собранного продукта, извлекают/собирают из продукционного сосуда. Поток собранного продукта может включать в себя, например, бесклеточный или содержащий клетки водный раствор, приходящий из продукционного сосуда, который содержит витамин С как результат превращения продукционного субстрата покоящимися клетками в продукционном сосуде. Клетки, все еще присутствующие в потоке собранного продукта, могут быть отделены от витамина С любой операцией, известной в этой области, такой как, например, фильтрация, центрифугирование, декантация, мембранная ультрафильтрация или микрофильтрация в поперечном потоке, ультрафильтрация или микрофильтрация в тангенциальном потоке или тупиковая фильтрация. После этой операции отделения клеток поток собранного продукта по существу не содержит клеток.

В дополнительном аспекте способ данного изобретения может быть комбинирован с дополнительными стадиями отделения и/или очистки полученного витамина С от других компонентов, содержащихся в потоке собранного продукта, т. е. так называемыми стадиями обработки ниже по ходу процесса. Эти стадии могут включать в себя любые средства, известные квалифицированному в данной области лицу, такие как, например, концентрирование, кристаллизация, осаждение, адсорбция, ионный обмен, электродиализ, биполярный мембранный электродиализ и/или обратный осмос. Витамин С может быть дополнительно очищен в форме свободной кислоты или любой из его известных форм солей посредством таких операций, как, например, обработка активированным углем, ионообмен, адсорбция и элюция, концентрирование, кристаллизация, фильтрация и сушка. Конкретно, первое отделение витамина С от других компонентов в потоке собранного продукта может выполняться любой комбинацией или повторением, например, следующих способов: содержащего два или три компартмента электродиализа, биполярного мембранного электродиализа, обратного осмоса или адсорбции, например, на ионообменных или неионообменных смолах. Если полученной формой витамина С является соль Ь-аскорбиновой кислоты, превращение этой формы соли в форму свободной кислоты может быть выполнено, например, биполярным мембранным электродиализом, ионообменом, хроматографическими способами с имитированным движущимся слоем и т. п. Комбинирование указанных стадий, например, электродиализа и биполярного мембранного электродиализа в одной стадии может быть также использовано, как и комбинирование указанных стадий, например, нескольких стадий ионообмена с использованием хроматографических способов с имитированным движущимся слоем. Любые из этих процедур, отдельно или в комбинации, представляют удобные средства для выделения и очистки этого продукта, т.е. витамина С. Полученный таким образом продукт может быть дополнительно выделен таким способом, как, например, концентрирование, кристаллизация, осаждение, промывание и сушка кристаллов, и/или дополнительно очищен, например, обработкой активированным углем, ионообменом и/или перекристаллизацией.

В предпочтительном варианте осуществления витамин С очищают из потока собранного продукта рядом стадий обработки ниже по ходу процесса, как описано выше, без перенесения его в неводный раствор в любой момент этой обработки, т.е. все стадии выполняют в водной среде. Такая предпочтительная процедура обработки ниже по ходу процесса может включать в себя, например, концентрирование потока собранного продукта, приходящего из продукционного сосуда, при помощи имеющего два или три компартмента электродиализа, превращение витамина С в его форме соли, присутствующей в концентрированном растворе, в его форму кислоты с использованием биполярного мембранного электродиализа и/или ионообмена, очистку такими способами, как, например, обработка активированным углем, ионообменом или неионными смолами с последующей стадией концентрирования и кристаллизации. Эти кристаллы могут быть отделены, промыты и высушены. Если необходимо, эти кристаллы могут быть

- 9 013412 опять повторно солюбилизированы в воде, обработаны активированным углем и/или ионообменными смолами и перекристаллизованы. Затем эти кристаллы могут быть отделены, промыты и высушены.

Предпочтительные варианты осуществления этого изобретения становятся очевидными из зависимых пунктов формулы изобретения. Эти и другие аспекты и варианты осуществления данного изобретения должны быть очевидными специалистам с квалификацией в данной области из приведенных здесь утверждений.

Последовательность гена, содержащая нуклеотидную последовательность в соответствии с 8ЕЦ ГО N0:1, кодирующую белок 8М8 27, определяли секвенированием геномного клона, полученного из 01цсопоЬас1ет охубапБ ΙΕ0 3293.

Данное изобретение относится также к полинуклеотиду, кодирующему по меньшей мере биологически активный фрагмент или производное полипептида 8М8 27, показанного в 8ЕЦ ГО N0:2.

В данном контексте «биологически активный фрагмент или биологически активное производное» обозначает полипептид, который сохраняет, по существу, ту же самую биологически активную функцию или активность, что и полипептид, показанный в 8ЕЦ ГО N0:2. Примерами биологической активности могут быть, например, ферментативная активность, активность передачи сигнала или реактивность антитела. Термин «та же самая биологическая функция» или «функциональный эквивалент» обозначает в данном контексте, что этот белок имеет по существу ту же самую биологическую активность, например, ферментативную активность, активность передачи сигнала, реактивность антитела, функцию регулятора транскрипции, что и полипептид, показанный в 8ЕЦ ГО N0:2.

Полипептиды и полинуклеотиды данного изобретения предпочтительно обеспечивают в выделенной форме и предпочтительно очищают до гомогенности.

Термин «выделенный» означает, что этот материал удален из его исходного окружения (например, природного окружения, если он является природно-встречающимся). Например, природновстречающийся полинуклеотид или полипептид, присутствующий в живом микроганизме, не является выделенным, но тот же самый полинуклеотид или полипептид, отделенный от нескольких или всех сосуществующих материалов в природной системе, является выделенным. Такие полинуклеотиды могли бы быть частью вектора и/или такие полинуклеотиды или полипептиды могли бы быть частью композиции и все еще быть выделенными, в том смысле, что такой вектор или композиция не являются частью их природного окружения.

Выделенным полинуклеотидом или выделенной нуклеиновой кислотой может быть ДНК или РНК, которая является непосредственно смежной с обеими из кодирующих последовательностей, с которыми она является непосредственно смежной (одной на 5'-конце и одной на З'-конце) в природновстречающемся геноме организма, из которого она получена. Таким образом, в одном варианте осуществления нуклеиновая кислота включает в себя несколько или все 5'-некодирующие (например, промотор) последовательности, которые являются непосредственно смежными с кодирующей последовательностью. Таким образом, термин «выделенный полинуклеотид» включает в себя, например, рекомбинантную ДНК, которая включена в вектор, в автономно реплицирующуюся плазмиду или вирус или в геномную ДНК прокариоты или эукариоты или которая существует в виде отдельной молекулы (например, фрагмента кДНК или геномной ДНК, полученного при помощи ПЦР или обработки рестрикционными эндонуклеазами), независимой от других последовательностей. Этот термин включает в себя также рекомбинантную ДНК, которая является частью гибридного гена, кодирующего дополнительный полипептид, которая по существу не содержит клеточного материала, вирусного материала или культуральной среды (при получении способами рекомбинантных ДНК) или химических предшественников или других материалов (при химическом синтезе). Кроме того, «выделенный фрагмент нуклеиновой кислоты» является фрагментом нуклеиновой кислоты, который не встречается в природе в виде фрагмента и не мог бы быть обнаружен в природном состоянии.

В данном контексте термины «полинуклеотид», «ген» и «рекомбинантный ген» относятся к молекулам нуклеиновых кислот, которые могут быть выделены из хромосомной ДНК, которые включают в себя открытую рамку считывания, кодирующую белок, например, белки 8М8 О. охубапБ ΙΕ0 3293. Полинуклеотид может включать в себя полинуклеотидную последовательность, показанную в 8ЕЦ ГО N0:1, или ее фрагменты и районы слева и справа от последовательностей гена, которые могут включать в себя, например, районы промотора, районы регулятора и района терминатора, важные для правильной экспрессии и стабилизации полученного из них полипептида.

Ген может включать в себя кодирующие последовательности, некодирующие последовательности, такие как, например, нетранслируемые последовательности, расположенные при 3'- и 5'-концах кодирующего района гена, и регуляторные последовательности. Кроме того, термин ген относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, определенной здесь. Кроме того, квалифицированному в данной области специалисту понятно, что могут существовать полиморфизмы ДНК-последовательности, которые приводят к изменениям в аминокислотной последовательности белков 8М8 в популяции, например, в популяции С1исопоЬас1ег охубапБ. Такой генетический полиморфизм в гене 8М8 27 может существовать среди индивидуумов в популяции вследствие природной вариации или в клетках из различных популяций. Такие природные вариации могут обычно приводить к 1-5% дисперсии в нуклеотидной после

- 10 013412 довательности гена 8М8 27. Предполагается, что любые и все подобные вариации и полученный полиморфизм аминокислот в 8М8 27 являются результатом природной вариации, которая не изменяют функциональную активность, и находятся в объеме этого изобретения.

В данном контексте предполагается, что термины «полинуклеотид» или «молекула нуклеиновой кислоты» включают в себя молекулы ДНК (например, кДНК или геномной ДНК) и молекулы РНК (например, мРНК) и аналоги ДНК или РНК, генерированные с использованием аналогов нуклеотидов. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двухцепочечной, но предпочтительно является двухцепочечной ДНК. Нуклеиновая кислота может быть синтезирована с использованием аналогов или производных олигонуклеотидов (например, инозина или фосфоротиоатных нуклеотидов). Такие олигонуклеотиды могут быть использованы, например, для получения нуклеиновых кислот, которые имеют измененные способности спаривания оснований или увеличенную устойчивость к нуклеазам.

Информация последовательности, обеспеченная здесь, не должна пониматься так узко, как информация, требующая включения ошибочно идентифицированных оснований.

Конкретные последовательности, раскрытые здесь, могут быть легко использованы для выделения полного гена из рекомбинантного или нерекомбинантного микроорганизма, способного превращать конкретный источник углерода непосредственно в витамин С и/или 2-КСА, в частности, С1исоиоЬас(ег охубаик, предпочтительно С1исоиоЬас(ег охубапк ΙΕ0 3293, который, в свою очередь, может быть легко подвергнут дополнительному анализу последовательности с идентификацией посредством этого ошибок секвенирования.

Если нет другого указания, все нуклеотидные последовательности, определенные секвенированием молекулы ДНК здесь, определяли с использованием автоматизированного ДНК-секвенатора, и все аминокислотные последовательности полипептидов, кодируемых определенными здесь молекулами ДНК, предсказывали трансляцией последовательности ДНК, определенной выше. Таким образом, как известно в этой области для любой ДНК-последовательности, определенной с использованием этого автоматизированного подхода, любая определенная здесь нуклеотидная последовательность может содержать некоторое количество ошибок. Нуклеотидные последовательности, определенные с использованием автоматизации, обычно являются по меньшей мере на приблизительно 90% идентичными, более часто по меньшей мере на приблизительно 95% - по меньшей мере приблизительно 99,9% идентичными фактической нуклеотидной последовательности секвенированной молекулы ДНК. Фактическая последовательность может быть более точно определена другими подходами, включающими в себя способы мануального секвенирования, хорошо известные в этой области. Как также известно в этой области, единственная инсерция или делеция в определенной нуклеотидной последовательности в сравнении с фактической последовательностью будет вызывать сдвиг рамки в трансляции этой нуклеотидной последовательности, так что предсказанная аминокислотная последовательность, кодируемая определенной нуклеотидной последовательностью, будет полностью отличающейся от аминокислотной последовательности, фактически кодируемой секвенированной молекулой ДНК, начинающейся с точки такой инсерции или делеции.

Специалист с квалификацией в этой области способен идентифицировать такие ошибочно идентифицированные основания и корректировать такие ошибки.

Молекула нуклеиновой кислоты в соответствии с этим изобретением может содержать только часть или фрагмент последовательности нуклеиновой кислоты, обеспеченной данным изобретением, такой как, например, последовательность, показанная в 8ЕО ΙΌ N0:1, например фрагмент, который может быть использован в качестве зонда или праймера, таких как, например, 8Е0 ΙΌ N0:3 или 8Е0 ΙΌ N0:4, или фрагмент, кодирующий часть белка в соответствии с данным изобретением. Нуклеотидная последовательность, определенная из клонирования гена 8М8 27, позволяет генерировать зонды и праймеры, предназначенные для применения в идентификации и/или клонировании других членов семейства 8М8 27, а также гомологов 8М8 27 из других видов. Зонд/праймер обычно содержит, по существу, очищенные олигонуклеотиды, которые обычно содержат район нуклеотидной последовательности, который гибридизуется предпочтительно при условиях высокой строгости по меньшей мере с приблизительно 12 или 15, предпочтительно приблизительно 18 или 20, более предпочтительно приблизительно 22 или 25, даже более предпочтительно приблизительно 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, или 75 или более последовательными нуклеотидами нуклеотидной последовательности, показанной в 8Е0 ΙΌ N0:1 или ее фрагмента или производного.

Молекула нуклеиновой кислоты, включающая в себя всю последовательность нуклеиновой кислоты или часть последовательности нуклеиновой кислоты 8Е0 ΙΌ N0:1, может быть также выделена полимеразной цепной реакцией (ПЦР) с использованием синтетических олигонуклеотидных праймеров, сконструированных на основе информации последовательности, содержащейся в ней.

Нуклеиновая кислота этого изобретения может быть амплифицирована с использованием кДНК, мРНК или альтернативно геномной ДНК в качестве матрицы и подходящих праймеров в соответствии со стандартными способами ПЦР-амплификации. Амплифицированная таким образом нуклеиновая кислота может быть клонирована в подходящий вектор и охарактеризована анализом секвенирования ДНК.

Фрагменты полинуклеотида по данному изобретению могут также включать в себя полинуклеоти

- 11 013412 ды, не кодирующие функциональные полипептиды. Такие полинуклеотиды могут функционировать в качестве зондов или праймеров для ПЦР-реакции.

Нуклеиновые кислоты в соответствии с этим изобретением, независимо от того кодируют ли они функциональные или нефункциональные полипептиды, могут быть использованы в качестве гибридизационных зондов или праймеров полимеразной цепной реакции (ПЦР). Применения молекул нуклеиновых кислот данного изобретения, которые не кодируют полипептид, имеющий активность 8М8 27, включают в себя, ш1ег а11а, (1) выделение гена, кодирующего белок данного изобретения, или его аллельных вариантов из библиотеки кДНК, например, из других организмов, чем О1исоиоЬас1ег охубаик, и (2) Нозерн-блот-анализ для детектирования экспрессии мРНК указанного белка в специфических клетках или (3) применение в усилении и/или улучшении функции или активности гомологичных генов 8М8 27 в указанных других организмах.

Зонды на основе обеспеченных здесь нуклеотидных последовательностей могут быть использованы для детектирования транскриптов или геномных последовательностей, кодирующих те же самые или гомологичные белки, например, в других организмах. Молекулы нуклеиновых кислот, соответствующие природным вариантам и гомологам ДНК не-6. охубаик ДНК 6. охубаик 8М8 27 данного изобретения, которые также включены в это изобретение, могут быть выделены на основе их гомологии с нуклеиновой кислотой С. охубаик 8М8 27, описанной здесь, с использованием ДНК С. охубаик или ее части, в качестве гибридизационного зонда в соответствии со стандартными способами гибридизации, предпочтительно при условиях гибридизации высокой строгости.

В предпочтительных вариантах осуществления этот зонд дополнительно содержит присоединенную к нему группу метки, например, эта группа метки может быть радиоактивным изотопом, флуоресцентным соединением, ферментом или кофактором фермента.

Последовательности гомологичных генов могут быть выделены, например, выполнением ПЦР с использованием двух пулов вырожденных олигонуклеотидных праймеров, сконструированных на основе нуклеотидных последовательностей, описанных здесь.

Матрицей для этой реакции может быть кДНК, полученная обратной транскрипцией мРНК, полученной из штаммов, в отношении которых известно или предполагается, что они экспрессируют полинуклеотид в соответствии с данным изобретением. Этот продукт ПЦР может быть субклонирован и секвенирован для подтверждения, что амплифицированные последовательности представляют последовательности новой последовательности нуклеиновой кислоты, описанной здесь, или ее функциональный эквивалент.

Затем этот фрагмент ПЦР может быть использован для выделения полноразмерного кДНК-клона различными известными способами. Например, этот амплифицированный фрагмент может быть помечен и использован для скрининга кДНК-библиотеки бактериофага или космиды. Альтернативно, этот меченый фрагмент может быть использован для скрининга геномной библиотеки.

Технология ПЦР может быть также использована для выделения полноразмерных кДНКпоследовательностей из других организмов. Например, РНК может быть выделена в соответствии со стандартными процедурами из подходящего клеточного или тканевого источника. Реакция обратной транскрипции может быть выполнена на этой РНК с использованием олигонуклеотидного праймера, специфического в отношении самого крайнего 5'-конца амплифицированного фрагмента для праймирования синтеза первой цепи.

Полученный гибрид РНК/ДНК может быть затем удлинен с образованием «хвоста» (например, гуанинами) с использованием стандартной реакции терминальной трансферазы, этот гибрид может быть расщеплен РНКазой Н и затем синтез второй цепи может быть праймирован (например, поли-Спраймером). Таким образом, кДНК-последовательности слева от амплифицированного фрагмента могут быть легко выделены. В отношении обзора применимых стратегий клонирования см., например, 8ашЬгоок е1 а1., кирга; и АикиЬе1 е1 а1., кирга.

Нуклеиновые кислоты, кодирующие другие члены семейства 8М8 27, которые, следовательно, имеют нуклеотидную последовательность, которая отличается от нуклеотидной последовательности 8ЕЦ 10 N0:1, находятся также в объеме этого изобретения. Кроме того, нуклеиновые кислоты, кодирующие белки 8М8 27 из разных видов, которые, следовательно, могут иметь нуклеотидную последовательность, которая отличается от нуклеотидной последовательности, показанной в 8Е0 ГО N0:1, находятся в объеме этого изобретения.

Это изобретение относится также к выделенному полинуклеотиду, гибридизуемому при строгих условиях, предпочтительно при условиях высокой строгости, с полинуклеотидом данного изобретения, таким как, например, полинуклеотид, показанный в 8Е0 ГО N0:1. Предпочтительно, такой полинуклеотид может быть получен из микроорганизма, способного превращать предоставленный источник углерода непосредственно в Витамин С, в частности, из 01исоиоЬас1ег охубаик, предпочтительно 01исоиоЬас1ег охубаик ΙΕ0 3293.

В данном контексте термин «гибридизация» предназначен для описания условий для гибридизации и промывания, при которых нуклеотидные последовательности, гомологичные друг другу по меньшей мере на приблизительно 50%, по меньшей мере на приблизительно 60%, по меньшей мере на приблизи

- 12 013412 тельно 70%, более предпочтительно по меньшей мере на приблизительно 80%, даже более предпочтительно по меньшей мере на приблизительно 85-90%, наиболее предпочтительно по меньшей мере на 95%, обычно остаются гибридизованными друг с другом.

В одном варианте осуществления нуклеиновая кислота этого изобретения является по меньшей мере на 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более гомологичной последовательности нуклеиновой кислоты, показанной в 8ЕО ΙΌ N0:1 или ее комплементу.

Предпочтительным неограничивающим примером строгих условий гибридизации является гибридизация в смеси 6х хлорид натрия/цитрат натрия (88С) при приблизительно 45°С с последующими одной или несколькими промывками в 1х 88С, 0,1% ДСН при 50°С, предпочтительно при 55°С, более предпочтительно при 60°С и еще более предпочтительно при 65°С.

Условия высокой строгости включают в себя инкубации при 42°С в течение периода нескольких дней, например 2-4 дней, с использованием меченого ДНК-зонда, например, меченого дигоксигенином (ЭЮ) ДНК-зонда, с последующими одной или несколькими промывками в 2х 88С, 0,1% ДСН при комнатной температуре и одной или несколькими промывками в 0,5х 88С, 0,1% ДСН или 0,1х 88С, 0,1 ДСН при 65-68°С. В частности, условия высокой строгости включают в себя, например, инкубацию 2 ч - 4 дня при 42°С с использованием ΌΙΟ-меченого ДНК-зонда (полученного, например, с использованием системы ΌΙΟ-мечения; Коске Ωίαβοοδίίοδ ОшЬН, 68298 Маппкет, Оегшаиу) в растворе, таком как раствор ΌίдЕакуНуЬ 8о1иИоп (Коске ΩίαβηοδΙχδ ОшЬН), содержащем или не содержащем 100 мкг/т1 ДНК спермы лосося, или в растворе, содержащем 50% формамид, 5х 88С (150 мМ №С1, 15 мМ тринатрийцитрат), 0,02% додецилсульфат натрия, 0,1% Ν-лауроилсаркозин и 2% блокирующий реагент (Коске О|;щпо5Цс5 ОтЬН), с последующим промыванием фильтров дважды в течение 5-15 мин в 2х 88С и 0,1% ДСН при комнатной температуре и затем промыванием дважды в течение 15-30 мин в 0,5х 88С и 0,1% ДСН или 0,1х 88С и 0,1% ДСН при 65-68°С.

Предпочтительно выделенная молекула нуклеиновой кислоты этого изобретения, которая гибридизуется предпочтительно при условиях высокой строгости с нуклеотидной последовательностью этого изобретения, соответствует природно-встречающейся молекуле нуклеиновой кислоты. В данном контексте «природно-встречающейся» молекулой нуклеиновой кислоты называют молекулу РНК или ДНК, имеющую нуклеотидную последовательность, которая встречается в природе (например, кодирует природный белок). В одном варианте осуществления эта нуклеиновая кислота кодирует природный белок 8М8 27 О. охубапк.

Квалифицированному специалисту будет известно, какие условия следует применить в качестве строгих условий гибридизации и условий гибридизации высокой строгости. Дополнительное руководство в отношении таких условий является доступным в этой области, например в 8атЬгоок е! а1., 1989, Мо1еси1аг С1ошпд, А ЬаЬога1огу Мапиа1, Со1б 8ргкщ НагЬог Ргекк, Ν. Υ.; и Аи8иЬе1 е! а1. (ебк.), 1995, Сиггеп! РгоЮсок ίη Мо1еси1аг Вю1оду, (1окп ^йеу & 8оп§, Ν. Υ.). Конечно, полинуклеотид, который гибридизуется только с поли (А)-последовательностью (такой как З'-концевой поли (А)-участок мРНК) или с комплементарными остатками участка Т (или и), не должен включаться в полинуклеотид этого изобретения, используемый для специфической гибридизации части нуклеиновой кислоты этого изобретения, так как такой полинуклеотид может гибридизоваться с любой молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей поли (А)-участок или его комплемент (например, практически с любым клоном двухцепочечной кДНК).

В типичном подходе могут быть подвергнуты скринингу библиотеки геномных ДНК или кДНК, сконструированные из других организмов, например микроорганизмов, способных превращать предоставленный источник углерода непосредственно в витамин С, в частности, других видов С1исопоЬас1ег.

Например, штаммы О1исопоЬас1ег могут быть подвергнуты скринингу на гомологичные полинуклеотиды при помощи блот-анализа по Саузерну и нозерн-блот-анализа. После детектирования транскриптов, гомологичных полинуклеотидам этого изобретения, могут быть сконструированы ДНКбиблиотеки из РНК, выделенных из подходящего штамма, с использованием стандартных способов, хорошо известных специалистам с квалификацией в данной области. Альтернативно, библиотека тотальной геномной ДНК может быть подвергнута скринингу с использованием зонда, гибридизуемого с полинуклеотидом в соответствии с данным изобретением.

Молекула нуклеиновой кислоты данного изобретения, такая как, например, молекула нуклеиновой кислоты, показанная в 8ЕО ΙΌ N0:1, или ее фрагмент или производное, могут быть выделены с использованием стандартных способов молекулярной биологии и информации последовательности, обеспеченной здесь. Например, с использованием всей или части последовательности нуклеиновой кислоты, показанной в 8ЕО ΙΌ N0:1, в качестве гибридизационного зонда, молекулы нуклеиновых кислот этого изобретения могут быть выделены с использованием стандартных способов гибридизации и клонирования (например, описанных в 8атЬгоок, 1., Ргккк, Е. Р., апб Машакк, Т. Мо1еси1аг С1ошпд : А ЬаЬога1огу Мапиа1. 2пб, еб., Со1б 8ргкщ НагЬог ЬаЬога1огу, Со1б 8ргкщ НагЬог ЬаЬогаФгу Ргекк, Со1б 8ргкщ НагЬог, ΝΥ, 1989).

Кроме того, олигонуклеотиды, соответствующие нуклеотидным последовательностям или гибридизуемые с нуклеотидными последовательностями этого изобретения, могут быть получены стандартными

- 13 013412 синтетическими способами, например, с использованием автоматизированного ДНК-синтезатора.

Термины «гомология» или «процентная идентичность» используются здесь взаимозаменяемо. Для цели этого изобретения здесь определено, что для определения процентной идентичности двух аминокислотных последовательностей или двух последовательностей нуклеиновых кислот, эти последовательности сопоставляют для целей оптимального сравнения (например, в последовательности первой аминокислотной последовательности или последовательности нуклеиновой кислоты могут быть введены гэпы для оптимального сопоставления со второй аминокислотной последовательностью или последовательностью нуклеиновой кислоты). Затем сравнивают аминокислотные остатки или нуклеотиды в соответствующих положениях аминокислот или нуклеотидов. Когда положение в первой последовательности занято тем же самым аминокислотным остатком или нуклеотидом, что и соответствующее положение во второй последовательности, эти молекулы являются идентичными в этом положении. Процентная идентичность между двумя последовательностями является функцией числа идентичных положений, общих для двух последовательностей (т.е. % идентичность = число идентичных положений/общее число положений (т.е. перекрывающихся положений) х 100). Предпочтительно эти две последовательности имеют одну и ту же длину.

Квалифицированному специалисту известен тот факт, что несколько различных компьютерных программ доступны для определения гомологии между двумя последовательностями. Например, сравнение последовательностей и определение процентной идентичности между двумя последовательностями может выполняться с использованием математического алгоритма. В предпочтительном варианте осуществления процентную идентичность между двумя аминокислотными последовательностями определяют при помощи алгоритма №еб1етап аиб ^ипксй (1. Μοί. ΒίοΙ. (48): 444-453 (1970)), который был включен в программу САР в пакете программ ССС (доступном в ййр://тетете.ассе1тук.сот), использующую либо матрицу В1оккот 62, либо матрицу РАМ250 и вес гэпа 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4 и вес длины 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Специалисту в данной области будет понятно, что все эти различные параметры будут давать несколько различающиеся результаты, но что общая процентная идентичность двух последовательностей не изменяется значимо при использовании различных алгоритмов.

Еще в одном варианте осуществления, процентную идентичность между двумя нуклеотидными последовательностями определяют с использованием программы САР в пакете программ ССС (доступном в ййр://тетете.ассе1тук.сот), использующей матрицу Ы^Здарбиа.СМР и вес бреши 40, 50, 60, 70 или 80 и вес длины 1, 2, 3, 4, 5 или 6. В другом варианте осуществления процентную идентичность между двумя аминокислотными или нуклеотидными последовательностями определяют с использованием алгоритма Е. Меуегк апб ^. МШет (САВЮ8, 4: 11-17 (1989), который был включен в программу АЫСЫ (версию 2.0) (доступную в 1Шр://уеда.|Ш1.спг5.Гг/Ьт/аПВп-дие55.сщ). использующую таблицу весов остатков РАМ120, штрафа за длину бреши 12 и штрафа за брешь 4.

Последовательности нуклеиновых кислот и белков данного изобретения могут быть дополнительно использованы в качестве «запрашиваемой последовательности» для выполнения поиска против публичных баз данных, например, для идентификации других членов семейства или родственных последовательностей. Такие поиски могут выполняться с использованием программ ВЬА^ТЫ и ВЬА8ТХ (версии 2.0) Айксйи1, е! а1. (1990) 1. Мо1. Βίο1. 215:403-10. Поиски нуклеотидов ВЬА8Т могут выполняться с программой ВЕА8ТЫ, оценкой = 100, длиной слова =12 для получения нуклеотидных последовательностей, гомологичных молекулам нуклеиновых кислот этого изобретения. Поиски белков ВЬА8Т могут выполняться с программой ВЬА8ТХ, оценкой = 50, длиной слова = 3 для получения аминокислотных последовательностей, гомологичных молекулам белков этого изобретения. Для получения имеющих гэпы сопоставлений для целей сравнения может быть использована Сарреб ВЬА8Т, описанная в Л115сНн1 е! а1., (1997) М.1с1е1с Ас1бк Век. 25 (17): 3389-3402. При использовании программ ВЬА8Т и Сарреб ВЬА8Т могут быть использованы параметры по умолчанию соответствующих программ (например ВЬА8ТХ и ВЬА§ТН). См. 1Шр://\\л\лу.псЫ.п1т.ш11.доу.

В другом предпочтительном варианте осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты этого изобретения содержит молекулу нуклеиновой кислоты, которая является комплементом нуклеотидной последовательности данного изобретения, такой как, например, последовательность, показанная в 8ЕО ΙΌ N0:1. Молекула нуклеиновой кислоты, которая является комплементарной нуклеотидной последовательности, описанной здесь, является молекулой нуклеиновой кислоты, которая является достаточно комплементарной нуклеотидной последовательности, показанной в 8ЕО ΙΌ N0:1, так что она может гибридизоваться с указанной нуклеотидной последовательностью с образованием стабильного дуплекса.

В следующем предпочтительном варианте осуществления, нуклеиновая кислота этого изобретения, показанная в 8ЕО ΙΌ N0:1, или ее комплемент содержит по меньшей мере одну мутацию, приводящую к продукту гена с модифицированной функцией/активностью. Эта по меньшей мере одна мутация может вводиться описанными здесь способами. В одном аспекте эта по меньшей мере одна мутация приводит к белку 8М8 27, функция которого в сравнении с копией дикого типа является полностью или частично разрушенной. Способы введения таких мутаций хорошо известны в этой области.

Термин «уменьшение» активности включает в себя, в данном контексте, уменьшение активности

- 14 013412 одного или нескольких полипептидов в продуцирующем организме, которые, в свою очередь, кодируются соответствующими описанными здесь полинуклеотидами. Имеется ряд способов, доступных в данной области, для выполнения уменьшения активности конкретного белка, в этом случае белка 8М8 27. Обычно может быть уменьшена удельная активность белка или может быть уменьшено число копий этого белка.

Для облегчения такого уменьшения может быть уменьшена копийность генов, соответствующих описанным здесь полинуклеотидам, например, недостаточной экспрессией или разрушением гена. Ген называют «недостаточно экспрессируемым», если уровень транскрипции указанного гена уменьшен в сравнении с геном дикого типа. Это может быть измерено, например, Нозерн-блот-анализом, определяющим количество мРНК как показатель экспрессии гена. В данном контексте ген является недостаточно экспрессируемым, если количество генерированной мРНК уменьшено по меньшей мере на 1, 2, 5 10, 25, 50, 75, 100, 200 или даже более чем 500%, в сравнении с количеством мРНК, генерированным из гена дикого типа. Альтернативно, может быть использован слабый промотор для регуляции экспрессии полинуклеотида. В другом варианте осуществления промотор, регуляторный район и/или сайт связывания рибосом слева от этого гена могут быть изменены для получения пониженной экспрессии. Экспрессия может быть также уменьшена уменьшением относительного полупериода существования мессенджер-РНК. В другом варианте осуществления активность самого полипептида может быть уменьшена при помощи одной или нескольких мутаций в аминокислотной последовательности полипептида, которые уменьшают активность. Например, изменение аффинности этого полипептида в отношении его соответствующего субстрата может приводить к уменьшенной активности. Подобным образом может быть уменьшен полупериод существования этого полипептида. В любом сценарии, будь это уменьшенная экспрессия гена или уменьшенная активность, уменьшение может достигаться изменением состава сред культуры клеток и/или способов, используемых для культивирования. «Уменьшенная экспрессия» или «уменьшенная активность» обозначает в данном контексте уменьшение по меньшей мере на 1, 2, 5 10, 25, 50, 75, 100, 200 или даже более, чем 500%, в сравнении с белком, полинуклеотидом, геном дикого типа; или активностью и/или концентрацией белка, присутствующего перед уменьшением этих полинуклеотидов или полипептидов. Активность белка 8М8 27 может быть также уменьшена контактированием этого белка со специфическим или общим ингибитором его активности. Термины «уменьшенная активность», «уменьшенная или устраненная активность» используются здесь взаимозаменяемо.

Другой аспект этого изобретения относится к векторам, содержащим нуклеиновую кислоту, кодирующую белок в соответствии с этим изобретением или его функциональный эквивалент или часть. В данном контексте термин «вектор» относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она была связана. Одним типом вектора является «плазмида», которая является кольцевой двухцепочечной петлей ДНК, в которую могут быть лигированы дополнительные сегменты ДНК. Другим типом вектора является вирусный вектор, в котором дополнительные сегменты ДНК могут быть лигированы в вирусный геном. Некоторые векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они введены (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальный сайт инициации репликации). Другие векторы интегрируются в геном клетки-хозяина после введения в эту клетку-хозяина, и посредством этого реплицируются вместе с геномом хозяина.

Рекомбинантные векторы этого изобретения содержат нуклеиновую кислоту этого изобретения в форме, подходящей для экспрессии этой нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине, что означает, что этот рекомбинантный экспрессирующий вектор включает в себя одну или несколько регуляторных последовательностей, выбранных на основе клеток-хозяев, подлежащих использованию для экспрессии, которые функционально связаны с последовательностью нуклеиновой кислоты, которая должна быть экспрессирована. В рекомбинантном экспрессирующем векторе «функционально связанная» означает, что представляющая интерес нуклеотидная последовательность связана с регуляторной последовательностью (регуляторными последовательностями) таким образом, что создается возможность экспрессии этой нуклеотидной последовательности (например, в системе ίη νίίΓΟ транскрипции-трансляции или в клеткехозяине, при введении этого вектора в клетку-хозяина). Термин «регуляторная последовательность» включает в себя промоторы, энхансеры и другие регуляторные элементы экспрессии (например, аттенуатор). Такие регуляторные последовательности описаны, например, в Оое66е1; Оепе Ехргеккюп Тес1по1оду: Ме11юб5 ίη Епхуто1оду 185, Лсабетю Рге§8, 8ап О|едо. СА (1990). Регуляторные последовательности включают в себя последовательности, которые управляют конститутивной или индуцируемой экспрессией нуклеотидной последовательности во многих типах клеток-хозяев, и последовательности, которые управляют экспрессией нуклеотидной последовательности только в определенной клетке-хозяине (например, тканеспецифические регуляторные последовательности). Специалистам с квалификацией в данной области будет понятно, что конструкция экспрессирующего вектора может зависеть от таких факторов, как выбор клетки-хозяина для трансформации, уровень экспрессии желаемого белка и т. д. Экспрессирующие векторы этого изобретения могут вводиться в клетки-хозяева для получения посредством этого белков или пептидов, кодируемых нуклеиновыми кислотами, описанными здесь, в том числе, но не только, мутантных белков, их фрагментов, вариантов или их функциональных эквивалентов, и слитых белков, кодируемых нуклеиновой кислотой, описанной здесь, например, белков 8М8 27, мутант

- 15 013412 ных форм белков 8М8 27, слитых белков и т.п.

Рекомбинантные экспрессирующие векторы этого изобретения могут быть сконструированы для экспрессии белков 8М8 27 в подходящем микроорганизме. Например, белок в соответствии с данным изобретением может быть экспрессирован в бактериальных клетках, таких как штаммы, принадлежащие к родам С1исоиоЬас!ег, 61исопасе!оЬас!ег или Асе!оЬас!ег. Экспрессирующие векторы, применимые в данном изобретении, включают в себя хромосомные, эписомные и произведенные из вирусов векторы, например, векторы, произведенные из бактериальных плазмид, бактериофага, и векторы, произведенные из их комбинаций, такие как векторы, произведенные из генетических элементов плазмид и бактериофагов, такие как космиды и фагмиды.

ДНК-инсерт может быть функционально связан с подходящим промотором, который может быть либо конститутивным, либо индуцируемым промотором. Квалифицированный в данной области специалист знает, как отобрать подходящие промоторы. Экспрессионные конструкции могут содержать сайты инициации, терминации транскрипции и, в транскрибируемом районе, сайт связывания рибосом для трансляции. Кодирующая часть зрелых транскриптов, экспрессируемых этими конструкциями, может предпочтительно включать в себя кодон инициации в начале и кодон терминации, подходящим образом расположенный в конце транслируемого полипептида.

Векторная ДНК может быть введена в подходящие клетки-хозяева посредством способов трансформации или трансфекции. В данном контексте термины «трансформация», «трансконъюгация», «трансфекция» обозначают различные признанные в данной области способы введения чужеродной нуклеиновой кислоты (например, ДНК) в клетку-хозяина, включающие в себя кальций-фосфатное или кальций-хлоридное соосаждение, опосредованную ДЭАЭ-декстраном трансфекцию, трансдукцию, инфекцию, липофекцию, опосредованную катионным липидом трансфекцию или электропорацию. Подходящие способы для трансформации или трансфекции клеток-хозяев могут быть найдены в 8атЬгоок, е1 а1. (кирга), Бау15 е! а1., Вакю МеШойк ίη Мо1еси1аг Вю1оду (1986) и других лабораторных руководствах.

Для идентификации и отбора клеток, которые интегрировали чужеродную ДНК в их геном, ген, который кодирует селектируемый маркер (например, устойчивости к антибиотикам), обычно вводят в клетки-хозяева вместе с представляющим интерес геном. Предпочтительные селектируемые маркеры включают в себя маркеры, которые сообщают устойчивость к лекарственным средствам, таким как канамицин, тетрациклин, ампициллин и стрептомицин. Нуклеиновую кислоту, кодирующую селектируемый маркер, предпочтительно вводят в клетку-хозяина на том же самом векторе, который кодирует белок данного изобретения, или ее можно вводить на отдельном векторе, например, суицидный вектор, который не может реплицироваться в клетках-хозяевах. Клетки, стабильно трансфицированные введенной нуклеиновой кислотой, могут быть идентифицированы отбором с лекарственным средством (например, клетки, которые включили в себя ген селектируемого маркера, будут выживать, в то время как другие клетки умирают).

Данное изобретение обеспечивает также выделенный полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, доказанную в 8Е0 ΙΌ N0:2, или аминокислотную последовательность, получаемую экспрессией полинуклеотида данного изобретения, такого как, например, полинуклеотидная последовательность, показанная в 8Е0 ΙΌ N0:1, в подходящем хозяине.

Полипептиды по данному изобретению могут содержать только консервативные замены одной или нескольких аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной 8Е0 ΙΌ N0:2, или замены, инсерции или делеции аминокислот, не являющихся незаменимыми. Таким образом, такая заменимая аминокислота является остатком, который может быть изменен в аминокислотных последовательностях, показанных в 8Е0 ΙΌ N0:2, без изменения, по существу, биологической функции. Например, предсказывается, что аминокислотные остатки, которые являются консервативными среди белков данного изобретения, являются особенно не поддающимися изменению. Кроме того, аминокислоты, консервативные среди белков по данному изобретению и других белков 8М8 27, по-видимому не поддаются изменению.

Термин «консервативная замена» обозначает замену, в которой аминокислотный остаток заменен аминокислотным остатком, имеющим сходную боковую цепь. Эти семейства известны в данной области и включают в себя аминокислоты со щелочными боковыми цепями (например, лизин, аргинин и гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин).

Как упоминалось выше, полинуклеотиды этого изобретения могут быть использованы в генетической инженерии подходящей клетки-хозяина для превращения этой клетки в лучшую и более эффективную в ферментации, например в прямом ферментационном способе для витамина С.

В соответствии с этим изобретением описана генетически сконструированная/рекомбинантно полученная клетка-хозяин (также называемая рекомбинантной клеткой или трансформированной клеткой),

- 16 013412 несущая такой модифицированный полинуклеотид, причем функция соответствующего белка значимо модифицирована в сравнении с клеткой дикого типа, так что выход, продуцирование и/или эффективность продуцирования одного или нескольких ферментационных продуктов, таких как витамин С, улучшается. Эта клетка-хозяин может быть выбрана из микроорганизмов, способных непосредственно продуцировать один или несколько ферментационных продуктов, таких как, например, витамин С, из предоставленного источника углерода, в частности, С1исопоЬас1ег охубапБ, предпочтительно О. охубапБ ΙΕ0 3293.

«Трансформированная клетка» или «рекомбинантная клетка» является клеткой, в которую (или в предка которой) была введена, при помощи способов рекомбинантных ДНК, нуклеиновая кислота в соответствии с данным изобретением, или в которой была уменьшена или устранена активность белка 8М8 27. Подходящие клетки-хозяева включают в себя клетки микроорганизмов, способные продуцировать конкретный продукт ферментации, например, превращением предоставленного источника углерода непосредственно в витамин С. В частности, они включают в себя штаммы из родов РБеиботопаБ, Рап1оеа, ЕБсбепсЫа, СотупеЬас1епит, КеЮщбошсщепцпп и уксуснокислые бактерии, такие как, например, О1исопоЬас1ет, Лсе1оЬас1ег или О1исопасе1оЬас1ет, предпочтительно Лсе1оЬас1ег Бр., Лсе1оЬас1ег асеб, О1исопоЬас1ет £га1ешй, С1нсопоЬас1ег сеппиБ, С1нсопоЬас1ег 1бабапб1сиБ, С1нсопоЬас1ег охубапБ, более предпочтительно О. охубапБ, наиболее предпочтительно О охубапБ ΙΕ0 3293.

Для улучшения продуцирования витамина С и/или 2-КОА определенной рекомбинантной клеткихозяина экспрессия гена 8М8 27 может быть ингибирована в этом организме, например, нацеливанием нуклеотидных последовательностей, комплементарных регуляторному району нуклеотидной последовательности 8М8 27 (например, промотору и/или энхансеру 8М8 27), для образования трехспиральных структур, которые предотвращают транскрипцию гена 8М8 27 в клетках-мишенях. См., в общем, Не1епе, С. (1991) АпбсапсетОтидПеБ. 6 (6): 569-84; Не1епе, С. е1 а1. (1992) Апп. N. Υ Асаб 8с1. 660: 27-36; и Мабет, Ь. I. (1992) ВюаББауБ 14 (12): 807-15.

Ингибирование или предотвращение экспрессии гена может также достигаться модификацией гена 8М8 27, например, введением одной или нескольких мутаций в ген 8М8 27, где эти модификации приводят к белку 8М8 27 с функцией, которая значимо уменьшена в сравнении с белком дикого типа.

Таким образом, в одном дополнительном варианте осуществления полинуклеотид, несущий по меньшей мере одну мутацию, получают из полинуклеотида, представленного 8ЕЦ ΙΌ N0:1, или его эквивалентов.

Мутация в данном контексте может быть любой мутацией, приводящей к менее функциональному или нестабильному полипептиду, например, менее функциональным или нестабильным продуктам гена 8М8 27. Это может включать в себя, например, изменение в геноме микроорганизма, которое препятствует синтезу 8М8 27 или приводит к экспрессии белка 8М8 27 с измененной аминокислотной последовательностью, функция которого в сравнении с копией дикого типа, имеющей неизмененную аминокислотную последовательность, является полностью или частично разрушенной. Эта вмешательство может происходить на транскрипционном, трансляционном или посттрансляционном уровне.

Это изменение в геноме микроорганизма может быть получено, например, заменой в результате рекомбинации посредством единственного или двойного кроссинговера ДНК-последовательности дикого типа ДНК-последовательностью, содержащей изменение. Для удобного отбора трансформантов микроорганизма с изменением в его геноме этим изменением может быть, например, ДНК-последовательность, кодирующая маркер устойчивости к антибиотику, или ген, восполняющий возможную ауксотрофию этого микроорганизма. Мутации включают в себя, но не ограничиваются ими, делеционные-инсерционные мутации. Пример такого изменения включает в себя разрушение гена, т.е. пертурбацию гена таким образом, что продукт, обычно продуцируемый из этого гена, не продуцируется в функциональной форме. Это может быть следствием полной делеции, делеции и инсерции селективного маркера, мутации «сдвига рамки», делеции в рамке считывания или точковой делеции, которая приводит к преждевременной терминации. В некоторых из этих случаев отсутствует вся мРНК этого гена, в других случаях варьируется количество продуцируемой мРНК. Во всех случаях полипептид, кодируемый указанным геном, не продуцируется в функциональной форме, либо отсутствует, либо находится в мутированной форме, например, в виде белка, имеющего уменьшенную активность, как определено здесь.

Изменение в геноме микроорганизма, приводящие к менее функциональному или нефункциональному полипептиду, могут быть также получены случайным мутагенезом с использованием, например, химических мутагенов, облучения или транспозонов и отбора или скрининга на мутанты, которые являются лучшими или более эффективными продуцентами одного или нескольких продуктов ферментации. Стандартные способы для скрининга и отбора известны квалифицированному в данной области специалисту.

В конкретном варианте осуществления, желаемым является нокаут гена 8М8 27 данного изобретения, т.е. способ, в котором экспрессию гена искусственно подавляют для улучшения выхода, продуктивности и/или эффективности продуцирования продукта ферментации при введении в подходящую клеткухозяина. Способы обеспечения нокаутов, а также микроорганизмов, несущих такие подвергнутые супрессии гены, хорошо известны в данной области. Супрессия эндогенного гена 8М8 27 может быть ин

- 17 013412 дуцирована делегированием по меньшей мере части этого гена или его регуляторного района. В данном контексте «супрессия экспрессии гена» включает в себя полную или частичную супрессию, а также супрессию при конкретных условиях и также супрессию экспрессии любого одного из этих двух аллелей.

Для создания микроорганизма с нокаутом, в котором экспрессия гена 8М8 27 искусственно подавлена, ген 8М8 27 сначала может быть клонирован, а затем может быть сконструирован вектор для гомологичной рекомбинации с использованием этого гена для инактивации эндогенного гена 8М8 27 в микроорганизме-мишени. Вектор для гомологичной рекомбинации содержит затем последовательность нуклеиновой кислоты, сконструированную для инактивации эндогенного гена 8М8 27 в микроорганизмемишени. Такой нуклеиновой кислотой может быть, например, последовательность нуклеиновой кислоты гена 8М8 27 или ее регуляторный район, такой как существующий фланкирующий район гена, подлежащего инактивации (ίη С18), или существующий отдельно (ίη 1гап5). содержащий по меньшей мере частичную делецию, или альтернативно, она может быть последовательностью нуклеиновой кислоты гена 8М8 27 или ее регуляторным районом, содержащим другие гены. Ген, который может также функционировать в качестве маркера, предпочтительно выбирают в качестве гена, встраиваемого в ген 8М8 27 или его регуляторный район. Подлежащие использованию гены инсерта включают в себя, например, гены устойчивости к лекарственным средствам, как определено выше. Нет особого ограничения в отношении положения, в котором могут быть встроены эти гены в гене 8М8 27, пока инсерция в этом положении приводит к супрессии экспрессии эндогенного гена 8М8 27 в этой мишени. Во избежание полярных эффектов этой инсерции могут быть введены молчащие делеции в рамке считывания с использованием, например, системы касВ или ПЦР с гомологией длинных фланкирующих районов. Эти способы хорошо известны в этой области.

Вышеупомянутые стратегии мутагенеза для белков 8М8 27 могут приводить к увеличенным выходам желаемого соединения, в частности, витамина С и/или 2-КСА. Этот список не является ограничивающим; вариации этих стратегий мутагенеза будут вполне очевидными специалисту с обычной квалификацией в этой области. При помощи этих механизмов молекулы нуклеиновых кислот и белков могут быть использованы для генерирования микроорганизмов, таких как С1исопоЬас1сг охубапк или родственные штаммы бактерий, экспрессирующих мутированные молекулы нуклеиновой кислоты и белка, так что выход, продуктивность и/или эффективность продуцирования желаемого соединения, такого как витамин С и/или 2-КСА, улучшаются.

В связи с вышеуказанным способом с использованием микроорганизма, в одном аспекте, способ данного изобретения приводит к выходам витамина С, которые равны по меньшей мере приблизительно более, чем 5,7 г/л, например 10, 20, 50, 100, 200, 300, 400 г/л или более, чем 600 г/л. В одном варианте осуществления выход витамина С, полученного способом данного изобретения, находится в диапазоне приблизительно более, чем 5,7 - приблизительно 600 г/л. Выходом витамина С называют концентрацию витамина С в потоке собранного продукта, выходящем непосредственно из продукционного сосуда, т. е. бесклеточного супернатанта, содержащего витамин С.

В одном аспекте этого изобретения, обеспечены микроорганизмы (в частности, из родов С1исопоЬас!ет, С1исопасс1оЬас1сг и Асе!оЬас!ет), которые способны непосредственно продуцировать витамин С из подходящего источника углерода, такого как Ό-сорбит и/или Ь-сорбоза. При измерении, например, в способе покоящихся клеток после инкубационного периода 20 ч было обнаружено, что эти организмы способны продуцировать витамин С непосредственно из Ό-сорбита или Ь-сорбозы даже до уровня 280 мг/л и 670 мг/л, соответственно. В другом аспекте этого изобретения обеспечен микроорганизм, способный непосредственно продуцировать витамин С в количествах 300 мг/л или более из Ό-сорбита в качестве исходного материала или 800 мг/л или более из Ь-сорбозы в качестве исходного материала, соответственно, например, при измерении в способе покоящихся клеток после инкубационного периода 20 ч. Такой выход может быть получен уменьшением или элиминацией активности полипептида 8М8, предпочтительно полипептида 8М8 27. Выход витамина С, полученного из Ό-сорбита, может быть даже таким высоким, как 400, 600, 1000 мг/л, или даже превышать 1,5, 2, 4, 10, 20, 50 г/л. Выход витамина С, полученного из Ь-сорбозы, может быть даже таким высоким, как 1000 мг/л, или даже превышать 1,5, 2, 4, 10, 20, 50 г/л. Предпочтительно эти количества витамина С могут достигаться при измерении способом покоящихся клеток после инкубационного периода 20 ч.

В данном контексте измерение в «способе покоящихся клеток» предусматривает (ί) выращивание этих клеток посредством любого способа, хорошо известного специалисту с квалификацией в данной области, (ίί) сбор этих клеток из бульона для выращивания и (ίίί) инкубирование собранных клеток в среде, содержащей субстрат, который должен быть превращен в желаемый продукт, например, витамин С, при условиях, в которых клетки уже не растут, т.е. нет увеличения в количестве биомассы во время этой так называемой стадии превращения. Более общее описание способа покоящихся клеток описано, например, в АО 2005/017159 и в следующих абзацах.

В одном аспекте этого изобретения обеспечены микроорганизмы (в частности, из родов С1исопоЬас!ет, О1исопасе!оЬас!ег и Асе!оЬас!ет), которые способны непосредственно продуцировать 2-КСА из подходящего источника углерода, такого как Ό-сорбит и/или Ь-сорбоза. При измерении, например, способом покоящихся клеток, как в примере 4, было обнаружено, что эти организмы способны продуциро

- 18 013412 вать 2-КОА непосредственно из Ό-сорбита или Ь-сорбозы в количествах приблизительно 0,5-0,7 г/л. В другом аспекте этого изобретения обеспечен микроорганизм, способный непосредственно продуцировать 2-КОА в количествах приблизительно 7, 8, 9, 10 г/л или более или даже приблизительно 50, 60, 70, 80, 90, 100 г/л или более из Ь-сорбозы в качестве исходного материала. Такой выход может быть получен уменьшением или устранением активности полипептида 8М8. предпочтительно полипептида 8М8 27 в 6 охубапк ΙΡ0 3293.

Рекомбинантный микроорганизм, несущий, например, модифицированный ген 8М8 27, который способен продуцировать этот продукт ферментации со значительно более высокими выходом, продуктивностью и/или эффективностью, может культивироваться в водной среде, дополненной подходящими питательными веществами в аэробных условиях, как описано выше.

Молекулы нуклеиновых кислот, полипептиды, векторы, праймеры и рекомбинантные микроорганизмы, описанные здесь, могут быть использованы в одном или нескольких из следующих способов: идентификации О1исопоЬас(ег охубапк и родственных организмов; картировании геномов организмов, родственных О1исопоЬас(ег охубапк; идентификации и локализации представляющих интерес последовательностей О1исопоЬас(ег охубапк; эволюционных исследованиях; определении районов белка 8М8 27, необходимых для функции; модуляции активности или функции белка 8М8 27; модуляции активности пути 8М8; и модуляции клеточного продуцирования желаемого соединения, такого как витамин С и/или 2-КОА.

Это изобретение обеспечивает способы для скрининга молекул, которые модулируют активность белка 8М8 27 либо взаимодействием с самим этим белком или субстратом или партнером связывания белка 8М8 27, либо модуляцией транскрипции или трансляции молекул нуклеиновой кислоты 8М8 27 этого изобретения. В таких способах микроорганизм, экспрессирующий один или несколько белков 8М8 27 этого изобретения, контактируют с одним или несколькими тест-соединениями и оценивают действие каждого тест-соединения на активность или уровень экспрессии белка 8М8 27.

Обычно биологическая, ферментативная или другая активность белка 8М8 может быть измерена способами, хорошо известными квалифицированному в данной области специалисту, например, инкубированием клеточной фракции, содержащей белок 8М8, в присутствии его субстрата, акцептора (акцепторов) электронов или донора (доноров) электронов, включающих в себя феназинметосульфат (РМС, ФМС), дихлорфенол-индофенол (ΌΟΙΡ), ХАЭ (НАД), ХАЭН (НАДН), ХАЭР (НАДФ), ХАЭРН (НАДФН), потребление которых может быть прямо или опосредованно измерено фотометрическими, колориметрическими или флуорометрическими способами, и других неорганических компонентов, которые могут быть релевантными для развития активности. Так, например, активность мембраносвязанной Ό-сорбитолдегидрогеназы может быть измерена в анализе, в котором фракции мембран, содержащие этот фермент, инкубируют в присутствии фосфатного буфера при рН 6, Ό-сорбита и искусственных акцепторов электронов ΌΟΙΡ и РМ8. Скорость потребления ΌΟΙΡ может измеряться при 600 нм, и она прямо пропорциональна активности Ό-сорбитолдегидрогеназы, присутствующей в этой фракции мембран.

Биологическая, ферментативная или другая активность белков 8М8, в частности, белка 8М8 27, может быть измерена способами, хорошо известными квалифицированному в данной области специалисту, например, определением экспрессии генов, о которых известно, что они находятся под контролем белка 8М8 27, способами, известными специалистам с квалификацией в этой области, такими как, например, нозерн-блот-анализ, анализ транскрипционного слияния, анализ микроматриц и т.п. Связывание белка 8М8 27 с его промоторными районами-мишенями может быть продемонстрировано экспериментами футпринтинга ДНК, анализами изменения подвижности в геле и т.п.

Из приведенного выше описания очевидно, что продукт ферментации способами в соответствии с этим изобретением может не ограничиваться только витамином С. «Желаемым соединением» или «продуктом ферментации», в данном контексте, может быть любой природный продукт О1исопоЬас(ег охубапк, который включает в себя конечные продукты и промежуточные продукты путей биосинтеза, такие как, например, Ь-сорбоза, Ь-сорбозон, Ό-глюконат, 2-кето-Э-глюконат, 5-кето-Э-глюконат, 2,5-дикетоΌ-глюконат и 2-кето-Ь-гулонат (2-КОА), в частности, биосинтетического генерирования витамина С.

Таким образом, данное изобретение относится к применению полинуклеотида, полипептида, вектора, праймера и рекомбинантного микроорганизма, описанных здесь, в получении витамина С и/или 2КОА, т.е. прямом превращении источника углерода в витамин С и/или 2-КОА. В предпочтительном варианте осуществления, модифицированный полинуклеотид, полипептид, вектор и рекомбинантный микроорганизм, описанные здесь, используют для улучшения выхода, продуктивности и/или эффективности продуцирования витамина С и/или 2-КОА.

Термины «продукция» или «продуктивность» являются общепризнанными в этой области и включают в себя концентрацию продукта ферментации (например, витамина С и/или 2-КОА), образованного в пределах конкретного времени и в конкретном объеме ферментации (например, кг продукта в час на литр). Термин «эффективность продуцирования» включает в себя время, необходимое для конкретного уровня продукции, который должен быть достигнут (например, сколько времени требуется клетке для достижения конкретной скорости выхода продукта ферментации). Термин «выход» является общепризнанным в этой области и включает в себя эффективность превращения источника углерода в продукт

- 19 013412 (т.е. витамин С). Он обычно выражается, как, например, кг продукта на кг источника углерода. Под «увеличением выхода и/или продукции/продуктивности» этого соединения имеется в виду, что количество извлеченных молекул или полезных извлеченных молекул этого соединения в конкретном количестве культуры увеличивается на протяжении конкретного периода времени. Термины «биосинтез» или «биосинтетический путь» являются общепризнанными в этой области и включают в себя синтез соединения, предпочтительно органического соединения, клеткой из промежуточных соединений в способе, который может быть многостадийным и высокорегулируемым способом. Выражение «метаболизм» является общепризнанным в этой области и включает в себя все биохимические реакции в целом, которые происходят в организме. Таким образом, метаболизм конкретного соединения (например, метаболизм аминокислоты, такой как глицин) включает в себя все биосинтетические пути, пути модификации и деградации в клетке, связанные с этим соединением. Выражение «транспорт» или «импорт» признано в этой области и включает в себя облегченное перемещение одной или нескольких молекул через клеточную мембрану, через которую эта молекула в противном случае была бы неспособна проходить или проходила бы неэффективно.

Витамин С в данном контексте может находиться в любой химической форме Ь-аскорбиновой кислоты, обнаруживаемой в водных растворах, например, недиссоциированной, в ее форме свободной кислоты или диссоциированной в виде аниона. Солюбилизированная форма соли Ь-аскорбиновой кислоты может быть охарактеризована как анион в присутствии любого типа катионов, обычно обнаруживаемых в супернатантах ферментации, таких как, например, калий, натрий, аммоний или кальций. Могут быть включены также изолированные кристаллы формы свободной кислоты Ь-аскорбиновой кислоты. С другой стороны, изолированные кристаллы формы соли Ь-аскорбиновой кислоты называют по соответствующему названию соли, т. е. аскорбат натрия, аскорбат калия, аскорбат кальция и т. п.

В одном предпочтительном варианте осуществления данное изобретение относится к способу получения витамина С, в котором нуклеотид в соответствии с этим изобретением, описанный выше, инактивируют в подходящем микроорганизме описанными выше способами, этот рекомбинантный микроорганизм культивируют в условиях, которые делают возможным продуцирование витамина С с высокой продуктивностью, высоким выходом и/или высокой эффективностью, полученный продукт ферментации выделяют из культуральной среды и необязательно дополнительно очищают.

Осуществление изобретения

Это изобретение дополнительно иллюстрируется следующими примерами, которые не должны рассматриваться как ограничивающие это изобретение. Содержание всех ссылок, заявок на патенты, патентов и опубликованных заявок на патенты, цитируемых на протяжении этой заявки, включено тем самым здесь путем отсылки.

Примеры

Пример 1. Получение хромосомной ДНК и амплификация ДНК-фрагмента при помощи ПЦР

Хромосомную ДНК 61исоиоЬас1ег охубаик ΙΕ0 3293 получали из клеток, культивированных при 30°С в течение 1 дня в жидкой среде содержащего маннит бульона (МВ), состоящей из 25 г/л маннита, 5 г/л дрожжевого экстракта (ЫГсо) и 3 г/л бактопептона (ЫГсо). по способу, описанному 8атЬгоок е1 а1. (1989) Мо1еси1аг С1ошид: А ЬаЬога!огу Маииа1/8есоиб Ебйюи, Со1б 8ргшд НагЬог ЬаЬогаФгу Ргекк.

ДНК-фрагмент получали при помощи ПЦР с хромосомной ДНК, полученной, как описано выше, и набором праймеров, РГ (8Е0 ΙΌ N0:3) и Рг (8Е0 ΙΌ N0:4). Для реакции использовали набор Ехраиб Нщ11 Ибе1йу РСК. кй (Коске О1адиокйск) и использовали 10 нг хромосомной ДНК в общем объеме 100 мкл в соответствии с инструкцией поставщика, чтобы иметь продукт ПЦР, содержащий ДНКпоследовательность 8М8 27 (8Е0 ΙΌ N0:1). Этот продукт ПЦР извлекали из этой реакции и подтверждали его правильную последовательность.

Пример 2. Разрушение гена 8М8 27 в 6. охубаик ΙΕ0 3293

Для конструирования мутанта с нокаутом гена 8М8 27, ПЦР Ьоид-Наиктд Ното1оду (ЬРН) использовали для конструирования чистой делеционной-инсерционной мутации. Во-первых, левый и правый районы, фланкирующие ген 8М8 27, амплифицировали при помощи ПЦР с использованием соответствующих пар праймеров 8М8 27БЕН+1 (8ЕО ΙΌ ^:5)/8М8 27КтЬЕН-1 (8ЕО ΙΌ N0:6) и 8М8 27КтЬЕН+1 (8ЕО ΙΌ N0:7) / 8М8 27БЕН-1 (8ЕО ΙΌ N0:8). Геномную ДНК 6. охубаик ΙΕ0 3293 использовали в качестве матрицы и условия реакции состояли из 30 циклов денатурации при 95°С в течение 1 мин, отжига при 50°С в течение 1 мин и удлинения при 72°С в течение 1,5 мин. В обоих случаях для минимизации генерируемых ПЦР ошибок использовали ДНК-полимеразу Негси1аке (81га!адеие). Кассету устойчивости к канамицину амплифицировали с использованием ДНК плазмиды рЬС4К (Атегкйат Вюкаеисе, ассеккюи №. Х06404) в качестве матрицы и пары праймеров 8М8 27Кт-1 (8Е0 ΙΌ N0:9)/8М8 27Кт+1 (8Е0 ΙΌ N0:10) для генерирования фрагмента 1,3 т.п.н. Условия реакции были такими, как описанные выше. Эти три продукта очищали из геля, смешивали и использовали в реакции ПЦР второго раунда с фланкирующими праймерами 8М8 27ЬЕН+1/ 8М8 27ЬЕН-1 для генерирования продукта 2,6 т.п.н. Условия реакции для второго раунда состояли из 94°С, 2 мин, затем 10 циклов [94°С, 30 с, 63°С, 30 с, 68°С, 6 мин], с последующими 20 циклами [94°С, 30 с, 63°С, 30 с, 68°С, 6 мин с дополнительными 20 с на один цикл] и конечного удлинения при 68°С в течение 10 мин.

- 20 013412

Продукт ПЦР клонировали в вектор рСЕМ-ТЕаку (Рготеда) с получением плазмиды рСЕМ-8М8 27. Эту плазмиду трансформировали в компетентные клетки С. охуйапк ΙΡ0 3293 се1к, отбирая трансформанты на среде с агаром МВ, содержащей канамицин до конечной концентрации 50 мкг мл^-1, с получением мутантного штамма С. охуйапк ΙΡ0 3293-8М8 27::Кт. ПЦР с использованием фланкирующих праймеров 8М8 27ЕЕИ+1/8М8 27ΕΕΉ-1 использовали для подтверждения, что мутация 8М8 27::Кт была интегрирована посредством двойного кроссинговера.

Пример 3. Получение витамина С из Ό-сорбита с использованием покоящихся клеток

Клетки С охуйапк ΙΡ0 3293 и С. охуйапк ΙΡ0 3293-8М8 27::Кт высевали сначала на МВ-среду и выращивали в течение трех дней. Затем клетки выскребали из этих чашек и наносили на среду №. 3ΒΌ, содержащую 7% сорбит, и выращивали в течение 3 дней при 30°С. Эти клетки использовали в реакциях покоящихся клеток с 2% сорбитом в качестве субстрата и при плотности клеток 0Ό₆₀₀=10.

После 20-часового периода инкубации, С. охуйапк ΙΡ0 3293 продуцировал 30 мг/л витамина С из Όсорбита. В качестве сравнения, штамм С. охуйапк ΙΡ0 3293-8М8 27::Кт продуцировал более чем 350 мг/л, витамина С.

Пример 4. Получение 2-КСА из Ό-сорбита с использованием покоящихся клеток

В соответствии с экспериментальной постановкой примера 3 клетки штаммов С. охуйапк ΙΡ0 3293 и С. охуйаик ΙΡ0 3293-8М8 27::Кт испытывали на их способность продуцировать 2-КСА из Ό-сорбита.

После 20-часового периода инкубации, С охуйаик ΙΡ0 3293 продуцировал 700 мг/л 2-КСА из Όсорбита. В качестве сравнения, штамм С. охуйаик ΙΡ0 3293-8М8 27::Кт продуцировал более, чем 7 г/л, 2-КСА.

Пример 5. Присутствие гена 8М8 27 и его эквивалентов в других организмах

Присутствие 8ЕЦ ΙΌ N0:1 и/или эквивалентов, обнаруживающих сходство/идентичность с 8ЕЦ ΙΌ N0:1, в других организмах, чем организмы, описанные здесь ранее, например, организмах, описанных в табл. 1, может быть определено простым экспериментом гибридизации ДНК.

Штаммы АсеЮЬасЮг асей киЬкр. ху1шит ΙΡ0 13693 апй ΙΡ0 13773 выращивают при 27°С в течение 3 дней на среде №. 350, содержащей 5 г/л бактопептона (ОгГсо), 5 г/л дрожжевого экстракта (ОгГсо), 5 г/л глюкозы, 5 г/л маннита, 1 г/л Мд80₄*7Η₂0, 5 мл/л этанола и 15 г/л агара. Все другие штаммы АсеЮЬас!ег, С1исопасе!оЬас!ег и все штаммы С1исопоЬас!ег выращивают при 27°С в течение 3 дней на агаровой среде с содержащим маннит бульоном (МВ), содержащей 25 г/л маннита, 5 г/л дрожжевого субстрата (Оксо), 3 г/л бактопептона (Э|Гсо) и 18 г/л агара (Эйсо). Е. сой К-12 выращивают на агаровой среде с бульоном Луриа. Другие штаммы/клетки выращивают на среде, рекомендуемой поставщиками, или в соответствии со способами, известными в этой области. Геномную ДНК экстрагируют, как описано, например, 8атЬгоок е! а1., 1989, Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога!огу Мапиа1/8есопй Еййюп, Со1й 8ргтд ΗηγЬог ЬаЬога!огу Рге§8, из подходящего организма, например, упомянутого в табл. 1.

Препараты геномной ДНК расщепляют рестрикционными ферментами, такими как ЕсоП или ΗίπάΙΠ, и 1 мкг этих ДНК-фрагментов разделяют электрофорезом на агарозном геле (1% агарозе). Этот гель обрабатывают 0,25 N НС1 в течение 15 мин и затем блоттируют (промакают) на нитроцеллюлозную или найлоновую мембрану с использованием Уасиит В1ойег Мойе1 785 (ВЮ-ВАО ЬаЬогакпек АС, 8\\йхег1апй) в соответствии с инструкцией поставщика. Затем полученный блот приводят в контакт/гибридизуют с раствором, в котором находится зонд, такой как, например, ДНК-фрагмент с последовательностью 8ЕЦ ΙΌ N0:1 или ДНКфрагмент, содержащий часть последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0:1 или всю последовательность 8ЕЦ ΙΌ N0:1, для детектирования положительного ДНК-фрагмента (положительных ДНК-фрагментов) из тесторганизма. Может быть приготовлен ОЮ-меченый зонд, например, 8ЕЦ ΙΌ N0:1, в соответствии с примером 1 с использованием набора для ПЦР-ЭЮ-мечения (Воске П1адио8Йс8) и набора праймеров, 8ЕЦ ΙΌ N0:3 и 8ЕЦ ΙΌ N0:4, в соответствии с протоколом поставщика. Результат такого блота изображен в табл. 1.

Гибридизация может выполняться при строгих условиях при условиях высокой строгости. Предпочтительным, неограничивающим примером таких условий является гибридизация в смеси 6х хлорид натрия/цитрат натрия (88С) при приблизительно 45°С с последующими одной или несколькими промывками в 1х 88С, 0,1% ДСН при 50°С, предпочтительно при 55°С, более предпочтительно при 60°С и еще более предпочтительно при 65°С. Условия высокой строгости включают в себя, например, инкубацию 2 часа - 4 дня при 42°С в растворе, таком как раствор О^Еа^у^Ь 8о1ийоп (Воске О|адпо5Йс5 СтЬЩ, содержащий или не содержащий 100 мкг/т1 ДНК спермы лосося, или в растворе, содержащем 50% формамид, 5х 88С (150 мМ №С1, 15 мМ тринатрийцитрат), 0,02% додецилсульфат натрия, 0,1% N лауроилсаркозин и 2% блокирующий реагент (Воске О|адпо511с5 СтЬЩ, с последующим промыванием фильтров дважды в течение 5-15 мин в 2х 88С и 0,1% ДСН при комнатной температуре и затем промыванием дважды в течение 15-30 мин в 0,5х 88С и 0,1% ДСН или 0,1х 88С и 0,1% ДСН при 65-68°С. Для детектирования ДНК-фрагментов с более низкой идентичностью с этим зондом ДНК конечные стадии промывания могут быть выполнены при более низких температурах, таких как 50-65°С и в течение более короткого времени промывания, например 1-15 мин.

Гены, соответствующие положительным сигналам в соответствующих организмах, показанных в табл. 1, могут быть клонированы ПЦР-способом, хорошо известным в этой области, с использованием

- 21 013412 геномной ДНК такого организма вместе с подходящим набором праймеров, таким как, например, 8ЕЦ ΙΌ N0:3 и 8ЕЦ ΙΌ N0:4, в условиях, описанных в примере 1, или следующим образом: 5 - 100 нг геномной ДНК используют на реакцию (общий объем 50 мкл). Система ПЦР Ехрапб Нщй Ибс1йу (Косйс 0|адпо5Пск) может быть использована с условиями реакции, состоящими из 94°С в течение 2 мин; 30 циклов (ί) стадии денатурации при 94°С в течение 15 с, (ίί) стадии отжига при 60°С в течение 30 с, (ίίί) стадии синтеза 72°С в течение 0,5-5 мин в зависимости от длины ДНК-мишени (1 мин /1 т.п.н.); удлинения при 72°С в течение 7 мин. Альтернативно, можно выполнять ПЦР с вырожденными праймерами, которые могут быть синтезированы на основе 8ЕЦ ΙΌ N0:2 или аминокислотных последовательностей в виде консенсусных последовательностей, выбранных сопоставлением нескольких аминокислотных последовательностей, полученных с использованием программы поиска последовательностей, такой как ВБА8ТР (или ВБА8ТХ при использовании нуклеотидной последовательности в качестве «запрашиваемой последовательности»), для нахождения белков, имеющих сходство с белком 8ЕЦ ΙΌ N0:2. Для ПЦР, использующей вырожденные праймеры, температура второй стадии отжига (см. выше) может быть понижена до 55°С или даже до 50-45°С. Результат такого эксперимента показан в табл. 1.

Пробы реакций ПЦР разделяют электрофорезом в агарозном геле и полосу визуализируют с использованием транс-иллюминатора после окрашивания, например, этидийбромидом, выделяют из геля и подтверждают правильную последовательность.

Вышеупомянутыми консенсусными последовательностями могут быть аминокислотные последовательности, принадлежащие к определенным категориям нескольких баз данных доменов/семейств белков, таких как РКО81ТЕ (база данных семейств и доменов белков), СОО (Кластер групп ортологов), СЭЭ (базы данных консервативных доменов), рГат (большая коллекция множественных выравниваний последовательностей и скрытых моделей Маркова, включающих в себя многие общие домены и семейства белков). После выбора определенного белка с функцией, идентичной/сходной с функцией белка данного изобретения, из белков, содержащих домен или семейство таких баз данных, соответствующая ДНК, кодирующая этот белок, может быть амплифицирована при помощи ПЦР с использованием белковой последовательности или ее нуклеотидной последовательности, когда она доступна в публичных базах данных.

Пример 6. Разрушение гена 8М8 27 и его эквивалентов в других организмах для получения витамина С и/или 2-КОА

Для улучшения продукции витамина С в подходящем микроорганизме, который способен непосредственно продуцировать витамин С из конкретного субстрата, ген 8М8 27 и эквиваленты, такие как, например, продукт ПЦР, полученный в примере 5, называемый далее геном Х, может быть разрушен в соответствии с геном 8М8 27 в О. охубапв ΙΕΌ 3293 (см. пример 2) для генерирования мутанта с нокаутом, несущим эквивалентный ген 8М8 27::Кт. Подходящие штаммы-хозяева для генерирования таких мутантов с нокаутом могут быть выбраны, например, из штаммов С1исопоЬас1сг. перечисленных в табл. 1, в частности, например, О охубапв ΙΕ0 3292, О. охубапв АТСС 621Н, О. охубапв ΙΕ0 12528, О охубапв ΙΕ0 3291, О. охубапв ΙΕ0 3255, О. охубапв ΙΡ0 3244, О. ссппиз ΙΡ0 3266, О. Гга!сит ΙΡ0 3260, О. охубапв ΙΡ0 3287, Асс1оЬас1сг асс11 виЬвр. ог1сапп5 ΙΕ0 3259, Асс1оЬас1сг асс11 зиЬзр. ху1шиш ΙΕ0 13693, Асс1оЬас1сг асс11 зиЬзр. ху1шиш ΙΕ0 13773 и АссЮЬас1сг §р. АТСС 15164, и их производных, несущих гены, участвующие в путях продуцирования витамина С, и смежные районы, в которых может быть локализован ген 8М8 27 или его эквивалент.

Мутант с нокаутом, такой как мутант с нокаутом О. охубапв ΙΕ0 3292-эквивалентный ген::Кт 8М8 27, может быть генерирован следующим образом: ПЦР-продукт, полученный из О. охубапв ΙΕ0 3293, описанный в примере 5, клонируют в векторе Е. сой рСВ2.1-Т0Р0 и используют для трансформации Е. сой ТО1 с получением Ар^г-трансформанта, несущего рСВ2.1-ген X. Затем кассету Кш^г, выделенную из рИС-4К (АтспЛат Β^βα^^, асссххюп №. Х06404), встраивают в один из сайтов рестрикции гена-мишени при помощи лигазы и полученный продукт лигирования используют для трансформации Е. сой ТОI с получением трансформанта Арг Кшг, несущего рСВ2.1-ген Х::Кт. Плазмиду рСВ2.1-ген Х::Кт, полученную из этого трансформанта, расщепляют двумя рестриктазами, выбранными из части сайта множественного клонирования этого вектора для выделения ДНК-фрагмента, содержащего ген Х::Кт. Полученный ДНК-фрагмент используют для трансформации штамма-хозяина, несущего эквивалентный ген 8М8 27, электропорацией с получением разрушенного гена, несущего эквивалентный ген::Кт 8М8 27.

Дополнительные модификации, включающие в себя гены, участвующие в превращении Ό-сорбита, Ь-сорбозы и/или Ь-сорбозона в витамин С в указанных штаммах, могут быть генерированы для улучшения продукции витамина С в таких штаммах.

Продуцирование витамина С с использованием клеток мутанта с нокаутом, например, О. охубапв ΙΕ0 3292-эквивалентный ген::Кт 8М8 27, и соответствующего штамма дикого типа, например, О охубапв ΙΕ0 3292, выполняли в соответствии с примером 3.

Продуцирование 2-КОА с использованием клеток мутанта с нокаутом, например, О. охубапв ΙΕ0 3292-эквивалентный ген::Кт 8М8 27, и соответствующего штамма дикого типа, например, О. охубапв ΙΕ0 3292, выполняли в соответствии с примером 4.

В реакции покоящихся клеток с 1% Ь-сорбозоном в качестве субстрата, мутантный штамм может продуцировать по меньшей мере более чем 20% витамина С и по меньшей мере более чем 10%, 2-КОА, в

- 22 013412 сравнении со штаммом дикого типа.

Таблица 1. Эквиваленты гена 8М8 27 в других организмах

Штамм	Сигнал 1	Сигнал 2	Сигнал 3
С. οχγάαηχ ΙΡΟ 3293	+	+	+
Сг. οχγάαηχ 08М 17078	+	+	+
Сг. οχγάαηχ ΙΡΟ 3292	+	+	+
Сг. οχγάαηχ АТСС 621Η	+	+	+
С. οχγάαηχ ΙΡΟ 12528	+	+	+
Сг. οχγάαηχ Ο 624	+	-	+
Сг. οχγάαηχ Τ-100	+	+	+
0. οχγάαηχ ΙΡΟ 3291	+		+
Ο. οχγάαηχ ΙΡΟ 3255	+		+
С. οχγάαηχ АТСС 9937	+		+
Ο. οχγάαηχ ΙΡΟ 3244	+		+
Сг. сегтих ΙΡΟ 3266	+		+
Сг. /га1еигИ ΙΡΟ 3260	+		+
Сг. οχγάαηχ ΙΡΟ 3287	+		+
АсеТоЪас/ег асеИ хиЪхр. оНеапих ΙΡΟ 3259	-		+
Асе1оЪас1ег асеИ хиЪхр. хрИпит ΙΡΟ 13693	-		+
АсеТоЪасТег асеИ хиЬхр. хрИпит ΙΡΟ 13773	-		+
Асе1оЪас1ег хр. АТСС 15164	-		+
С. 1каИапА1сих ΝΒΚ.0 100600	+		+
С1исопасе(оЪас1ег Ицие/асгепх АТСС 14835	+		+
С1исопасе1оЪас1ег ροϊγοχοξβηβχ ΝΒΙ 1028			+
С1исопасе1оЪасТег А1аго1горЫсих АТСС 49037			+
СгТисопасе/оЬасТег еигораеих ϋ8Μ 6160			+
АсеТоЬас/ег асеИ 1023			+
АсеТоЪас/ег рахТеиггапих ΝΟΙ1193			+ ι
Е. соИ			-
Еасскаготрсех οβΓβνϊχϊαε			-
Ахрег^Ших т%ег			-
Мышь			-

Сигнал 1: Детектирование ДНК на блоте с геномной ДНК разных штаммов и 8Е0 ГО N0:1 в качестве меченого зонда. Сигнал 2: Детектирование ДНК различных штаммов в ПЦР-реакции с использованием пары праймеров 8Е0 Ш N0:3 и 8Е0 Ш N0:4. Сигнал 3: Детектирование ДНК разных штаммов в ПЦР-реакции с использованием вырожденных праймеров. В отношении более подробного объяснения смотрите текст.

- 23 013412

3ΕΟϋΕΝΟΕ ΙιΙΕΤΙΝΟ <110> ϋ3Μ ΙΡ АззеЬз Β.ν.' <120> Νονβΐ Сепе 3Μ3 27 <130>24998 <160> 16 <170> РаЬепЫп νβτβίοη 3.2 <210> 1 <211>495 <212> ϋΝΑ <213> С1исопоЬасЕег охуйапз ΙΓΟ 3293 <400> 1

аСдссссЕЬд	адаааадсад	адсдЬссЕсс	ЕсЬасдаааа	адсдЕдЬсад	ддасдскдад	60
дссасдааар	СасдсаЕЕсЕ	сдаадсддсд	аадааддадЕ	РРдсссдааа	сдддсЫгдаа	120
ддсдсдсддд	СсдаЕасдаЬ	сдсссЕсдаЕ	дссааддсса	асаададааБ	дсЬсЬассас	180
ЕаЬБЕсаааа	дЕааддасдд	ссЫЛЕссдс	ассдСссЕдд	адсдддааСа	есСсаасаЬс	240
сдддаддаад	адассадасЕ	ддаЬсЬддад	аассЬссссс	сссаддасад	сссЕсдааас	300
дсесдЪссдЕ	ЪЪсасаЕддд	ааЬасЕаЬаЕ	сдссааЕссд	дадРБсаЬса	сссЕЕдЪдаа	360
садсдадаас	сЬсСдРсадд	ссдсссаЕаР	ссддааЬЕса	сссасасСда	адасдаЕсад	420
ЬсадаааЕСс	дТссдссдса	ЕссадЕсссЬ	ЬсИддаИсдд	ддсдЕЬсддд	ааааГдЕсТП:	480

ссдсдаСддс аЕЕда495 <210> 2 <211>164 <212> ΡΚΤ <213> С1исопоЬасЕег охудапз ΙΓΟ 3293 <400>2

МеБ 1

Рго

Ьеи

01 и

Ьуз 5

Зег

Агд

А1а

Зег

Зег 10

Зег

ТЬг

Ьуз

Ьуз

Агд 15

Уа1

Агд

Азр

А1а

01 и 20

А1а

ТЬг

Ьуз

Ьеи

Агд 25

Не

Ьеи

О1и

А1а

А1а 30

Ьуз

Ьуз

С1и

РЬе

А1а 35

Агд

Азп

01 у

Ьеи

С1и 40

С1 у

А1а

Агд

Уа1

Азр 45

ТЬг

11е

А1а

Ьеи

Азр

А1а

Ьуз

А1а

Азп

Ьуз

Агд

МеЬ

Ьеи

Туг

Н13

Туг

РЬе

Ьуз

Зег

55 60

- 24 013412

Ьуз 65

Азр

<31 у Ьеи

РЬе Агд ТЬг УаЬ Ьеи СЬи Агд СЬи

Туг

Ьеи

Азп

Не 80

70

75

Агд

СЬи

СЬи

СЬи

ТЬг

Агд

Ьеи

Азр

Ьеи

СЬи

Азп

Ьеи

Рго

Рго

СЬп

Азр

85

90

95

Зег

Рго

Агд

Азп

АЬа

Агд

Рго

РЬе

НЬз

МеЪ

СЬу

Не

Ьеи

Туг

Агд

СЬп

100

105

110

Зег

СЬу

УаЬ

Н13

НЬз

Рго

Суз

СЬи

СЬп

Агд

СЬи

Рго

Ьеи

Зег

СЬу

Агд

115

120

125

Рго

Туг

Рго

СЬи

РЬе

ТЬг

НЬз

ТЬг

СЬи

Азр

Азр

СЬп

Зег

СЬи

11е

Агд

130

135

140

Рго

Рго

ΗΪ3

Рго

УаЬ

Рго

Зег

СЬу

Зег

СЬу

Агд

Зег

СЬу

Ьуз

Суз

Ьеи

145

Ь50

155

Ь60

Рго Агд Тгр НЬз <210> 3 <211> 20 <212> ϋΝΑ <213> АгбЬ£ЬсЬаЬ <220>

<223> ргЬтег <400> 3 аБдссссББд адаааадсад <210> 4 <211> 20 <212> βΝΑ <213> АгЬЬНсЬаЬ <220>

<223> ргЬтег <400> 4

ЬсааЬдссаЕ сдсддаадас <210> 5 <211> 22 <212> ϋΝΑ <213> АгЫГЬсЬаЬ <220>

<223> <400> дддЬда	ргхтег 5
.еддд аасабсаЪда дс	22
<210>	6
<211>	43
<212>	ϋΝΑ
<213>	Аг£1£1с1а1
<220>
<223>	ргхтег
<400>	6
сасдаддсад ассЬсадсдс сдсдЁааСЫ: сдЬддссЕса дед	43
<210>	7
<211>	47
<212>	ϋΝΑ
<213>	Аг-Ы£1С1а1
<220>
<223>	ргхтег
<400>	7 -
сададаЕЕее дадасасаас дЕддсдаЬаЕ дссдссЪддЬ сЬдсаад	47
<210>	8
<211>	21
<212>	ϋΝΑ
<213>	АгЕ1£1Сха1
<220>
<223>	ргхтег
<400>	8
дддсддсЕСс с£дсаса£сд д	21
<210>	9
<211>	43
<212>	ϋΝΑ
<213>	ΑΓΐίίϊσίβΙ
<220>
<223>	рг1тег
<400>	9
сдсЬдаддсс асдаааЕЪас дсддсдсСда ддРсСдссЪс д£д	43
<210>	10
<211>	47
<212>	ϋΝΑ
<213>	Аг£х£хсха1

- 26 013412 <220>

<223> ргхтег <400>10 сЕЕдсадасс аддсддсака СсдссасдЕЕ дЕдксксааа аЕсСскд47 <210> 11 <211>1596 <212> ϋΝΑ <213> С1исопоЬасГег охубапз ΙΡΟ3293 <400> 11

аСдасдадсд дССССдаЪСа саЬсдССдСс ддСддсддСС сддсЕддсСд ЪдЕЕсСсдса	60
дсссдссЕЕЕ ссдааааЕсс ЕкссдЪссдк дксЕдссЕса Ьсдаддсддд ссддсдддас	120
асдсаЕсссс СдаЕссаЕаН дссддЕсддг СЕсдсдаада Едассасддд дссдсаСасс	180
ЕдддаЕсЕЪс Едасддадсс дсадааасаЪ дсдаасаасс дссадаЕссс сЬаСдЕдсад	240
ддссддаЪЪс Сдддсддсдд аксдЕссаЕс аасдсддаад ЪсЕЕсасдсд дддасасссЕ	300
ЕссдаЪЕЕсд ассдскдддс ддсддааддк дсддакддсИ ддадсккссд ддаЕдСссад	360
аадЪасЕЕса ЕссдЕСссда аддсааЕдсс дСдЕЕСЕсдд дсассЕддса Сддсасдаас	420
дддссдсЕсд дддЬдЕссаа ссЕсдсадаЕ ссдаасссда ссадссдЕдс сЕЕсдЕдсад	480
адсЕдЕсадд аааЕддддсС дсссЕасаас ссЕдасЕЪса аЕддсдсаЕс дсаддааддд	540
дсЕддсаЬсЬ ассадакдас саЕссддаас аассддсдск дсксдасддс ЕдЕддддкак	600
сЕдсдъссдд сссЪддддсд даадаассЪд асддЕЕдСда сдсдддсдсЕ ддЪссСдаад	660
а+сдЬсЕ+са асдддасдсд ддсдасдддс дСдсадЕаСа Есдссаасдд сасссЕдааЕ	720
ассдссдаад сдадссадда ааЕсдЕЕдкд асддссддад сдаСсддаас дссдаадсЪд	780
аЬдаЕдсЬдЕ сдддсдЕсдд дсскдссдсд саСсЕЪсдсд ааааЕддСак сссддЕсдкд	840
саддассЕдс сдддсдЕддд сдадаассЕГ саддассаЫ: ЕсддЕдЬдда СаСсдСадсс	900
дадсЕсаада сддаЕдадад сЕЕсдасаад Еассддааас ЬдсасЕддаЕ дсСдЕдддса	960
ддЪсЕЕдааЕ асассаЕдГЕ садакссддс сссдЕсдсдк ссаасдЕддЕ Едадддсддс	1020
дсдЕЕсСддЕ. асксддассс дЕсаЕсдддк дЕЕссЕдаЕс ЕссадкЪсса ЕЕЪЕсЕЕдсд	1080
ддддсадддд скдаддсадд ддЕдасдксс дкСсссаадд дсдсдксддд даккасдсЕд	1140
аасадсЕаЪд ЕдсЕдсдЕсс даадЪсЕсдс ддЬассдкЛс ддсЕдсд+Ес ддсадаЕсса	1200
адддЕсаакс сдаЪддЕсда ЕсссааЕЕкс сЕСддадасс сддссдассЕ ЕдадасдксЬ	1260
дсддааддкд ЕдсддсЕдад сЕасдадакд ЕПсксссадс сЕЕссЕЕдса даадсаса^с	1320
ааддааасаЕ дсЕЕсЕЕСад сддЕааасад ссдасдабдс адаСдЪаЕсд ддас+аЬдсд	1380

- 27 013412 сдддаасаСд дссддассЬс сЪаЪсаЕссд асаЪдсассЪ дсаадаЬддд дсдддаСдас 1440 аЬдЪссдЕсд ЕсдаЕссдсд ЬсЕдааддЬЪ саСддссЕЬд адддсаЕсад даЬсЪдСдас 1500 адс£сдд£са СдссдЬсдсЕ дсЬсддСЕсс аасассааЬд ссдсдасдаС саЬдассадЬ 1560 дадсдддсад сддаЫЛсаЪ Ъсаддддаас дссЪда 1596 <210> 12 <211> 531 <212> РКТ <213> 61исопоЬас£ег охус!апз ΙΓΟ 3293 <400> 12

МеЬ 1

ТЬг Зег С1у РЬе Азр Туг 5

11е Уа1 Уа1 10

С1у С1у

С1у

Зег

А1а 15

С1у

Суз

Уа1

Ьеи

А1а

А1а

Агд

Ьеи

Зег

С1и

Азп

Рго

Зег

Уа1

Агд

Уа1

Суз

20

25

30

Ьеи

Не

С1и

А1а

С1у

Агд

Агд

Азр

ТЬг

Н13

Рго

Ьеи

Не

ΗΪ3

МеЪ

Рго

35

40

45

Уа1

С1у

РЬе

А1а

Ьуз

МеЬ

ТЬг

ТЬг

С1у

Рго

НЬз

ТЬг

Тгр

Азр

Ьеи

Ьеи

50

55

60

ТЬг

61и

Рго

εΐη

Ьуз

Н1з

А1а

Азп

Азп

Агд

εΐη

Пе

Рго

Туг

Уа1

εΐη

65

70

75

80

С1у

Агд

11е

Ьеи

С1у

С1у

С1у

Зег

Зег

11е

Азп

А1а

С1и

Уа1

РЬе

ТЬг

85

90

95

Агд

61 у

ΗΪ3

Рго

Зег

Азр

РЬе

Азр

Агд

Тгр

А1а

А1а

С1и

С1у

А1а

Азр

100

105

110

С1у

Тгр

Зег

РЬе

Агд

Азр

Уа1

С1п

Ьуз

Туг

РЬе

11е

Агд

Зег

εΐυ

С1у

115

120

125

Азп

А1а

Уа1

РЬе

Зег

С1у

ТЬг

Тгр

Н1з

С1у

ТЬг

Азп

61 у

Рго

Ьеи

С1у

130

135

140

Уа1

Зег

Азп

Ьеи

А1а

Азр

Рго

Азп

Рго

ТЬг

Зег

Агд

А1а

РЬе

Уа1

С1п

145

150

155

160

Зег

Суз

С1п

С1и

Ме£

С1у

Ьеи

Рго

Туг

Азп

Рго

Азр

РЬе

Азп

С1у

А1а

165 170 175

- 28 013412

Зег 61п С1и 61у

А1а 61у

11е

Туг

С1п МеЬ ТЬг 11е Агд Азп

Азп

Агд

180

185

190

Агд

Суз

Зег

ТЬг

А1а

Уа1

С1у

Туг

Ьеи

Агд

Рго

А1а

Ьеи

61у

Агд

Ьуз

195

200

205

Азп

Ьеи

ТЬг

Уа1

Уа1

ТЬг

Агд

А1а

Ьеи

Уа1

Ьеи

Ьуз

Не

Уа1

РЬе

Азп

210

215

220

61 у

ТЬг

Агд

А1а

ТЬг

61у

νβΐ

61п

Туг

11е

А1а

Азп

61у

ТЬг

Ьеи

Азп

225

230

235

240

ТЬг

А1а

С1и

А1а

Зег

С1п

61и

Не

Уа1

Уа1

ТЬг

А1а

С1у

А1а

Не

С1у

245

250

255

ТЬг

Рго

Ьуз

Ьеи

МеЬ

МеЬ

Ьеи

Зег

01у

Уа1

С1у

Рго

А1а

А1а

Н1з

Ьеи

260

265

270

Агд

С1и

Азп

61у

Не

Рго

νβΐ

Уа1

61п

Азр

Ьеи

Рго

61у

Уа1

01у

61и

275

280

285

Азп

Ъви

01 п

Н1з

РЬе

т ν

Уа1

А «г»

Не

Уа1

А1а

С1и

Ьеи

Т.ия

ТЬг

•·—с

--Д

—л —

290

295

300

Азр

С1и

Зег

РЬе

Азр

Ьуз

Туг

Агд

Ьуз

Ьеи

Нтз

Тгр

МеЪ

Ьеи

Тгр

А1а

305

310

315

320

01 у

Ьеи

61и

Туг

ТЬг

МеЬ

РЬе

Агд

Зег

С1у

Рго

Уа1

А1а

Зег

Азп

Уа1

325

330

335

Уа1

С1и

С1у

61у

А1а

РЬе

Тгр

Туг

Зег

Азр

Рго

Зег

Зег

61у

Уа1

Рго

340

345

350

Азр

Ьеи

С1п

РЬе

ΗΪ3

РЬе

Ьеи

А1а

С1у

А1а

С1у

А1а

С1и

А1а

С1у

Уа1

355

360

365

ТЬг

Зег

Уа1

Рго

Ьуз

61у

А1а

Зег

С1у

Не

ТЬг

Ьеи

Азп

Зег

Туг

Уа1

370

375

380

Ьеи

Агд

Рго

Ьуз

Зег

Агд

С1у

ТЬг

Уа1

Агд

Ьеи

Агд

Зег

А1а

Азр

Рго

385

390

395

400

Агд

Уа1

Азп

Рго

МеЬ

Уа1

Азр

Рго

Азп

РЬе

Ьеи

61 у

Азр

Рго

А1а

Азр

405

410

415

- 29 013412

Ьеи С1и Ткг Зег

А1а С1и С1у

57а1 Агд Ьеи 425

Зег

Туг

С1и

МеЬ 430

Рке

Зег

420

С1п

Рго

Зег

Ьеи

61п

Ьуз

НЬз

11е

Ьуз

СЬи

Ткг

Суз

Рке

Рке

Зег

СЬу

435

440

445

Ьуз

С1п

Рго

Ткг

МеЬ

С1п

Мек

Туг

Агд

Азр

Туг

А1а

Агд

СЬи

НЬз

СЬу

450

455

460

Агд

Ткг

Зег

Туг

ΗΪ3

Рго

Ткг

Суз

Ткг

Суз

Ьуз

МеЬ

С1у

Агд

Азр

Азр

465

470

475

480

МеЬ

Зег

57а 1

57а1

Азр

Рго

Агд

Ьеи

Ьуз

57а 1

НЬз

СЬу

Ьеи

СЬи

С1у

1Ье

485

490

495

Агд

Не

Суз

Азр

Зег

Зег

\7а1

МеЬ

Рго

Зег

Ьеи

Ьеи

СЬу

Зег

Азп

Ткг

500

505

510

Азп

А1а

А1а

Ткг

11е

МеЬ

11е

Зег

СЬи

Агд

А1а

АЬа

Азр

Рке

11е

СЬп

515

520

525

С1у Азп А1а

530 <210> 13 <211> 1497 <212> ϋΝΑ <213> С1исопоЬасЬег охубапз ΙΓΟ 3293 <400> 13

аЬдааЬдЬЬд	ЬсЬсааадас	ЬдЬаЬсЬЬЬа	ссдЬЬааадс	сдсдЬдадЬЬ	сддаЬЬсЬаЬ	60
аЬЬдаЬддад	ааЬддсдсдс	аддЬааддаЬ	ЬЬсЬЬсдаЬс	дЬЬссЬсдсс	ддсЬсаЬдаЬ	120
дЬЬсссдЬса	сссдЬаЬЬсс	асдсЬдсасс	сдЬдаддасс	ЬЬдаЬдаддс	адЬсдсЬдсЬ	180
дсасдЬсдЬд	сЬЬЬсдадаа	сддаадсЬдд	ЬсдддссЬдд	сддссдсдда	ЬсдЬдсддсд	240
дЬЬсЬЬсЬда	аадссдсддд	ссЬЬсЬдсдс	дадсдссдсд	аЬдасаЬсдс	ЬЬасЬдддаа	300
дЬЬсЬсдааа	асдддаадсс	саЬсадссад	дсдаадддсд	адаЬсдаЬса	сЬдЬаЬсдсс	360
ЬдЬЬЬсдада	Ьддсддссдд	сдсЬдсдсдд	аЬдсЬдсаЬд	дЬдаЬасдЬЬ	саасааЬсЬд	420
ддсдаддддс	ЬдЬЬсддсаЬ	ддЬссЬдсдд	дадсссаЬсд	дЬдЬсдЬсдд	ЬсЬдаЬЬасд	480
ссдЬддаасЬ	ЬсссдЬЬсаь	даЬссЬдЬдЬ	дадсдсдсдс	сЬЬЬсаЬЬсЬ	сдсаЬссддс	540
ЬдсасдсЬдд	ЬсдЬсаадсс	ЬдссдаадЬс	асдадЬдсса	сдасдсЬЬсЬ	ЬсЬддсддаа	600

- 30 013412

дЬдсЕддсдд	аЕдсддддсЕ	дссдаадддЕ	дСсЕЕсааЕд	ЕЕдЕдасддд	сасддддсдс	660
асддЕсдддс	аддссаЕдас	сдадсаЕсад	дасаЕсдаса	ЕдсЕдЕссЕЕ	сасдддсЕсс	720
асдддсдЕсд	дсаадЬссЕд	саЕссаЬдсд	дсддсЕдаса	дсаасскдаа	дааасЕдддс	780
сььдадсЕЕд	дсддсаадаа	сссдаЕсдьс	дЬдЕЕсдсЕд	асадсаассЕ	ЕдаддаЕдсд	840
дссдаЕдсдд	ЕадсЕЕЕсдд	даЕЕадЬЕЕс	аасассдддс	адЕдсЕдЬдЕ	дЬсдЕсдадс	900
сдссЕдаЕЕд	ЕададсддЕс	сдЕддссдад	аадЬЕсдадс	дЬсЕсдЕЕдЬ	ддсдааааЕд	960
дадаадаЕсс	дсдЕсддсда	ЕссдЕЕсдаЕ	ссЕдадасдс	адаЕсддсдс	саЕЛасдасд	1020
даадсдсада	асаадассаЕ	ЕсЕддасЕаЕ	аЕсдссаадд	дсааддссда	дддсдссадд	1080
оЕдсЕсЕдсд	дЕддсдддаЬ	сдЕсдаЕЕЕс	ддсааадддс	адЕаЬаЬсса	дссдасдсЕЕ	1140
ЕЕсасддаЕд	ЕдаадсссЕс	даЬдддсаЕс	дсдсдЕдасд	адаЬЕЕЕЕдд	дссддЕссЕд	1200
дсдЬссЕЕсс	асЕЕсдаЬас	сдЬсдаЕдад	дсдаЕсдсда	ЕЕдссааЕда	сасд'дЕЕЕас	1260
ддссЕддссд	саЕсддЬсЕд	дадсааддаЕ	аЕсдасаадд	сдсЕЕдссдЕ	дасссдЕсдЬ	1320
дЬЕсдсдсЕд	дссдсЕЕсЕд	ддЕдаасасс	аЕсаЬдадсд	дЬддЕсссда	дасдссдсЕд	1380
ддЪддЕЕЕса	адсадЕсддд	сЕддддссдЕ	даддссддЕс	ЕдЕасддсдЬ	ЕдаддааЕаЕ	1440
асдсадасса	аагсгдЕсса	Еагсдааасг	ддсааасдгг	сдсассддаг	гссдгаа	1497
<210> 14
<211> 498
<212> РКТ
<213> 61исопоЪасЪег охубапз ΙΓΟ	3293
<400> 14
МеЕ Азп Уа1	Уа1 Зег Ьуз ТИг Уа1 Зег Ьеи Рго	Ьеи Ьуз Рго	, Агд С1и
1	5		10		15
РЬе С1у РЬе	Туг Не Азр 31 у 31и Тгр Агд А1а	61у Ьуз Азр	• РЬе РЬе
	20	25	30
Азр Агд Зег	Зег Рго А1а Н1з Азр 7а1 Рго \7а1	ТЬг Агд 11е	Рго Агд
35		40		45
Суз ТЬг Агд	С1и Азр Ьеи Азр С1и А1а Уа1 А1а	А1а А1а Агд	Агд А1а
50		55		60
РЬе С1и Азп	С1у Зег Тгр Зег 61у Ьеи А1а А1а	А1а Азр Агд	А1а А1а
65	70		75		80

- 31 013412

νβΐ

Ьеи

Ьеи

Ьуз

АЬа 85

АЬа СЬу

Ьеи Ьеи Агд 90

СЬи Агд

Агд

Азр

Азр 95

Пе

А1а

Туг

Тгр

СЬи

баЬ

Ьеи

СЬи

Азп

СЬу

Ьуз

Рго

Не

Зег

СЬп

АЬа

Ьуз

ЬОО

Ь05

Ь10

СЬу

СЬи

ЬЬе

Азр

НЬз

Суз

Пе

А1а

Суз

РЬе

СЬи

МеЬ

АЬа

АЬа

СЬу

АЬа

ЬЬ5

120

Ь25

АЬа

Агд

МеС

Ьеи

НЬз

СЬу

Азр

ТЬг

РЬе

Азп

Азп

Ьеи

СЬу

СЬи

СЬу

Ьеи

130

135

140

РЬе

СЬу

Меб

ЦаЬ

Ьеи

Агд

СЬи

Рго

Пе

СЬу

\7аЬ

УаЬ

СЬу

Ьеи

1Ье

ТЬг

145

Ь50

155

160

Рго

Тгр

Азп

РЬе

Рго

РЬе

МеЪ

Не

Ьеи

Суз

СЬи

Агд

АЬа

Рго

РЬе

Пе

Ь65

Ь70

Ь75

Ьеи

АЬа

Зег

СЬу

Суз

ТЬг

Ьеи

УаЬ

УаЬ

Ьуз

Рго

АЬа

СЬи

УаЬ

ТЬг

Зег

180

Ь85

190

7\ Ί -»

ТЬ V

тк ».

Т А,,

Т ГЧ 1

Τ

пл ,·»

Т Л'1

А1а

Л

Ь 1 га

/?1

Ьеи

ϋν-Λ

С1.1.С1

1114.

1111

4_1 45 Ч

ич ч

ч

съа- а

ч»·*. ч

V чл.

хич ч

пжч

'-'-‘Л

-и Ч

Ь95

200

205

Ьуз

СЬу

УаЬ

РЬе

Азп

УаЬ

УаЬ

ТЬг

СЬу

ТЬг

СЬу

Агд

ТЬг

УаЬ

СЬу

СЬп

2Ь0

215

220

АЬа

Меб

ТЬг

СЬи

НЬз

СЬп

Азр

Не

Азр

МеЪ

Ьеи

Зег

РЬе

ТЬг

СЬу

Зег

225

230

235

240

ТЬг

СЬу

\7аЬ

СЬу

Ьуз

Зег

Суз

1Ье

НЬз

АЬа

А1а

АЬа

Азр

Зег

Азп

Ьеи

245

250

255

Ьуз

Ьуз

Ьеи

СЬу

Ьеи

СЬи

Ьеи

СЬу

СЬу

Ьуз

Азп

Рго

1Ье

\7аЬ

УаЬ

РЬе

260

265

270

АЬа

Азр

Зег

Азп

Ьеи

СЬи

Азр

АЬа

АЬа

Азр

АЬа

УаЬ

АЬа

РЬе

СЬу

ЬЬе

275

280

285

Зег

РЬе

Азп

ТЬг

СЬу

СЬп

Суз

Суз

УаЬ

Зег

Зег

Зег

Агд

Ьеи

Не

УаЬ

290

295

300

СЬи

Агд

Зег

УаЬ

АЬа

СЬи

Ьуз

РЬе

СЬи

Агд

Ьеи

УаЬ

УаЬ

АЬа

Ьуз

МеЬ

305

310

315

320

- 32 013412

С1и

Ьуз 11е

Агд

Уа1 325

С1у

Азр

Рго

РЬе

Азр Рго Е1и ТЬг С1п Не

б1у

330

335

А1а

Не

ТЬг

ТЬг

С1и

А1а

С1п

Азп

Ьуз

ТЬг

Не

Ьеи

Азр

Туг

Не

А1а

340

345

350

Ьуз

С1у

Ьуз

А1а

С1и

С1у

А1а

Агд

Ьеи

Ьеи

Суз

С1у

С1у

С1у

Не

Уа1

355

360

365

Азр

РЬе

С1у

Ьуз

С1у

С1п

Туг

11е

С1П

Рго

ТЫ

Ьеи

РЬе

ТЬг

Азр

Уа1

370

375

380

Ьуз

Рго

Зег

МеЬ

01 у

Не

А1а

Агд

Азр

С1и

11е

РЬе

61у

Рго

Уа1

Ьеи

385

390

395

400

А1а

Зег

РЬе

Н1з

РЬе

Азр

ТЬг

Уа1

Азр

С1и

А1а

11е

А1а

11е

А1а

Азп

405

410

415

Азр

ТЬг

Уа1

Туг

С1у

Ьеи

А1а

А1а

Зег

Уа1

Тгр

Зег

Ьуз

Азр

Не

Азр

420

425

430

Ьуз

А1а

Ьеи

А1а

Уа1

ТЬг

Агд

Агд

Уа1

Агд

А1а

<31у

Агд

РЬе

Тгр

УаЬ

435

440

445

Азп

ТЬг

Не

Ме£

Зег

С1у

С1у

Рго

С1и

ТЬг

Рго

Ьеи

С1у

Е1у

РЬе

Ьуз

450

455

460

С1п

Зег

С1у

Тгр

С1у

Агд

С1и

А1а

С1у

Ьеи

Туг

С1у

Уа1

С1и

<31и

Туг

465

470

475

480

ТЬг

С1п

Не

Ьуз

Зег

Уа1

ΗΪ3

11е

С1и

ТЬг

С1у

Ьуз

Агд

Зег

ΗΪ3

Тгр

485

490

495

Не Зег <210>15 <211>1401 <212> ϋΝΑ <213> С1исопоЬас£ег охубапз ΙΕΌ 3293 <400>15 аЕдадЬдасд ЕЬддсдЬсдС адададсдЕЪ ссдсдсдЕЬЬ сасЬсаасдд садаадЕдсс60 сЕддЪадсса сЬсЕддсЬдс ддЪддсаддЬ сЕдакдЬЬсд ддсЬддаЬсЬ дддЬдЬсака120

- 33 013412

Бссддадсдс	БдаааБЕсаС	сддБаБсдад	БББсаддЬса	аБдаБББсдд	сааддадБдс	180
аЬЬд'Ьсбссд	дсаЪдаЪддЬ	сддадсадсд	сБсддддссс	ЪдЬЬсддЕдд	дсддсЪдБсс	240
БаЕаЬЕсЪдд	ддсдсааааа	дсЁдсЕдаЪс	аБсЕсддсас	БдсЬсБЬсаЬ	ЬЕссдддЬсд	- 300
дсасксЪдсд	сдсБддсасс	сБссдБЪссд	дЕссбдаЬсд	сддддсдЬдб	ддБссЕБдда	360
сЬддсдаБсд	дсдЪсдсдад	сЕБСассдсБ	ссасЬсЪаСа	ШсддадаЬ	Ьдсдсассад	420
садсаБсдсд	дддсдсСдаЪ	ЬБссдЕсЕаЕ	садсЬсаБда	Ы^асддЬддд	саБЕсСддЬс	480
дсдББсаЕсЕ	ссдаБдсдсБ	ЪсЬддссЪаБ	ЬсдддаЬсак	ддсдсЕддаБ	дсБддддакс	540
дЪдддЪдЪсс	ссддсдЪдсб	дБЪссБдаЪс	ддЪдЕссЪдЬ	БссЬХссдда	садсссдсдс	600
сддсгддггс	Бдсдддддсд	дсасдатдаа	дсдтхсдаТд	ГссГдсасдд	дсСдсдГддс	660
ааБдаЪдсдс	аРдсдсддда	сдадаЬсдБс	даааБссдЪд	аСсадсЪБдс	асаддссдаЪ	720
ддсддаЕаЬа	сдсЕсЬЪсаа	дааааасссд	аасРЪссдсс	дсдсддЪсСа	ЬсЬдддсдЬд	780
дсдсббсадд	сдабссадса	дЕЬсассддс	аЬсаасдкдд	БсаЪдСасба	сдсдссдсаб	840
аЬсЕБсдааа	ЕддссддБЪЪ	сддсассадЬ.	дссдсссБдЬ.	ддддсасддИ	даСсдГддда	900
сЬддЬсааЕд	ЕдсБсЕссас	дЕСсаЪсдсс	аБЕддакаБд	БсдаБсдсБд	дддссддсдд	960
сссаБдсЪда	ЕсдсдддсЕЕ	саЕсаЪдаБд	дсдсБсддЪа	ЪдСХСасддЕ	сддсаЪдсЬд	1020
аЬдЬатсд	дсасдддсаа	садсдаЕсБд	дсдсдЕБасд	сддсадББдс	даЬдсЪдсЬд	1080
Ъдсббсаксд	ЕсдддЬИдс	аШБссдсс	дддссдсЪдд	ЕдСддаЕссЪ	дгдсЪсИдаа	1140
дЬЕсадссса	Едааддддсд	БдасСЪсддс	аЬсдддЬдск	сдассБЪсас	саасБддддс	1200
ассаасаБда	ЕБдСЪддБсБ	дассСЪссБс	БсдсЕЪсЕда	сдасасЪддд	аадбдсссад	1260
ассЕСсБддс	СсСаСдсссБ	дсЬБааБсБс	аСсБЕсаЕЪЪ	ЕсдБдасдаЕ	даадЬЪсдЬд	1320
ссддааассс	дЬддсдкдкс	дсССдадсад	аЬсдадсдда	аСсксаЕддс	сддБааассс	1380
сЬсааБсдСа	БсддсседЪа	а				1401

<210> 16 <211> 466 <212> РКТ <213> СЬисопоЬасбег охубапз ΙΕ0 3293 <400> 16

Ме-Ь Зег 1	Азр УаЬ СЬу УаЬ УаЬ СЬи Зег Уа1 Рго Агд УаЬ Зег Ьеи Азп
5	10	15
СЬу Агд	Зег АЬа Ьеи УаЬ АЬа	ТЬг Ьеи А1а	А1а Уа1 А1а СЬу Ьеи МеЬ
	20	25	30

- 34 013412

РЬе СЬу

Ьеи 35

Азр

Ьеи С1у \7а1

Не 40

Зег

С1у АЬа

Ьеи

Ьуз 45

РЬе

Пе

СЬу

Не

С1и

РЬе

С1п

Уа1

Азп

Азр

РЬе

61у

Ьуз

СЬи

Суз

Пе

Уа1

Зег

СЬу

50

55

60

Мей

МеЬ

Уа1

СЬу

А1а

АЬа

Ьеи

С1у

АЬа

Ьеи

РЬе

СЬу

С1у

Агд

Ьеи

Зег

65

70

75

80

Туг

Пе

Ьеи

С1у

Агд

Ьуз

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Пе

Пе

Зег

АЬа

Ьеи

Ьеи

РЬе

85

90

95

Пе

Зег

СЬу

Зег

А1а

Ьеи

Суз

А1а

Ьеи

А1а

Рго

Зег

Уа1

Рго

Уа1

Ьеи

100

105

110

Пе

А1а

С1у

Агд

\7а1

Уа1

Ьеи

С1у

Ьеи

АЬа

Пе

С1у

Уа1

А1а

Зег

РЬе

115

120

125

ТЬг

А1а

Рго

Ьеи

Туг

Пе

Зег

С1и

Пе

А1а

НЬз

С1п

СЬп

НЬз

Агд

С1у

130

135

140

А1а

Ьеи

Пе

Зег

Уа1

Туг

С1П

Ьеи

Меи

Пе

ТЬг

Уа1

С1у

Пе

Ьеи

Уа1

145

150

155

160

А1а

РЬе

Пе

Зег

Азр

А1а

Ьеи

Ьеи

А1а

Туг

Зег

С1у

Зег

Тгр

Агд

Тгр

165

170

175

Мек

Ьеи

С1у

Пе

νβΓ

С1у

Уа1

Рго

СЬу

Уа1

Ьеи

РЬе

Ьеи

Пе

СЬу

Уа1

180

185

190

Ьеи

РЬе

Ьеи

Рго

Азр

Зег

Рго

Агд

Тгр

Ьеи

Уа1

Ьеи

Агд

СЬу

Агд

НЬз

195

200

205

Азр

С1и

АЬа

РЬе

Азр

Уа1

Ьеи

НЬз

СЬу

Ьеи

Агд

С1у

Азп

Азр

А1а

НЬз

210

215

220

А1а

Агд

Азр

С1и

Пе

Уа1

С1и

Пе

Агд

Азр

С1П

Ьеи

А1а

С1П

А1а

Азр

225

230

235

240

С1у

С1у

Туг

ТЬг

Ьеи

РЬе

Ьуз

Ьуз

Азп

Рго

Азп

РЬе

Агд

Агд

АЬа

Йа1

245

250

255

Туг

Ьеи

СЬу

Уа1

А1а

Ьеи

С1п

А1а

Ые

С1п

С1п

РЬе

ТЬг

С1у

Пе

Азп

260 265 270

Уа1 Уа1 МеЕ

Туг Туг

А1а

Рго

НЬз 280

11е

РЬе

С1и

МеЕ

А1а 285

б!у

РЬе

С1у

275

ТЬг

Зег

А1а

А1а

Ьеи

Тгр

01 у

ТЬг

Уа1

Не

Уа1

б1у

Ьеи

Уа1

Азп

Уа1

290

295

300

Ьеи

Зег

ТЬг

РЬе

Не

А1а

Не

01у

Туг

Уа1

Азр

Агд

Тгр

С1у

Агд

Агд

305

310

315

320

Рго

МеЕ

Ьеи

Не

А1а

С1у

РЬе

Не

МеЕ

МеЕ

А1а

Ьеи

<31у

МеЕ

Р’пе

ТЬг

325

330

335

Уа1

С1у

МеЕ

Ьеи

МеЕ

Туг

РЬе

61у

ТЬг

С1у

Азп

Зег

Азр

Ьеи

А1а

Агд

340

345

350

Туг

А1а

А1а

Уа1

А1а

МеЕ

Ьеи

Ьеи

Суз

РЬе

11е

Уа1

О1у

РЬе

А1а

РЬе

355

360

365

5ег

А1а

С1у

Рго

Ьеи

Уа1

Тгр

Не

Ьеи

Суз

Зег

С1и

Уа1

С1п

Рго

МеЕ

370

375

380

Ьуз

С1у

Агд

Азр

РЬе

С1у

Не

61у

Суз

Зег

ТЬг

РЬе

ТЬг

Азп

Тгр

61у

385

390

395

400

ТЬг

Азп

МеЕ

11е

Уа1

С1у

Ьеи

ТЬг

РЬе

Ьеи

Зег

Ьеи

Ьеи

ТЬг

ТЬг

Ьеи

405

410

415

(31у

Зег

А1а

С1п

ТЬг

РЬе

Тгр

Ьеи

Туг

А1а

Ьеи

Ьеи

Азп

Ьеи

Не

РЬе

420

425

430

Не

РЬе

Уа1

ТЬг

МеЕ

Ьуз

РЬе

Уа1

Рго

С1и

ТЬг

Агд

С1у

Уа1

Зег

Ьеи

435

440

445

01и

01п

Не

61и

Агд

Азп

Ьеи

МеЕ

А1а

61у

Ьуз

Рго

Ьеи

Азп

Агд

Не

450 455 460

Claims (17)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Полинуклеотид, кодирующий полипептид, обладающий активностью репрессора транскрипции Б-сорбозодегидрогеназы (8ИН) и Б-сорбозондегидрогеназы (§N0^, выбранный из группы, состоящей из:

   (a) полинуклеотидов, кодирующих полипептид, содержащий аминокислотную последовательность в соответствии с ГО N0:2;

   (b) полинуклеотидов, содержащих нуклеотидную последовательность в соответствии с ГО N0:1;

   (c) полинуклеотидов, содержащих нуклеотидную последовательность, получаемую амплификацией нуклеиновой кислоты, например полимеразной цепной реакцией, с использованием геномной ДНК из микроорганизма в качестве матрицы и набора праймеров в соответствии с §Ер ГО N0:3 и §Ер ГО N0:4;

   (б) полинуклеотидов, содержащих нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент или производное полипептида, кодируемого полинуклеотидом в соответствии с 8Ер ГО N0:1, где в указанном производном один или более аминокислотных остатков являются консервативно замененными в сравнении с указанным полипептидом, и указанный фрагмент или указанное производное имеет активность регулятора транскрипции, предпочтительно репрессора Б-сорбозодегидрогеназы (8ОН) и/или Бсорбозондегидрогеназы (§N0^;

   (е) полинуклеотидов, комплементарная цепь которых гибридизуется при строгих условиях с полинуклеотидом в соответствии с 8Ер ГО N0:1, и которые кодируют репрессор транскрипции Б

   - 36 013412 сорбозодегидрогеназы (8ΌΗ) и/или Ь-сорбозондегидрогеназы (8ΝΏΗ); и (ί) полинуклеотидов, которые по меньшей мере на 60%, например, 70, 85, 90 или 95% идентичны полинуклеотиду в соответствии с 8Е0 ΙΌ N0:1 и которые кодируют репрессор транскрипции Ьсорбозодегидрогеназы (8ΌΗ) и/или Ь-сорбозондегидрогеназы (8ΝΏΗ);

   или комплементарная цепь такого полинуклеотида.
2. 2. Рекомбинантный микроорганизм, генетически сконструированный с использованием полинуклеотида по п.1.
3. 3. Микроорганизм по п.2, непосредственно продуцирующий витамин С из Ό-сорбита в количествах 300 мг/л или более при измерении в способе покоящихся клеток после периода инкубации 20 ч.
4. 4. Микроорганизм по п.3, способный непосредственно продуцировать витамин С из Ь-сорбозы в количествах 800 мг/л или более.
5. 5. Полипептид, кодируемый полинуклеотидом по п.1.
6. 6. Применение разрушенного полинуклеотида по п.1 для получения витамина С и/или 2-КОА.
7. 7. Микроорганизм по п.2 или микроорганизм, содержащий эндогенный ген, включающий в себя полинуклеотид по п.1, причем указанный микроорганизм генетически изменен таким образом, что это приводит к улучшенному выходу и/или улучшенной эффективности продуцирования витамина С и/или 2КОА, продуцируемых указанным микроорганизмом.
8. 8. Микроорганизм по п.7, продуцирующий полипептид по п.4 с уменьшенной или устраненной активностью репрессора транскрипции гена Ь-сорбозодегидрогеназы (8ΌΗ) и/или Ьсорбозондегидрогеназы (8ΝΌΗ).
9. 9. Микроорганизм по любому из пп.2-4, 7 или 8, в котором полинуклеотид по п.1 является разрушенным.
10. 10. Микроорганизм по любому из пп.2-4 или 7-9, выбранный из группы, состоящей из Ркеиботопак, Рап1оеа, ЕксЬепсЫа, Ке1о§и1ошс1дешит и уксусно-кислых бактерий, таких как, например, О1исопоЬас1ег, Асе1оЬас1ег или О1исопасе1оЬас1ег, предпочтительно Асе1оЬас1ег §р., Асе1оЬас1ег асей, О1исопоЬас1ег йга1еит, О1исопоЬас1ег сегшш, О1исопоЬас1ег Шайапбкш, О1исопоЬас1ег охубапк, предпочтительно О1исопоЬас1ег охубапк, более предпочтительно О1исопоЬас1ег охубапк ΙΡ0 3293.
11. 11. Способ получения разрушенного эндогенного гена репрессора транскрипции Ьсорбозодегидрогеназы (8ΌΗ) и/или Ь-сорбозондегидрогеназы (8ΝΏΗ) в микроорганизме, причем указанный микроорганизм содержит полинуклеотид по п.1, причем указанный способ предусматривает стадию изменения указанного полинуклеотида таким образом, что это приводит к улучшенному выходу и/или улучшенной эффективности продуцирования витамина С и/или 2-КОА, продуцируемых указанным микроорганизмом.
12. 12. Способ получения микроорганизма, способного продуцировать витамин С и/или 2-КОА, предусматривающий стадию изменения указанного микроорганизма, несущего полипептид по п.1, таким образом, что этот микроорганизм продуцирует полипептид с уменьшенной или устраненной активностью репрессора транскрипции гена Ь-сорбозодегидрогеназы (8ΌΗ) и/или Ь-сорбозондегидрогеназы (8ΝΏΗ), приводя к улучшенному выходу и/или улучшенной эффективности продуцирования витамина С и/или 2КОА, продуцируемых указанным микроорганизмом.
13. 13. Способ получения микроорганизма, способного продуцировать витамин С и/или 2-КОА, предусматривающий стадию изменения указанного микроорганизма таким образом, что микроорганизм продуцирует полипептид с уменьшенной или устраненной активностью репрессора транскрипции гена Ьсорбозодегидрогеназы (8ΌΗ) и/или Ь-сорбозондегидрогеназы (8ΝΌΗ), приводя к улучшенному выходу и/или улучшенной эффективности продуцирования витамина С и/или 2-КОА, продуцируемых указанным микроорганизмом.
14. 14. Способ получения микроорганизма, содержащего эндогенный ген, включающий полинуклеотид по п.1, предусматривающий стадию изменения указанного микроорганизма таким образом, что эндогенный ген недостаточно экспрессируется или разрушен, приводя к улучшенному выходу и/или улучшенной эффективности продуцирования витамина С и/или 2-КОА, продуцируемых указанным микроорганизмом.
15. 15. Способ по п.13 или 14 для получения микроорганизма по любому из пп.7-10.
16. 16. Способ получения витамина С и/или 2-КОА при помощи микроорганизма по любому из пп.7-10 или пп.2-4, где указанный микроорганизм инкубируют/культивируют в водной среде в условиях, которые делают возможным прямое получение витамина С и/или 2-КОА из Ό-сорбита или Ь-сорбозы, и где витамин С и/или 2-КОА необязательно выделяют в виде продукта ферментации.
17. 17. Применение микроорганизма, в котором полинуклеотид по п.1 разрушен, для получения витамина С и/или 2-КОА.