KR20110104955A

KR20110104955A - 리보플라빈의 제조 방법

Info

Publication number: KR20110104955A
Application number: KR1020117016203A
Authority: KR
Inventors: 플로리안 키르크너; 클라우스 마우흐; 요아킴 슈미드
Original assignee: 디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이.
Priority date: 2008-12-15
Filing date: 2009-12-15
Publication date: 2011-09-23
Also published as: KR101739147B1; DE102008063234A1; JP5813512B2; DE102008063234B4; CN102245781B; EP2358893A2; CN102245781A; JP2012511898A; US8759024B2; WO2010075960A3; WO2010075960A8; WO2010075960A2; US20110312026A1

Abstract

본 발명은 리보플라빈(비타민 B2로도 언급된다)의 생명공학적 발효 생산 방법 및 수단, 및 상기 방법을 수행하기 위한 수단, 특히 리보플라빈 생산이 증가된 개질된 미생물 숙주 세포에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 숙주 세포의 리보플라빈 생산에 참여하는 효소 활성의 발현을 조절하는 신규한 방법 및 수단을 개시한다.

Description

리보플라빈의 제조 방법{METHOD FOR PRODUCING RIBOFLAVIN}

본 발명은 리보플라빈(이하, 비타민 B2로도 언급된다)의 생명공학적 발효 생산 방법 및 수단, 및 상기 방법을 수행하기 위한 수단, 특히 리보플라빈 수율이 증가된 개질된 미생물 숙주 세포에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 숙주 세포의 리보플라빈 생산에 참여하는 효소 활성의 발현을 조절하는 신규한 방법 및 수단을 개시한다.

리보플라빈은 플라빈 모노뉴클레오타이드(FMN) 및 플라빈 아데닌 다이뉴클레오타이드(FAD)의 전구체 분자이다. 이들은 생물적 세포 및 유기체에서 다수의 효소적 산화환원 반응을 위한 필수 보조인자이다. 따라서, 리보플라빈은 식품 및 동물 사료 산업에서 중요한 첨가제이다. 미생물 및 식물에서, 리보플라빈은 통상적으로 퓨린 물질대사에서 나온 구아노신 트라이포스페이트(GTP) 및 펜토스 포스페이트 경로에서 나온 리뷸로스-5-포스페이트로부터 7개 효소 반응을 통해 합성된다.

연간 약 4000톤의 리보플라빈이 다양한 미생물에서 생명공학적으로 생산된다. 가장 중요한 숙주 유기체는 바실러스, 특히 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis)이다. 이들과는 별도로, 저급 진핵세포를 비롯한 다른 미생물 세포가 또한 이용된다. 예는 에레모테시움 애쉬비(Eremothecium ashbyii), 애쉬비아 고시피(Ashbya gossypii), 칸디다 파마타(Candida famata)이다.

리보플라빈 합성에 대해 공지된 생명공학적 방법은 개선을 필요로 하고, 무엇보다도 리보플라빈의 수율 및 생산 속도가 개선될 필요가 있다. 따라서, 특히 미생물 바실러스 섭틸리스에 근거한, 개선된 생산 방법 및 개선된 숙주 세포를 제공할 필요가 있다. 이는 특히 물질대사 활성, 특히 숙주 세포에서 리보플라빈 합성과 관련된 효소 활성을 단순하고 효과적으로 제어할 수 있는 수단을 제공하는 것에 관한 것이다. 또한, 이는 특히 야생형과 비교하였을 때 증가된 리보플라빈 합성을 갖는 개질된 숙주 세포의 제공에 관한 것이다.

본 발명자는 놀랍게도 전사 인자 CcpC가 리보플라빈 생산 속도에 긍정적인 영향을 갖는 것을 발견하였다. CcpC는 LysR 전사 인자의 패밀리에 속하고, 트라이카복실산 사이클(TCA)의 효소 활성을 코딩하는 유전자, 무엇보다도 citB 및 citZ를 조절하는 것을 공지되어 있다. 놀랍게도, 리보플라빈 수율이 전사 인자 CcpC의 활성 및/또는 세포내 농도에 직접적으로 의존하는 것으로 발견되었다. CcpC의 감소된 활성은 수율의 감소로 이어진다. CcpC에 의해 조절되는 것으로 공지된 TCA의 효소 활성이 리보플라빈 합성의 물질대사 경로와 직접적인 연관성이 없기 때문에, 이 효과는 놀랍고 당 분야에서 예상할 수 없었던 것이다.

바이오매스 생산, 특히 본 발명에 따라 개질된 세포, 특히 CcpC-결핍 세포, 예를 들면 바실러스 섭틸리스의 ccpC 녹아웃(knockout) 형질변환체의 성장 속도가 본질적으로 변화되지 않고 유지된다는 점이 또한 놀랍다.

따라서, 본 발명은 CcpC 유형의 전사 인자 및/또는 세포에서 존재하고/하거나 발현되는 이의 호몰로그(homolog) 또는 오르토로그(ortholog)의 활성 또는 농도가 개질된, 특히 감소된 점을 특징으로 하는 개질된 리보플라빈 생산 세포 또는 세포주, 진핵 세포 또는 원핵 세포, 특히 미생물 세포에 관한 것이다. 이 개질을 통해 세포 또는 세포주는 리보플라빈 생산을 증가시킬 수 있다.

특히 CcpC 유형의 전사 인자의 발현 및/또는 활성이 비-개질된 미생물 또는 야생형 미생물에 비해 감소된, 바람직하게는 25% 이상 감소된, 개질된 리보플라빈-생산 미생물에 관한 것이다.

바람직하게는, 전술된 세포 또는 세포주는 CcpC를 코딩하는 유전자가 전혀 발현되지 않거나(발현 억제) 또는 적어도 감소된 발현을 나타내고(저발현됨), 이로 인해 상기 세포/세포주에서 CcpC 단백질의 활성이 존재하지 않거나 감소된다. 세포/세포주는 바람직하게는 CcpC-결핍된 돌연변이체 또는 형질전환체이고, 특히 CcpC 및/또는 이의 호몰로그 및/또는 오르토로그를 코딩하는 하나 이상의 유전자의 녹아웃 돌연변이체이다.

본원과 관련하여, "감소된"이란 CcpC 단백질, 또는 이의 호몰로그 또는 오르토로그의 전사 인자로서의 작용의 감소된 활성, 특히 활성 없음, 및 세포, 특히 CcpC-결핍 세포에서 유전자 생성물 CcpC의 낮은 카피 수 또는 농도를 야기하는 ccpC 유전자 또는 이의 호몰로그 또는 오르토로그의 감소된 발현, 특히 발현 없음 둘 모두를 의미하는 것으로 이해된다. 감소된 활성은 비-개질된(CcpC 야생형) 세포/세포주에서 ccpC 유전자의 발현을 기준으로 25% 이상, 바람직하게는 50, 75, 80, 90, 95, 98 또는 100%의 감소를 의미하는 것으로 이해된다. 이러한 감소는 유전자의 활성 및 또한 상응하는 유전자 생성물 둘 모두에 관한 것이다.

따라서, 본 발명에 따른 세포 또는 본 발명에 따라 개질된 세포에서, 무엇보다도 ccpC 유전자 및/또는 이의 유전자 생성물은 예를 들면 바실러스, 특히 바실러스 섭틸리스에서 발현되었을 때 CcpC 야생형에 비해 억제되거나, "녹-아웃"되거나, 이의 기능(활성)이 손상된다.

유전자 또는 단백질 활성을 측정하기 위한 다양한 방법이 당 분야의 숙련자들에게 공지되어 있다. 적합한 방법은 예를 들면 노던 블럿 또는 ccpC 유전자의 활성을 측정하기 위한 "유전자 칩" 방법의 이용 및 CcpC에 대해 특이적인 항체를 이용한 웨스턴 블랏, 또는 세포 내의 단백질 농도를 측정하기 위한 정량적 "2-D SDS-PAGE 젤"이다. 전사 인자, 특히 CcpC의 활성은 또한 조절되고자 하는 유전자, 예를 들면 citB 또는 citZ의 상응하는 결합 부위에서 결합된 CcpC의 양을 측정하는 "겔 시프트" 실험을 통해 간접적으로 측정될 수 있다. ccpC의 유전자 발현을 감소시킴으로써, 결합된 CcpC의 양이 또한 하락할 것이고, 이는 폴리아크릴아마이드 겔 상에서의 신호의 정량적 측정에 의해 분석될 수 있다. 이들 및 다른 측정 방법은 당 분야의 숙련자들에게 공지되어 있고 본 발명의 측면에서 CcpC의 활성을 측정하는데 이용할 수 있다.

본 발명을 수행하기 위한 적합한 세포 또는 세포주(숙주 세포로 요약됨)는 ccpC 유전자 또는 이의 호몰로그 또는 오르토로그의 발현이 감소될 수 있는 모든 공지된 리보플라빈-생산 세포이다. 예는 원핵세포 또는 진핵 세포, 바람직하게는 그램 음성 또는 그램 양성 박테리아, 특히 미생물 세포, 예를 들면, 바실러스(Bacillus), 코리네박테리움(Corynebacterium) 또는 슈도모나스(Pseudomonas)이다. 바람직한 세포는 바실러스 속, 예를 들면 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 스테아로테모필루스(Bacillus stearothermophilus), 바실러스 할로두란스(Bacillus halodurans), 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquifaciens) 또는 바실러스 섭틸리스이고, 바실러스 섭틸리스가 특히 바람직하고, 예를 들면 바실러스 섭틸리스 168이다.

본 발명에 적합한 특히 바람직한 숙주 세포는 강한 프로모터인 P_spo15가 삽입되어 리보플라빈 유전자의 전사가 강화된 개질된 리보플라빈(rib) 오페론을 코딩하는 여러 카피(예를 들면 약 5 내지 약 20개 카피)의 플라스미드 pRF69를 함유하는 바실러스 섭틸리스 RB50::[pRF69]_n이다(예를 들면 리보플라빈 합성을 증가시키는 균주의 구축 및 배양 조건에 대해서는 유럽 특허 제405370호 및 [Perkins et al., J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 22:8-18, 1999]를 참고할 수 있다). 바실러스 섭틸리스 RB50 및 플라스미드 pRF69는 부다페스트 협약에 따라 각각 "미국 농무성 균주 보존 센터"(NRRL; 미국 일리누이주 페오리아 소재)에서 수탁 번호 B 18502로, 그리고 "미국 균주 보존 센터"(ATCC; 미국 버지니아주 20108 마나사스 우편함 1549)에서 수탁 번호 ATCC 68338로 기탁되어 있다.

본 발명의 바람직한 양태에서, ccpC 유전자의 개질은 바실러스 속, 특히 바실러스 섭틸리스 균주에서 수행된다. 리보플라빈 오페론이 규제철페된 바실러스 균주, 특히 바실러스 섭틸리스 균주가 숙주 세포로서 특히 바람직하다. 규제철폐된 리보플라빈 오페론의 예는 공지되어 있고, 소위 "ribO" 및 "ribC" 돌연변이를 포함한다. 규제철폐로 인해 rib 유전자의 유전자 발현이 강화된다. 전사 조절자인 Spo0A를 코딩하는 유전자가 (과)발현된 숙주 세포, 특히 바실러스 섭틸리스가 특히 바람직하다. 따라서, 가장 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 spo0A 유전자의 활성 형태가 발현되도록 돌연변이된 바실러스 섭틸리스 RB50에서 수행된다.

본 발명에 적합한 추가의 미생물은 예를 들면 하기의 기탁 기관에서 공공연하게 이용가능하다: 독일 생물자원은행(DSMZ)(독일 데-38124 브라운슈베이그 인호프펜스트라쎄 7베 소재), NITE 생물 자원 센터(일본 292-0818 시바현 기자라주시 가주사카마타리 2-5-8 소재)(이전 명칭: 오사카 발효 연구소(IFO)(일본 532-8686 오사카시 요도가와쿠 주소-혼마치 2-초메 17-85 소재), 또는 바실러스 유전 보존 센터(BGSC)(미국 오하이오주 43210 콜롬버스 오하이오 주립 대학 소재).

본 발명과 관련하여, 상기 미생물은 원핵생물 국제 명명법에 의해 정의된, 동일한 생리학적 성질을 갖는 종의 동명 또는 이명도 포함함을 이해해야 한다. 본원에서 사용된 미생물 명명법은 국제 원핵생물 분류 위원회, 및 국제 미생물학회 연맹의 박테리아 및 응용 미생물 부서에 의해 공식적으로 승인된 명명법이고, 우선권 출원시 문헌[International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology(IJSEM)]에 공개되어 있다.

본 발명은 돌연변이된, 특히 비-기능성 유전자에 관한 것이다. 본 발명은 이로부터의 돌연변이된, 특히 비-기능성 전사물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이로부터의 돌연변이된, 특히 비-기능성 폴리펩타이드에 관한 것이다. CcpC 야생형 또는 이의 호몰로그 또는 오르토로그의 기능이 감소되거나 억제된 유전적으로 개질된 숙주 세포를 제공하기 위해서 이런 돌연변이된 구조체가 본 발명에서 특히 적합하다.

결론적으로 본 발명에 따른 개시 내용의 필수 요소는 숙주 세포에서 리보플라빈 생합성을 증가시키기 위해 세포에서 ccpC 유전자, CcpC 전사체 또는 번역된 전사 인자의 유효, 즉 활성 농도를 감소시키는 것이다. CcpC 또는 이의 호몰로그 또는 오르토로그의 활성 및/또는 세포내 농도의 감소는 당 분야에 공지된 방식으로 달성될 수 있다. 당 분야의 숙련자들은 소위 CcpC-결핍되거나 ccpC 녹아웃 돌연변이체 또는 형질변환체를 수득하기에 적절한 생명공학적 공정 및 수단을 알고 있다. 따라서 본 발명은 본원에 보다 상세하게 개시된 바람직한 변이체 및 실시양태로 제한되지 않는다.

본 발명에 따르면, 용어 "돌연변이"는 비-기능성 "돌연변이된" 유전자 생성물을 야기하는 핵산 분자의 임의의 유전적 개질, 즉 분자 수준에서의 특정한 개질을 의미하고자 한다. 특히, 이는 유전자 생성물의 합성을 방해하는, 즉 본원에서는 CcpC 유형의 전사 인자의 합성을 방해하고/하여 "돌연변이"되거나 개질된 폴리펩타이드의 발현을 야기하는 미생물의 게놈에서의 변화를 의미하는 것으로 이해되고, 이는 변화된 "돌연변이된" 아미노산 서열을 갖고, 이의 기능이 CcpC 야생형에 비해 부분적으로 또는 완전히 손실된다. 유전자 또는 유전자 생성물에서 본 발명에 따른 돌연변이는 전사, 번역 및 적용가능한 경우 번역 후 개질에서 선택된 발현에서의 하나 이상의 단계에서의 변화를 야기한다. 이 돌연변이는 바람직하게는 점 돌연변이, 결실, 치환, 삽입, 및 유전자 서열 이내에서 하나 이상의 뉴클레오타이드의 반점에서 선택된다. 그러나 유전자 돌연변이에 대한 평가는 이들 바람직한 실시양태로 제한되지 않는다. 당 분야의 숙련자들은 유전자에 돌연변이를 위치시키기위한 추가의 가능성을 알고 있다. 본 발명에 따른 돌연변이의 목적은 CcpC를 코딩하는 하나 이상의 유전자의 발현을 억제하는 것이다. 이와 관련된 목적은 세포에서 감소된 활성, 특히 조절 활성을 나타내는 야생형에 비해 개질된 전사 인자의 발현이다.

"돌연변이"는 유전자의 코딩 서열의 직접적인 개질 뿐만 아니라 발현과 관련된 다른 구조 또는 서열의 개질에 관한 것이다. 이들은 바람직하게는 유전자의 오페론의 구조, 특히 바람직하게는 프로모터, 조절자, 오퍼레이터, 전사 인자 결합 부위, 터미네이터 및 이의 보조 인자에서 선택되는 조절 구조를 포함하며, 이로 배타적으로 제한되지는 않는다.

본 발명에서, "기능"은 "기능-관련", "기능-유사" 및 "기능화"와 관련하여, 전사 인자가 결합되는 오퍼레이터 구조를 갖는 유전자 또는 오페론의 발현의 조절을 위한 CcpC 야생형, 또는 이의 호몰로그 또는 오르토로그의 전사 인자 기능을 의미하는 것으로 이해된다. 단백질, 특히 전사 인자, 예를 들면 CcpC의 기능은 본 발명에 따라 또한 활성으로 표현되고, 여기서 CcpC 야생형의 전사 인자 기능은 100%의 전사 인자 활성에 상응한다. 활성을 결정하기에 적합한 공지된 방법의 선택이 전술되어 있다.

본 발명의 대상은 ccpC 유전자, 및 이의 호몰로그 및 오르토로그를 나타내는 단리된 핵산 분자이다. 본 발명은 특히 서열 번호: 1의 뉴클레오타이드 서열로 표현되고, 예를 들면 바실러스 섭틸리스에서 발생되는 이 유전자에 관한 것이다. 본 발명은 또한 예를 들면 서열 번호: 2의 아미노산 서열로 표현되는 이의 유전자 생성물(CcpC 단백질)에 관한 것이다. 유전자 ccpC는 특히 전술된 적합한 숙주 세포중 하나, 바람직하게는 바실러스 섭틸리스에서의 오페론의 일부이다. 예를 들면 EMBL, 젠뱅크(Genbank), 스위스프로트(SwissProt) 등과 같은 적합한 데이터베이스에서 "BLAST" 조사를 수행하는 호몰로거스/오르토로거스 CcpC 서열을 찾는 방법은 당 분야의 숙련된 이들에게 공지되어 있다. 이들 서열은 CcpC 야생형으로 작용하고, 이는 그런 다음, 본 발명에 따라 개질되고, 이는 적절한 숙주 미생물에서 리보플라빈 생합성의 증가를 야기한다. 이 야생형 서열을 함유하는 미생물은 본 발명과 관련하여 야생형 미생물로서 언급된다.

따라서, 본 발명은 특히 CcpC 유형 또는 이의 호몰로그 또는 오르토로그에서 유래된 "돌연변이된" 전사 인자를 코딩하는 -바람직하게는 단리된- 돌연변이된(개질된) 핵산 분자에 관한 것이고, 여기서 비-개질된 (야생형) 핵산 분자는

a) 서열 번호: 1의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 상기 뉴클레오타이드 서열로 구성된 핵산 분자;

b) 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하거나 상기 아미노산 서열로 구성된 폴리아미노산 분자(단백질)를 코딩하는 핵산 분자;

c) a) 또는 b)의 핵산 분자와 70% 이상의 상동성을 갖는 핵산 분자;

d) 엄격한 조건 하에서 a) 또는 b)의 핵산 분자 중 하나와 하이브리드를 형성하는 핵산 분자; 및

e) CcpC 유형의 전사 인자의 기능/활성을 갖는 단백질을 코딩하는, a) 또는 b)의 핵산 분자의 절편 및/또는 유사체(analog)

로 구성된 군에서 선택되며, 여기서 돌연변이된 핵산 분자는 CcpC 야생형의 활성과 비교하였을 때 CcpC 단백질의 활성 감소를 야기하는 하나 이상의 유전자 돌연변이를 나타낸다.

전술된 바와 같이, 바람직한 실시양태에서, ccpC 유전자는 완전히 녹아웃된다(소위 녹아웃 돌연변이).

본 발명의 추가의 대상은

a) 적어도 서열 번호: 2의 아미노산을 포함하거나 상기 아미노산 서열로 구성된 폴리아미노산 분자;

b) 상기 특징을 갖는 핵산 분자에 의해 코딩되는 폴리아미노산 분자;

c) a) 또는 b)의 분자에 대해 70% 이상의 상동성을 갖는 폴리아미노산 분자; 및

d) CcpC 유형의 전사 인자의 기능을 갖는 a) 또는 b)의 폴리아미노산 분자중 하나 이상의 단편 및/또는 유사체로 구성된 군에서 선택되며,

여기서, a) 내지 d)의 단백질이 상기 개시된 바와 같이 변형되어 전사 인자로서의 활성이 감소된 야생형 CcpC인, 바람직하게는 단리된 상태로 존재하는, 폴리아미노산 분자(단백질 또는 폴리펩타이드)이다.

본 발명은 또한 각각 바람직한 서열 번호: 1 또는 서열 번호: 2에 대해 특히 상당히 "상동성"인 상당한 서열 동일성을 나타내는 이런 핵산 분자 또는 단백질에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 이는 70% 이상, 바람직하게는 75% 이상, 특히 바람직하게는 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상의 서열 동일성의 상동성을 의미하는 것으로 이해된다. 바람직하게는, 서열은 전체 길이에 걸쳐 각각 서열 번호: 1 또는 서열 번호: 2에 대한 동일성에 관한 것이다. 바람직한 변형에서, 전술된 서열 동일성은 배타적으로 서열 번호: 1 및 서열 번호: 2의 기능-관련된 영역에 관한 것이다. 이런 영역의 예는 ccpC 유전자에서의 DNA 결합 도메인이다. 당 분야의 숙련자들은 이런 유전자 영역을 확인하기 위한 프로그램에 대해 알고 있다.

핵산 분자 사이의 "상동성"에 관해, "엄격한 조건"하에서의 하이브리드화가 하나의 기준으로서 이해될 수 있다. "엄격한 기준"의 경우, 예를 들면 [Maniatis et al., 1989: "Molecular cloning, a laboratory manual", 2^nd Edition, Cold Spring Harbours Laboratory, N.Y.]에 개시된 바와 같은 공지된 기술 문헌을 참고할 수 있다. "엄격한 조건"은 실제 서열에 의존한다. 통상적으로, 서열-동일한 상보적 프로브의 50%가 표적 서열에 하이브리드를 형성하는 특정 서열의 용융점보다 5 내지 10K 더 낮은 하이브리드화 온도를 의미하는 것으로 이해된다. 핵산 서열의 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상 또는 특히 바람직하게는 80% 이상, 가장 바람직하게는 85% 내지 90% 이상, 특히 95% 이상이 서로에 대해 상동성인 조건이 바람직하다.

예로서 제시된 엄격한 조건 하에서의 하이브리드 형성에 관한 실시양태에서, 반응은 약 45℃에서 6x 염화나트륨/시트르산나트륨(SSC)에서 수행되고, 후속적으로 50℃, 바람직하게는 55℃, 특히 바람직하게는 60℃, 특히 바람직하게는 65℃에서 1x SSC, 0.1% SDS로 세척된다.

"매우 엄격한 조건" 하에서의 하이브리드화, 예를 들면 42℃에서 며칠, 예를 들면 2일 내지 4일동안 표지된 프로브, 예를 들면 디곳시게닌(DIG)로 라벨링된 프로브를 이용하여 항온처리된 후, 실온에서 2x SSC, 0.1% SDS중에서의 1회 이상의 세척 단계 및 65 내지 68℃에서 0.5x SSC, 0.1% SDS 또는 0.1x SSC, 0.1% SDS중에서의 1회 이상의 세척 단계가 바람직하다. 특히 예를 들면 "매우 엄격한 조건"은 예를 들면 "디그이지하이브(DigEasyHyb) 용액"(로슈 다이아그노스틱스 게엠베하)와 같은 용액(및 100㎍/ml의 연어 정자 핵산의 선택적 첨가), 또는 50% 포름아미드, 5x SSC, 0.02% SDS, 0.1% N-라우릴사코신 및 2% "블록킹 시약"(로슈 다이아그노스틱스 게엠베하)을 함유하는 용액 중에서 DIG-라벨링된 프로브(예를 들면 독일 만하임 68298 소재의 로슈 다이아그노스틱스 게엠베하의 "DIG 라벨링 시스템"을 이용하여 제조됨)를 사용하여 42℃에서 2시간 내지 4일동안 항온처리한 후, 실온에서 2x SSC, 0.1% SDS중에서 5 내지 15분간 2회 세척하고, 0.5x SSC, 0.1% SDS 또는 0.1x SSC, 0.1% SDS에서 65℃ 내지 68℃에서 2회 동안 세척함을 포함한다.

본원에서, 용어 "상동성" 또는 "동일성%"는 상호교환되어 사용된다. 2개의 핵산 또는 아미노산 서열이 서로에 대해 "상동성" 또는 "동일"한 비율을 측정하기 위해서는, 2개의 서열을 모두 최적 비교되도록 조절한다(따라서, 예를 들면 2개의 서열이 최적 배열되도록 한 서열에 간극이 도입된다). 그런 다음, 상응하는 위치에서의 뉴클레오타이드를 비교한다. 제1 핵산 서열에서의 한 위치가 제2 서열의 상응하는 위치에서의 동일한 뉴클레오타이드에 의해 점유되는 경우, 2개의 분자는 그 위치에서 동일하고, 이는 100%의 상동성 또는 동일성에 상응한다. 2개 서열 사이의 % 동일성은 상기 서열들이 공유하는 동일한 위치의 수의 함수이다(즉, 동일성 % = 동일한 위치의 수/총 위치의 수(즉, 겹쳐지는 위치) x 100). 바람직하게는, 비교되고자 하는 서열은 동일한 길이를 갖는다. 동일성을 측정하기 위해서 당업자는 여러 다양한 컴퓨터 프로그램, 예를 들면 니들만(Needleman) 및 번슈(Wunsch)(J. Mol. Biol. (48): 444-453 (1970)) 알고리즘에 따라 조작되는 GCG 소프트웨어 팩키지(http://www.accelrys.com에서 이용가능한)의 한 요소인 GAP 프로그램을 이용할 수 있다.

본 발명과 관련하여, 용어 "오르토로그"는 모두가 하나의 공통의 기원 유전자에서 발생한 서로 다른 속의 유전자를 의미하는 것으로 이해되어야만 한다. 정상적으로, 이들 오르토로그 유전자의 기능은 진화동안 보존된다. 이전에 서열이 확인되지 않은 게놈에서 유전자 기능을 신뢰성있게 예측할 수 있기 위해서는 오르토로그의 확인은 중요하다.

이와는 대조적으로, 본 발명의 측면에서, 하나의 공통 유전자에서 실제로 유래되었지만, 진화 과정에서 획득된 다른 기능을 갖는 유전자는 "유사체"라 언급된다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명은 조절된 유전자 또는 오페론과 연관된 오퍼레이터 구조와의 상호작용 및/또는 결합 활성이 감소되거나 없는 CcpC 또는 이의 호몰로그 또는 오르토로그에서 유래된 개질되거나 "돌연변이된" 유전자 생성물이 수득되도록, 전사 인자 CcpC 또는 이의 호몰로그 또는 오르토로그의 활성, 결합 친화성 및/또는 조절된 유전자의 오페론과의 상호작용의 개질, 특히 감소를 제공한다.

바람직한 변이체에서, 개질된 "돌연변이된" 아미노산 서열, 특히 개질된 단백질 구조를 갖는 유전자 생성물이 수득되도록, 이는 원래의 ccpC 유전자(야생형) 또는 이의 호몰로그 또는 오르토로그의 직접적 유전자 개질에 의해 수득된다.

대안적이거나 바람직한 추가의 변이체에서, 전사, 번역 및, 적용가능한 경우 번역-후 가공에서 선택된 하나 이상의 공정을 변형시킴으로써 수행되고, 이들 공정과 관련된 하나 이상의 분자 구조, 또는 이를 위한 보조인자의 개질이 특히 바람직하다. 이는 이들 공정중 하나 이상에서 포함된 구조 또는 서열에 결합하고/하거나 이를 불활성화시키는 하나 이상의 구조 또는 구축물을 이용함으로써 수행된다. 이 구조 또는 구축물은 바람직하게는 안티센스 구축물 및 항체에서 선택되지만, 이로 배타적으로 제한되지는 않는다.

바람직하게는, 전사 인자 CcpC 또는 이의 호몰로그 또는 오르토로그의 활성 및/또는 농도는 특정한 억제제를 이용함으로써 직접적으로 감소된다. 이런 특이적 억제제의 예는 CcpC 유전자 또는 이의 호몰로그 또는 오르토로그, 또는 본 발명에 따른 다른 구조적으로 관련된 핵산 분자의 안티센스 구축물이고, 이는 당 분야에 공지된 방식으로 숙주 세포에 일시적 또는 안정적으로 도입되어 숙주 세포에서 발현된다.

다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 전사 인자 CcpC 및 이의 호몰로그 또는 오르토로그의 농도/활성, 즉, 특히 카피 수 또는 발현이 감소되거나/되고, 필요한 경우 이의 보조 인자의 발현이 감소된, 특히 발현이 감소되거나 완전히 억제된 개질이 제공된다. 바람직한 변이체에서, 이는 ccpC 유전자 또는 이의 호몰로그 또는 오르토로그의 오페론의 직접적인 유전자 개질에 의해 수행된다. 바람직한 변이체에서는, 저발현이 일어나거나 또는 전혀 발현되지 않는, 달리 말하자면 "녹아웃"되도록 유전자의 발현을 조절하는 프로모터의 개질이 이를 위해 제공된다.

다른 또는 바람직하게는 추가의 변이체에서, 이는 전사, 번역 및 적용가능한 경우 번역-후 가공에서 선택된 하나 이상의 공정, 바람직하게는 이들 공정과 관련된 하나 이상의 분자 구조 또는 이들을 위한 보조인자를 조절함으로써 수행된다. 여기에는 특히 녹아웃 돌연변이가 포함되고, 이는 예를 들면 동종 재조합, 및 또한 당 분야에 공지된 방식의 안티센스 구조체를 이용하여 수득될 수 있다.

본 발명에 따른 핵산 또는 안티센스 구조체는 일반적으로 공지된 방법에 의해 숙주 세포로 도입될 수 있다. 바람직한 방법은 바람직하게는 전기천공, 세제 또는 유사한 수단에 의해 숙주 세포의 세포 벽 및/또는 막을 붕괴시키고, 다르게는 또는 바람직하게는 추가로 탄도적 방법(예를 들면 "유전자 총") 또는 유사한 방법을 이용하는 것이며, 본 발명은 이들 방법 및 수단으로 한정되지 않는다.

따라서, 본 발명의 한 양태는 안티센스 배향으로 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 서열을 갖는 합성적으로 생성된 DNA 또는 RNA 분자이고, 이는 숙주 세포에 도입될 수 있다. 이는 특히 안티센스 배향인 이 핵산 분자의 하나 이상의 카피를 포함하는 벡터를 포함한다.

따라서, 본 발명의 바람직한 실시양태는 CcpC 또는 이의 호몰로그 또는 오르토로그의 발현이 억제되도록 개질되어 있는 개질된 미생물 세포이다. 한 변이체에서, 세포는 CcpC 또는 이의 호몰로그 또는 오르토로그가 저발현되도록 개질된다. 바람직한 실시양태에서, 세포는 CcpC를 코딩하는 하나 이상의 유전자의 녹아웃 돌연변이체이다. 따라서 본 발명은 또한 바실러스 섭틸리스의 CcpC 코딩 유전자의 호몰로그의 녹아웃 돌연변이체인 개질된 세포를 포함한다. 따라서 본 발명은 또한 바실러스 섭틸리스의 CcpC 코딩 유전자의 오르토로그의 녹아웃 돌연변이체를 포함한다. 본 발명은 또한 CcpC 및 이의 유전자의 다른 기능-유사체의 녹아웃 돌연변이체를 포함한다.

숙주 세포의 유전자 개질의 다른 또는 바람직한 추가의 변이체에서, 유전자 개질은 CcpC 전사 인자의 하나 이상, 바람직하게는 여러 결합 구조 및 이의 절편에서 일어난다. 이들은 바람직하게는 숙주 세포에서 CcpC에 의해 조절되는 유전자의 오퍼레이터 구조이다. 조절된 유전자는 특히 citB 및 citZ이지만, 본 발명이 이로 한정되지는 않는다. CcpC에 의해 조절되는 유전자의 오퍼레이터 분획 부근에서 본 발명에 따른 하나 이상의 바람직하게 제공된 돌연변이를 통해, 전사 인자의 오퍼레이터로의 결합이 방지 또는 감소되어 유전자의 전사에 대한 조절 효과가 감소되거나 전혀 생성되지 않는다. 전사 인자, 특히 전사 인자에 대한 이들의 결합 서열에 의해 조절되는 유전자의 오퍼레이터 분획의 조절 방법은 당 분야의 숙련자들에게 공지되어 있다. 조절된 유전자인 citB 및 citZ 및 ccpC 유전자 그 자체에서의 결합 서열은 예를 들면 "바실러스 섭틸리스에서 전사 조절의 데이타베이스"(DBTBS; see http://dbtbs.hgc.jp/)에 공지되어 있다. ccpC 유전자 그 자체의 조절 서열에서의 공지된 결합 활성의 예는 출발 코돈에 대해 위치 -10 내지 +15(서열 번호: 3), 특히 위치 -5 내지 +10(서열 번호: 8)에 위치한다. citB의 공지된 결합 서열은 출발 코돈에 대해 위치 -75 내지 -52(서열 번호: 4), 특히 위치 -73 내지 -68(서열 번호: 9) 또는 위치 -64 내지 -60(서열 번호: 10) 및 위치 -35 내지 -22(서열 번호: 5) 또는 위치 -35 내지 -17(서열 번호: 11), 특히 위치 -27 내지 -22(서열 번호: 12)에 위치하고, citZ의 공지된 결합 서열은 위치 -11 내지 +5 (서열 번호: 6), 특히 위치 -11 내지 -8 (서열 번호: 13), 및 위치 +21 내지 +44 (서열 번호: 7), 특히 위치 +23 내지 +26 (서열 번호: 14) 또는 위치 +34 내지 +37 (서열 번호: 15)에 위치한다. 전술된 공지된 결합 서열 및 상응하는 오페론은 표 1에 열거되어 있다.

[표 1]

CcpC에 의해 조절되는 공지된 유전자 및 이의 오페론 목록. "절대 위치"는 "NCBI 서열 파일(수납 번호 NC 000964)에서의 위치에 근거하여 계산되었다. 정확한 결합 서열(시스 요소)에는 밑줄이 그어져 있다. 공급원: http://dbtbs.hgc.jp/.

따라서 본 발명은 유전자의 발현 감소를 야기하는 ccpC 유전자에서의 개질/돌연변이를 함유하는 개질된 숙주 세포에 관한 것이다. 그러나, 추가의 실시양태에서, 숙주 세포는 또한 서열 번호: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15에 따른 전술된 결합 서열중 하나에서 ccpC 유전자 생성물에 대한 결합 서열에서의 개질/돌연변이를 포함하여 CcpC의 결합이 감소되도록 개질될 수 있다. 이 감소된 결합은 전술된 바와 같은 CcpC의 감소된 활성으로 이해되어야만 하고, 야생형의 활성에 비해 25% 이상의 감소된 활성이 바람직하며, 이는 25% 이상 감소된 활성에 상응한다. 본 발명은 또한 본원의 개시 내용의 측면에서 숙주 세포에서의 리보플라빈 합성을 조절, 특히 증가시키기 위한 이의 전사체 및 이로부터 합성된 단백질 및 이의 안티센스 구조체의 이용에 관한 것이다. 돌연변이의 도입 및 후속적인 결합 활성의 측정 방법, 예를 들면 "겔 시프트" 실험 또는 "지문" 실험"의 실행(예를 들면 [Maniatis et al., 1989: "Molecular cloning, a laboratory manual," 2^nd Edition, Cold Spring Harbours Laboratory, N.Y.] 참조)이 당 분야의 숙련자들에게 공지되어 있다.

본 발명은 또한 전술된 분자 및 구조에 대한 분자 결합에 관한 것이다. 이런 분자는 CcpC, 또는 호몰로그 또는 오르토로그의 기능 또는 활성을 개질, 특히 억제하는데 적합하다. 바람직하게는 이런 분자는 서열 번호: 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 및 15에서 선택된 뉴클레오타이드 서열에 의해 정의될 수 있는 구조 또는 분자, 특히 오퍼레이터 구조의 하나 이상에 결합한다. 바람직하게는, 결합 분자는 이렇게 한정된 구조에 대해 특이적인 항체이다.

따라서, 본 발명의 대상은 전술된 폴리아미노산 서열 또는 분자에 따른 하나에 특이적으로 결합할 수 있는 모노클론 또는 폴리클론 항체이다. 항체의 CcpC로의 결합을 통해, 전사 인자의 citB 또는 citZ과 같은 조절되고자 하는 유전자의 오퍼레이터 서열로의 결합이 방지된다.

전술된 개질된 핵산 분자 및 개질된 숙주 세포가 리보플라빈 합성을 증가시키기 위해 이용된다. 따라서, 본 발명은 a) 본 발명에 따른 개질된 숙주 세포의 제공, b) 숙주 세포에서 리보플라빈이 합성될 수 있게 하는 적합한 배양 조건 및 적합한 배양 배지에서 개질된 숙주 세포의 배양, 및 선택적으로 c) 개질된 숙주 세포 및/또는 배양 배지로부터 리보플라빈의 단리를 포함하는, 리보플라빈의 생명공학적 합성 방법에 관한 것이다.

본 발명의 특정한 양태는 상기 개질된 숙주 세포를 이용한 리보플라빈의 발효 생산에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 용어 "리보플라빈"은 리보플라빈을 포함하고, 또한 플라빈 모노뉴클레오타이드(FMN) 및 플라빈 아데닌 다이뉴클레오타이드(FAD), 및 리보플라빈, FMN 또는 FAD의 전구체("전구체"), 유도체 및/또는 염을 포함한다. 염의 예는 특히 리보플라빈-5-포스페이트 및 나트륨 리보플라빈-5-포스페이트이다. 리보플라빈, FMN 또는 FAD의 전구체 분자 및 유도체는 예를 들면 DRAPP, 5-아미노-6-리보실아미노-2,4(1H,3H)-피리미딘다이온-5'-포스페이트, 2,5-다이아미노-6-리비틸아미노-4(3H)-피리미딘온-5'-포스페이트, 5-아미노-6-리비틸아미노-2,4(1H,3H)-피리미딘다이온-5'-포스페이트, 5-아미노-6-리비틸아미노-2,4(1H,3H)-피리미딘다이온, 6,7-다이메틸-8-리비틸루마진(DMRL) 및 플라보단백질을 포함한다.

리보플라빈의 발효 합성에 대한 일반적인 방법 및 리보플라빈 생합성에 관여된 유전자, 특히 바실러스에서의 발효 합성은 공지되어 있다(예를 들면 유럽 특허 제405370호, 또는 ["Ullman's Encyclopedia of Industrial Chemistry", 7^th Edition, 2007, Chapter: Vitamins] 참조). 이들 방법은 또한 본원에 개시된 개질된 숙주 세포를 이용한 리보플라빈 합성에 적용될 수 있다.

여러 기질이 본 발명의 방법, 즉 전술한 바와 같은 리보플라빈의 생산 방법에서 탄소 공급원으로서 사용될 수 있다. 특히 적합한 탄소 공급원은 3, 5 또는 6개의 탄소 원자로 구성된 화합물, 예를 들면, D-글루코스, 글리세롤, 농축 쥬스, 덱스트로스, 전분, 수크로스 및 리보스로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 탄소원은 D-글루코스이다. 상기 방법과 관련하여 용어 "탄소원", "기질" 및 "생성 기질"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다.

개질된 숙주 세포를 이용하여 리보플라빈을 합성하는 본 발명에 따른 방법은 (배양) 배지로서 리보플라빈의 생산에 적합한 모든 배지를 사용할 수 있다. 이는 전형적으로, 예를 들어, 염 및 기질을 포함하며 일정한 pH를 갖는 수성 배지이다. 기질이 리보플라빈으로 전환되는 배지는 생산 배지로도 지칭된다.

본원에서 사용되는 "발효", "생산" 또는 "발효 공정"은 당업자에게 공지되어 있는 조건 하에서 배지 중의 성장 세포의 사용, 또는 적절한 기질을 당업자에게 공지되어 있는 조건 하에서 배양시킨 후의 비-성장 세포, 즉 소위 휴지기 세포의 사용일 수 있다. 이들 성장 또는 비성장 세포는 당 분야의 숙련자들에게 공지된 조건 하에서 적합한 기질의 리보플라빈으로의 전환을 위해 사용된다.

합성된 리보플라빈은 임의의 적절한 수단에 의해 세포로부터 수득/단리될 수 있다. 이는 예를 들어, 리보플라빈이 생성 배지로부터 분리될 수 있음을 의미한다. 선택적으로, 이렇게 수득된 리보플라빈은 추가 가공, 예를 들면 정제될 수 있다.

개질된 숙주 세포를 사용하여 리보플라빈을 생성하는 상기 방법과 관련하여, 미생물의 성장 상은 적절한 영양분이 보충된 수성 배지에서 호기성 조건 하에서 정상적으로 일어난다. 배양은 예를 들어, 회분식, 유가배양식, 반-연속식 또는 연속식으로 수행될 수 있고, 이때 유가배양식 또는 반-연속식이 바람직하다.

숙주 세포, pH, 온도 및 영양 배지에 따라, 배양 기간은 예를 들어 약 10시간 내지 약 10일, 바람직하게는 약 4 내지 약 7일, 더 바람직하게는 약 2 내지 약 6일일 수 있다. 당 분야의 숙련자는 선택된 미생물을 위한 최적의 배양 조건을 알 것이다.

배양은 예를 들어, 약 7.0의 pH, 바람직하게는 약 6 내지 약 8의 pH, 더 바람직하게는 약 6.5 내지 7.5의 pH, 및 약 13 내지 약 70℃, 바람직하게는 약 35 내지 약 39℃, 더 바람직하게는 약 30 내지 약 39℃, 가장 바람직하게는 약 36 내지 약 39℃의 적합한 온도에서 수행된다. 배양 배지는 통상적으로 동화가능한 탄소원으로서 D-글루코스, 글리세린, 농축 쥬스, 덱스트로스, 전분, 사카로스 또는 리보스, 섭취가능한 질소원, 예를 들면, 펩톤, 효모 추출물 및 아미노산을 포함한다. 또한, 예를 들면 황산마그네슘, 황산망간, 인산칼슘 또는 탄산칼슘과 같은 염이 존재할 수 있다. 바실러스 섭틸리스의 세포를 이용한 리보플라빈의 발효 생산의 예가 제WO04/113510호(VF 배지)에 개시되어 있고, 이는 본원에 참고로 혼입되어 있다. 이 방법은 바람직하게는 본 발명에 이용되어야만 한다.

전술된 바와 같은 전사 인자 CcpC의 활성을 개질시킴으로써, (개질된) 숙주 세포가 리보플라빈 합성을 증가시킬 수 있다. 본 발명에 따른 숙주 세포, 특히 바실러스 섭틸리스의 리보플라빈 수율이 비-개질된 세포 또는 야생형 세포의 리보플라빈 수율에 비해 10% 이상 증가될 수 있다. 20% 이상, 특히 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 80% 이상의 증가가 바람직하다. 리보플라빈의 수율/생산성을 측정하는 분석 방법은 공지되어 있다. 예는 HPLC 또는 인디케이터 균주의 이용이다(예를 들면 [Bretzel et al., J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 22, 19-26, 1999] 참조). 발효시킨 후, 당 분야에 공지된 방법에 의해 생산된 리보플라빈을 다른 성분(배양 배지, 바이오매스 등)으로부터 분리하고, 정제하고, 농축하고, 대조 반응을 야생형 균주를 이용하여 실시한다.

용어 "생산", "제조" 또는 "생산성"은 당 분야의 숙련자들에게 공지되어 있고, 주어진 시간 및 주어진 발효 체적에서 형성되는 리보플라빈의 농도를 포함한다(예를 들면 시간당 리터당 생성물 kg). 용어 "수율"은 당 분야의 숙련자들에게 공지되어 있고, 탄소 공급원이 생성물(즉, 리보플라빈)로 전환되는 효율을 포함한다. 이는 일반적으로 탄소 공급원 kg 당 생성물 kg으로 표기된다. 본 발명과 관련하여 "수율 및/또는 생산/생산성의 증가"란 주어진 시간동안 주어진 양의 배양액 중의 수득된 분자의 양의 증가를 의미한다.

사용되지만 열거되지 않은 모든 배지는 제 WO2007/051552호에 개시되어 있다.

100X 미량 원소 용액 A: 12.5 g의 MgCl₂·6H₂O; 0.55 g의 CaCl₂; 1.35 g의 FeCl₂·6H₂O; 0.1 g의 MnCl₂·4H₂O; 0.17 g/ℓ의 ZnCl₂; 0.043 g의 CuCl₂·2H₂O; 0.06 g의 CoCl₂·6H₂O; 0.06 g의 Na₂MoO₄·2H₂O; 약 1 ℓ가 되도록 H₂O, 멸균됨.

5X 최소 염 용액: 0.057 M의 K₂SO₄; 0.31 M의 K₂HPO₄·5H₂O; 0.22 M의 KH₂PO₄; 0.017 M의 Na-시트레이트·7H₂O; 0.004 M의 MgSO₄·H₂O(pH 7.0), 멸균됨.

1OOX 미량 원소 용액 B: 0.55 g의 CaCl₂; 0.17 g의 ZnCl₂; 0.043 g의 CuCl₂·2H₂O; 0.06 g의 CoCl₂·6H₂O; 0.06 g의 Na₂MoO₄·2H₂O; 1 ℓ가 되도록 H₂O, 멸균됨.

리보플라빈 스크리닝 배지(RSM): 200ml의 10X 스피지젠 염; 10ml의 100X 미량원소 용액 A; 2ml의 50% 글루코스; 36ml의 25% 라피노스; 10ml의 10% 효모 추출액; 1 ℓ가 되도록 H₂O.

스피지젠 최소 배지(SMM): 100ml의 10X 스피지젠 염; 10ml의 50% 글루코스; 1ml의 40% 나트륨 글루타메이트; 10ml의 미량 원소 용액 A; 1 ℓ가 되도록 H₂O.

진탕 플라스크에서 리보플라빈의 생성을 하기와 같이 시험하였다: 냉동된 글리세롤 원액으로부터 5ml의 VY 배지를 접종하고 교반하면서 37℃에서 6 내지 8시간동안 배양하였다(280rpm). 250ml들이 플라스크중의 25ml의 RSM에 접종하기 위해 5ml의 배양액을 직접 이용하였다. 500㎕의 배양액을 35㎕의 4N NaOH로 처리하고, 1분동안 격렬하게 진탕하였다. 샘플을 465㎕의 1M 인산칼륨 완충액(pH 6.8)으로 처리하고, 13200 rpm에서 5분동안 원심분리하였다. 리보플라빈, 6,7-다이메틸-8-리비틸루마진(DMRL) 및 옥소루마진의 함량을 HPLC로 측정하였다. 제 2 배양 샘플을 원심분리(5분, 13200rpm)한 후, 상층액을 이용하여 잔류 글루코스 및 라피노스의 농도를 측정하였다. 값을 측정함으로써 수율의 계산이 가능해졌다.

진탕기 배양 샘플을 HPLC로 분석하였다. 평형화된 오토샘플러, 다이오드 어레이 및 형광 검출기가 장착된 아질런트(Agilent) 1100 HPLC 시스템에서 크로마토그래피를 수행하였다. 4mm LC-8DB 가드 컬럼이 장착된 슈펠코실(Supelcosil) LC-8DB-5μ 컬럼(150mm x 4.6mm)에서 분리를 수행하였다. 0.1M 아세트산과 메탄올의 혼합물을 이동상으로 이용하였다. 구배를 이용하여 용출을 수행하였다. 2% 메탄올에서 5분 후에 15분만에 50%까지 메탄올 농도를 증가시켰다. 컬럼을 20℃에서 유지시켰다. 280nm에서의 UV 신호를 검출을 위해 이용하였다. 리보플라빈은 15.2분 후의 단리된 피크로서 검출되었다. 보정 방법은 플루카(Fluka)의 리보플라빈을 이용하여 수행되고, 10g/ℓ 내지 1/ℓ의 선형이었다. 액체 배양 배지 중의 글루코스 및 라피노스의 농도의 측정을 위해, 4원 펌프, 오토샘플러 및 굴절 지수 검출기가 부착되어 있는 아질런트 1100 시리즈 HPLC 시스템을 또한 이용하였다. CAPCELL PAK NH2 UG80 컬럼(4.6mm x 250mm, 5μ)(시세이도(Shiseido) 제품) 상에서 분리를 수행하였다. 최적 컬럼 온도는 35℃였다. 이동상은 65/35 비의 아세토니트릴과 탈이온수의 혼합물이다. 유속은 1.0ml/분으로 설정되었다. 주입 체적은 5㎕이었다. 굴절 지수 신호를 검출에 이용하였다. 이 방법은 0.5g/ℓ 내지 30g/ℓ의 농도에 이용될 수 있다.

실시예 1: CcpC 의 활성 변화를 이용한 리보플라빈 수율의 모의 실험

본 발명에 따른 활성 변화를 갖는 숙주 세포에서 리보플라빈 합성에서의 물질대사 플럭스 분포를 예측하기 위해, 특히 전사 인자 CcpC의 활성의 감소를 예측하기 위해, CcpP의 활성에서의 제1단계 변화를 확인하고, CcpC에 의해 조절되는 유전자에 대한 이들의 영향을 "네트워크 성분 분석"(NCA) 및 유전자 발현 시간 시리즈로 정량하였다. 전사 인자 활성의 영향을 예측하기 위해, 출발 플럭스 분포의 조절된 플럭스를 전환한 후, 정방형 컨벡스 최적화를 통해 새로운 물질대사 유동 분포를 계산한다. 예를 들면 글루코스 상에서의 호기성 성장동안 리보플라빈을 생산하는 바실러스 섭틸리스 균주를 취하여 모의실험을 수행하였다.

1 미만의 CcpC 활성을 갖는 돌연변이체(AF < 1, 예를 들면 녹아웃 돌연변이체)는 야생형에 비해 현저히 증가된 리보플라빈 수율을 나타낸다. 즉, 0.02(글루코스 1g 당 리보플라빈의 g)에 비해 0.05의 수율을 나타낸다.

실시예 2: CcpC -결핍 균주의 생성

숙주 세포인 바실러스 섭틸리스에서 전사 인자 CcpC에 대한 녹아웃 돌연변이체를 제조하기 위해, 바실러스 섭틸리스의 게놈의 원래의 ccpC 유전자좌에 항생제 내성 유전자 카세트를 도입하였다.

바실러스 섭틸리스 168의 게놈 DNA로부터 PCR을 이용하여 증폭된 2개의 DNA 단편을 제 3 PCR에서 네오마이신 내성 유전자 카세트와 조합하였다([Itaya et al., 1989, A neomycin resistance gene cassette selectable in a single copy state in the Bacillus subtilis chromosome, Nucleic Acids Res. 17: 4410]). 유전자 ccpC의 5' 및 3' 영역에 상동성인 2개의 절편을 제조하기 위해, 하기 PCR을 수행하였다: 50㎕ 중의 5'-상동성 절편, 바실러스 섭틸리스 168에서 나온 100 ng의 게놈 DNA, 1㎕의 100 μM 프라이머 p436(서열 번호: 16) 용액, 1㎕의 100 μM 프라이머 p439(서열 번호: 17) 용액, 1㎕의 10mM dNTP 용액, 5㎕의 10x 완충액 및 0.5㎕의 Pfu 폴리머라제(스트라타진). PCR 반응은 35 사이클로 구성된다: (i) 94℃에서 30초동안의 변성 단계; (ii) 52℃에서 30초동안의 어닐링 단계; (iii) 72℃에서 1분동안의 증폭 단계. 실제 PCR 반응 이전에, 주형 DNA를 95℃에서 3분동안 변형시켰다. 3' DNA 절편의 경우, 프라이머 p437(서열 번호: 18) 및 프라이머 p438(서열 번호: 19)의 프라이머 쌍을 이용하였다. 네오마이신 내성 유전자 카세트를 코딩하는 DNA 절편을 p9(서열 번호: 20)와 p10(서열 번호: 21)의 프라이머 쌍과 동일한 조건 하에서 제조하였다. 제4 PCR에서, 3개의 DNA 절편은 이제 이들의 상동성인 서로 겹쳐지는 구역을 통해 함께 결합되었다. 이를 위해, 아가로스 겔 전기영동에 의해 정제된 50ng의 각각의 DNA 절편을 이용하였다. 상기 언급된 PCR 조건에 비해, 증폭 시간은 2.5분으로 증가되었다. 모든 다른 변수는 변화되지 않고 유지되었다. 프라이머 쌍으로서, 프라이머 p45 및 p51을 이용하였다. 생성된 PCR 생성물을 퀴아퀵(QiaQuick) PCR 정제 키트(퀴아겐 제품)를 이용하여 정제하였다. 컴피튼트(competent) 바실러스 섭틸리스 168 세포를 2㎍의 정제된 생성물로 형질전환시켰다. 네오마이신-내성 콜로니를 2mg/l의 네오마이신을 함유하는 TBAB 상에서 수행하였다. 추가의 PCR(전술된 조건 하에서 p45와 p10의 프라이머 쌍)을 이용하여 선택된 네오마이신-내성 형질전환체의 유전형을 확인하였다. 하나의 양성 형질전환체를 BS5878로 명명하였다.

실시예 3: ccpC 녹아웃의 선택된 리보플라빈- 과생산 균주로의 이동

리보플라빈을 과생산하는 선택된 바실러스 섭틸리스 균주로 ccpC 녹아웃을 이동시키기 위해서, 파지 PBS-1을 이용한 형질도입을 이용하였다(제WO07/051552호의 실시예 6 참조). 균주 BS5878의 PBS-1 파지 용균물을 제조하였다. 형질도입에 이용된 리보플라빈 생산자인 BS3914 및 BS3917을 하기와 같이 제조하였다: 균주 BS3914 및 BS3917은 리보플라빈-과생산 균주인 BS3534의 자손이다(BS3534의 구축에 대해서는 제WO2007/051552호 참조). BS3534는 유럽 특허 제405370호에 개시되어 있는 균주 바실러스 섭틸리스 RB50에 근거하고, NRRL B-18502호로 기탁되어 있다. BS3914 및 BS3917 균주에서, 리보플라빈 유전자좌로 통합된 플라스미드 pRF69를 네오마이신 내성 유전자 카세트로 대체하였다. 상응하는 PCR 생성물의 제조를 위해, 전술된 PCR 방법을 이용하였다. PCR 생성물은 바실러스 섭틸리스 168의 게놈 DNA 상의 리보플라빈 오페론 프로모터(프라이머 쌍 p50; 서열 번호: 22 및 p51; 서열 번호: 23)의 업스트림에 위치한 526bp 길이의 3' 영역, 및 바실러스 섭틸리스 168의 게놈 DNA 상의 ribD 유전자(프라이머 쌍 p44; 서열 번호: 24 및 p45; 서열 번호: 25)의 502bp 길이의 5' 영역으로 구성되고, 이들은 PCR에 의해 네오마이신 내성 유전자 카세트(플라스미드 pUB110 상의 프라이머 p9 및 p10)를 이용하여 융합된다. 정확한 반응 조건은 상기에 추가로 개시되어 있다. 정제된 PCR 생성물을 컴피튼트 바실러스 섭틸리스 168 세포의 형질전환을 위해 이용하였다. 100mg/l의 리보플라빈 및 2mg/l의 네오마이신을 함유하는 TBAB 플레이트 상에서 선택이 일어났다. 성장된 콜로니의 유전형을 PCR 및 서열분석에 의해 확인하였다. 한가지의 확인된 단리된 형질전환체를 BS3813으로 표기한다. BS3813의 PBS-1 파지 용균물을 균주 BS3534로 구축물을 이동시키기 위해 제조하였다. 이렇게 제조된 균주를 BS3798로 표기하였다.

다음 단계에서, 리보플라빈-영양요구성 균주인 BS3813의 네오마이신 내성 카세트를 다시 기능성 리보플라빈 오페론으로 대체하였다. 양성 형질전환체/형질도입체의 선택을 위해, 최소 배지 플레이트(1x 광물성 염 용액에 용해된 2g/l의 글루코스 - 미량 원소 용액)을 이용하였다. 변형된 프로모터/mRNA 리더 서열에서, 천연 프로모터는 바실러스 섭틸리스의 veg 유전자의 프로모터로 대체되었다. 또한, 리더 영역의 사이토신은 티미딘(서열 번호: 26)으로 대체되었다. 균주 BS3813의 컴피튼트 세포를 서열 번호: 26에 따른 서열을 갖는 DNA 절편으로 형질전환시켰다. 형질전환된 세포는 다시 리보플라빈이 첨가되지 않은 배지에서 성장될 수 있는 능력을 가졌다. 성장된 콜로니의 유전형은 PCR 및 후속적인 서열화에 의해 확인되었다. 하나의 확인된 콜로니는 BS3953으로 표기되었다. 균주 BS3953의 PBS-1 파지 용균액을 BS3798의 형질도입에 이용하였다. 전술된 바와 같이 선택이 수행되었다. 2가지 유형의 형질도입체를 단리하였다. 첫번째 경우, BS3798의 불활성화된 spo0A 유전자는 야생형 대립 유전자로 대체되지 않았다. 한 확인된 형질도입체를 BS3914로 표기하였다. 두번째 경우, 형질도입동안의 더 큰 DNA 조각의 이동으로 인해 불활성화된 spo0A 유전자를 활성 야생형 형태로 대체하였다. 한가지 시험된 Spo0A-양성 돌연변이체를 BS3917로 표기하였다.

BS3914 및 BS3917을 이제 BS5878의 용균액으로 형질도입시켰다. 또다시, 2mg/l의 네오마이신을 함유하는 TBAB 플레이트상에서 선택이 일어났다. 선택된 형질도입체의 유전형을 전술된 PCR로 확인하였다. 균주 BS3914의 형질도입에서 나온 5개의 확인된 형질도입체를 BS5891, BS5893, BS5894 및 BS5895로 표기하였다. BS3917로부터 유래된 4가지 형질도입체를 BS5887 내지 BS5890으로 표기하였다.

새로 생성된 균주의 리보플라빈 생성을 진탕 플라스크에서 전술된 바와 같이 시험하였다. 48시간 후에, 500㎕의 시료를 배양액에서 취하고, 4N NaOH로 처리하고, 중화시키고, 원심분리한 후, 시료의 리보플라빈 농도를 HPLC로 측정하였다. 수율의 계산을 위해, 최종 시료중의 당 농도를 또한 측정하였다. 결과를 표 2A 및 2B에 요약한다.

[표 2A]

BS3914에 근거하여 새로 제조된 ccpC 녹아웃 균주의 진탕 플라스크 시험에서 리보플라빈의 수율. 새로운 균주의 리보플라빈 수율을 숙주 균주인 BS3914의 리보플라빈 수율과 비교하였다.

[표 2B]

BS3917에 근거하여 새로 제조된 ccpC 녹아웃 균주의 진탕 플라스크 시험에서 리보플라빈의 수율. 새로운 균주의 리보플라빈 수율을 숙주 균주인 BS3917의 리보플라빈 수율과 비교하였다.

균주(BS3914)로부터 유래된 형질도입체는 숙주 균주 BS3914와 동일한 수율을로 리보플라빈을 생산하였다. Spo0A-플러스 균주의 ccpC 녹아웃 균주는 숙주 균주인 BS3917에 비해 현저히 개선된 수율로 리보플라빈을 생산하였다. 심지어 BS3917 그 자체가 언급된 조건 하에서는 Spo0A-마이러스 균주인 BS3914보다 상당히 우수한 수율(25%)을 나타내었다.

따라서, 활성 spo0A 유전자를 갖는 리보플라빈-생산 바실러스 섭틸리스에서 ccpC의 불활성화는 진탕 플라스크 조건 하에서 수율을 20% 이상 개선시켰다.

ccpC의 부분적 불활성화, 즉, 전사 기능을 감소, 예를 들면 75%, 50% 또는 25% 감소시키는 돌연변이를 유전자 서열로 도입한 후, 리보플라빈 농도를 측정하면, 야생형 균주에 비해 약 10% 내지 최대 20%의 증가가 관찰될 수 있다. 이런 결과는 또한 돌연변이체를 CcpC에 대한 결합 서열(표 1 참조)에 삽입시킴으로써 수득될 수 있고, 이에 의해 결합 친화성의 감소에 따라 약 25%의 영역에서의 리보플라빈 농도의 증가가 달성될 수 있다. 상기 개시된 돌연변이는 표준 프로토콜에 따라 삽입되고, 그런 다음 결합 친화성 또는 결합 친화성의 감소를 공지된 방법(상세한 설명 참조)으로 측정하고, 리보플라빈의 양을 전술된 바와 같이 측정하였다.

SEQUENCE LISTING <110> DSM IP Assets B.V. <120> Method for producting riboflavin <130> 27577 <140> PCT/EP2009/008987 <141> 2009-12-15 <150> DE 10 2008 063 234.1 <151> 2008-12-15 <160> 26 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 882 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <400> 1 atgcagcttc aagagcttca tatgctcgta gttttagctg aggaattaaa tatgagaaag 60 gcggcagaac ggctttttgt atctcagccg gctttatctc agcgcttaca aaccattgaa 120 aaggcgtggg gaacaaaaat ctttttaaga tctcaaaaag gattaacggt aacgcccgcc 180 ggtgagaaaa tcattcagtt tgcgaatgat gtgacattag agcaggaaag aataagagaa 240 aatattgacg agcttgaagg tgaaattcac ggcacattga agcttgccgt cgcctccata 300 atcggtcagc attggctccc taaagtcctg aagacgtatg tggaaaagta tccgaatgca 360 aagatctcgc tcataaccgg gtggagcagc gaaatgctga aaagcttgta tgaggatcag 420 gttcatatcg gcattataag aggcaaccct gagtggaagg ggcgcaaaga ttacttaatg 480 acagatcatc tgtatttagt ggatactgaa atttcctgca tcgaagatat tgcccataca 540 gaacgtccgt ttatccagtt taaaagtgac agcacttatt ttcaggaaat tcagcactgg 600 tggcatcaaa aatttaaaac 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Glu Asp Gln Val His Ile Gly 130 135 140 Ile Ile Arg Gly Asn Pro Glu Trp Lys Gly Arg Lys Asp Tyr Leu Met 145 150 155 160 Thr Asp His Leu Tyr Leu Val Asp Thr Glu Ile Ser Cys Ile Glu Asp 165 170 175 Ile Ala His Thr Glu Arg Pro Phe Ile Gln Phe Lys Ser Asp Ser Thr 180 185 190 Tyr Phe Gln Glu Ile Gln His Trp Trp His Gln Lys Phe Lys Thr Ser 195 200 205 Pro Lys Gln Thr Ile Leu Val Asp Gln Ile Glu Thr Cys Lys Gln Met 210 215 220 Ala Leu His Gly Ile Gly Tyr Ala Ile Leu Pro Ser Val Thr Leu Gln 225 230 235 240 Asn Glu Asp Lys Val Asn Lys Met Pro Leu Leu Asp Met Lys Gly His 245 250 255 Pro Ile Gly Arg Asp Thr Trp Leu Leu Gly Tyr Glu Pro Ala Phe Glu 260 265 270 Leu Lys Gln Val Gln Ala Phe Val Gln Val Ile Lys Asp Met Leu Asp 275 280 285 Gln Glu Asn Pro Phe 290 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <400> 3 gggagataag aaaaacttat tgata 25 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <400> 4 tcataagtcg aacttattgt attt 24 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <400> 5 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gccttagatc ttgcgaagca gggcgaagga cagaccgaat ccaatccgct cgtcggcgct 960 gttgtcgtaa aggacggaca aattgtcgga atgggcgccc atttaaaata tggtgaagct 1020 catgcagaag ttcatgccat ccatatggct ggagcacatg cagagggtgc cgacatttac 1080 gttacactcg aaccgtgcag ccattacgga aaaacaccgc catgtgcaga attgattatc 1140 aactctggta tcaaaagagt gttcgtggcg atgagagatc ctaatccgct tgtggctgga 1200 agagggatca gcatgatgaa agaagctggc attgaggtaa gggaaggcat cctggcagac 1260 caggcggaga ggctgaatga aaaatttctg cactttatga ggacaggcct tccgtacgtc 1320 acgctaaaag cggctgccag ccttgacggc aagatagcta ccagcacggg tgacagcaaa 1380 tggatcacgt cagaggctgc aagacaggat gctcagcaat acaggaaaac acaccaaagc 1440 attttagtcg gagttggcac agtgaaagcc gacaatccga gcttaacctg cagactgccg 1500 aatgtaacaa aacagccggt tcgggtcata cttgataccg tactctcgat tcctgaggac 1560 gctaaagtga tttgcgatca aatagcgccg acatggattt ttacgacggc acgcgcagac 1620 gaggaaaaga aaaaacggct ttcagctttc ggagtgaaca tatttacact tgaaaccgag 1680 cgcattcaaa ttcctgatgt tttgaagatc ctagcggaag aaggcatcat gtcggtgtat 1740 gtggaaggcg gttcagctgt tcacggaagc tttgtcaaag aaggctgttt tcaagaaatc 1800 atcttctatt ttgcccctaa actaatcgga ggaacgcatg ctcccagctt aatctccggt 1860 gaaggttttc aatcaatgaa agatgtcccc ttattacaat tcactgatat aacccaaatc 1920 ggccgtgata tcaaactgac ggcaaaaccg acaaaggaat ag 1962

Claims

CcpC 유형의 전사 인자의 발현 및/또는 활성이 비-개질된 미생물 또는 야생형 미생물에 비해 감소됨, 바람직하게는 25% 이상 감소됨을 특징으로 하는 개질된 리보플라빈-생산 미생물.
제 1 항에 있어서,
CcpC 유형의 전사 인자에 의해 조절되는 하나 이상의 유전자의 하나 이상의 결합 서열에서, 바람직하게는 유전자 citZ 및/또는 citB의 결합 서열에서 하나 이상의 돌연변이를 포함함을 특징으로 하는 개질된 리보플라빈-생산 미생물.
제 2 항에 있어서,
서열 번호: 3, 4, 5, 6, 7의 서열 또는 이의 절편, 특히 서열 번호: 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15의 서열에서 하나 이상의 돌연변이를 포함함을 특징으로 하는 개질된 리보플라빈-생산 미생물.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
CcpC를 코딩하는 유전자가 녹아웃(knocked out)됨을 특징으로 하는 개질된 리보플라빈-생산 미생물.
제 1 항 또는 제 4 항에 있어서,
a) 서열 번호: 1의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 상기 뉴클레오타이드 서열로 구성된 핵산 분자;
b) 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하거나 상기 아미노산 서열로 구성된 폴리아미노산 분자(단백질)를 코딩하는 핵산 분자;
c) 상기 a) 또는 b)의 핵산 분자와 70% 이상의 상동성을 갖는 핵산 분자;
d) 엄격한 조건 하에서 상기 a) 또는 b)의 핵산 분자와 하이브리드를 형성하는 핵산 분자; 및
e) CcpC 유형의 전사 인자의 기능/활성을 갖는 단백질을 코딩하는, 상기 a) 또는 b)의 핵산 분자의 절편 및/또는 유사체(analog)
로 구성된 군에서 선택되는 핵산 분자를 포함하고, 여기서 상기 a) 내지 e)의 핵산 분자가 CcpC 야생형의 활성에 비해 CcpC 단백질의 활성을 감소시키는, 바람직하게는 25% 이상 감소시키는 하나 이상의 유전적 돌연변이를 갖고 있음을 특징으로 하는 개질된 리보플라빈-생산 미생물.
제 1 항 내지 제 5 항중 어느 한 항에 있어서,
리보플라빈 수율이 비-개질된 미생물 또는 야생형 미생물에 비해 10% 이상 증가됨을 특징으로 하는 개질된 리보플라빈-생산 미생물.
제 1 항 내지 제 6 항중 어느 한 항에 있어서,
바실러스(Bacillus), 코리네박테리움(Corynebacterium) 및 슈도모나스(Pseudomonas)로 구성된 군, 바람직하게는 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 스테아로테모필루스(Bacillus stearothermophilus), 바실러스 할로두란스(Bacillus halodurans), 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquifaciens) 및 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis)로 구성된 군에서 선택된 미생물임을 특징으로 하는 개질된 리보플라빈-생산 미생물.
비-개질된 미생물 또는 야생형 미생물에서의 리보플라빈 합성에 비해 리보플라빈 합성을 증가, 특히 10% 이상 증가시키기 위한, 제 1 항 내지 제 7 항중 어느 한 항에 따른 개질된 리보플라빈-생산 미생물의 용도.
개질로 인해 전사 인자 기능이 감소되고, 바람직하게는 25% 이상 감소되고, 개질되는 핵산 분자가
a) 서열 번호: 1의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 상기 뉴클레오타이드 서열로 구성된 핵산 분자;
b) 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하거나 상기 아미노산 서열로 구성된 폴리아미노산 분자(단백질)를 코딩하는 핵산 분자;
c) 상기 a) 또는 b)의 핵산 분자와 70% 이상의 상동성을 갖는 핵산 분자;
d) 엄격한 조건 하에서 상기 a) 또는 b)의 핵산 분자와 하이브리드를 형성하는 핵산 분자; 및
e) CcpC 유형의 전사 인자의 기능/활성을 갖는 단백질을 코딩하는, 상기 a) 또는 b)의 핵산 분자의 절편 및/또는 유사체
로 구성된 군에서 선택됨을 특징으로 하는, CcpC 유형의 전사 인자를 코딩하는 개질된 핵산 분자의 용도.
개질로 인해 CcpC 유형의 전사 인자의 기능이 감소되고, 바람직하게는 25% 이상 감소되고, 개질되는 핵산 분자가 상기 전사 인자의 결합 서열로부터 선택됨을 특징으로 하는 개질된 핵산 분자의 용도.
제 10 항에 있어서,
개질된 핵산 분자가 서열 번호: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 및 15로 구성된 군에서 선택됨을 특징으로 하는 개질된 핵산 분자의 용도.
제 1 항 내지 제 7 항중 어느 한 항에 따른 개질된 리보플라빈-생산 미생물을 배양함을 포함하는 것을 특징으로 하는 리보플라빈의 제조 방법.
a) 제 1 항 내지 제 7 항중 어느 한 항에 따른 적합한 숙주 세포를 제공하는 단계,
b) 리보플라빈 생산에 적합한 발효 조건 하에서 배양하는 단계, 및
c) 배양 배지 및/또는 개질된 숙주 세포로부터 리보플라빈을 단리하는 단계
를 포함함을 특징으로 하는 리보플라빈의 제조 방법.