JP2012511898A - リボフラビンの生産方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、リボフラビン（以下、ビタミンＢ２とも称する）をバイオテクノロジーにより発酵生産するための方法および手段、ならびにこの方法を実行するための手段、とりわけリボフラビン生産量が増加した修飾された微生物宿主細胞に関する。本発明はしたがって、宿主細胞のリボフラビン生産に関与する酵素活性の発現を制御するための新規な方法および手段を提供する。

Description

発明の詳細な説明

本発明は、リボフラビン（以下、ビタミンＢ２とも称する）をバイオテクノロジーにより発酵生産するための方法および手段、ならびにこの方法を実行するための手段、とりわけリボフラビン生産量が増加した修飾された微生物宿主細胞に関する。本発明はしたがって、宿主細胞のリボフラビン生産に関与する酵素活性の発現を制御するための新規な方法および手段を提供する。

リボフラビンは、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）およびフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）の前駆体分子である。これらは、生体細胞および生物体における多くの酵素的酸化還元反応の必須補因子である。リボフラビンはしたがって、食品産業および動物飼料産業における重要な添加物である。微生物および植物では、リボフラビンは通例、７つの酵素反応により、プリン代謝由来のグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）およびペントースリン酸経路由来のリブロース−５−リン酸から合成される。

年間、約４０００トンのリボフラビンが、バイオテクノロジーにより様々な微生物で生産される。最も重要な宿主生物体は桿菌、とりわけバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である。これらとは別に、下等真核生物を含む、他の微生物細胞も使用される。例は、生物体エレモテシウム・アシュビ（Ｅｒｅｍｏｔｈｅｃｉｕｍ ａｓｈｂｙｉｉ）、アシュビア・ゴシッピー（Ａｓｈｂｙａ ｇｏｓｓｙｐｉｉ）、およびカンジダ・ファマタ（Ｃａｎｄｉｄａ ｆａｍａｔａ）である。

リボフラビン合成のための既知のバイオテクノロジー方法は、とりわけリボフラビンの生産量および生産速度に関して、改善が必要である。したがって、とりわけ、微生物バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に基づいた、改良された生産方法および改良された宿主細胞を提供する必要がある。これはとりわけ、宿主細胞におけるリボフラビン合成と関連がある代謝活性およびとりわけ酵素活性の、特に簡単で効果的な調節を可能にする手段の提供に関する。さらに、これは、特に野生型と比較してリボフラビン合成が増加した、修飾された宿主細胞の提供に関する。

本発明者は意外にも、転写因子ＣｃｐＣが、リボフラビン生産速度に好ましい影響を与えることを発見した。ＣｃｐＣは、ＬｙｓＲ転写因子ファミリーに属し、トリカルボン酸回路（ＴＣＡ）の酵素活性をコードする遺伝子、とりわけｃｉｔＢおよびｃｉｔＺを制御することが知られている。意外なことに、リボフラビン生産量は、転写因子ＣｃｐＣの活性および／または細胞内濃度に直接左右されることが分かっている。ＣｃｐＣの活性低下は、生産量の増加につながる。ＣｃｐＣにより制御されることが知られているＴＣＡにおける酵素活性は、リボフラビン合成の代謝経路と直接的な関係がないため、この結果は意外であり、現状技術からは予測できない。

バイオマス生産、すなわち、とりわけ本発明に従って修飾された細胞、とりわけＣｃｐＣ−欠失細胞、たとえばバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のｃｃｐＣノックアウト形質転換細胞の増殖速度が、本質的に不変のままであることもまた意外であった。

本発明はしたがって、その細胞に存在するおよび／または細胞で発現される、ＣｃｐＣタイプの転写因子および／またはその相同体またはオルソログの活性または濃度が変更されていること、とりわけ減少していることを特徴とする、修飾されたリボフラビン産生細胞または細胞株、原核細胞または真核細胞、とりわけ微生物細胞に関する。この修飾によって、細胞または細胞株は、リボフラビン生産増加が可能になる。

とりわけ、ＣｃｐＣタイプの転写因子の発現および／または活性が、非修飾微生物または野生型微生物と比較して、好ましくは少なくとも２５％減少している、修飾されたリボフラビン産生微生物を主張するものである。

好ましくは、前述の細胞または細胞株は、ＣｃｐＣをコードする遺伝子が、全く発現されないか（発現抑制）または少なくとも減少した発現を示す（過小発現）かのいずれかであるように修飾されており、これが上記細胞／細胞株におけるＣｃｐＣ蛋白質の欠如または低下／減少した活性につながる。細胞／細胞株は好ましくはＣｃｐＣ欠失変異体または形質転換細胞、とりわけＣｃｐＣをコードする少なくとも１つの遺伝子のノックアウト変異体および／またはその相同体および／またはオルソログである。

これに関連して、「減少した」は、ＣｃｐＣ蛋白質、またはその相同体オルソログの、転写因子としての機能における、活性低下、とりわけ活性欠如、およびｃｃｐＣ遺伝子またはその相同体またはオルソログの、発現低下、とりわけ発現欠如、の両方を意味すると理解され、その結果として、細胞、とりわけＣｃｐＣ−欠失細胞における遺伝子産物ＣｃｐＣの低コピー数または低濃度を招く。発現減少は、非修飾（ＣｃｐＣ野生型）細胞／細胞株におけるｃｃｐＣ遺伝子の発現を基準にして少なくとも２５％、好ましくは少なくとも５０、７５、８０、９０、９５、９８または１００％の低下を意味すると理解される。この減少は、遺伝子の活性および対応する遺伝子産物の両者に関する。

したがって、本発明による細胞または本発明に従って修飾された細胞では、中でもｃｃｐＣ遺伝子および／またはその遺伝子産物は、たとえば桿菌、好ましくは生物体バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）で発現されるとき、特にＣｃｐＣ野生型と比べて、抑制されている、「ノックアウト」である、または、その機能（活性）が損なわれている。

遺伝子または蛋白質活性を測定する様々な方法が、当業者に知られている。好適な方法は、たとえばノーザン・ブロットすなわちｃｃｐＣ遺伝子の活性を測定するための「遺伝子チップ」法の使用、およびＣｃｐＣに対する特異的抗体を用いるウエスタン・ブロットすなわち細胞内の蛋白質濃度を測定するための定量的「２−Ｄ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル」である。転写因子、とりわけＣｃｐＣの活性はまた、たとえばｃｉｔＢまたはｃｉｔＺ等の、制御される遺伝子の対応結合部位で結合したＣｃｐＣの量が測定される「ゲルシフト」実験により、間接的に測定することもできる。ｃｃｐＣの遺伝子発現を低下させることによって、結合されるＣｃｐＣの量も減少し、これは、ポリアクリルアミドゲルを用いたシグナルの定量的測定により分析することができる。これらの測定方法および他の測定方法は当業者に周知であり、また本発明の意味でのＣｃｐＣ活性の測定に使用することができる。

本発明の実行に好適な細胞または細胞株（宿主細胞としてまとめる）は全て、ｃｃｐＣ遺伝子あるいはその相同体またはオルソログの発現を減少させることができる既知のリボフラビン産生細胞である。例は、原核細胞または真核細胞、好ましくはグラム陰性菌またはグラム陽性菌、とりわけたとえばバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）またはシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）等の微生物細胞である。バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、たとえば炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・ハロデュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｉｆａｃｉｅｎｓ）またはバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の細胞が好ましく、たとえばバチルス・スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８等のバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）が特に好ましい。

本発明に好適な特に好ましい宿主細胞は、バチルス・スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＲＢ５０：：［ｐＲＦ６９］_ｎであり、これは修飾されたリボフラビン（ｒｉｂ）オペロンをコードする、プラスミドｐＲＦ６９の複数のコピー（たとえば約５〜約２０コピー）を含み、その修飾は強力プロモーターＰ_{ｓｐｏ１５}の挿入であって、結果としてリボフラビン遺伝子の転写が強化される（菌株の構築およびリボフラビン合成を増加させるための培養条件に関しては、たとえば欧州特許第４０５３７０号明細書およびＰｅｒｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２２：８−１８，１９９９を参照されたい）。バチルス・スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＲＢ５０およびプラスミドｐＲＦ６９はそれぞれ、ブダペスト条約の条項に従って、米国イリノイ州ペオリアの「アグリカルチュラル・リサーチ・カルチャー・コレクション（ＮＲＲＬ）、カルチャー・コレクション部門（“Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ”（ＮＲＲＬ），Ｐｅｏｒｉａ，ＩＬ，ＵＳＡ，Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）に番号（「寄託番号」）Ｂ１８５０２で、また米国２０１０８バージニア州マナッサスＰ．Ｏ．Ｂｏｘ １５４９の「アメリカ培養細胞系統保存機関」（“Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ”（ＡＴＣＣ），Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ １５４９，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ２０１０８ ＵＳＡ）に、番号（「寄託番号」）ＡＴＣＣ ６８３３８で、寄託されている。

本発明の好ましい態様では、ｃｃｐＣ遺伝子における修飾は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の菌株、とりわけバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）で行われる。ここで好ましいのは、宿主細胞としてのバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株、とりわけリボフラビンオペロンで調節解除されたバチルス・スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株である。調節解除されたリボフラビンオペロンの例は周知であり、いわゆる「ｒｉｂＯ」および「ｒｉｂＣ」変異を含む。調節解除は、ｒｉｂ遺伝子の遺伝子発現強化を引き起こす。転写制御因子Ｓｐｏ０Ａをコードする遺伝子が（過剰）発現される宿主細胞、とりわけバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）が特に好ましい。したがって、最も好ましい実施態様において、本発明はｓｐｏ０Ａ遺伝子の活性型が発現されるように変異させたバチルス・スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＲＢ５０で実行される。

本発明に好適なさらなる微生物は、たとえば下記の供託場所を介して公的に入手可能である：ドイツ・Ｄ−３８１２４ブラウンシュヴァイク・インホッフェンシュトラッセ７Ｂのドイツ・微生物および細胞培養コレクション（ＤＳＭＺ）（Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＤＳＭＺ），Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａｓｓｅ ７Ｂ，Ｄ−３８１２４ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ， Ｇｅｒｍａｎｙ）、日本・２９２−０８１８千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８の「ＮＩＴＥ生物遺伝資源センター」（以前は、日本５３２−８６８６大阪市淀川区十三本町２丁目１７−８５の「発酵研究所」、大阪（ＩＦＯ）として知られていた）または米国４３２１０オハイオ州コロンバス、オハイオ州立大学の「バチルス遺伝子ストックセンター（ＢＧＳＣ）」（“Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ”（ＢＧＳＣ），Ｔｈｅ Ｏｈｉｏ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｏｌｕｍｂｕｓ，Ｏｈｉｏ ４３２１０ ＵＳＡ）。

本発明と関連して、前述の微生物は、「国際原核生物命名規約」に定められている、同一生理的特性を有するシノニムおよびバソニムも含む。本発明における微生物の命名法は、「国際原核生物分類命名委員会および国際微生物学連合細菌学・応用微生物学部門（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｓ ｏｆ Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｉｅｓ）」により公的に承認され、優先権出願時に、「Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（ＩＪＳＥＭ）」で公表されたものである。

本発明は、変異した、とりわけ非機能的な遺伝子に関する。本発明は、それらに由来する、変異した、とりわけ非機能的な転写物に関する。本発明はまた、それらに由来する、転移した、とりわけ非機能的な、ポリペプチド類にも関する。このような変異した構造物は本発明の意味で、ＣｃｐＣ野生型あるいはその相同体またはオルソログの機能が低下または阻害されている、遺伝子的に修飾された宿主細胞を提供するために特に好適である。

結果として、本発明による教示の必須要素は、宿主細胞におけるリボフラビン生合成を増加させるために、効果的な、すなわち有効な、ｃｃｐＣ遺伝子、ＣｃｐＣ転写物または翻訳された転写因子の細胞内濃度を低下させることである。ＣｃｐＣあるいはその相同体またはオルソログの活性および／または細胞内濃度の低下は、それ自体、周知の方法で達成される。当業者は、いわゆるＣｃｐＣ欠失変異体、すなわちｃｃｐＣノックアウト変異体または形質転換細胞を獲得するのに適当な、バイオテクノロジーによる方法および手段を知っている。本発明はしたがって、本願明細書でさらに詳細に記述される望ましいバリアントおよび実施態様に限定されない。

本発明によれば、用語「変異」は何らかの遺伝子的修飾、すなわち、とりわけ分子レベルでの、非機能的な「変異した」遺伝子産物をもたらす核酸分子の修飾を意味するものと理解される。とりわけ、遺伝子産物の合成を妨げ、すなわちここではＣｃｐＣタイプの転写因子の合成を妨げ、および／または、ＣｃｐＣ野生型と比較して、変化した「変異した」アミノ酸配列を有し、またその機能が部分的にまたは完全に失われている、「変異した」または修飾されたポリペプチドの発現をもたらす、微生物のゲノムの変化を意味すると理解される。本発明による、遺伝子または遺伝子産物における変異は、転写、翻訳および該当する場合には翻訳後修飾から選択される、発現における少なくとも１つのステップに変化をもたらす。この変異は好ましくは、遺伝子配列内の少なくとも１つのヌクレオチドの点変異、欠失、置換、挿入および反転から選択される。しかし、遺伝子変異の方策は、これらの好ましい実施態様に限定されない。当業者は、遺伝子に変異を適所に配置するさらなる実行可能手段を知っている。本発明による変異の目的は、ＣｃｐＣをコードする少なくとも１つの遺伝子の発現を抑制することである。それと関連した目的は、野生型と比べて低下した活性、とりわけ制御活性を示す、修飾された転写因子の、細胞における発現である。

「変異」は、遺伝子のコード配列の直接的な修飾のみならず、発現と関連した他の構造物または配列の修飾にも関する。これらは好ましくは、遺伝子のオペロンの構造物、とりわけ、排他的にそれらに限定されることを望まないが好ましくはプロモーター、制御因子、オペレーター、転写因子結合部位、ターミネーターおよびそれらの補因子から選択される、制御構造物を含む。

本発明と関連して、特に用語「機能関連の」、「機能的に類似した」および「機能的な」と関連した、「機能」は、転写因子が結合するオペレーター構造を有するオペロンまたは遺伝子の発現を制御するための、ＣｃｐＣ野生型、あるいはその相同体またはオルソログの、転写因子機能を意味すると理解される。蛋白質、とりわけたとえばＣｃｐＣ等の転写因子の蛋白質の機能は、本発明では、活性としても表現され、その場合、ＣｃｐＣ野生型の転写因子機能は、１００％の転写因子活性に相当する。活性を測定するための既知の好適な方法の選択は、上述の通りである。

本発明の主題は、ｃｃｐＣ遺伝子、ならびにその相同体およびオルソログを表す単離された核酸分子である。本発明は、とりわけ、ヌクレオチド配列で配列番号（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．：）１として表され、またたとえば生物体バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）で生じる、この遺伝子に関する。本発明はまた、たとえば、アミノ酸配列配列番号２で表される、その遺伝子産物（ＣｃｐＣ蛋白質）にも関する。遺伝子ｃｃｐＣは、とりわけ、前述の好適な宿主細胞の１つ、好ましくはバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）におけるオペロンの一部である。相同な／オルソロガスなＣｃｐＣ配列を発見する方法は、たとえばＥＭＢＬ、Ｇｅｎｂａｎｋ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ等の好適なデータベースで、たとえば「ＢＬＡＳＴ」検索を実施することなど、当業者に周知である。これらの配列はＣｃｐＣ野生型の役割を果たし、これが次には本発明に従って修飾され、適切な宿主生物体でのリボフラビン生合成の増加をもたらす。この野生型配列を含む微生物は、本発明に関連して、野生型微生物と呼ばれる。

本発明はしたがって、非変異（野生型）核酸分子が、
ａ）ヌクレオチド配列配列番号１を含むかまたはそれからなる、核酸分子；
ｂ）アミノ酸配列配列番号２を含むかそれからなる、ポリアミノ酸分子（蛋白質）をコードする核酸分子；
ｃ）ａ）またはｂ）の核酸分子と少なくとも７０％の相同性を有する核酸分子；
ｄ）ストリンジェントな条件下で、ａ）またはｂ）の核酸分子の１つとハイブリダイズする核酸分子；および
ｃ）ＣｃｐＣタイプの転写因子の機能／活性を有する蛋白質をコードし、変異した核酸分子が、ＣｃｐＣ野生型の活性と比較して、ＣｃｐＣ蛋白質の活性低下をもたらす少なくとも１つの遺伝子変異を示す、ａ）またはｂ）による核酸分子の断片および／または類似体、
からなる群から選択される、
とりわけ、ＣｃｐＣタイプあるいはその相同体またはオルソログに由来する、「変異した」転写因子をコードする、−好ましくは単離された−変異した（修飾された）核酸分子に関する。

上述の通り、好ましい実施態様では、ｃｃｐＣ遺伝子は完全にノックアアウトされている（いわゆるノックアウト変異）。

本発明のさらなる主題は、
ａ）少なくともアミノ酸配列配列番号２を含むかそれからなるポリアミノ酸分子；
ｂ）上記の特徴を有する核酸分子によりコードされるポリアミノ酸分子；
ｃ）ａ）またはｂ）の分子と少なくとも７０％の相同性を有するポリアミノ酸分子；および
ｄ）ＣｃｐＣタイプの転写因子の機能を有する、ａ）またはｂ）のポリアミノ酸分子の少なくとも１つの断片および／または類似体、
からなる群から選択される、ポリアミノ酸分子（蛋白質またはポリペプチド）、好ましくは、単離物として存在する分子であって、
ここでａ）〜ｄ）の蛋白質は野生型ＣｃｐＣであり、−上述の通り−修飾されて、その結果として転写因子としての活性が低下する。

本発明はまた、それぞれ、好ましい配列番号１または配列番号２において、かなりの配列同一性、すなわち、とりわけかなりの「相同性」を示す、このような核酸分子または蛋白質にも関する。本発明によれば、これは、少なくとも７０％の相同性、好ましくは少なくとも７５％、特に好ましくは少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％および少なくとも９８％の配列同一性を意味すると理解される。好ましくは、配列は、全長にわたる、それぞれ、配列番号１または配列番号２との同一性に関する。好ましいバリアントでは、前述の配列同一性は、専ら、配列番号１および配列番号２の配列の機能関連領域に関する。このような領域の例は、ｃｃｐＣ遺伝子におけるＤＮＡ結合ドメインである。当業者は、これらの遺伝子領域を同定するためのプログラムを知っている。

核酸分子間の「相同性」に関して、「ストリンジェントな条件」下でのハイブリダイゼーションを、１つの基準として理解することができる。「ストリンジェントな条件」について、たとえばＭａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９８９：“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ”，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．に記述されているような既知の技術的背景を参照すると、「ストリンジェントな条件」は、実際の配列によって異なる。通例、これは、特定配列の融点より５〜１０Ｋ低いハイブリダイゼーション温度を意味すると理解され、この温度で、配列同一性５０％の相補的プローブが、標的配列にハイブリダイズする。少なくとも５０％、６０、７０％または特に好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも８５％〜９０％、とりわけ、少なくとも９５％の核酸配列が互いに相同である条件が好ましい。

実施例として示されたストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションの実施態様において、反応は、約４５℃で、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）で実施され、続いて５０℃で、好ましくは５５℃で、特に好ましくは６０℃で、殊に好ましくは６５℃で、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄される。

たとえばジゴキシゲニン（ＤＩＧ）で標識したプローブ等の、標識プローブを使用した、たとえば４２℃で数日間、たとえば２〜４日間のインキュベーション、その後室温にて２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで１回または複数回の洗浄ステップ、および６５〜６８℃の０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳまたは０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの少なくとも１回の洗浄ステップ等が続く、「高ストリンジェント条件」下でのハイブリダイゼーションが好ましい。とりわけ「高ストリンジェント条件」は、ＤＩＧ標識プローブ（たとえば「ＤＩＧ標識システム（ＤＩＧ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）」，Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ，６８２９８ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙで調製）を使用して、たとえば「ＤｉｇＥａｓｙＨｙｂ ｓｏｌｕｔｉｏｎ」（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ）等に１００μｇ／ｍｌのサケ精子核酸を任意選択により添加した溶液中、または５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．０２％ＳＤＳ、０．１％Ｎ−ラウリルサルコシンおよび２％「ブロッキング試薬」（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ）を含有する溶液中、たとえば４２℃にて２時間〜４日間のインキュベーション、続いて室温にて２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で５〜１５分間、２回の洗浄、さらに６５〜６８℃にて０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、または０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で１５〜３０分間、２回の洗浄を含む。

本出願では、用語「相同性」または「パーセント同一性」は、互換的に使用される。２つの核酸またはアミノ酸配列が互いに「相同」または「同一」であるパーセンテージを決定するために、両配列を最適比較に合わせて調節する（したがって、たとえば２つの配列の最適アラインメントのために、一方の配列にギャップを導入する）。次いで、対応する位置のヌクレオチドを比較する。第１の核酸配列のある位置が、第２の配列の対応する位置において、同一ヌクレオチドで占められているのであれば、両分子はこの位置で同一であり、１００％の相同性または同一性に該当する。２つの配列間の同一性のパーセンテージ値（パーセント同一性）は、両配列が共通して有する多数の同一位置の関数として表すことができる［すなわち％同一性＝同一位置の数／位置の総数（すなわち重複位置）×１００］。比較する配列は、好ましくは同じ長さを有する。相同性を決定するために、様々な既知のコンピュータープログラム、たとえば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４４−４５３，１９７０）のアルゴリズムに従って作動するＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ａｃｃｅｌｒｙｓ．ｃｏｍ／で入手可能）のコンポーネントとしてのプログラム“ＧＡＰ”が、当業者には利用できる。

本発明に関連して、用語「オルソログ」は、全て、１つの共通のオリジナル遺伝子から出発して生じた、異なる属の遺伝子を意味すると理解されたい。通常、これらのオルソロガスな遺伝子の機能は、進化の間ずっと保存される。これまで配列決定されていないゲノムで、における信頼できる遺伝子機能を予測できるためには、オルソログの同定が重要である。

これとは対照的に、本発明の意味で、実際に１つの共通遺伝子に由来するが、進化の過程で別の機能を獲得した遺伝子は、「相同体」と呼ばれる。

好ましい実施態様において、本発明は、とりわけ、転写因子ＣｃｐＣ、あるいはその相同体またはオルソログの結合親和性の活性を低下させる修飾、および／または、ＣｃｐＣ、あるいはその相同体またはオルソログに由来する修飾されたすなわち「変異した」遺伝子産物、すなわち低下した結合活性を示すか結合活性を全く示さない蛋白質が得られるというような、制御された遺伝子、とりわけ転写因子結合構造物の、および／またはその補因子の、オペロンとの、その相互作用、および／または制御された遺伝子またはオペロンと連結されるオペレーター構造物との相互作用を提供する。

好ましいバリアントでは、これは、修飾された「変異した」アミノ酸配列を有する、とりわけ修飾された蛋白質構造を有する遺伝子産物が得られるように、オリジナルｃｃｐＣ遺伝子（野生型）あるいはその相同体またはオルソログの直接的遺伝子修飾によって実施される。

代替または好ましくは付加的なバリアントでは、これは、転写、翻訳および該当する場合には翻訳後プロセシングから選択される、少なくとも１つの工程を修飾することにより、これらの工程と関連した少なくとも１つの分子構造またはこれらの補因子の特に好ましい修飾によって、実施される。これは、とりわけ、これらの工程の少なくとも１つに関与している構造物または配列と結合しかつ／または不活性化する少なくとも１つの構造物または構築物を使用して実行される。この構造物または構築物は、好ましくはアンチセンス構築物および抗体から選択されるが、排他的にそれらに限定されるものではない。

好ましくは、転写因子ＣｃｐＣ、あるいはその相同体またはオルソログの活性および／または濃度は、特異的インヒビターにより直接低下する。このような特異的インヒビターの例は、ＣｃｐＣ遺伝子、あるいはその相同体またはオルソログ、あるいは本発明による他の構造的に関係した核酸分子のアンチセンス構築物であって、それ自体周知でありかつ宿主細胞で発現される方法で、宿主細胞に一時的または安定的に導入される。

別の好ましい実施態様において、本発明は、とりわけ、転写因子ＣｃｐＣおよびそれぞれその相同体またはオルソログの発現、濃度／活性、すなわちとりわけコピー数、および／または必要に応じて、とりわけ上記発現を減少させるかまたは完全に抑制するための、それらの補因子の発現、を減少させる、修飾を提供する。好ましいバリアントでは、これは、ｃｃｐＣ遺伝子あるいはその相同体またはオルソログのオペロンの直接的遺伝子修飾によって実行される。好ましいバリアントでは、このために、遺伝子の発現を調節するプロモーターの修飾が提供され、好ましくは過少発現が起こるかまたは発現が全く起こらないような、言い換えれば「ノックアウト」である。

代替のまたは好ましくは付加的なバリアントにおいて、これは、好ましくはとりわけ、これらの工程と関連した少なくとも１つの分子構造物またはこれらの補因子の、転写、翻訳および該当する場合には翻訳後プロセシングから選択される少なくとも１つの工程を調節することによって実行される。これらの中にはとりわけ、たとえば相同組換えによって、またそれ自体既知の方法でアンチセンス構築物を使用しても、得ることができる、ノックアウト変異も含まれる。

本発明による核酸またはアンチセンス構築物は、一般に知られている方法で宿主細胞に導入することができる。好ましい方法は、好ましくはエレクトロポレーション、洗剤または類似した手段による、および代わりにまたは好ましくは加えて弾道的方法（たとえば「遺伝子銃」）または類似した方法による、宿主細胞の細胞壁および／または膜の崩壊であるが、本発明はこれらの方法および手段に制限されない。

したがって、本発明の一態様は、本発明によるヌクレオチド配列をアンチセンス方向に有する、外的に生産されたとりわけ合成的に生産されたＤＮＡまたはＲＮＡ分子であり、これを宿主細胞に導入することができる。これはとりわけ、アンチセンス方向に、この核酸分子の１つまたは複数のコピーを含むベクターを含む。

したがって、本発明の好ましい実施態様は、ＣｃｐＣ、あるいはその相同体またはオルソログの発現を抑制するために修飾される、修飾された微生物細胞である。一バリアントにおいて、細胞は、ＣｃｐＣ、あるいはその相同体またはオルソログの過少発現のために修飾される。好ましい実施態様では、細胞は、ＣｃｐＣをコードする少なくとも１つの遺伝子のノックアウト変異体である。本発明はしたがって、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のＣｃｐＣコード化遺伝子の相同体のノックアウト変異体である、修飾された細胞も含む。本発明はしたがって、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のＣｃｐＣコード化遺伝子のオルソログのノックアウト変異体も含む。本発明はまた、ＣｃｐＣおよびその遺伝子の、他の機能類似体のノックアウト変異体も含む。

宿主細胞の遺伝子修飾の代替のまたは好ましくは付加的なバリアントにおいて、遺伝子修飾は、ＣｃｐＣ転写因子の少なくとも１つの結合構造、および好ましくは数個の結合構造物、およびその断片で行われる。これらは、好ましくは宿主細胞においてＣｃｐＣにより制御される遺伝子のオペレーター構造物である。制御された遺伝子は、とりわけｃｉｔＢおよびｃｉｔＺであるが、本発明はそれらに限定されるものではない。本発明によれば、ＣｃｐＣにより制御される遺伝子のオペレーター区域付近の、本発明により好ましく提供される少なくとも１つの変異を介して、遺伝子の転写に関する制御作用が低い程度まで起こるかまたは全く生じないように、転写因子のオペレーターへの結合が阻止されるかまたは低下する。転写因子およびとりわけそれらの転写因子の結合配列により制御される遺伝子のオペレーター区域の修飾方法は当業者に周知である。制御された遺伝子ｃｉｔＢおよびｃｉｔＺの結合配列ならびにｃｃｐＣ遺伝子それ自身における結合配列は、たとえば「バチルス・スブチリスにおける（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）転写制御のデータベース」（ＤＢＴＢＳ；ｈｔｔｐ：／／ｄｂｔｂｓ．ｈｇｃ．ｊｐ／を参照されたい）で公開／言及されている。ｃｃｐＣ遺伝子それ自身の制御配列における既知の結合配列の例は、開始コドンに対して、−１０〜＋１５位（配列番号３）、とりわけ−５〜＋１０位（配列番号８）に位置する。ｃｉｔＢの既知の結合配列は、開始コドンに対して−７５〜−５２位（配列番号４）、とりわけ−７３〜−６８位（配列番号９）または−６４〜−６０位（配列番号１０）、ならびに−３５〜−２２位（配列番号５）または−３５〜−１７位（配列番号１１）、とりわけ−２７〜−２２位（配列番号１２）に位置し、またｃｉｔＺの既知の結合配列は、開始コドンに対して、−１１〜＋５位（配列番号６）、とりわけ−１１〜−８位（配列番号１３）、および＋２１〜＋４４位（配列番号７）、とりわけ＋２３〜＋２６位（配列番号１４）または＋３４〜＋３７位（配列番号１５）に位置する。前述の既知の結合配列および対応するオペロンを、表１に記載する。

本発明はしたがって、遺伝子（上記参照）の発現減少をもたらす、ｃｃｐＣ遺伝子に修飾／変異を含む修飾された宿主細胞に関する。しかし、さらなる実施態様では、ｃｃｐＣ遺伝子産物の結合配列に、好ましくは、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５により上述した結合配列の１つに、修飾／変異を含み、それによってＣｃｐＣの結合が減少するように、宿主細胞を修飾することもできる。この結合減少は、上述の通り、ＣｃｐＣの活性低下と理解すべきであり、野生型の活性と比較して少なくとも２５％の活性低下が好ましく、これは少なくとも２５％減少した結合に相当する。本発明はまた、本明細書に記載の意味で、宿主細胞におけるリボフラビン合成を制御する、とりわけ増加するための、その転写物およびそれから合成可能な蛋白質およびそのアンチセンス構築物の使用にも関する。変異の導入方法およびそれに続く結合活性の測定方法、たとえば「ゲルシフト」実験または「フットプリント」実験等の実行（たとえばＭａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９８９：“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ”，２^ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．を参照されたい）は、当業者に周知である。

本発明はまた、前述の分子および構造物への分子結合にも関する。本発明によれば、このような分子は、ＣｃｐＣ、あるいは相同体またはオルソログの機能または活性を修飾、とりわけ抑制するのに好適である。好ましくはこのような分子は、配列番号１、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、および配列番号１５から選択されるヌクレオチド配列により限定できる構造物または分子の少なくとも１つ、とりわけオペレーター構造物に結合する。好ましくは、結合分子は、このようにして限定できる構造に対する特異的抗体である。

したがって、本発明の主題は、前述のポリアミノ酸配列または分子による１つに特異的に結合することができる、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である。ＣｃｐＣへの抗体の結合により、たとえばｃｉｔＢまたはｃｉｔＺ等の、制御すべき遺伝子におけるオペレーター配列への転写因子の結合が阻止される。

上述の修飾された核酸分子および修飾された宿主細胞は、リボフラビン合成を増加させるために使用される。本発明はしたがって、とりわけ下記のステップ：
ａ）本発明にしたがって修飾された宿主細胞の提供、
ｂ）宿主細胞におけるリボフラビンの合成を可能にする、好適な培地中および好適な培養条件での、修飾された宿主細胞の培養、および任意選択的に、
ｃ）修飾された宿主細胞および／または培地からの、リボフラビンの単離
を含む、バイオテクノロジーによるリボフラビン合成方法にも関する。

本発明の特別な態様は、前述の修飾された宿主細胞を用いたリボフラビンの発酵生産である。本発明によれば、用語「リボフラビン」は、リボフラビン、ならびにフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）およびフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、ならびにそれらの前駆体分子（「前駆体」）、リボフラビン、ＦＭＮまたはＦＡＤの誘導体および／または塩類も含む。塩類の例は、とりわけリボフラビン−５−リン酸およびリボフラビン−５−リン酸ナトリウムである。リボフラビン、ＦＭＮまたはＦＡＤの前駆体分子および誘導体としては、たとえばＤＲＡＰＰ、５−アミノ−６−リボシルアミノ−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ピリミジンジオン−５’−リン酸、２，５−ジアミノ−６−リビチルアミノ−４（３Ｈ）−ピリミジノン−５’−リン酸、５−アミノ−６−リビチルアミノ−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ピリミジンジオン−５’−リン酸、５−アミノ−６−リビチルアミノ−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ピリミジンジオン、６，７−ジメチル−８−リビチルルマジン（ＤＭＲＬ）およびフラボ蛋白質などが挙げられる。

リボフラビン発酵合成の一般的方法およびリボフラビン生合成、とりわけバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）での発酵合成、に関与する遺伝子は周知である（たとえば欧州特許第４０５３７０号明細書または“Ｕｌｌｍｎａ’ｓ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，７^ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００７，Ｃｈａｐｔｅｒ：Ｖｉｔａｍｉｎｓを参照されたい）。こうした方法は、本明細書に記載の修飾された宿主細胞を用いたリボフラビン合成にも応用することができる。

様々な基質を、リボフラビン合成のための炭素源として本発明による方法で使用することができる。特に好適な炭素源は、３、５または６個の炭素原子を有する化合物、たとえば、Ｄ−グルコース、グリセリン、「濃厚汁」、デキストロース澱粉、ショ糖またはリボースから選択することができる。好ましくは、炭素源はＤ−グルコースである。本明細書に記載の方法と関連した、用語「炭素源」、「基質」および「生産基質」は、互換的に使用される。

修飾された宿主細胞を用いたリボフラビン合成のための本発明による方法のための培地として、リボフラビン合成に適する全ての培地を使用することができる。これは一般に、たとえば塩類および基質を含み、また特定のｐＨを有する、水性培地である。基質がリボフラビンに変換される培地は、生産培地とも呼ばれる。

本発明と関連して「発酵」または「生産」または「発酵工程」は、当業者に周知の条件下の培地中での成長細胞の使用、および、これらが、当業者に周知の条件下で適切な培地中で成長した後、もはや成長していない細胞（いわゆる「休止細胞」）の使用の両方を指す。これらの成長中の細胞またはもはや成長していない細胞は、当業者に周知の条件下で、好適な基質をリボフラビンに変換するために使用される。

合成されたリボフラビンは、好適な方法により宿主細胞から得る／単離することができる。これは、たとえば、生産培地からのリボフラビンの分離を意味する。次いで、任意選択的に、得られたリボフラビンをさらに加工する、たとえば精製することができる。

修飾された宿主細胞を用いてリボフラビンを生産するための上記方法と関連して、微生物の増殖相は通常、有酸素条件下、適切な栄養を加えた水性培地中で行われる。培養は、たとえばバッチ法、フェドバッチ法、半連続法または連続法で行われ、フェドバッチ法または半連続法が好ましい。

宿主細胞に応じて、ｐＨ、温度および栄養培地、培養期間は、たとえば約１０時間〜約１０日間、好ましくは約４〜約７日間、特に好ましくは約２〜約６日間である。当業者は、選択された宿主細胞に最適の条件を知っている。

培養は、たとえば、約７．０、好ましくは約６〜約８、特に好ましくは約６．５〜７．５のｐＨ、および約１３℃〜約７０℃、好ましくは約３５℃〜約３９℃、特に好ましくは約３０℃〜約３９℃、とりわけ約３６℃〜約３９℃の適温で実施される。培地は通常、炭素源としてＤ−グルコース、グリセリン、「濃厚汁」、デキストロース、澱粉、ショ糖またはリボースを、またたとえばペプトン、酵母エキスまたはアミノ酸等の窒素源を含む。加えて、塩類、たとえば硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、リン酸カルシウムまたは炭酸カルシウムが存在してもよい。バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の細胞を使用したリボフラビンの発酵生産の一例は、国際公開第０４／１１３５１０号パンフレット（ＶＦ培地）に記載されており、これを参照により本明細書に援用する。本方法は、好ましくは本発明に使用されることが望ましい。

転写因子ＣｃｐＣの活性における修飾により、上述の通り、（修飾された）宿主細胞は、増加したリボフラビン合成ができる。本発明による宿主細胞、とりわけ菌株バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の、リボフラビン生産量は、非修飾細胞すなわち野生型細胞のリボフラビン生産量と比較して、少なくとも１０％増加することができる。少なくとも２０％、とりわけ少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、８０％およびそれ以上の増加が好ましい。リボフラビンの生産量／生産性を測定するための分析方法は周知である。ＨＰＬＣまたは指示菌株（たとえばＢｒｅｔｚｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２，１９−２６，１９９９を参照されたい）の使用が、その例である。発酵が行われた後、生産されたリボフラビンを、既知の方法で他成分（培地、バイオマス等々）から分離し、精製して濃度測定し、野生型菌株で対照反応を実施する。

「生産」または「作製」および「生産性」等の用語は当業者に周知であり、所与の時間および所与の発酵体積で形成されるリボフラビン濃度（たとえば、時間当たりリットル当たりのｋｇ生成物）を含む。用語「生産量」は当業者に周知であり、炭素源の生成物への、すなわちリボフラビンへの変換効率を含む。生産量は一般に、炭素源ｋｇ当たりの生成物ｋｇとして表現される。本発明と関連して、「生産量および／または生産性」の増加は、所与の期間中の所与の培養体積で得られる分子の量の増加を意味する。
［実施例］

使用したが記載されていない培地は全て、国際公開第２００７／０５１５５２号パンフレットに記述されている。

１００×微量元素溶液Ａ：ＭｇＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ １２．５ｇ；ＣａＣｌ_２ ０．５５ｇ；ＦｅＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ １．３５ｇ；ＭｎＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏ ０．１ｇ；０．１７ｇ／ｌ ＺｎＣｌ_２；ＣｕＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ ０．０４３ｇ；ＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ ０．０６ｇ；Ｎａ_２ＭｏＯ_４・２Ｈ_２Ｏ ０．０６ｇ；Ｈ_２Ｏで１リットルにする、加圧滅菌。

５×最小塩類溶液：０．０５７Ｍ Ｋ_２ＳＯ_４；０．３１Ｍ Ｋ_２ＨＰＯ_４・５Ｈ_２Ｏ；０．２２Ｍ ＫＨ_２ＰＯ_４；０．０１７Ｍ クエン酸Ｎａ・７Ｈ_２Ｏ；０．００４Ｍ ＭｇＳＯ_４Ｈ_２Ｏ、ｐＨ７．０、加圧滅菌。

１００×微量元素溶液Ｂ：ＣａＣｌ_２ ０．５５ｇ；ＺｎＣｌ_２ ０．１７ｇ；ＣｕＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ ０．０４３ｇ；０．０６ ＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ；Ｎａ_２ＭｏＯ_４・２Ｈ_２Ｏ ０．０６ｇ；Ｈ_２Ｏで１リットルにする、加圧滅菌。

リボフラビンスクリーニング培地（ＲＳＭ）：１０×スピッツァイツェン（Ｓｐｉｚｉｚｅｎ）塩類 ２００ｍｌ；１００×微量元素溶液Ａ １０ｍｌ；５０％グルコース ２ｍｌ；２５％ラフィノース ３６ｍｌ；１０％酵母エキス １０ｍｌ；Ｈ_２Ｏで１リットルにする。

スピッツァイツェン（Ｓｐｉｚｉｚｅｎ）最小培地（ＳＭＭ）：１０×スピッツァイツェン（Ｓｐｉｚｉｚｅｎ）塩類 １００ｍｌ；５０％グルコース １０ｍｌ；４０％グルタミン酸ナトリウム １ｍｌ；微量元素溶液Ａ １０ｍｌ；Ｈ_２Ｏで１リットルにする。

振盪フラスコ内でのリボフラビン生産は、以下の通りに試験した：凍結グリセリンストックから開始してＶＹ培地５ｍｌを接種し、振盪（２８０ｒｐｍ）しながら３７Ｃで６〜８時間培養した。培養５ｍｌを、２５０ｍｌフラスコ内のＲＳＭ培地２５ｍｌの接種にそのまま使用した。振盪（２２０ｒｐｍ）しながら、３９Ｃで４８時間インキュベートした後、培養液５００μｌを４Ｎ ＮａＯＨ ３５ｍｌで処理し、１分間、激しく振った。この試料を、リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）４６５ｍｌで処理し、１３２００ｒｐｍで５分間、遠心分離した。リボフラビン、６，７−ジメチル−８−リビチルルマジン（ＤＭＲＬ）およびオキソルマジンの含量をＨＰＬＣで測定した。第２の培養試料を遠心分離し（５分、１３２００ｒｐｍ）、その上澄を、残余グルコースおよびラフィノースの測定に使用した。数値の決定により、生産量を算出することが可能になった。

振盪機培養試料をＨＰＬＣで分析した。クロマトグラフィは、平衡化オートサンプラー、ダイオードアレイおよび蛍光検出器を具備した、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣシステムで実施した。分離は、４ｍｍ ＬＣ−８ＤＢ ガードカラムを具備したＳｕｐｅｌｃｏｓｉｌ ＬＣ−８ＤＢ ５μカラム（１５０ｍｍ×４．６ｍｍ）で実行した。０．１Ｍ酢酸およびメタノールの混合物を移動相として使用した。溶出は、勾配を用いて実施した。２％メタノールの濃度で５分後、メタノール濃度を１５分で５０％まで上げた。カラムを、２０Ｃで平衡化した。２８０ｎｍにおけるＵＶシグナルを検出に使用した。１５．２分後に、孤立ピークとしてリボフラビンを検出した。Ｆｌｕｋａからのリボフラビンで本法の較正を実施したところ、１０ｍｇ／ｌから１ｇ／ｌまで直線状であった。培養ブロスからのグルコースおよびラフィノースを測定するために、クォータナリ（ｑｕａｔｅｒｎａｒｙ）ポンプ、オートサンプラー、屈折率検出器を取り付けた、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣシステムも使用した。分離は、ＳｈｉｓｅｉｄｏからのＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ ＮＨ２ ＵＧ８０カラム（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、５μ）で遂行した。至適カラム温度は３５Ｃであった。移動相は、比率６５／３５の、アセトニトリルと脱イオン水との混合物であった。流量は、１ｍｌ／分に設定した。注入量は５μｌであった。屈折率検出器シグナルを、検出に使用した。本法は、濃度０．５ｇ／ｌ〜３０ｇ／ｌに使用することができた。

［実施例１］
ＣｃｐＣの活性の変化を伴うリボフラビン生産量のシミュレーション
本発明による活性変化、とりわけ転写因子ＣｃｐＣの活性低下を伴う、宿主細胞におけるリボフラビン合成の代謝フラックス分布を予測するために、第１ステップで、ＣｃｐＣの活性変化を確認し、ＣｃｐＣにより制御される遺伝子に及ぼすそれらの影響を、「Ｎｅｔｗｏｒｋ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ」（ＮＣＡ）および遺伝子発現時系列で定量化した。転写因子活性の影響を予測するために、開始フラックス分布の制御されたフラックスを転用し、次いで、二次凸最適化により、新しい代謝流れ分布を算出する。例として、グルコースを用いた好気生育中に、リボフラビン産生バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株を使用して、シミュレーションを実施した。

１未満のＣｃｐＣ活性を有する変異体（ＡＦ＜１、たとえばノックアウト変異体）は、野生型（ＡＦ＝１）と比べて著しく増加したリボフラビン生産量、すなわち、０．０２（グルコース１ｇ当たりのリボフラビンｇ）に比して、生産量０．０５を示す。

［実施例２］
ＣｃｐＣ−欠損菌株の発生
宿主細胞バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）における転写因子ＣｃｐＣのノックアウト変異体を作製するために、バチルス・スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のゲノムのオリジナルｃｃｐＣ遺伝子座に、抗生物質耐性遺伝子カセットを導入した。

バチルス・スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８のゲノムＤＮＡからＰＣＲを用いて増幅しておいた２つのＤＮＡ断片を、第３のＰＣＲで、ネオマイシン耐性遺伝子カセットと結合した（Ｉｔａｙａ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ａ ｎｅｏｍｙｃｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅ ｃａｓｓｅｔｔｅ ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ ｉｎａ ｓｉｎｇｌｅ ｃｏｐｙ ｓｔａｔｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：４４１０）。遺伝子ｃｃｐＣの５’領域および３’領域に相同な、２つの断片を作製するために、以下のＰＣＲを実施した：５０μｌ中に、５’−相同断片、バチルス・スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８由来のゲノムＤＮＡ １００ｎｇ、プライマーｐ４３６（配列番号１６）の１００μＭ溶液１μｌ、プライマーｐ４３９（配列番号１７）の１００μＭ溶液１μｌ、１０ｍＭ ｄＮＴＰ溶液１μｌ、１０×緩衝液５μｌおよびＰｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）０．５μｌ。ＰＣＲ反応は、３５サイクルの（ｉ）９４℃で３０秒間の変性；（ｉｉ）５２℃で３０秒間のアニーリング；（ｉｉｉ）７２℃で１分間の増幅；で構成されていた。実際のＰＣＲ反応前に、鋳型ＤＮＡを９５℃で３分間変性した。３’ＤＮＡ断片の場合には、プライマー対プライマーｐ４３７（配列番号１８）およびプライマーｐ４３８（配列番号１９）を使用した。プライマー対ｐ９（配列番号２０）およびｐ１０（配列番号２１）と同一条件下で、ネオマイシン耐性遺伝子カセットをコードするＤＮＡ断片を作製した。第４のＰＣＲで、３つのＤＮＡ断片は、それらの相同な、重複領域により結合された。このために、アガロースゲル電気泳動法で精製したＤＮＡ断片各５０ｎｇを使用した。上述のＰＣＲ条件と比較して、増幅時間を２．５分に増加した。他のパラメータは全て、不変であった。プライマー対として、プライマーｐ４５およびｐ５１を使用した。結果として得られたＰＣＲ産物は、ＱｉａｇｅｎからのＱｉａＱｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キットを用いて精製した。コンピテントなバチルス・スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８細胞を、精製産物２μｇで形質転換した。２ｍｇ／ｌネオマイシンを含有するＴＢＡＢ培地で、ネオマイシン耐性コロニーの選択を実施した。さらなるＰＣＲ（前述の条件下、プライマー対ｐ４５およびｐ１０）を用いて、選択されたネオマイシン耐性形質転換細胞の遺伝子型を確認した。陽性の形質転換細胞１個は、ＢＳ５８７８と名付けられた。

［実施例３］
選択されたリボフラビン過剰生産菌株へのｃｃｐＣノックアウトのトランスファー
リボフラビンを過剰生産する選択されたバチルス・スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株にｃｃｐＣノックアウトをトランスファーするために、ファージＰＢＳ−１による形質導入を使用した（国際公開第０７／０５１５５２号パンフレット、実施例６を参照されたい）。菌株ＢＳ５８７８のＰＢＳ−１ファージ溶菌液を作製した。形質導入に使用したリボフラビン生産株ＢＳ３９１４およびＢＳ３９１７は、以下の通りに作製した：菌株ＢＳ３９１４およびＢＳ３９１７は、リボフラビン−過剰生産菌株ＢＳ３５３４の子孫である（ＢＳ３５３４の構築に関しては、国際公開第２００７／０５１５５２号パンフレットを参照されたい）。ＢＳ３５３４は、欧州特許第４０５３７０号明細書に記載され、またＮＲＲＬＢ−１８５０２の番号で寄託された、菌株バチルス・スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＲＢ５０に基づく。菌株ＢＳ３９１４およびＢＳ３９１７において、リボフラビン遺伝子座に組み込まれたプラスミドｐＲＦ６９を、ネオマイシン耐性遺伝子カセットに置き換えた。対応するＰＣＲ産物を作製するために、上述のＰＣＲ法を使用した。ＰＣＲ産物は、バチルス・スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８のゲノムＤＮＡ上のリボフラビンオペロンプロモーター（プライマー対ｐ５０；配列番号２２およびｐ５１；配列番号２３）から上流に５２６ｂｐ長の３’領域、およびＰＣＲを用いてネオマイシン耐性遺伝子カセット（プラスミドｐＵＢ１１０上のプライマーｐ９およびｐ１０）と融合させた、バチルス・スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８のゲノムＤＮＡ上のｒｉｂＤ遺伝子（プライマー対ｐ４４；配列番号２４およびｐ４５；配列番号２５）における５０２ｂｐ長の５’領域からなる。正確な反応条件は、さらに上に記述されている。精製したＰＣＲ産物を、コンピテントなバチルス・スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８細胞の形質転換に使用した。選択は、１００ｍｇ／ｌリボフラビンおよび２ｍｇ／ｌネオマイシンを含有するＴＢＡＢプレートで行われた。成長したコロニーの遺伝子型は、ＰＣＲおよび配列決定を用いて確認した。確認され、単離された１つの形質転換細胞は、ＢＳ３８１３と名付けられた。菌株ＢＳ３５３４に構築物をトランスファーするために、ＢＳ３８１３のＰＢＳ−１ファージ溶菌液を作製した。このように作製された菌株は、ＢＳ３７９８と名付けられた。

次のステップで、リボフラビン栄養要求菌株ＢＳ３８１３のネオマイシン耐性カセットを、再度、機能性リボフラビンオペロンに置き換えた。陽性の形質転換細胞／形質導入体を選択するために、最小培地プレート（１×無機塩溶液−微量元素溶液に溶解した２ｇ／ｌグルコース）を使用した。修飾されたプロモーター／ｍＲＮＡリーダー配列において、自然のプロモーターをバチルス・スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のｖｅｇ遺伝子のプロモーターに置き換えた。加えて、リーダー領域のシトシンを、チミジンに置き換えた（配列番号２６）。菌株ＢＳ３８１３のコンピテント細胞を、配列番号２６による配列を有するＤＮＡ断片で形質転換した。形質転換細胞はまた、リボフラビンを添加しない培地で成長する能力を有していた。成長したコロニーの遺伝子型を、ＰＣＲで確認し、続いて配列決定した。確認したコロニー１つは、ＢＳ３９５３と呼ばれた。菌株ＢＳ３９５３のＰＢＳ−１ファージ溶菌液を、ＢＳ３７９８の形質導入に使用した。選択は、上述の通りに実施した。２タイプの形質導入体を単離した。第一の場合には、ＢＳ３７９８の不活性化したｓｐｏ０Ａ遺伝子は、野生型対立遺伝子に置き換えられていなかった。確認された形質導入体１つは、ＢＳ３９１４と名付けられた。第２の場合、不活性化されたｓｐｏ０Ａ遺伝子は、形質導入中にＤＮＡの大断片をトランスファーしたことにより、活性な野生型に置き換えられていた。試験したＳｐｏ０Ａ陽性変異体１つは、ＢＳ３９１７と名付けられた。

ＢＳ３９１４およびＢＳ３９１７に、ＢＳ５８７８由来の溶菌液を形質導入した。再度、２ｍｇ／ｌネオマイシン含有するＴＢＡＢプレートで選択を行った。選択した形質導入体の遺伝子型を、前述のＰＣＲで確認した。菌株ＢＳ３９１４の形質導入から確認された形質導入体５つは、ＢＳ５８９１、ＢＳ５８９３、ＢＳ５８９４およびＢＳ５８９５と名付けられた。ＢＳ３９１７由来の４つの形質導入体はＢＳ５８８７〜ＢＳ５８９０と名付けられた。

新しく作製された菌株のリボフラビン生産を、上述の通り振盪フラスコで試験した。４８時間後、試料５００μｌを培養から採取し、４Ｎ ＮａＯＨで処理し、中和して、遠心分離後、ＨＰＬＣで試料のリボフラビン濃度を測定した。生産量を算出するため、最終試料中の糖濃度も測定した。結果を、表２Ａおよび２Ｂにまとめる。

菌株（ＢＳ３９１４）由来の形質導入体は、宿主菌株ＢＳ３９１４と同じ生産量で、リボフラビンを生産した。Ｓｐｏ０Ａ−プラス菌株ＢＳ３９１７のｃｃｐＣノックアウト菌株は、宿主菌株ＢＳ３９１７より著明に改善された生産量で、リボフラビンを生産した。ＢＳ３９１７自身でさえ、既述の条件で、Ｓｐｏ０Ａ−マイナス菌株ＢＳ３９１４より有意に優れた生産量（２５％）を示した。

活性なｓｐｏ０Ａ遺伝子を有するリボフラビン産生バチルス・スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株において、ｃｃｐＣの不活性化は、振盪フラスコ条件で、少なくとも２０％の生産量の改善をもたらすと、結論することができる。

ｃｃｐＣの部分的不活性化、すなわち、転写機能の縮小につながる、たとえば７５％、５０％または２５％の活性縮小につながる、遺伝子配列への変異の導入、およびその後のリボフラビン濃度の測定により、野生型菌株と比較して約１０〜最大２０％の増加が認められた。こうした結果はまた、ＣｃｐＣの結合配列（表１参照）への変異の挿入によって達成することもでき、それによって、結合親和性の減少に応じて、約２５％のリボフラビン濃度の増加が達成される。上述の変異は、標準プロトコールに準じて挿入され、その後、既知の方法（Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ参照）を用いて結合親和性または結合親和性の減少を測定することができ、また上述の通りにリボフラビンの量を測定することができる。

Claims (13)

1. ＣｃｐＣタイプの転写因子の発現および／または活性が、非修飾の微生物すなわち野生型微生物と比較して、好ましくは少なくとも２５％減少していることを特徴とする、修飾されたリボフラビン産生微生物。
2. 少なくとも１つの変異を、前記ＣｃｐＣタイプの前記転写因子によって制御される少なくとも１つの遺伝子の１つまたは複数の結合配列に、好ましくは少なくとも１つの変異を、遺伝子ｃｉｔＺおよび／またはｃｉｔＢの結合配列に、含むことを特徴とする、請求項１に記載の微生物。
3. 配列番号３、４、５、６、７またはそれらの断片、とりわけ配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５による配列に、少なくとも１つの変異を含むことを特徴とする、請求項２に記載の微生物。
4. 前記Ｃｃｐｃをコードする遺伝子がノックアウトされていることを特徴とする、請求項１または２に記載の微生物。
5. ａ）ヌクレオチド配列配列番号１を含むかまたはそれからなる核酸分子；
   ｂ）アミノ酸配列配列番号２を含むかそれからなるポリアミノ酸分子（蛋白質）をコードする核酸分子；
   ｃ）ａ）またはｂ）の核酸分子と少なくとも７０％の相同性を有する核酸分子；
   ｄ）ストリンジェントな条件下で、ａ）またはｂ）の核酸分子の１つとハイブリダイズする、核酸分子；および
   ｃ）前記ＣｃｐＣタイプの転写因子の機能／活性を有する蛋白質をコードする、ａ）またはｂ）による核酸分子の断片および／または類似体；
   からなる群から選択される核酸分子を含み、
   ａ）〜ｃ）による核酸分子が、ＣｃｐＣ蛋白質の活性減少、好ましくは、ＣｃｐＣ野生型の活性と比較して少なくとも２５％の減少をもたらす、少なくとも１つの遺伝子変異を有する、
   ことを特徴とする、請求項１または４に記載の微生物。
6. 非修飾微生物すなわち野生型微生物と比較して、少なくとも１０％のリボフラビン生産量増加を有することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の微生物。
7. バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、好ましくは炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・ハロデュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｉｆａｃｉｅｎｓ）またはバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の微生物。
8. 非修飾の微生物または野生型微生物におけるリボフラビン合成と比較して、とりわけ少なくとも１０％、リボフラビン合成を増加させるための請求項１〜７のいずれか１項に記載の微生物の使用。
9. 前記修飾される核酸分子が、
   ａ）ヌクレオチド配列配列番号１を含むかまたはそれからなる核酸分子；
   ｂ）アミノ酸配列配列番号２を含むかそれからなるポリアミノ酸分子（蛋白質）をコードする核酸分子；
   ｃ）ａ）またはｂ）の核酸分子と少なくとも７０％の相同性を有する核酸分子；
   ｄ）ストリンジェントな条件下で、ａ）またはｂ）の核酸分子の１つとハイブリダイズする、核酸分子；および
   ｃ）前記ＣｃｐＣタイプの転写因子の機能／活性を有する蛋白質をコードする、ａ）またはｂ）による核酸分子の断片および／または類似体；
   からなる群から選択されることを特徴とする、前記修飾が、前記転写因子機能の低下、好ましくは少なくとも２５％の低下をもたらす、ＣｃｐＣタイプの転写因子をコードする修飾された核酸分子の使用。
10. 修飾される前記核酸分子が、前記転写因子の結合配列から選択されることを特徴とし、前記修飾が、前記ＣｃｐＣタイプの転写因子の機能の減少、好ましくは少なくとも２５％の減少をもたらすことを特徴とする、修飾された核酸分子の使用。
11. 前記修飾された核酸分子が、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４および１５からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１０に記載の使用。
12. 請求項１〜７のいずれか１項に記載の微生物の培養を含むことを特徴とする、リボフラビンを生産するための方法。
13. ａ）請求項１〜７のいずれか１項に記載の好適な宿主細胞を提供するステップ、
    ｂ）リボフラビン生産に好適な発酵条件で培養するステップ、および、
    ｃ）前記培地および／または前記修飾された宿主細胞からリボフラビンを単離するステップ
    を含むことを特徴とする、リボフラビンを生産するための方法。